WO2021193949A1 - 新規ｌ－ラムノースイソメラーゼ - Google Patents

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WO2021193949A1
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isomerase
rhamnose
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amino acid
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和也 秋光
何森　健
明秀 吉原
志郎 加藤
望月　進
裕美 吉田
成弘 神鳥
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国立大学法人香川大学
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    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/18—Erwinia

Definitions

  • the present invention presents a novel L-rhamnose isomerase and a method for producing the same, a microorganism that produces the enzyme, a DNA encoding the enzyme, a recombinant vector containing the same, a transformation host cell, an L-rhamnose isomerase variant, and L-rhamnose isomerase.
  • the present invention relates to a method for producing ketose or aldose using a l-rhamnose isomerase or a variant.
  • Rare sugars are, according to the definition of the International Rare Sugar Society, "sugars that rarely exist in nature", that is, monosaccharides that are abundant in nature.
  • monosaccharides tetrose
  • aldose two types of ketose
  • ketose two types of ketose
  • sugar alcohols three types of sugar alcohols.
  • aldose four types of ketose
  • sugar alcohols four types of sugar alcohols as monosaccharides (pentoses) having five carbon atoms.
  • monosaccharides (hexoses) with 6 carbon atoms in total 16 types of aldose, 8 types of ketose, and 10 types of sugar alcohol.
  • heptose monosaccharides having 7 carbon atoms
  • aldoheptose ketoheptose
  • heptitol having 7 carbon atoms
  • aldoses there are generally six types of aldoses that are abundant in nature: D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-ribose, D-xylose, and L-arabinose.
  • Other aldoses such as D-allose are defined as rare sugars.
  • the rare sugars are L-allose, L-gulose, L-glucose, L-galactose, L-altrose, L-idose, L-mannose, L-talose, and D-talose.
  • D-fructose is abundant in nature, while other kets are not abundant in nature, so it can be said to be a rare sugar.
  • D-allulose also known as D-psicose
  • D-tagatose D-sorbose
  • L-fructose L-allulose
  • L-allulose also known as L-psicose
  • L-tagatose L- Sorbose
  • D-allulose also known as D-psicose
  • D-psicose which is the basic raw material for the production of all rare sugars
  • D-allose becomes the center of new rare sugar production to D-allose and the like by the enzymatic reaction.
  • D-allose is an aldose which is an isomer different only in the OH group direction of the carbon at the 3-position from D-glucose, and is a rare sugar monosaccharide also known as an isomer of the ketose D-allose.
  • D-allose is a pharmaceutical composition containing it as an active ingredient for treating renal diseases selected from acute renal failure and uremia (Patent Document 1), and motor disorders caused by muscular atrophic lateral sclerosis.
  • Drugs for delaying the onset or progression of uremia Patent Document 2), blood pressure increase inhibitor (Patent Document 3), agents characterized by being used for suppressing angiogenesis (Patent Document 4), T lymphocyte proliferation inhibitor (Patent Document 5) or a peritoneal deterioration inhibitor used in combination with a peritoneal dialysate (Patent Document 6) is known, and is also known as an edible pesticide (Patent Document 7).
  • Patent Document 1 renal diseases selected from acute renal failure and uremia
  • Patent Document 3 Drugs for delaying the onset or progression of uremia
  • Patent Document 3 blood pressure increase inhibitor
  • agents characterized by being used for suppressing angiogenesis Patent Document 4
  • T lymphocyte proliferation inhibitor Patent Document 5
  • Non-Patent Document 1 L-rhamnose isomerase is an enzyme that catalyzes the reversible isomerization reaction between L-rhamnose and L-rhamnose, whereas P. stutzeri-derived L-rhamnose isomerase is not only between L-rhamnose and L-rhamnose.
  • L-lyxose-L-xylulose, L-mannose-L-fractose, D-growth-D-sorbose, D-ribose-D-ribbulose, D-allose-D-allose, L-tagatose-L A wide range of substrate specificities that can also act between tagatose have been revealed. Utilizing this broad substrate specificity, it has become possible to produce various rare aldoses and kets on ismoling, centering on the conversion of D-allose to D-allose.
  • the rare sugar D-allose is produced by using the pure rare sugar D-allose as a raw material and using a known L-rhamnose isomerase (EC 5.3.1.14).
  • L-rhamnose isomerase is an enzyme that catalyzes the isomerization reaction of L-rhamnose to L-rhamnose, and can also catalyze the isomerization of L-rhamnose to L-rhamnose. It is also known to act on the isomerization between D-allose and D-allulose. Since isomerases are named after the substrate that exhibits the highest activity, their substrate specificity varies among the enzymes named L-rhamnose isomerase.
  • the present invention is a novel L-rhamnose derived from a microorganism that has been approved for use in the production of foods and is not toxic, has high activity, and can isomerize D-allose to D-allose in high yield.
  • An object of the present invention is to provide an isomerase, a microorganism having the enzyme, and a production method using the enzyme.
  • the present inventors collected soils in various places, focusing on the non-toxic bacterial species on the list that are approved for use as foods not only in Japan but also in Europe and the United States. Microorganisms were isolated from it, and the search for microorganisms having L-rhamnose isomerase activity was continued. As a result, we found a microorganism belonging to the genus Erwinia that produces a novel L-rhamnose isomerase among many isolated strains. This Erwinia microorganism, Erwinia billingiae, produces a novel L-rhamnose isomerase with high activity and high heat resistance.
  • This novel microbial-derived L-lamnose isomerase catalyzes the isomerization reaction between aldose and the corresponding ketose, recognizes and reacts with the CHO group of C1 and the OH group of C2 of aldose, and OH the CHO group of C1. Based on this, the OH group of C2 is converted to a CO group, or the OH group of C1 of ketose and the CO group of C2 are recognized and reacted, and the OH group of C1 is converted to a CHO group and the CO group of C2 is converted to OH. It has an aldose-ketose isomerase activity that converts to a group. Further, when D-allose is produced using D-allose as a substrate, D-altrose, which is a by-product, is not produced, so that it is suitable for producing D-allose.
  • the present invention relates to the L-rhamnose isomerase described in the following (1) to (4) and the microorganism described in the following (5).
  • L-rhamnose isomerase derived from a microorganism belonging to the genus Erwinia, the molecular weight of the subunit measured by SDS-PAGE is 48 kDa, and the substrate specificities of the following (A) and (B) are determined.
  • L-rhamnose isomerase having.
  • A) The CHO group of C1 of Ardose and the OH group of C2 are recognized and reacted to convert the CHO group of C1 into an OH group and the OH group of C2 into a CO group, or the OH group of C1 of Ketose.
  • the optimum pH for the reaction is 9.
  • the optimum reaction temperature is 70 ° C. (3)
  • the present invention also describes the protein described in (5) to (7) below, the DNA described in (8) to (11) below, a recombinant vector, or a transformed host cell, or described in (12) below. Regarding microorganisms.
  • (5) A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the CHO group of C1 of Ardose and the OH group of C2 are recognized and reacted to convert the CHO group of C1 into an OH group and the OH group of C2 into a CO group, or the OH group of C1 of Ketose. It has an isomerase activity that recognizes and reacts with the CO group of C2 and converts the OH group of C1 into a CHO group and the CO group of C2 into an OH group.
  • a protein that is an amino acid substitution variant of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has 78% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has a SEQ ID NO: K3, L4, I5, Y9, E10, L11, Y16, D18, V19, I21, V23, E24, Q25, V26, M27, T28, G32, I33, R46, N52, E54, of the amino acid sequence represented by 1.
  • the reaction temperature is higher than that of a protein having an amino acid substitution at at least one site selected from 419, having the L-ramnose isomerase activity of (A) and (B) below, and consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the ratio of L-ramnose isomerase activity at 70 ° C. and 50 ° C. (T70 / T50) is high, the residual activity after heat retention at 60 ° C.
  • the present invention also relates to the immobilized protein according to the following (13) to (16).
  • the L-rhamnose isomerase according to any one of (1) to (4) above is in the state of a crude enzyme present in the cell disrupted product, or according to any one of (5) to (7) above.
  • Protein is immobilized on a carrier in the form of a crude protein present in a disrupted cell of a transformed host cell.
  • the present invention also relates to the method for producing L-rhamnose isomerase, or the method for producing ketose or aldose, described in (17) to (19) below.
  • the microbial cell of the genus L-rhamnose isomerase producing L-rhamnose isomerase according to any one of (1) to (4) above or the transformed host cell according to (11) above is cultured in a medium.
  • a method for producing ketose or aldose which comprises reacting the protein of 1 or the immobilized protein according to any one of (13) to (16) above to produce a corresponding ketose or aldose, and collecting the ketose or aldose. ..
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is characterized by having particularly high heat resistance and high activity as compared with the conventional L-rhamnose isomerase derived from a microorganism.
  • the conventional L-rhamnose isomerase derived from Pseudomonas stutzeri has an optimum temperature of 60 ° C.
  • the enzyme of the present invention has a high temperature of 70 ° C. and is heat-treated at 60 ° C. for 10 minutes. Since the residual activity of Pseudomonas stella has a thermal stability of 80% or more, it is suitable for use in industrial production.
  • the excellent heat resistance of this enzyme can be further enhanced by producing an amino acid substitution mutant of this enzyme.
  • the substrate when the substrate is 100 mM D-allose, it has a high conversion activity to D-allose of 2.26 U per unit protein at 60 ° C., and the present invention enables mass production of D-allose.
  • the enzyme of the present invention converts only D-allose and does not produce D-altrose, which is a by-product, so that the yield is increased accordingly.
  • the present invention relates to L-rhamnose isomerase that can be isolated from a microorganism belonging to the genus Erwinia, and has characteristic properties in high activity and heat resistance.
  • the L-lamnose isomerase of the present invention recognizes and reacts with the CHO group of C1 of aldose and the OH group of C2, and converts the CHO group of C1 into an OH group and the OH group of C2 into a CO group to form ketose.
  • it has an isomerase activity that recognizes and reacts with the OH group of C1 of ketose and the CO group of C2, and converts the OH group of C1 into a CHO group and the CO group of C2 into an OH group to form an aldose.
  • the ketose referred to in the present invention means a ketohexose of six-carbon sugar or a ketopentose of five-carbon sugar having a ketose structure.
  • Ketohexose contains allulose (also known as psicose), sorbose, tagatose and fructose, and ketopentose contains ribulose and xylulose.
  • aldose as used in the present invention means aldohexose of six-carbon sugar or ald-pentose of five-carbon sugar having an aldose structure.
  • Aldohexose includes glucose, allose, altrose, growth, idose, talose, galactose and mannose
  • aldopentose includes ribose, arabinose, xylose and lyxose.
  • D- or L- means these D-forms and L-forms.
  • the L-lamnose isomerase of the present invention acts on L-lamnose, L-lyxose, L-mannose, D-ribose, L-talose, and D-allose, and acts on L-lamnose-L-lamnose, L-lyxose-.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention belongs to the genus Erwinia, and by culturing a microorganism capable of producing L-rhamnose isomerase and isolating L-rhamnose isomerase from the cells grown in the culture medium. Can be prepared.
  • a microorganism capable of producing L-rhamnose isomerase and isolating L-rhamnose isomerase from the cells grown in the culture medium. can be prepared.
  • the microorganism belonging to the genus Erwinia for example, Erwinia billingiae GuaL218-3 and mutant strains thereof can be advantageously used.
  • the GuaL218-3 strain was internationally deposited on February 28, 2020 at the Patent Microbiology Depositary, National Institute of Technology and Evaluation, located at 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. Then, it was received as receipt number NITE ABP-03142, and then GuaL218-3 shares were formally deposited internationally
  • L-rhamnose isomerase-producing bacteria of the genus Elvinia are aerated and cultured in an inorganic salt medium supplemented with L-rhamnose, and then the cells are recovered from the culture solution by centrifugation.
  • the recovered cells were washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), suspended in 10 mL of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and lysozyme, a lytic enzyme, was added. Then, the cells are disrupted by enzymatic treatment, or the cells are disrupted with an ultrasonic homogenizer while cooling the bacterial cell suspension in ice water. The crushed material is centrifuged, and the centrifugal supernatant is used as a crude enzyme solution.
  • the activity of L-rhamnose isomerase in the crude enzyme solution before purification can be confirmed by measuring the amount of D-rhamnose isomerase produced using D-allulose as a substrate.
  • the enzyme activity for converting D-allose to D-allose, which is a reverse reaction, is also measured under the same conditions. These conversion reactions are usually carried out under the following conditions.
  • Substrate concentration is 1-60% (w / v), preferably about 5-50% (w / v)
  • reaction temperature is 30-80 ° C, preferably about 50-70 ° C
  • reaction pH is 6-11.
  • the reaction time can be appropriately selected from about 8 to 11, but in the case of a batch reaction, a range of 4 to 20 hours is usually selected.
  • the crude enzyme solution can be sequentially purified by ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography to isolate the purified enzyme.
  • SDS-PAGE gel concentration 12.5%
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention purified as described above is a metal enzyme having a subunit molecular weight of about 48 kDa by SDS-PAGE and its degree of activation regulated by metal ions.
  • the reaction with the substrate can be carried out in the presence of a metal ion selected from the group consisting of manganese, cobalt, nickel, magnesium, iron, copper, zinc and calcium at a concentration of 0.5-5 mM.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention has a predetermined amino acid sequence, and as an example, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence homologous thereto has an equivalent L. -Proteins that maintain l-rhamnose isomerase activity can be mentioned.
  • the homologous amino acid sequence is, for example, 75% or more, 78% or more, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more amino acids with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Refers to having sequence identity.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences can be determined, for example, by the following procedure. First, arrange the two arrays for optimal comparison. At this time, for example, a gap may be introduced in the first sequence to optimize the alignment with the second sequence. When the molecule at a specific position (amino acid residue or nucleotide) in the first sequence is the same as the molecule at the corresponding position in the second sequence, it can be said that the molecule at that position is the same.
  • comparison of two sequences and determination of identity can be realized using a mathematical algorithm.
  • mathematical algorithms available for sequence comparison include Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. There is an algorithm modified in USA 90: 5873-77, but it is not limited to this. Such an algorithm is described in Altschul et al. (1990) J. Mol. Mol. Biol. 215: It is incorporated into the NBLAST program and the XBLAST program (version 2.0) described in 403-10.
  • the DNA of the present invention is a gene encoding the protein and has a predetermined base sequence.
  • Examples thereof include a DNA sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a base sequence homologous to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the homologous base sequence is, for example, 75% or more, 78% or more, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more of the base sequence of SEQ ID NO: 2. Refers to having sequence identity.
  • the DNA of the present invention can also be inserted into an appropriate vector capable of autonomous replication to obtain a recombinant vector.
  • the recombinant vector is composed of DNA and a vector capable of autonomous replication, and if DNA is available, it can be relatively easily prepared by a conventional recombinant DNA technique.
  • Appropriate vectors are selected according to the purpose of use, such as cloning and protein expression, and depending on the host cell.
  • vectors examples include plasmid vectors such as pBR322, pUC18, pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 and phage vectors such as ⁇ gt ⁇ ⁇ C, ⁇ gt ⁇ ⁇ B, ⁇ 11, ⁇ 1, ⁇ 105. Be done.
  • the recombinant vector thus obtained can be introduced into an appropriate host cell such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycete, and yeast.
  • an appropriate host cell such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycete, and yeast.
  • introduction method a known method such as a calcium phosphate co-precipitation method, an electroporation method, a lipofection method, or a microinjection method is used.
  • a colony hybridization method or the like is applied to obtain transformed host cells.
  • the method for producing a protein having L-rhamnose isomerase and L-rhamnose isomerase activity of the present invention is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is a host cell transformed with a DNA encoding a microorganism capable of producing L-rhamnose isomerase of the present invention or a protein having L-rhamnose isomerase activity of the present invention.
  • a known method can be used as the culturing method, and for example, either liquid culture or solid culture can be used.
  • the enzyme and protein of the present invention are purified and recovered.
  • a method for purifying / recovering an enzyme or protein a known method can be freely selected. For example, when recovering from a culture solution, for example, the culture supernatant is filtered, centrifuged, or the like to insolubilize the culture supernatant. After removing the substance, separation and purification can be performed by appropriately combining concentration with an ultrafiltration membrane, salting out such as sulphate precipitation, dialysis, and various chromatographies such as ion exchange resins.
  • the cells are crushed by lytic enzyme treatment, ultrasonic treatment, or the like, and then separated and purified in the same manner.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention can be used by immobilizing an enzyme like other isomerases, and a highly active immobilized enzyme can be obtained by various immobilization methods.
  • an immobilized enzyme By using an immobilized enzyme, a large amount of isomerization reaction can be continuously carried out, and a known immobilization means such as a carrier binding method, a cross-linking method, a gel encapsulation method, a microencapsulation method and the like can be used. It can be an immobilized enzyme, and the carrier may be any known carrier.
  • One aspect of the method for immobilizing L-rhamnose isomerase of the present invention is immobilization using a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution containing L-rhamnose isomerase obtained by ultrasonically treating the cell suspension is added to an ion exchange resin or the like and bound at a low temperature to immobilize the L-rhamnose isomerase. be able to.
  • an ion exchange resin or the like In order to extract L-rhamnose isomerase from the cells, it is necessary to crush the cell walls of the cells, and as described above, there is a crushing method by ultrasonic treatment or enzyme treatment such as lysozyme. It was found that the crude enzyme solution obtained by ultrasonic treatment contained a large amount of active L-rhamnose isomerase.
  • any known immobilized carrier can be used, but ion exchange resins, sodium alginate, synthetic adsorbents and the like are convenient and often used.
  • the basic anion exchange resin for example, either a strong basic anion exchange resin or a weakly basic anion exchange resin can be used.
  • the strong basic anion exchange resin examples thereof include SA20A and PA418 (manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), and examples of the weakly basic anion exchange resin include WA30 (manufactured by Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), FPA54, FPA95 (manufactured by Organo Co., Ltd.) and the like.
  • the synthetic adsorbent include XAD7HP (manufactured by Organo Corporation).
  • the immobilized L-rhamnose isomerase When an immobilized enzyme is produced using a weakly basic anion exchange resin as a carrier, the immobilized L-rhamnose isomerase can be easily eluted after the reaction, and thus the regeneration of the immobilized enzyme is very high. It can be done easily and the production efficiency is good.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is obtained by culturing a host cell transformed with a DNA encoding a microorganism capable of producing L-rhamnose isomerase or a protein having L-rhamnose isomerase activity of the present invention in a nutrient medium. It can be produced by collecting a protein having L-rhamnose isomerase activity from the culture obtained in the above.
  • a known method can be used as the culturing method, and for example, either liquid culture or solid culture can be used.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is purified and recovered.
  • a known method can be freely selected. For example, when recovering from the culture solution, for example, the culture supernatant is filtered, centrifuged, or the like to obtain an insoluble matter. After removal, separation and purification can be performed by appropriately combining concentration with an ultrafiltration membrane, salting out such as sulphate precipitation, dialysis, and various chromatographies such as ion exchange resins.
  • the cells are crushed by lytic enzyme treatment, ultrasonic treatment, or the like, and then separated and purified in the same manner.
  • the purified L-rhamnose isomerase of the present invention or the immobilized enzyme is used to act on a solution containing one or more selected from possible substrates of aldose or ketose to produce the corresponding ketose or ketose. , These can be manufactured. Since the L-rhamnose isomerase of the present invention has a higher substrate specificity for D-allose than the conventional L-rhamnose isomerase, a large amount of the rare sugar D-allose is contained in the presence of D-allose which can be a substrate. Can be manufactured.
  • a mutation is introduced into the gene of L-rhamnose isomerase of the present invention, and the corresponding amino acid residue is replaced with another amino acid residue by a site-specific mutation operation to obtain a mutant having various amino acid substitutions.
  • an enzyme having high D-allulose isomerase activity at an optimum temperature and an enzyme having high heat resistance can be obtained from a wild-type enzyme without amino acid substitution.
  • the heat resistance is evaluated by four indexes that the ratio of loin isomerase activity (T80 / optimum temperature) is high.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention retains the enzyme activity even in a variant having an amino acid sequence identity of about 78%, and has an optimum temperature as compared with the wild-type enzyme of SEQ ID NO: 1.
  • the ratio of D-l-rhamnose isomerase activity (T70 / T50) at reaction temperatures of 70 ° C. and 50 ° C. is higher, the residual activity after heat retention at 60 ° C. for 1 hour is higher, or the reaction temperature is 80 ° C.
  • a variant having a higher ratio of D-allulose isomerase activity (T80 / optimum temperature) at the optimum temperature can be obtained.
  • Patent Document 8 the method for creating a phylogenetic tree described in Patent Document 8 was referred to. All the DNA sequences encoding the enzyme having an activity similar to that of L-rhamnose isomerase represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention or the putative enzyme are extracted, and the method of Patent Document 8 is used to obtain a phylogenetic tree as a common ancestral DNA. Create a phylogenetic tree that is phylogenetically derived from the DNA sequence of developmental origin.
  • amino acid sequences encoded by the obtained DNA sequences that are the same lineage as SEQ ID NO: 1 of the present invention are compared, and attention is paid to the amino acid sequences of the parts having different sequences.
  • various L-ramnorse isomerase variants are prepared by changing the amino acids and the like corresponding to the different sites of SEQ ID NO: 1 by base substitution by introducing a site-specific mutation. From among them, amino acid substitution mutants having high D-allulose isomerase activity at the optimum temperature and amino acid substitution mutants having high thermostability are selected from wild-type enzymes.
  • the amino acid substitution variants of the present invention include, as an exception, a variant in which one amino acid residue is added to the amino acid at position 418 at the C-terminal.
  • the site-specific mutagenesis method should be performed by any method such as inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "Revised 4th Edition New Genetic Engineering Handbook", Yodosha, p.82-88). Can be done. If necessary, various commercially available site-directed mutagenesis kits such as Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit and QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit can be used. Site-specific mutagenesis can most commonly be performed with mutation primers containing the nucleotide mutations to be introduced.
  • Such a mutation primer is annealed to a region containing a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be modified in a gene, and is modified in place of the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be modified. It may be designed to include a base sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding an amino acid residue.
  • amino acid substitution variant means a variant in which an amino acid in the original sequence is substituted with a different amino acid.
  • substitution there are conservative substitutions and non-conservative substitutions, and there is no particular concern about the substitutions.
  • the substitution is a conservative substitution.
  • Conservative substitutions are amino acids that have the same properties (basic, acidic, or neutral) and polarity (hydrophilic or hydrophobic), such as basic to basic, acidic to acidic, and polar to polar. , Substitution between aromatic amino acids or between aliphatic amino acids, and the like.
  • Conservative substitutions include, for example, basic amino acids (Arg, Lys, His), acidic amino acids (Glu, Asp), neutral non-polar amino acids (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met), aliphatic amino acids (Ala). , Val, Leu, Ile, Met), polar amino acids (Gln, Asn, Ser, Thr), aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr) and the like.
  • a non-conservative substitution is to exchange with an amino acid of a member outside the above group, for example, by deleting Cys or substituting with another amino acid to prevent folding into a protein in a tertiary structure.
  • the Hydropathy Index of Amino Acids J.I. Amino acids are substituted in consideration of Mol. Biol. (1982) Vol. 157, p. 105-132).
  • it may be replaced with an amino acid having less steric hindrance than the original amino acid, or a charged amino acid may be replaced with an uncharged amino acid.
  • substitutions there are conservative substitutions and non-conservative substitutions, for example, Ala to Ser or Thr substitution, Arg to Gln, His or Lys substitution, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp. Substitution to Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Asn, Gln, Lys or Asp Substitution to, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe Substitution, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution to Thr to Ser or Ala, Trp to Ph or Tyr, Tyr to His,
  • a wild-type enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 a large number of multiple mutants in which 90 amino acids are substituted are prepared from a mutant in which one amino acid is substituted, and an enzyme activity and heat resistance test are performed. As a result, 58 mutants were selected. Of these, 13 out of 58 mutants were confirmed to have higher D-allulose isomerase activity at the optimum temperature than the wild-type enzyme without amino acid substitution. In addition, 52 out of 58 mutants having a higher ratio of D-allulose isomerase activity (T70 / T50) at reaction temperatures of 70 ° C. and 50 ° C. than wild-type enzymes, and kept warm at 60 ° C. for 1 hour compared to wild-type enzymes.
  • T70 / T50 ratio of D-allulose isomerase activity
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is also excellent in that many mutants having higher heat resistance than the wild-type L-rhamnose isomerase can be obtained.
  • ⁇ Experiment 3 Preparation of crude enzyme> Bacterial cells were collected by centrifugation from the respective culture solutions of the GuaL218-3 strain and the AgM30 strain. The recovered cells were washed with 10 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9.0), and then the cells were suspended in 10 mL of Glycine-NaOH buffer (pH 9.0), and then the cells were suspended. The cells were disrupted with an ultrasonic homogenizer (Emerson Japan, Ltd.) while cooling the turbid liquid in ice water. The crushed product was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes, and the centrifugation supernatant was used as each crude enzyme.
  • an ultrasonic homogenizer Emerson Japan, Ltd.
  • Example 4 Production of D-allose by crude enzyme> Using the two crude enzyme solutions obtained, D-allulose was added as a substrate to a final concentration of 100 mM, and the enzyme reaction was carried out at 30 ° C. for 4 hours, and then the amount of D-allose produced was measured. Then, the amount of D-allose produced was compared by the area area of HPLC. Specifically, the composition of the enzyme reaction solution is 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9.0), 100 mM D-allulose, crude enzyme solution, 1 mM manganese chloride, reacted at 30 ° C. for 4 hours, and boiled for 2 minutes. After stopping the reaction, the liquid composition after the reaction was measured by HPLC.
  • the ratio of the area area of D-allose produced by HPLC analysis is shown in FIG.
  • the amount of conversion of D-allose to D-allose per amount of the same culture solution was about 23 times that of the control crude enzyme derived from the GuaL218-3 strain and that of the control crude enzyme derived from the AgM30 strain. rice field.
  • the enzyme purified by ion exchange chromatography was further purified by hydrophobic chromatography.
  • the column used was HiTrap PHENYL, which was dissolved by adding ammonium sulfate to an enzyme solution so as to have a concentration of 2M, and the concentration was reduced from 100% to 0% of 2M ammonium sulfate at a flow rate of 5 mL / min to elute and fractionate by 5 mL.
  • the fraction in which the enzyme activity was detected was dialyzed to remove ammonium sulfate to obtain a hydrophobic chromatographic separation and purification enzyme.
  • FIG. 6 shows the residual activity of this enzyme and the control enzyme after being kept warm at each temperature for 10 minutes under the reaction conditions (10 minutes) for which the optimum temperature was determined.
  • the decrease in relative activity of this enzyme at 60 ° C. was less than 20%, which was overwhelmingly less than the decrease of 80% in the control enzyme. In comparison, it was found to be a more stable enzyme at high temperatures.
  • D-allose or D-allose isomerase activity Regarding the measurement of the D-allose isomerase activity of this enzyme, the same experiment as in Experiment 6 was carried out to carry out an enzymatic reaction. Using 100 mM D-allose as a substrate, an enzymatic reaction is carried out at 60 ° C. for 60 minutes, and after the reaction, the reaction is stopped by putting the reaction solution in a boiling solution for 3 minutes, and the liquid composition after the reaction is measured by HPLC.
  • the enzyme activity of 1 unit (U) is the amount of enzyme that isomerizes D-allose to produce 1 ⁇ mol of D-allose per minute under the above conditions.
  • the reaction conditions are shown in Table 4. D-allulose isomerase activity was measured under similar conditions.
  • the enzyme activity of 1 unit (U) is the amount of enzyme that isomerizes D-allose to produce 1 ⁇ mol of D-allose per minute under the above conditions.
  • L-rhamnose The activity against L-rhamnose was the strongest, followed by L-lyxose, L-mannose, D-ribose, L-talose, and D-allose.
  • L-rhamnose, L-lyxose, L-mannose, D-ribose, and D-allose were in that order, and did not react with L-talose.
  • This enzyme is used between L-rhamnose and L-ramnose, between L-lyxose and L-xylulose, between L-mannose and L-fructoses, between D-ribose and D-ribulose, between L-talose and L-tagatose, and D.
  • ⁇ Experiment 7 Preparation of immobilized enzyme> The cells of the Erwinia billingiae GuaL218-3 strain, which had been cultured and recovered in the same manner as in Experiment 2, were used. 1. Acquisition of crude enzyme by ultrasonic treatment of bacterial cells 40 mL of 50 mM Glycine-NaOH buffer (pH 9.0) is suspended in 1 L of the culture solution, and the bacterial cell suspension is ultrasonically cooled in ice water. It was crushed with a homogenizer. The crushed product was centrifuged at 15,000 ⁇ g for 30 minutes, and the centrifugal supernatant was used as a crude enzyme solution.
  • Glycine-NaOH buffer pH 9.0
  • the enzyme activity of the immobilized enzyme was measured by measuring the amount of D-allose produced when the enzyme reaction was carried out using D-allulose as a substrate. First, a solution (500 ⁇ L) of 100 mg of an immobilized enzyme resin, Glycine-NaOH buffer (pH 9.0) (final concentration 50 mM), manganese chloride (final concentration 1 mM), and D-allulose (final concentration 100 mM) was added to the reaction solution. The composition was adjusted, and the reaction was carried out in a constant temperature water bath at 30 ° C. for 24 minutes, and then boiled at 100 ° C. for 2 minutes to immediately stop the reaction.
  • ⁇ Experiment 8-1 Determination of the entire base sequence of chromosomal DNA> Unlike existing similar enzymes, the D-allose isomerase enzyme of this bacterium could not be isolated using the PCR amplification method or the existing protein database. Therefore, the entire genome sequence of Erwinia billingiae GuaL218-3 strain was determined, and a database of proteins encoded by all ORFs in the genome was constructed. Erwinia billingiae GuaL218-3 strain cultured cells were requested to Macrogen Japan Co., Ltd. as test cells, and next-generation sequence analysis using PacBio-RSII / Sequence was requested.
  • ⁇ Experiment 8-2 Construction of protein database> Based on the obtained DNA sequence of about 5.7 Mb, 5,357 ORFs were estimated using the Prokka program, and the amino acid sequence was estimated for each ORF. The 5,357 amino acid sequences were used as a protein database of Erwinia billingiae GuaL218-3 strain.
  • a phylogenetic tree was prepared by the amino acid sequence of L-ramnorse isomerase represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention and the method described in Patent Document 8, and classified into the same strain as the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 of the present invention.
  • the amino acid sequence encoded by the DNA sequence is compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the amino acids and the like corresponding to the sites different from SEQ ID NO: 1 are changed by base substitution by site-specific mutagenesis, and various L-ramnorse isomerases are used.
  • a variant was created.
  • the amino acid substitution mutants of the present invention included a mutant in which one amino acid residue (G) was added to the amino acid at position 418 at the C-terminal.
  • a 1-amino acid substitution mutant was prepared by introducing a site-specific mutation.
  • the PCR reaction was performed.
  • the obtained PCR fragment was transformed into host Escherichia coli, and the plasmid DNA was extracted from the obtained clone to confirm that the target mutation was introduced by sequence analysis.
  • the multiple substitution mutant was prepared by repeating the above method.
  • Recombinant E. coli expressing recombinant enzymes containing site-specific mutant enzymes are 3.5% polypeptone with ampicillin added to a final concentration of 100 ⁇ g / ml, 2.0% yeast extract, 1.0% chloride.
  • Preculture was performed at 30 ° C. and 200 rpm for 12 hours in a medium containing sodium and 2 mM manganese chloride.
  • the preculture solution was inoculated into an expression medium containing ampicillin so as to have a final concentration of 100 ⁇ g / ml in a volume of 1/20, and main culture was carried out at 30 ° C. and 200 rpm for 2 hours.
  • IPTG was added so as to have a final concentration of 0.1 mM, and the expression of the recombinant enzyme was induced at 30 ° C. and 200 rpm overnight.
  • the composition of the medium for expression of recombinant Escherichia coli is shown in Table 8.
  • the enzymatic activity of the wild-type enzyme obtained by recombination and the crude enzyme of the amino acid substitution mutant is Tris-HCl buffer (pH 8.0) having a final concentration of 50 mM as a buffer using D-allulose having a final concentration of 100 mM as a substrate.
  • the reaction was carried out at each temperature for 10 minutes, and the sugar composition in the reaction solution was measured by measuring the amount of D-allose produced using HPLC.
  • the enzyme solution was heat-treated at 60 ° C. for 1 hour, and then the enzyme reaction was carried out at 60 ° C. for 10 minutes with the reaction composition shown in Table 9 to measure the residual activity. bottom.
  • the composition of the reaction solution is shown in Table 9 below.
  • the reaction optimum temperature and relative activity of each mutant were measured, and an amino acid substitution mutant having higher D-allulose isomerase activity than the wild-type enzyme at the reaction optimum temperature of each mutant was selected.
  • the wild-type enzyme is a crude enzyme produced by recombination, and the optimum temperature for D-allose production was 60 ° C., which was lower than the optimum temperature of 70 ° C. for L-ramnose of the purified enzyme, but mutation was caused. Some mutants returned to the optimum temperature by insertion. As a result, 13 mutants having a higher optimum temperature or higher D-allulose isomerase activity at the optimum temperature than the wild-type enzyme were obtained (Table 10).
  • the ratio of D-allulose isomerase activity at reaction temperatures of 70 ° C. and 50 ° C. of each variant is the same as the measurement of the optimum reaction temperature and relative activity of each variant.
  • the ratio of the residual activity after heat retention at 60 ° C. for 1 hour and the D-allulose isomerase activity at the reaction temperature of 80 ° C. and the optimum temperature (T80 / optimum temperature) was measured. Then, mutants having a higher index than wild-type enzymes were selected (Tables 11 to 13).
  • amino acid substitution sites and the like shown below are different from those shown in SEQ ID NOs: 3 to 60 in the sequence listing, the amino acid sequence shown in the sequence listing is the correct sequence.
  • the number in parentheses at the end of each sequence indicates the number of amino acid substitutions.
  • amino acid substitution mutants of sequences 3 to 60 have specific amino acid substitutions at the following 122 sites.
  • amino acid substitution mutants of sequences 3 to 60 are subjected to amino acid substitution and addition of one amino acid residue at the following 122 sites.
  • the largest number of amino acid substitutions in sequences 3 to 60 is 90 in sequence 33, and the amino acid sequence identity of the wild-type enzyme in sequence 1 is 78%.
  • the one having the largest number of amino acid substitutions is 84 of Sequence 32.
  • the number is 80%, and the identity of the sequence 1 with the amino acid sequence is 80%.
  • Table 11 shows the numbers of 52 sequences having a higher ratio of D-allulose isomerase activity (T70 / T50) at reaction temperatures of 70 ° C. and 50 ° C. than the wild-type enzyme of sequence 1.
  • Table 12 shows the numbers of 17 sequences having higher residual activity after being kept warm at 60 ° C. for 1 hour than the wild-type enzyme of sequence 1.
  • Table 13 shows the numbers of 56 sequences having a higher ratio of D-allulose isomerase activity (T80 / optimum temperature) at a reaction temperature of 80 ° C. and an optimum temperature than the wild-type enzyme of sequence 1.
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention is characterized by having particularly high heat resistance and high activity as compared with the conventional L-rhamnose isomerase derived from a microorganism.
  • the conventional L-rhamnose isomerase derived from Pseudomonas stutzeri has an optimum temperature of 60 ° C.
  • the enzyme of the present invention has a high temperature of 70 ° C. and is heat-treated at 60 ° C. for 10 minutes. Since the residual activity of Pseudomonas stella has a thermal stability of 80% or more, it is suitable for use in industrial production.
  • the substrate when the substrate is D-allose, it has a high conversion activity to D-allose of 2.26 U per mg protein at 60 ° C., and the present invention opens the way for mass production of D-allose. ..
  • the L-rhamnose isomerase of the present invention can obtain a highly active immobilized enzyme by various immobilization methods, and by using the immobilized enzyme, it is possible to carry out a continuous and large amount of isomerization reaction. Is. By being able to be fixed industrially, the target aldose can be mass-produced.
  • many amino acid-substituted variants of L-rhamnose isomerase of the present invention include those having higher enzyme activity or heat resistance than the present enzyme before mutation. Therefore, the establishment of the L-rhamnose isomerase and its variants of the present invention and the method for producing the same is extremely significant not only in the sugar manufacturing industry but also in the food, cosmetics, pharmaceuticals, and agrochemical industries related thereto.

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Abstract

エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に属する微生物から得ることができ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定したサブユニットの分子質量が約４８ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するＬ－ラムノースイソメラーゼ。 （Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。 （Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。

Description

新規Ｌ－ラムノースイソメラーゼ
　本発明は、新規なＬ－ラムノースイソメラーゼとその製造方法、これを生産する微生物、該酵素をコードするＤＮＡとこれを含む組換えベクターと形質転換宿主細胞、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ変異体、およびＬ－ラムノースイソメラーゼまたは変異体によるケトースまたはアルドースの製造方法に関する。
　希少糖とは、国際希少糖学会の定義によれば、「自然界に希にしか存在しない糖」であり、すなわち、自然界における存在量が少ない単糖である。
　炭素数が４つの単糖（テトロース）は、アルドース４種類、ケトース２種類および糖アルコール３種類ある。炭素数が５つの単糖（ペントース）は、アルドース８種類、ケトース４種類および糖アルコール４種類ある。炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。炭素数が７つの単糖（ヘプトース）の種類は、炭素数７のアルドヘプトース、ケトヘプトース、ヘプチトールはそれぞれ３２，１６，１６種類存在する。
　例えば、六炭糖（ヘキソース）には、一般に、自然界に多量に存在するアルドースは、Ｄ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノースの６種類であり、それ以外のＤ－アロースなどのアルドースは希少糖と定義される。すなわち、アルドースのうち希少糖とされるものとしては、Ｌ－アロース、Ｌ－グロース、Ｌ－グルコース、Ｌ－ガラクトース、Ｌ－アルトロース、Ｌ－イドース、Ｌ－マンノース、Ｌ－タロース、Ｄ－タロース、Ｄ－イドース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グロース、Ｄ－アロースが挙げられる。ケトースとしては、Ｄ－フラクトースは自然界に多量に存在するのに対し、他のケトースは、自然界に多量に存在しないので、希少糖といえる。ケトースのうち希少糖とされるものとしては、Ｄ－アルロース（別名Ｄ－プシコース）、Ｄ－タガトース、Ｄ－ソルボース、Ｌ－フラクトース、Ｌ－アルロース（別名Ｌ－プシコース）、Ｌ－タガトース、Ｌ－ソルボースが挙げられる。
　昨今、すべての希少糖生産の根幹原料となるＤ－アルロース（別名Ｄ－プシコース）の大量生産技術が確立し、入手困難であった希少糖の生産が可能となった。さらに酵素反応によって、Ｄ－アルロースはＤ－アロースなどへの新たな希少糖生産の中心となると考えられる。
　Ｄ－アロースは、Ｄ－グルコースと３位の炭素のＯＨ基方向のみ異なる異性体であるアルドースであって、ケトースであるＤ－アルロースの異性体としても知られる希少糖単糖類である。Ｄ－アロースは、それを有効成分とする、急性腎不全および尿毒症から選択される腎疾患を治療するための医薬組成物（特許文献１）、筋萎縮性側索硬化症に起因する運動障害の発症または進行を遅延するための医薬品（特許文献２）、血圧上昇抑制剤（特許文献３）、血管新生の抑制に用いることを特徴とする剤（特許文献４）、Ｔリンパ球増殖抑制剤（特許文献５）、または腹膜透析液に配合して使用される腹膜劣化抑制剤（特許文献６）が知られており、また、食することのできる農薬（特許文献７）としても知られている。最近では、腎細胞癌細胞に取り込まれての抗腫瘍効果（特願２０１９－５２１９５号）、ヒト尿路上皮癌細胞に対する強い抗腫瘍効果（特願２０１９－５８４７７号）に関する発明が出願されている。このような特徴から、Ｄ－アロースは医薬、農薬分野で次世代の核心的な素材として注目を浴びており、Ｄ－アルロースの次はＤ－アロースの大量生産技術の確立が求められている。
　微生物が生産する酵素を用いてＤ－アロースを生産する方法として、本発明者らはシュードモナス　スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ）から単離されたＬ－ラムノースイソメラーゼ（Ｌ－ｒｈａｍｎｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を用いてアルロースからアロースを生産する技術を開発した（非特許文献１）。Ｌ－ラムノースイソメラーゼはＬ－ラムノース－Ｌ－ラムニュロース間の可逆的な異性化反応を触媒する酵素であるが、Ｐ.ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来Ｌ－ラムノースイソメラーゼは、Ｌ－ラムノース－Ｌ－ラムニュロース間だけでなく、Ｌ－リキソース－Ｌ－キシルロース間、Ｌ－マンノース－Ｌ－フラクトース間、Ｄ－グロース－Ｄ－ソルボース間、Ｄ－リボース－Ｄ－リブロース間、Ｄ－アロース－Ｄ－アルロース間，Ｌ－タロース－Ｌ－タガトース間にも作用できる幅広い基質特異性が明らかとなった。この広い基質特異性を利用し、Ｄ－アルロースからＤ－アロースへの変換を中心に、イズモリング上のさまざまな希少アルドースおよびケトースの生産が可能となった。
特許第５３３０９７６号公報 特許第５３１７０５５号公報 特許第５１５８７７９号公報 特許第４９４３８３９号公報 特許第４７２４８２４号公報 特開２００９－２６９８８７号公報 特許第５８１６８７１号公報 米国特許第１０，４８０，０１８号明細書
Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉоｅｎｇ．(１９９７)　Ｖｏｌ．８４,ｐ．３１９
　今日、ほとんどの希少糖生産が可能になってきたことに伴い、希少糖生産にも新しい課題が次々と生まれてきた。例えば、生理活性が明らかになった希少糖Ｄ－アロースの実験室レベルの大量生産から産業化へつながる市場規模の大量生産へのシフトが本発明者らの新しい課題となった。すなわち、希少糖生産における効率のよい大量生産を可能にするためには、まず、より高い熱耐性活性と広範囲の至適ｐＨを持つ酵素を選抜することが必須であると考えた。
　上記のとおり従来の技術では、純粋な希少糖Ｄ－アルロースを原料として、公知のＬ－ラムノースイソメラーゼ（ＥＣ ５.３.１.１４）を用いて希少糖Ｄ－アロースを生産している。Ｌ－ラムノースイソメラーゼは、Ｌ－ラムノースから Ｌ－ラムニュロースへの異性化反応を触媒する酵素であり、Ｌ－ラムニュロースからＬ－-ラムノースへの異性化も触媒できる。Ｄ－アロ－スとＤ－アルロース間の異性化にも作用することが既知である。異性化酵素は最も高い活性を示す基質を元に命名されるため、Ｌ－ラムノースイソメラーゼと命名された酵素の中でも、その基質特異性は様々である。
また、該公知の酵素にはＤ－アロース生成時に、アルドースであるＤ－アルトロース（Ｄ－ａｌｔｒｏｓｅ）も副産物として生成させるものがあり、副産物であるＤ－アルトロースの存在は、Ｄ－アロース精製工程におけるＤ－アロースの収率低下の原因となっていた。そこで、大量生産による希少糖Ｄ－アロースの純度も課題の一つとなった。
　本発明は、食品を製造する際に使用が認められ毒性がないとされる微生物由来であり、かつ活性が高く、高収率でＤ－アルロースからＤ－アロースへ異性化できる新規なＬ－ラムノースイソメラーゼの提供、該酵素を有する微生物の提供、および、その酵素を用いる製造方法を提供することをその課題とする。
　本発明者らは、日本だけでなくヨーロッパおよびアメリカにおいても、食品として使用が認められているリストに載っている毒性がほとんどないとされる菌種に着目して、各地の土壌を採取し、そこから微生物を分離し、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ活性を有する微生物の探索を続けた。
　その結果、数多く単離した菌株の中に新規なＬ－ラムノースイソメラーゼを産生するエルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属する微生物を見出した。このエルビニア属微生物であるエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)は、活性が高くかつ高耐熱性の新規なＬ－ラムノースイソメラーゼを産生する。
　この微生物由来の新規なＬ－ラムノースイソメラーゼは、アルドースと対応するケトース間の異性化反応を触媒し、アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換する、アルドース－ケトース間のイソメラーゼ活性を有する。また、Ｄ－アルロースを基質としてＤ－アロースを製造する際に、副生成物であるＤ－アルトロースを生成しないことから、Ｄ－アロースの製造に適している。
　すなわち、本発明は、下記（１）ないし（４）に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ、および下記（５）に記載の微生物に関する。
（１）エルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属する微生物由来のＬ－ラムノースイソメラーゼであって、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定したサブユニットの分子質量が４８ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するＬ－ラムノースイソメラーゼ。
　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
（２）下記（Ｃ）および（Ｄ）の理化学的性質を有する、上記（１）に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
　（Ｃ）反応至適ｐＨは９である。
　（Ｄ）反応至適温度は７０℃である。
（３）エルビニア属に属する微生物がエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)である、上記（１）または（２）に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
（４）エルビニア属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として国際寄託されているエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
　また、本発明は、下記（５）ないし（７）に記載のタンパク質、下記（８）ないし（１１）に記載のＤＮＡ、組換えベクター、または形質転換宿主細胞、若しくは下記（１２）に記載の微生物に関する。
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体であるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列のＫ３、Ｌ４、Ｉ５、Ｙ９、Ｅ１０、Ｌ１１、Ｙ１６、Ｄ１８、Ｖ１９、Ｉ２１、Ｖ２３、Ｑ２５、Ｖ２６、Ｍ２７、Ｔ２８、Ｇ３２、I３３、Ｒ４６、Ｎ５２、Ｅ５４、Ｒ６８、Ｈ７３、Ａ７７、Ｉ７９、Ｅ８０、Ｋ８１、Ｍ８３、Ａ８９、Ｄ１０２、Ｔ１０３、Ｅ１０６、Ｄ１０８、Ａ１０９、Ｅ１１１、Ｑ１１３、Ｓ１１６、Ｈ１１７、Ｑ１２４、Ｈ１２５、Ｋ１２６、Ｓ１３４、Ｓ１４８、Ｄ１５１、Ｋ１５２、Ｇ１５３、Ｃ１６２、Ｉ１６８、Ｈ１７１、Ｐ１７９、Ｖ１８６、Ｌ１９３、Ｉ１９５、Ｌ１９８、Ａ１９９、Ｅ２０２、Ａ２０５、Ｓ２０６、Ｖ２１１、Ｆ２１６、Ｄ２１７、Ａ２１８、Ｓ２１９、Ｃ２４５、Ｌ２４６、Ａ２５０、Ｔ２５７、Ｔ２７５、Ｖ２８０、Ｌ３００、Ｔ３１０、Ａ３１３、Ｎ３１５、Ｋ３１６、Ｎ３１９、Ｋ３２０、Ａ３４５、Ｓ３５７、Ｄ３５８、Ｑ３５９、Ｒ３６１、Ｋ３６２、Ｌ３６５、Ｅ３６６、Ａ３７１、Ｌ３７５、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｗ３９１、Ｌ３９３、Ｈ３９５、Ｖ３９７、Ｄ４００、Ａ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０５、Ｅ４０６、Ｈ４０９、Ｑ４１２、Ｑ４１３、Ｔ４１４、Ｒ４１６、Ｌ４１７、４１９から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、至適温度におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性が高いタンパク質。
　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体であるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と７８％以上の同一性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列のＫ３、Ｌ４、Ｉ５、Ｙ９、Ｅ１０、Ｌ１１、Ｙ１６、Ｄ１８、Ｖ１９、Ｉ２１、Ｖ２３、Ｅ２４、Ｑ２５、Ｖ２６、Ｍ２７、Ｔ２８、Ｇ３２、I３３、Ｒ４６、Ｎ５２、Ｅ５４、Ｒ６８、Ｈ７３、Ａ７７、Ｉ７９、Ｅ８０、Ｋ８１、Ａ８２、Ｍ８３、Ｓ８４、Ａ８９、Ｋ９０、Ｉ９７、Ｄ１０２、Ｔ１０３、Ｅ１０６、Ｄ１０８、Ａ１０９、Ｅ１１１、Ｑ１１３、Ｓ１１６、Ｈ１１７、Ｅ１２０、Ｑ１２４、Ｈ１２５、Ｋ１２６、Ｓ１３４、Ｐ１３９、Ｌ１４０、Ｓ１４８、Ａ１５０、Ｄ１５１、Ｋ１５２、Ｇ１５３、Ｉ１５４、Ｃ１６２、Ｒ１６７、Ｉ１６８、Ｈ１７１、Ｐ１７９、Ｖ１８６、Ｌ１９３、Ｉ１９５、Ｌ１９８、Ａ１９９、Ｅ２０２、Ａ２０５、Ｓ２０６、Ｅ２１０、Ｖ２１１、Ｋ２１５、Ｆ２１６、Ｄ２１７、Ａ２１８、Ｓ２１９、Ｃ２４５、Ｌ２４６、Ａ２５０、Ｔ２５４、Ｔ２５７、Ｔ２７５、Ｖ２８０、Ｒ２８２、Ｌ３００、Ｔ３１０、Ａ３１３、Ｎ３１５、Ｋ３１６、Ｎ３１９、Ｋ３２０、Ａ３４５、Ｓ３５７、Ｄ３５８、Ｑ３５９、Ｒ３６１、Ｋ３６２、Ｌ３６３、Ｌ３６５、Ｅ３６６、Ｙ３６９、Ａ３７１、Ａ３７４、Ｌ３７５、Ｓ３８１、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｗ３９１、Ｌ３９３、Ｈ３９５、Ｖ３９７、Ｄ４００、Ａ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０５、Ｅ４０６、Ｈ４０９、Ｑ４１２、Ｑ４１３、Ｔ４１４、Ｒ４１６、Ｌ４１７、４１９から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度７０℃と５０℃におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高いか、６０℃で１時間保温後の残存活性が高いか、または反応温度８０℃と至適温度におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）が高いタンパク質。
　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
（８）上記（５）ないし（７）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（９）配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（１０）上記（８）または（９）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１１）上記（１０）に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
（１２）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として国際寄託されているエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３。
　また、本発明は、下記（１３）ないし（１６）に記載の固定化タンパク質に関する。
（１３）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ、または上記（５）ないし（７）のいずれかに記載のタンパク質が担体に固定化されている、固定化タンパク質。
（１４）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼが菌体破砕物中に存在する粗酵素の状態で、または上記（５）ないし（７）のいずれかに記載のタンパク質が形質転換宿主細胞の、菌体破砕物中に存在する粗タンパク質の状態で担体に固定化されている、固定化タンパク質。
（１５）前記担体が、イオン交換樹脂または合成吸着剤である上記（１３）または（１４）に記載の固定化タンパク質。
（１６）前記担体が、ＷＡ３０、ＦＰＡ５４、またはＦＰＡ９５である上記（１５）に記載の固定化タンパク質。
　また、本発明は、下記（１７）ないし（１９）に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼの製造方法、またはケトースまたはアルドースの製造方法に関する。
（１７）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼを生産するエルビニア属微生物、または上記（１１）に記載の形質転換宿主細胞を培地中で培養し、微生物菌体中に当該Ｌ－ラムノースイソメラーゼを蓄積させ、これを採取するＬ－ラムノースイソメラーゼの製造方法。（１８）前記培地がＬ－ラムノースを添加した無機塩培地である、上記（１７）に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼの製造方法。
（１９）アルドースまたはケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ、上記（５）ないし（７）のいずれかに記載のタンパク質、または上記（１３）ないし（１６）のいずれかに記載の固定化タンパク質を作用させて、対応するケトースまたはアルドースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースまたはアルドースの製造方法。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、微生物由来の従来のＬ－ラムノースイソメラーゼと比べて、特に高い耐熱性を有し、かつ高活性であることが特徴である。たとえば、従来のシュードモナス　スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＬ－ラムノースイソメラーゼは至適温度が６０℃であるのに対して、本発明の酵素は７０℃と高く、しかも６０℃で１０分間加熱処理した後の残存活性も８０％以上という熱安定性を有するので、工業的生産での使用に適している。この酵素のもつ優れた耐熱性は、この酵素のアミノ酸置換変異体の作成により、さらに高めることができるという特性がある。
　また、基質が１００ｍＭのＤ－アルロースである場合に、６０℃で単位タンパク当たり２．２６Ｕの高いＤ－アロースへの転換活性を有し、本発明によりＤ－アロースの大量生産が可能になる。特に、基質がＤ－アルロースである場合、本発明の酵素はＤ－アロースのみに変換し、副生成物であるＤ－アルトロースを生成しないので、収率がその分高くなる。
本粗酵素（ＧｕａＬ２１８－３株由来）と対照粗酵素（ＡｇＭ３０株由来）のＤ－アロースの生成量の比較を示す図である。 本酵素の分子質量を確認するためのＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。図中、左の数字の単位はｋＤａ。 本酵素と対照酵素の至適ｐＨを示す図である。 本酵素と対照酵素の２４時間後におけるｐＨ安定性を示す図である。 本酵素と対照酵素の至適温度を示す図である。 本酵素と対照酵素の１０分保温における温度安定性を示す図である。 本酵素と対照酵素の基質特異性を示す図である。 本酵素と対照酵素への金属イオンの影響を示す図である。 固定化担体による本酵素の固定化酵素の活性発現率の相対値を示す。 大腸菌で発現させた組換酵素のＳＤＳ‐ＰＡＧＥの結果を示す。 組換酵素によるＤ－アルロースからＤ－アロースへの転換反応を行った反応液のＨＰＬＣの分析結果を示す。
　本発明は、エルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属する微生物から単離することができるＬ－ラムノースイソメラーゼに関するものであり、高い活性、耐熱性において特徴的な性質を有する。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換してケトースにするか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換してアルドースにするイソメラーゼ活性を有する。
　本発明でいうケトースとは、ケトース構造を有する六炭糖のケトヘキソースまたは五炭糖のケトペントースを意味する。ケトヘキソースには、アルロース（別名プシコース）、ソルボース、タガトース、フラクトースが、ケトペントースには、リブロース、キシルロースが含まれる。
　本発明でいうアルドースとは、アルドース構造を有する六炭糖のアルドヘキソースまたは五炭糖のアルドペントースを意味する。アルドヘキソースには、グルコース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、ガラクトース、マンノースが、アルドペントースには、リボース、アラビノース、キシロース、リキソースが含まれる。Ｄ－またはＬ－とは、これらのＤ－体およびＬ－体を意味する。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、Ｌ－ラムノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｌ－タロース、およびＤ－アロースに作用し、Ｌ－ラムノース－Ｌ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソース－Ｌ－キシロース間、Ｌ－マンノース－Ｌ－フラクトース間、Ｄ－リボース－Ｄ－リブロース間、Ｌ－タロース－Ｌ－タガトース間、およびＤ－アロース－Ｄ－アルロース間の変換を触媒できる、幅広い基質特異性を有する。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、エルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属し、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生育した菌体中からＬ－ラムノースイソメラーゼを単離することにより調製することができる。エルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属する微生物としては、例えば、エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８－３およびこれらの変異株などが有利に利用できる。この出願をするに際し、ＧｕａＬ２１８－３株は、２０２０年２月２８日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託し、受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０３１４２として受領され、その後ＧｕａＬ２１８－３株は、２０２０年２月２８日付で受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として正式にブダペスト条約に基づき国際寄託された。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、エルビニア属の、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ生産菌を、Ｌ－ラムノースを添加した無機塩培地で通気培養した後、遠心分離により菌体を培養液から回収する。回収した菌体を、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)を用いて洗浄した後、１０ｍLの１０ｍＭトリス－ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．５)中に懸濁させ、溶菌酵素であるリゾチームを添加して酵素処理により細胞を破砕するか、または、菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細胞破砕する。それらの破砕物を遠心分離して、その遠心上清を粗酵素液とする。
　精製前の粗酵素液のＬ－ラムノースイソメラーゼの活性は、Ｄ－アルロースを基質とし、Ｄ－アロ－スの生成量を測定することにより確認することができる。
　逆反応であるＤ－アロースからＤ－アルロースへ変換する酵素活性についても同様の条件で測定する。これらの変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１～６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、約５～５０％（ｗ／ｖ）、反応温度は３０～８０℃、望ましくは、約５０～７０℃、反応ｐＨは６～１１、望ましくは、約８～１１、反応時間は適宜選択できるが、バッチ反応の場合には、通常４～２０時間の範囲が選ばれる。
　粗酵素液は、順次イオン交換クロマトグラフィーと疎水クロマトグラフィーにより精製して、精製酵素を単離することができる。酵素が精製されたことを確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２．５％）にかけて、単一なバンドが得られることと見掛けの分子質量を確認する。
　上記のように精製された本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるサブユニット分子質量が約４８ｋＤａであり、その活性化度が金属イオンによって調節される金属酵素である。基質との反応は、マンガン、コバルト、ニッケル、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛、およびカルシウムからなる群より選択された金属イオンの濃度０．５～５ｍＭでの存在下で行われうる。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、所定のアミノ酸配列を有しており、その例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれと相同なアミノ酸配列を有し、同等なＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を維持するタンパク質が挙げられる。相同なアミノ酸配列とは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と７５％以上、７８％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有することを指す。
　二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列（塩基配列）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して、第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。
　また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。
　本発明のＤＮＡは、前記タンパク質をコードする遺伝子であり、所定の塩基配列を有する。その例としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、配列番号２で表される塩基配列、または配列番号２で表される塩基配列と相同な塩基配列を有し、かつ、配列番号１のタンパク質と同等なＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を維持するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。相同な塩基配列とは、例えば、配列番号２の塩基配列と７５％以上、７８％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の塩基配列の同一性を有することを指す。
　本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えベクターとすることもできる。組換えベクターは、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。クローニングやタンパク質の発現という使用目的に応じて、また宿主細胞に応じて、適切なベクターが選択される。このようなベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。
　このようにして得られる組換えベクターを、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主細胞に導入することができる。導入方法は、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法を用いる。形質転換された宿主細胞を取得するために、コロニーハイブリダイゼーション法等を適用する。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼ、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。具体的には、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼ生産能を有する微生物、または本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を、栄養培地で培養して得られる培養物から、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することで製造することができる。培養方法には公知の手法を用いることができ、例えば液体培養及び固体培養の何れも用いることができる。
　このようにして、菌体を培養した後、本発明の酵素、タンパク質を精製・回収する。酵素、タンパク質の精製・回収方法は、公知の方法を自由に選択して行うことができ、例えば、培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することにより、不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことができる。また、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を溶解酵素処理、超音波処理などによって破砕した後、同様に分離、精製を行う。
　また、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、他のイソメラーゼと同様に、酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的に大量の異性化反応を行うことが可能となり、公知の固定化手段、例えば、担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素とすることができ、また、担体は公知の任意の担体であってよい。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼを固定化する方法の一態様は、粗酵素液を用いる固定化である。菌体懸濁液を超音波処理することで得られた、Ｌ－ラムノースイソメラーゼを含む粗酵素液をイオン交換樹脂等に添加し、低温下で結合させることにより、Ｌ－ラムノースイソメラーゼを固定化することができる。
　菌体内から、Ｌ－ラムノースイソメラーゼを取り出すためには、菌体細胞壁を破砕する必要があり、超音波処理あるいはリゾチームなどの酵素処理による破砕方法があるのは、上述のとおりである。超音波処理により得られる粗酵素液中に、活性を有するＬ－ラムノースイソメラーゼが多く含まれることがわかった。粗酵素液から酵素を固定化する担体としても、固定化担体として公知の任意のものを用いることができるが、イオン交換樹脂、アルギン酸ナトリウム、合成吸着剤等が便利でよく用いられる。
　イオン交換樹脂のうち、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＳＡ２０Ａ、ＰＡ４１８（三菱ケミカル社製）等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５（オルガノ社製）等が挙げられる。合成吸着剤としてはＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社製）等が挙げられる。
　弱塩基性陰イオン交換樹脂を担体に用いて固定化酵素を製造した場合、固定化した、Ｌ－ラムノースイソメラーゼは、その反応後容易に溶離させることができることから、固定化酵素の再生を非常に簡便に行うことができ、生産効率が良い。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、本発明の、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ生産能を有する微生物、または、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された宿主細胞を、栄養培地で培養して得られる培養物から、Ｌ－ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することで製造できる。培養方法には公知の手法を用いることができ、例えば液体培養及び固体培養の何れも用いることができる。
　菌体を培地で培養した後、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼを精製・回収する。タンパク質の精製・回収方法は、公知の方法を自由に選択して行うことができ、例えば、培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することにより、不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことができる。また、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を溶解酵素処理、超音波処理などによって破砕した後、同様に分離、精製を行う。
　本発明の精製されたＬ－ラムノースイソメラーゼまたは固定化された該酵素を用いて、基質となり得るアルドースまたはケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に作用させて、対応するケトースまたはアルドースを生成せしめ、これらを製造することができる。本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、Ｄ－アルロースに対する基質特異性が従来のＬ－ラムノースイソメラーゼに比べて高いので、基質となり得るＤ－アルロースの存在下で、希少糖であるＤ－アロースを大量に製造することができる。
　また、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼの遺伝子に突然変異を導入して、対応するアミノ酸残基を部位特異的変異操作により他のアミノ酸残基に置換して、様々なアミノ酸置換を有する変異体を調製することにより、アミノ酸置換していない野生型酵素より、至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高い酵素や耐熱性の高い酵素を得ることができる。至適温度、反応温度７０℃と５０℃におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、６０℃で１時間保温後の残存活性、または反応温度８０℃と至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）が高いという４つの指標で耐熱性を評価する。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼはアミノ酸配列の同一性が７８％程度の変異体であっても、酵素活性を保持しつつ、かつ、配列番号１の野生型酵素と比較して、至適温度が上がるか、反応温度７０℃と５０℃におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）がより高いか、６０℃で１時間保温後の残存活性がより高いか、または反応温度８０℃と至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）がより高い変異体を得ることができる。
　アミノ酸置換変異体の設計に関しては、特許文献８に記載の系統樹を作成する方法を参考にした。
　本発明の配列番号１で表されるＬ－ラムノースイソメラーゼと類似する活性を有する酵素あるいは推定酵素をコードするＤＮＡ配列を全て抽出し、特許文献８の方法を用いて、共通の祖先ＤＮＡとしての系統発生起源のＤＮＡ配列から系統発生的に派生する系統樹を作製する。そして、系統樹において本発明の配列番号１と同じ系統となる得られたＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を比較して、配列が相違する部分のアミノ酸配列に着目し、アミノ酸残基が異なる部位は酵素活性への関与が小さいと予想して、配列番号１のその相違する部位に対応するアミノ酸等を、部位特異的変異導入による塩基置換により変化させて各種Ｌ－ラムノースイソメラーゼ変異体を作製する。その中から、野生型酵素より、至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高いアミノ酸置換変異体や耐熱性の高いアミノ酸置換変異体を選択する。
　また、本発明のアミノ酸置換変異体には例外的に、Ｃ末端の４１８位のアミノ酸に、１アミノ酸残基を付加した変異体が包含されている。
　部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、p.82-88）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてStratagene社のQuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kitや、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
　部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、遺伝子内の改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその改変対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて改変後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。
　アミノ酸置換変異体とは、元の配列のアミノ酸に対して異なるアミノ酸に置換されている変異体を意味し、置換については、保存的置換もあれば非保存的置換もあり、特にこだわることもないが、発明の好ましい態様において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、塩基性を塩基性に、酸性を酸性に、極性を極性のように、同じ性質（塩基性、酸性、または中性）、極性（親水性または疎水性）を有するアミノ酸同士や、芳香族アミノ酸同士または脂肪族アミノ酸同士の置換などが該当する。
　保存的置換は、例えば、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、中性非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）等のグループ内により行われる。
　一方、非保存的置換とは、上記グループ外のメンバーのアミノ酸と交換することであり、例えば、３次構造でタンパク質中に折り畳まれることを防ぐためにＣｙｓを欠失させるか、他のアミノ酸に置換する。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）Ｖｏｌ．１５７，ｐ．１０５－１３２）を考慮して、アミノ酸を置換する。
　また、元のアミノ酸よりも立体障害の少ないアミノ酸への置換、電荷を持つアミノ酸から電荷を持たないアミノ酸へ置換することもある。
　置換については、保存的置換もあれば非保存的置換もあり、例えば、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＡｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、および、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸残基の置換については置換可能な残基の分類は例示であり、置換可能なアミノ酸残基はこの分類に限定されるものではない。
　配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型酵素において、１か所のアミノ酸を置換した変異体から９０か所のアミノ酸を置換した多数の多重変異体を作製して、酵素活性および耐熱性試験を行うことにより、５８個の変異体を選択した。このうち、アミノ酸置換していない野生型酵素より、至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高い変異体が、５８種中１３種確認された。
　また、野生型酵素より、反応温度７０℃と５０℃におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高い変異体は、５８種中５２種、野生型酵素より６０℃で１時間保温後の残存活性が高い変異体が、５８種中１７種、野生型酵素より反応温度８０℃と至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）が高い変異体が、５８種中５６種確認された。
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、耐熱性が野生型Ｌ－ラムノースイソメラーゼよりも高い変異体が数多く得られる点でも優れている。
　以下、実験により本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
＜実験１：菌株の由来および同定＞
　本発明者等はスクリーニングにより単離した数多くの菌を、Ｌ－ラムノースを添加した液体培地に植菌して振とう培養を行い、Ｌ－ラムノースを基質としてＬ－ラムニュロースの生成量を測定することにより、Ｌ－ラムノースイソメラーゼの活性を測定した。
　このようにして、最も活性の高い菌株として微生物ＧｕａＬ２１８－３株を見出し、ＧｕａＬ２１８－３株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、エルビニアに属することが判明した。
　菌株の同定
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
　１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１-５００ｂｐ領域を解析し、塩基数５００ｂｐを特定した。
（２）相同性検索
　この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により基準菌株とされている既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数５００ｂｐの塩基配列に対し、相同性９８％以上であった菌株名と相同性（％）の値から、ＧｕａＬ２１８－３株の微生物は、エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)であることが決定された。
　このＧｕａＬ２１８－３株は、２０２０年２月２８日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として国際寄託された。
＜実験２：エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２）株の培養＞
　Ｌ－ラムノース１．０％を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩液体培地に、エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２）株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で２４時間培養した。
　本発明の菌株と比較のための対照菌株として、アルスロバクター　グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株（以下、「ＡｇＭ３０株」という。）を、ＧｕａＬ２１８－３株と同様の培地および培養条件で培養した。
＜実験３：粗酵素の調製＞
　ＧｕａＬ２１８－３株とＡｇＭ３０株のそれぞれの培養液から、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体は、それぞれ１０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液(ｐＨ９．０)を用いて洗浄し、次いで、菌体を１０ｍLのＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液(ｐＨ９．０)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(日本エマソン株式会社)で細胞破砕した。破砕物を１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、その遠心上清をそれぞれの粗酵素とした。
＜実験４：粗酵素によるＤ－アロースの生産＞
　得られた２つの粗酵素液を用いて、それぞれ基質として終濃度１００ｍＭになるようにＤ－アルロースを添加して、３０℃で４時間酵素反応を行った後、Ｄ－アロースの生成量を測定し、Ｄ－アロースの生成量をＨＰＬＣのエリア面積により比較した。具体的には、酵素反応液組成は、５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液(ｐＨ９．０)、１００ｍＭ　Ｄ－アルロース、粗酵素液、１ｍＭ塩化マンガンを用い、３０℃４時間反応させ、２分間ボイルすることで反応を止めてから、ＨＰＬＣにかけて反応後の液組成を測定した。ＨＰＬＣ分析による生成されたＤ－アロースのエリア面積の比を図１に示す。
　同培養液量当たりの粗酵素を用いた際のＤ－アルロースからＤ－アロースへの変換量は、ＧｕａＬ２１８－３株由来の本粗酵素が、ＡｇＭ３０株由来の対照粗酵素の約２３倍であった。
＜実験５：酵素の精製＞
１．イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーによる精製
　２つの粗酵素液をイオンクロマトグラフィーによる精製を行った。用いたカラムは緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ　ＨＰであり、ＡＫＴＡシステムを用い流速５ｍL／ｍｉｎで１Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配で０％から１００％を５ｍLずつのフラクションに分けて分画した。酵素活性が検出されたフラクションを回収してイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。
２．イオン交換クロマト分離により精製した酵素をさらに疎水クロマトグラフィーにより精製した。用いたカラムはＨｉＴｒａｐ　ＰＨＥＮＹＬであり、酵素液に２Ｍとなるように硫安を加えて溶解し、流速５ｍＬ／ｍｉｎで２Ｍの硫安１００％から０％まで濃度を下げて溶出し５ｍＬずつ分画した。酵素活性が検出された画分を透析し硫安を除去して、疎水クロマト分離精製酵素を得た。
３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動
　常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度１２．５％）を行い、精製酵素の純度を確認した。図２では、左が標準の蛋白質であり、中央と右のレーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は約４８ｋＤａに単一なバンドが認められ、これにより酵素は純粋に精製されたことが確認され、精製した本酵素は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニット分子質量が約４８ｋＤａであることが判明した。
＜実験６：酵素の理化学的性質の測定＞
　精製酵素であるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性の測定については、下記の実験を行って酵素反応を行った。基質として５ｍＭ　Ｌ－ラムノースを用い、１０分間の酵素反応を各条件下で行い、反応後、反応液に１０％トリクロロ酢酸溶液を５０μL加えることで反応を停止し、システインカルバゾール硫酸法により生成したＬ－ラムニュロースを測定した。
１．反応至適ｐＨ
　測定にあたり、反応の至適ｐＨについて５ｍＭ　Ｌ－ラムノースを基質として用い、各種緩衝液ｐＨ３～１１を用いて３０℃で１０分間反応し、生成したＬ－ラムニュロースを、システインカルバゾール硫酸法を用いて測定することで求めた。
　反応条件を表１に示す。使用したバッファーを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　結果を図３に示す。本酵素の反応至適ｐＨは９であるのに対して、対照酵素の反応至適ｐＨは１０とアルカリ側にあり、本酵素の反応至適ｐＨはより広範囲であり、かつ、より酸性下で高い活性を示す。
２．ｐＨ安定性
　次に、表２のｐＨ４～１１の４つの緩衝液を用いて、各緩衝液中で、３０℃で２４時間保持した後の残存活性を図４に示す。
　本酵素も対照酵素もｐＨ６～１１において安定であるが、対照酵素のｐＨ安定性がｐＨ６で最も高いのに対して、本酵素ではｐＨ７．５と１０において、最も安定であった。
３．反応至適温度
　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液によりｐＨを９に調整し、３０－８０℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた。反応条件は表３に示す。４０℃から８０℃の温度範囲が本酵素の好適な温度であり、反応温度と相対活性を測定した結果を示す図５から、本酵素の至適温度は７０℃であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　対照酵素の至適温度は５０℃であるが、本酵素は、特に最も高い活性を示した７０℃を１００とした相対活性（％）が、８０℃で４０％、６０℃で８０％、５０℃で７０％であるのに対して、対照酵素では、最も高い活性を示した５０℃を１００とした相対活性（％）が、６０℃で６５％、７０℃で８％であり、本酵素は特に高温での活性が維持され、高い耐熱性を有する。
４．熱安定性
　表３に示した上記３．で至適温度を求めた反応条件（１０分）により、本酵素と対照酵素を各温度で１０分間保温した後の残存活性を、図６に示す。１０分間保温した後の温度安定性において、本酵素の６０℃での相対活性の減少は２０％未満であり、対照酵素の８０％の減少より圧倒的に少ないことから、本酵素は対照酵素に比べて、高温でより安定な酵素であることがわかった。
５．Ｄ－アロースまたはＤ－アルロースイソメラーゼ活性、
　本酵素のＤ－アロースイソメラーゼ活性の測定については、実験６と同様の実験を行って酵素反応を行った。基質として１００ｍＭ　Ｄ－アロースを用い、６０℃で６０分間の酵素反応を行い、反応後、反応液を３分間沸騰液中にいれることで反応を止めＨＰＬＣによって、反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位（Ｕ）は、上記条件下において、Ｄ－アロースを異性化し１分間に１μｍｏｌのＤ－アルロースを生成する酵素量である。反応条件を表４に示す。
　同様な条件で、Ｄ－アルロースイソメラーゼ活性を測定した。基質として１００ｍＭ　Ｄ－アルロースを用いて、６０℃で６０分の酵素反応を行い、Ｄ－アロースを生成させた。酵素活性１単位（Ｕ）は、上記条件下において、Ｄ－アルロースを異性化し１分間に１μｍｏｌのＤ－アロースを生成する酵素量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　その結果は、本酵素のＤ－アロースに対する比活性は、５．２１Ｕ／ｍｇであり、Ｄ－アルロースに対する比活性は２．２６Ｕ／ｍｇであるということが判明した。
　しかも、本酵素によりＤ－アルロースをＤ－アロースに異性化する際、副生成物のＤ－アルトロースは生成されなかった。
６．Ｌ－ラムノースイソメラーゼの基質特異性
　Ｌ－ラムノースと５種類のアルドース（Ｄ－アロース、Ｌ－タロース、Ｌ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｌ－マンノース）に対する、本酵素の異性化活性について検討した。酵素反応組成は、下記表５に示したように各基質終濃度５ｍＭ、酵素液（終濃度５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ８．０）で、７０℃１０分間反応しＨＰＬＣによる分析によりそれぞれのアルドースから異性化されたケトースを測定した。
　Ｌ－ラムノースの異性化活性を１００として、それぞれのアルドースに対する活性を、相対活性として示している。
　Ｄ－アロース(Ｄ-Allose)、Ｌ－マンノース（Ｌ－Mannose）、Ｌ－タロース（Ｌ－Talose）、Ｌ－リキソース（Ｌ－Lyxose）、Ｄ－リボース(Ｄ-Ribose)を基質として活性を相対活性として、表６と図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　最もＬ－ラムノースに対する活性が強く、次いでＬ－リキソース、Ｌ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｌ－タロース、Ｄ－アロースの順であった。一方、対照酵素では、Ｌ－ラムノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－マンノース、Ｄ－リボース、Ｄ－アロースの順であり、Ｌ－タロースには反応しなかった。本酵素は、Ｌ－ラムノース－Ｌ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソース－Ｌ－キシルロース間、Ｌ－マンノース－Ｌ－フラクトース間、Ｄ－リボース－Ｄ－リブロース間，Ｌ－タロース－Ｌ－タガトース間、Ｄ－アロース－Ｄ－アルロース間の異性化反応を触媒する。
７．金属イオンの影響
　次に、Ｄ－アロースイソメラーゼ活性に対する金属イオンの影響を調べる目的で、酵素を一部透析して酵素活性を測定した。透析は、酵素液をセルロース膜に入れ、２０ｍＭＥＤＴＡを含むＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）に浸し、この緩衝液をゆっくりと１６時間かけて撹拌することにより行い、他の金属イオンの影響を取り除いた。こうして得られた酵素の酵素活性を、各種二価金属イオン１ｍＭの存在下（表７の反応条件下）で反応後、システインカルバゾール法により測定した。　
　その結果、ＣｏＣｌ２は本酵素活性を著しく上昇させ、本酵素は金属依存性を示した（図７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜実験７：固定化酵素の調製＞
　実験２と同様に培養して回収したエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３株の菌体を使用した。
１.菌体の超音波処理による粗酵素の取得
　培養液１Ｌ分の菌体を５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）４０ｍＬ懸濁し、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザーで細破砕した。破砕物を１５，０００×ｇで３０分間遠心し、その遠心上清を粗酵素液とした。
２.粗酵素の固定化
　純水でよく洗浄して膨潤させた後に５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したイオン交換樹脂または合成吸着剤に上記で得た粗酵素液を添加し、４℃で２０時間緩やかに混和することで粗酵素タンパク質を結合させた。次いで、５０ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）で洗浄し、固定化酵素を得た。
　固定化担体として、強塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製のＳＡ１０Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＳＡ２０Ａ、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８、弱塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製のＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０およびオルガノ社製のＦＰＡ５４、ＦＰＡ６０ＣＬ、ＦＰＡ９５）、または合成吸着剤（オルガノ社製のＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１１８ＯＮ）を用いた。
３．固定化酵素の酵素活性の測定方法
　固定化酵素の酵素活性の測定は、Ｄ－アルロースを基質として酵素反応させたときのＤ－アロースの生成量を測定することにより行った。
　まず、１００ｍｇの固定化酵素樹脂、Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）（終濃度５０ｍＭ）、塩化マンガン（終濃度１ｍM）、及びＤ－アルロース（終濃度１００ｍＭ）の溶液（５００μＬ）を反応液組成とし、３０℃恒温水槽で２４分間反応させた後、１００℃で２分間ボイルすることで直ちに反応を停止させた。この反応後の溶液を室温まで冷却してからイオン交換樹脂（２００ＣＴ及びＩＲＡ６７の混合樹脂（いずれもオルガノ社製））で脱塩し、さらにフィルター処理をして分析サンプルとした。分析は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＧＬ－Ｃ６１１（Ｈｉｔａｃｈｉ）、温度：６０℃、溶離液：０．１ｍＭ ＮａＯＨ、流速：１．０ｍL／分、検出器：ＲＩＤ－２０Ａ（島津））を用いて、生成したＤ－アロースのピーク面積を測定することにより行った。
４．酵素固定化に用いる担体による酵素活性の比較
　酵素固定化に用いる担体による影響を確認するため、上記２に記載の各担体に固定化した本酵素の酵素活性を比較した。なお、相対値は、比較サンプルのうち活性発現率の最も高いサンプルを１００として算出することにより求めた。
　図９に、各種固定化酵素の活性発現率の相対値を示す。
＜実験８：酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えベクターと形質転換宿主細胞の調製＞
　Ｄ-アルロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８-３株からクローニングし、自立複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換微生物の調製を行った。
＜実験８－１：染色体ＤＮＡの全塩基配列の決定＞
　本菌のＤ-アロースイソメラーゼ酵素は既存の類似酵素と異なり、ＰＣＲ増幅の手法や既存のタンパク質データベースを用いて単離することが出来なかった。そこで、エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株の全ゲノム配列を決定し、そのゲノム中の全ＯＲＦのコードするタンパク質群のデータベースの構築を行った。エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株培養菌体を供試菌体として株式会社マクロジェン・ジャパンに依頼しＰａｃＢｉｏ-ＲＳＩＩ／Ｓｅｑｕｅｌを用いた次世代シーケンス解析を依頼した。
　その結果、塩基数４，３０１，１３１ｂｐと１，０２４，７５４ｂｐ、２８０，５６８ｂｐ、１２６，９３８ｂｐの４つのコンティグが得られた。この４つのコンティグで約５．７Ｍｂであることから、エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株の全ゲノム配列をカバー出来ていると考えた。
＜実験８－２：タンパク質データベースの構築＞
　得られた約５．７ＭｂのＤＮＡ配列を基に、Ｐｒｏｋｋａプログラムを用いて５，３５７個のＯＲＦを推定し、それぞれのＯＲＦについてアミノ酸配列を推定した。この５，３５７個のアミノ酸配列をエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株のタンパク質データベースとした。
＜実験８－３：Ｄ-アルロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質の同定＞
　上記のタンパク質データベースを用いて、タンパク質同定システムであるＭＡＳＣＯＴｓｅｒｖｅｒ（マトリックスサイエンス社）に登録し、Ｄ-アルロースイソメラーゼ活性が見られたタンパク質の同定を行った。供試サンプルには、段落［００４５］のＳＤＳ-ＰＡＧＥの４８ｋＤａのバンドを用い、還元処理、アルキル化処理の後、トリプシン消化した断片をＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ解析に供した。
　その結果、下記の４１８アミノ酸からなる配列１（配列表の配列番号１）のアミノ酸配列中で下線を引いて示すアミノ酸配列と７８％の相似性が見られたことから、本タンパク質がエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株のＬ－ラムノースイソメラーゼであることが強く示唆された。
［配列１］
MTKLIEQAYELAKQRYADVGIDVEQVMTQLDGIPVSMHCWQGDDVRGFENPNGELTGGIQATGNYPGRARNAHELRADIEKAMSLIPGAKRLNLHAIYLESDTPVERDAIEPQHFSHWVEWAKQHKLGLDFNPSCFSHPLSADGFTLSHADKGIRQFWIDHCKASRRISAHFGEQLGTPSVMNIWVPDGMKDLTIDRLAPRERLASALDEVISEKFDASHHIDAVESKLFGIGAESYTVGSNEFCLGYAASRQTALTLDAGHFHPTEVISDKISTAMLYVPRLLLHVSRPVRWDSDHVVLLDDETQAIATEIARNKLFNKVHIGLDFFDASINRIAAWVIGTRNAKKALLRALLEPSDQLRKLELEGDYTARLALLEEQKSLPWQAVWEAWCLRHDVPADASWLSEVRHYEQQTLRLR
（配列１　エルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)ＧｕａＬ２１８-３株のタンパク質データベースを用いて同定したアミノ酸配列。下線部で示すアミノ酸配列がＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ-ＭＳ解析で得られたピークと一致した配列。）
＜実験８－４：Ｄ-アルロースイソメラーゼ活性を有する酵素遺伝子の単離＞
　アミノ酸配列より同定した遺伝子の配列２のＤＮＡ配列（配列表の配列番号２）を合成し、ｐＱＥ６０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）に組み込み、発現用大腸菌を形質転換した。構築した大腸菌発現系を用いて誘導酵素の確認を行った。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果は図１０に示すように、誘導タンパク質が可溶性画分に確認された。また、この誘導された組換酵素を用いて、６０％（ｗ／ｖ）のＤ-アルロースを基質に３０℃で２４時間反応させ、ＨＰＬＣでＤ-アルロースイソメラーゼ活性を確認した結果を図１１に示した。この図のリテンションタイム２２．４８分のピークはＤ-アロース、リテンションタイム２９．６７分のピークはＤ-アルロースであり、本組換え酵素は、Ｄ-アルロースからＤ-アロースへ異性化反応を触媒し、副生成物として懸念されていたＤ－アルトロースも生成しなかった。
［配列２］
ATGACAAAGCTGATTGAACAAGCTTATGAACTGGCTAAACAACGTTACGCTGACGTAGGAATTGATGTGGAGCAGGTGATGACGCAATTGGATGGGATTCCTGTGTCGATGCACTGCTGGCAGGGGGATGACGTGCGCGGCTTCGAAAACCCCAATGGCGAACTCACCGGCGGGATTCAGGCCACAGGTAACTATCCGGGACGCGCGCGTAATGCGCATGAACTGCGCGCCGATATCGAAAAAGCCATGTCGCTGATTCCAGGCGCTAAGCGCCTCAATCTGCACGCCATCTATCTGGAAAGCGACACGCCGGTAGAACGTGATGCTATCGAACCGCAACACTTCAGCCACTGGGTGGAGTGGGCAAAACAGCATAAATTAGGGCTCGATTTTAATCCAAGCTGCTTCTCGCATCCTTTAAGTGCCGATGGTTTTACCCTGTCACACGCTGACAAAGGCATCCGCCAGTTCTGGATTGATCACTGCAAGGCCAGTCGCCGCATCTCGGCACATTTTGGTGAACAACTGGGCACGCCCTCAGTGATGAACATCTGGGTTCCGGACGGTATGAAAGATCTCACCATTGATCGCCTGGCGCCGCGTGAACGTTTAGCCAGCGCGCTGGATGAAGTGATCAGCGAAAAATTCGATGCCAGTCATCATATCGACGCCGTCGAAAGTAAGTTATTCGGGATTGGTGCTGAGAGTTATACCGTGGGGTCCAATGAGTTTTGCCTTGGCTACGCTGCCAGCCGCCAGACCGCGCTGACACTTGATGCCGGGCATTTCCATCCCACTGAAGTGATCTCCGACAAAATCTCCACCGCGATGCTGTATGTCCCGCGCCTGTTATTGCACGTCAGCCGTCCGGTGCGTTGGGACAGCGACCATGTGGTGCTGCTGGATGATGAAACCCAGGCCATTGCCACTGAAATTGCGCGTAACAAGCTGTTCAACAAAGTGCATATCGGCCTCGACTTCTTTGATGCTTCCATCAACCGCATCGCGGCGTGGGTGATTGGTACCCGCAATGCCAAAAAGGCGTTACTGCGTGCGCTGTTGGAGCCGAGTGACCAACTGCGCAAACTGGAGCTTGAGGGGGATTACACCGCACGTCTGGCGCTGCTGGAGGAGCAAAAGTCATTGCCATGGCAGGCTGTCTGGGAAGCCTGGTGCTTGCGTCACGATGTCCCTGCTGATGCCAGTTGGCTCAGCGAAGTCCGTCATTATGAACAACAAACACTGCGTCTACGTTAA
＜実験９：本酵素のアミノ酸置換変異体の作成とその酵素活性、耐熱性＞
　本発明の配列番号１で表されるＬ－ラムノースイソメラーゼのアミノ酸配列と、特許文献８に記載された方法で系統樹を作成し、本発明の配列番号２のＤＮＡ配列と同じ系統に分類されたＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列を比較して、配列番号１と相違する部位に対応するアミノ酸等を部位特異的変異導入による塩基置換により変化させて、各種Ｌ－ラムノースイソメラーゼ変異体を作成した。本発明のアミノ酸置換変異体には例外的に、Ｃ末端の４１８位のアミノ酸に、１アミノ酸残基（Ｇ）を付加した変異体を含めた。
　部位特異的変異導入により、まず１アミノ酸置換変異体を作成した。目的の変異導入部位にアミノ酸置換が起こるような１ないし２塩基対に塩基置換を加えた塩基配列を持つ両ＤＮＡ鎖のＰＣＲプライマーを作製し、変異導入元のプラスミドＤＮＡとこれらの両プライマーを用いたＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ断片を宿主大腸菌に形質転換し、得られたクローンからプラスミドＤＮＡを抽出して目的変異が導入されたことを、シークエンス解析によって確認した。多重置換変異体については、上記の方法を繰り返すことにより作製した。
　部位特異的変異酵素を含む組換え酵素を発現する組換え大腸菌は、終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加えた３．５％ポリペプトン、２．０％酵母抽出物、１．０％塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マンガンを含む培地で３０℃、２００ｒｐｍで１２時間前培養を行った。前培養液を１／２０量、終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを加えた発現用培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２時間本培養を行った。本培養後、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して３０℃、２００ｒｐｍで一晩組換え酵素の発現誘導を行った。
　組換え大腸菌の発現用培地の組成を、表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　組換えによって得られた野生型酵素およびアミノ酸置換変異体の粗酵素の酵素活性は、終濃度１００ｍＭのＤ－アルロースを基質に、緩衝液として終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)を用いて各温度で１０分間反応させ、反応液中の糖組成をＨＰＬＣを用いて生産されたＤ－アロースの量を測定した。
　また、これら粗酵素の６０℃で１時間保温後の残存活性として、酵素液を６０℃で１時間熱処理した後、表９の反応組成で６０℃で１０分間酵素反応を行い、残存活性を測定した。
　反応液の組成を、下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記方法で、各変異体の反応至適温度と相対活性を測定し、各変異体の反応至適温度において、野生型酵素よりＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高いアミノ酸置換変異体を選択した。
　野生型酵素は組換えで製造された粗酵素のことであり、Ｄ－アロース生産における至適温度は６０℃であり、精製酵素のＬ-ラムノースに対する至適温度７０℃より下がったが、変異を挿入することで至適温度が戻った変異体も存在した。
　結果として、野生型酵素より、至適温度が高いかまたは至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高い変異体が、１３個得られた（表１０）。
　また、耐熱性の指標として、上記各変異体の反応至適温度と相対活性の測定と同様に各変異体の反応温度７０℃と５０℃におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、６０℃で１時間保温後の残存活性、および反応温度８０℃と至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）を測定した。そして、野生型酵素よりいずれかの指標が高い変異体を選択した（表１１～１３）。
　その結果、野生型酵素より上記４つの指標のいずれかが高い変異体を５６個取得した。これら５６の変異体の各アミノ酸配列を、配列表の配列番号３～８、１０～２８、３０～６０に示す。配列番号９および２９のアミノ酸配列を有する変異体は、活性は有するものの、４つの指標のいずれでも野生型酵素に届かなかった。
　これら配列表の配列番号３～６０のアミノ酸配列を有する各変異体を、「配列３～６０」と名付ける。
　以下、配列３～６０における野生型酵素（配列番号１）からのアミノ酸置換部位（位置）と置換アミノ酸をそれぞれ示す。この場合、以下に示すアミノ酸置換部位等が、配列表の配列番号３～６０に示すものと相違している場合には、配列表に示すアミノ酸配列が正しい配列である。また各配列の最後の括弧内の数字は、アミノ酸置換の数をしめす。
配列３　４１９Ｇ　（１）
　　４　Ｖ２８０Ｉ　（１）
　　５　Ｖ３８７Ｉ　（１）
　　６　Ｌ１９８Ｆ　（１）
　　７　Ｓ４０５Ｅ　（１）
　　８　Ｎ５２Ｅ　（１）
　　９　Ｑ１２４Ｒ　（１）
　１０　Ｄ１０２Ｔ　（１）
　１１　Ｑ３５９Ｌ　（１）
　１２　Ｋ１５２Ｐ　（１）
　１３　Ｄ１８Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｔ３１０Ｓ、Ｌ３６５Ｑ　（４）
　１４　Ｄ１８Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｌ３６５Ｑ　（３）
　１５　Ｙ９Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｋ、Ｔ２８Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ａ７７Ｓ、Ｉ７９Ｖ、Ｔ１０３Ｋ、Ｅ１０６Ｄ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｔ、Ｐ１７９Ａ、Ｉ１９５Ｖ、Ａ１９９Ｇ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ａ２５０Ｓ、Ｌ３００Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｓ、Ａ３７１Ｇ、Ｌ３７５Ｍ、Ｌ４１７Ｑ　（３１）
　１６　Ｙ９Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ａ７７Ｓ、Ｉ７９Ｖ、Ｔ１０３Ｋ、Ｅ１０６Ｄ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｔ、Ｐ１７９Ａ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ａ２５０Ｓ、Ｌ３００Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｎ、Ａ３７１Ｇ、Ｌ３７５Ｍ、Ｌ４１７Ｑ　（２９）
　１７　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ａ７７Ｓ、Ｉ７９Ｖ、Ｔ１０３Ｋ、Ｅ１０６Ｄ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｔ、Ｐ１７９Ａ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ａ２５０Ｓ、Ｌ３００Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｓ、Ａ３７１Ｇ、Ｌ３７５Ｍ　（２７）
　１８　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｉ７９Ｖ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｐ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ３１０Ｓ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｎ、Ｌ４１７Ｑ　（２０）
　１９　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｔ１０３Ｋ、　　Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｈ１２５Ｎ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、　　Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｌ３６５Ｎ　（１９）
　２０　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｈ１２５Ｎ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｎ３１５Ｈ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｎ　（２１）
　２１　Ｙ９Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｇ、Ｇ３２Ｒ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｔ１０３Ｋ、Ｅ１０６Ａ、Ａ１０９Ｅ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｖ２１１Ｉ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ４０６Ｄ　（４０）
　２２　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｇ、Ｇ３２Ｒ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｔ１０３Ｋ、Ｅ１０６Ａ、Ａ１０９Ｅ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｖ２１１Ｉ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ４０６Ｄ　（３９）
　２３　Ｙ９Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ｇ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ４０６Ｄ　（３０）
　２４　Ｙ９Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｎ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｖ２１１Ｉ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ４０６Ｄ　（３１）
　２５　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２８Ａ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｋ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ｖ２１１Ｉ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｓ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｌ３６５Ｎ　（２７）
　２６　Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２６Ａ、Ｔ２８Ａ、Ｇ３２Ｒ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ｉ７９Ｌ、Ｅ８０Ｄ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｋ、Ｓ１３４Ｔ、Ｈ１７１Ｙ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｖ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ３１０Ｎ、Ｎ３１５Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ　（３１）
　２７　Ｌ４Ｑ、Ｙ９Ｆ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｉ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ａ７７Ｓ、Ｅ８０Ｄ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ａ、Ｓ１１６Ａ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１４０Ｍ、Ａ１５０Ｓ、Ｇ１５３Ｔ、Ｉ１５４Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｍ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ａ３４５Ｔ、Ｓ３５７Ｔ、Ｑ３５９Ｒ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６３Ａ、Ｌ３６５Ｎ、Ａ３７４Ｔ、Ｓ４０５Ｇ、Ｅ４０６Ｄ　（４８）
　２８　Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｉ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｈ７３Ｄ、Ａ７７Ｓ、Ｅ８０Ｄ、Ｔ１０３Ｋ、Ｑ１１３Ａ、Ｓ１１６Ａ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ｅ、Ｌ１４０Ｍ、Ａ１５０Ｓ、Ｇ１５３Ｔ、Ｉ１５４Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｍ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ａ３４５Ｔ、Ｓ３５７Ｔ、Ｑ３５９Ｒ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６３Ａ、Ｌ３６５Ｎ、Ａ３７４Ｔ、Ｓ４０５Ｇ、Ｅ４０６Ｄ　（４６）
　２９　Ｄ１８Ｅ、Ｖ１９Ｎ、Ｉ２１Ｖ、Ｅ２４Ｄ、Ｑ２５Ｌ、Ｔ２８Ａ、Ｇ３２Ｅ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ７３Ｄ、Ｍ８３Ｉ、Ｋ９０Ｍ、Ｄ１０２Ｓ、Ｔ１０３Ｑ、Ｑ１１３Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ｓ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｒ、Ｓ１３４Ｔ、Ｐ１３９Ａ、Ｌ１４０Ｋ、Ｋ１５２Ｔ、Ｒ１６７Ｈ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９８Ｆ、Ｅ２０２Ｑ、Ｅ２１０Ａ、Ｖ２１１Ｉ、Ｋ２１５Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ｑ、Ａ２５０Ｓ、Ｔ２５４Ｉ、Ｔ３１０Ｈ、Ｎ３１５Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｑ３５９Ｒ、Ｋ３６２Ｒ、Ｌ３６５Ｓ、Ｙ３６９Ｆ　（４３）
　３０　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ａ８２Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｈ３９５Ｎ、Ｖ３９７Ａ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ａ、Ｑ４１２Ｅ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（８４）
　３１　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ａ８２Ｔ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｈ３９５Ｎ、Ｖ３９７Ａ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ａ、Ｑ４１２Ｅ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（８４）
　３２　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｇ、Ｓ１１６Ｔ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｈ３９５Ｎ、Ｖ３９７Ａ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ａ、Ｑ４１２Ｋ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（８４）
　３３　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｅ１０Ｄ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｅ２４Ｄ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ａ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｓ１４８Ａ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｄ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｎ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｓ、Ｑ３５９Ａ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｅ、Ｅ３６６Ｎ、Ａ３７４Ｖ、Ｓ３８１Ｔ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｈ３９５Ｎ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｍ、Ｑ４１２Ｋ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（９０）
　３４　Ｌ１１Ｉ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｇ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｌ１９８Ｆ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｖ２８０Ｉ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（６０）
　３５　Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｇ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｉ９７Ｌ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｔ、Ｈ１２５Ｎ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｌ１９８Ｆ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｖ２８０Ｉ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ、Ｓ３８１Ｃ　（６１）
　３６　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｄ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（５７）
　３７　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｄ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（５９）
　３８　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（５８）
　３９　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（５７）
　４０　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｋ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｄ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｓ　（５６）
　４１　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｋ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｓ　（５６）
　４２　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｐ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｑ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ａ８９Ｐ、Ｄ１０８Ｎ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｄ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（５０）
　４３　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ｓ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｓ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｓ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｒ２８２Ｑ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ａ　（５７）
　４４　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ｓ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｓ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｓ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｒ２８２Ｑ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ａ　（５７）
　４５　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ｓ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｓ、Ａ７７Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｓ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｒ２８２Ｑ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ａ　（５９）
　４６　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（６１）
　４７　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｄ　（６２）
　４８　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ａ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（６２）
　４９　Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（６５）
　５０　Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（６４）
　５１　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｓ１４８Ａ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｎ　（６３）
　５２　Ｅ１０Ｄ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ　Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｒ、Ｓ１４８Ａ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｖ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ａ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｅ、Ｅ３６６Ｎ　（６６）
　５３　Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｔ１０３Ｅ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｒ、Ｓ１４８Ａ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｎ、Ｇ１５３Ｅ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｖ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ａ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｅ、Ｅ３６６Ｎ　（６５）
　５４　Ｅ１０Ｄ、Ｄ１８Ａ、Ｉ２１Ｖ、Ｅ２４Ｄ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｔ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｌ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ａ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｓ１４８Ａ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｄ、Ｃ１６２Ｖ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｖ２１１Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ｓ、Ｑ３５９Ａ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｅ、Ｅ３６６Ｎ、Ａ３７４Ｖ、Ｓ３８１Ｔ　（６９）
　５５　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｌ１１Ｉ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２３Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｑ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｄ１０２Ｔ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｑ１２４Ｒ、Ｋ１２６Ｑ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｐ、Ｇ１５３Ｅ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｌ１９８Ｆ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｖ２８０Ｉ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｌ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ３６６Ｄ、Ｖ３８７Ｉ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｅ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｔ、Ｑ４１２Ｋ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（８１）
　５６　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｄ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｐ、Ｋ１２６Ｑ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｅ、Ｇ１５３Ｅ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ３６６Ｄ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｔ、Ｑ４１２Ｋ、Ｑ４１３Ｄ、Ｔ４１４Ｖ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ、４１９Ｇ　（７５）
　５７　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｔ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｎ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｇ、Ｋ１２６Ｑ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｅ、Ｇ１５３Ｅ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｌ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ３６６Ｄ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｔ、Ｑ４１２Ｋ　（７１）
　５８　Ｙ９Ｗ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｔ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｎ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｇ、Ｋ１２６Ｑ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｅ、Ｇ１５３Ｅ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｌ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ３６６Ｄ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｔ、Ｑ４１２Ｋ　（６８）
　５９　Ｙ９Ｗ、Ｄ１８Ａ、Ｖ１９Ｉ、Ｉ２１Ｖ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ａ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｔ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｎ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８３Ｌ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ａ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ｇ、Ｋ１２６Ｑ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｅ、Ｇ１５３Ｅ、Ｈ１７１Ｙ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ｎ、Ｆ２１６Ｌ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｉ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｎ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｌ、Ｋ３６２Ｑ、Ｌ３６５Ｎ、Ｅ３６６Ｄ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ、Ｓ４０５Ｄ、Ｅ４０６Ｎ、Ｈ４０９Ｔ　（６７）
　６０　Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｗ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ、Ｑ２５Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ、Ｔ２８Ｒ、Ｇ３２Ｒ、Ｉ３３Ｌ、Ｒ４６Ｓ、Ｎ５２Ｅ、Ｅ５４Ｓ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｓ、Ｉ７９Ｌ、Ｋ８１Ｑ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８９Ｐ、Ｅ１０６Ｓ、Ａ１０９Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ｅ、Ｓ１１６Ｋ、Ｈ１１７Ｎ、Ｑ１２４Ａ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１５２Ｄ、Ｇ１５３Ｓ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ、Ｓ２０６Ａ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｔ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｒ２８２Ｑ、Ｔ３１０Ｓ、Ａ３１３Ｖ、Ｎ３１５Ｈ、Ｋ３１６Ｄ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ、Ｓ３５７Ｔ、Ｄ３５８Ａ、Ｑ３５９Ｅ、Ｌ３６５Ａ、Ｅ３６６Ｐ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｖ３９７Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｅ、Ｓ４０５Ｅ、Ｅ４０６Ｓ、Ｈ４０９Ａ、Ｑ４１２Ｋ、Ｑ４１３Ｅ、Ｔ４１４Ｉ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｒ、４１９Ｇ　（７８）
　これらをまとめると、配列３～６０のアミノ酸置換変異体は、以下の１２２の部位に特定のアミノ酸置換がなされている。
Ｋ３Ｔ、Ｌ４Ｑ、Ｉ５Ｌ、Ｙ９Ｆ／Ｗ、Ｅ１０Ｄ、Ｌ１１Ｉ、Ｙ１６Ｆ、Ｄ１８Ａ／Ｅ、Ｖ１９Ｉ／Ｎ、Ｉ２１Ｖ、Ｖ２３Ａ、Ｅ２４Ｄ、Ｑ２５Ｋ／Ｌ／Ｅ、Ｖ２６Ａ、Ｍ２７Ｌ／Ｉ、Ｔ２８Ａ／Ｇ／Ｒ／Ｐ、Ｇ３２Ｅ／Ｒ、I３３Ｌ、Ｒ４６Ａ／Ｓ、Ｎ５２Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｑ、Ｅ５４Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｒ６８Ｋ、Ｈ７３Ｄ／Ｇ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｑ、Ａ７７Ｓ／Ｔ、Ｉ７９Ｌ／Ｖ、Ｅ８０Ｄ、Ｋ８１Ｑ／Ｌ、Ａ８２Ｔ、Ｍ８３Ｉ／Ｌ、Ｓ８４Ｒ、Ａ８９Ｐ、Ｋ９０Ｍ、Ｉ９７Ｌ、Ｄ１０２Ｓ／Ｔ、Ｔ１０３Ｅ／Ｋ／Ｑ、Ｅ１０６Ａ／Ｄ／Ｓ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｅ／Ｑ、Ｅ１１１Ｋ、Ｑ１１３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｇ、Ｓ１１６Ａ／Ｋ／Ｔ、Ｈ１１７Ｎ、Ｅ１２０Ａ、Ｑ１２４Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｐ／Ｓ／Ｔ、Ｈ１２５Ｎ、Ｋ１２６Ｒ／Ｑ、Ｓ１３４Ｔ、Ｐ１３９Ａ、Ｌ１４０Ｋ／Ｍ、Ｓ１４８Ａ、Ａ１５０Ｓ、Ｄ１５１Ｎ、Ｋ１５２Ｄ／Ｅ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｇ１５３Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ｉ１５４Ｖ、Ｃ１６２Ｖ、Ｒ１６７Ｈ、Ｉ１６８Ｖ、Ｈ１７１Ｙ、Ｐ１７９Ａ、Ｖ１８６Ｉ、Ｌ１９３Ｉ、Ｉ１９５Ｖ、Ｌ１９８Ｆ、Ａ１９９Ｇ、Ｅ２０２Ｑ、Ａ２０５Ｌ／Ｍ／Ｖ、Ｓ２０６Ａ／Ｄ／Ｎ、Ｅ２１０Ａ、Ｖ２１１Ａ／Ｉ、Ｋ２１５Ｑ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ２１７Ｎ、Ａ２１８Ｐ、Ｓ２１９Ａ／Ｑ、Ｃ２４５Ｙ、Ｌ２４６Ｍ、Ａ２５０Ｓ／Ｔ、Ｔ２５４Ｉ、Ｔ２５７Ｃ、Ｔ２７５Ａ、Ｖ２８０Ｉ、Ｒ２８２Ｑ、Ｌ３００Ｉ、Ｔ３１０Ｎ／Ｈ／Ｓ、Ａ３１３Ｉ／Ｖ、Ｎ３１５Ｈ／Ｑ、Ｋ３１６Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ３１９Ｄ、Ｋ３２０Ｒ、Ａ３４５Ｍ／Ｔ、Ｓ３５７Ｔ／Ｖ、Ｄ３５８Ａ／Ｅ／Ｓ、Ｑ３５９Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｒ、Ｒ３６１Ｋ、Ｋ３６２Ｑ／Ｒ、Ｌ３６３Ａ、Ｌ３６５Ａ／Ｅ／Ｎ／Ｓ／Ｑ、Ｅ３６６Ａ／Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｓ、Ｙ３６９Ｆ、Ａ３７１Ｇ、Ａ３７４Ｔ／Ｖ、Ｌ３７５Ｍ、Ｓ３８１Ｃ／Ｔ、Ｖ３８７Ｉ、Ａ３９０Ｍ、Ｗ３９１Ｙ、Ｌ３９３Ｑ、Ｈ３９５Ｎ、Ｖ３９７Ａ／Ｔ、Ｄ４００Ｇ、Ａ４０１Ｓ、Ｓ４０２Ｑ／Ｅ、Ｓ４０５Ｄ／Ｅ／Ｇ、Ｅ４０６Ｄ／Ｎ／Ｓ、Ｈ４０９Ａ／Ｔ／Ｍ、Ｑ４１２Ｅ／Ｋ、Ｑ４１３Ｄ／Ｅ、Ｔ４１４Ｖ／Ｉ、Ｒ４１６Ｓ、Ｌ４１７Ｑ／Ｒ、４１９Ｇ
　さらに、配列３～６０のアミノ酸置換変異体には、以下の１２２の部位にアミノ酸置換と１アミノ酸残基の付加がなされている。
Ｋ３、Ｌ４、Ｉ５、Ｙ９、Ｅ１０、Ｌ１１、Ｙ１６、Ｄ１８、Ｖ１９、Ｉ２１、Ｖ２３、Ｅ２４、Ｑ２５、Ｖ２６、Ｍ２７、Ｔ２８、Ｇ３２、I３３、Ｒ４６、Ｎ５２、Ｅ５４、Ｒ６８、Ｈ７３、Ａ７７、Ｉ７９、Ｅ８０、Ｋ８１、Ａ８２、Ｍ８３、Ｓ８４、Ａ８９、Ｋ９０、Ｉ９７、Ｄ１０２、Ｔ１０３、Ｅ１０６、Ｄ１０８、Ａ１０９、Ｅ１１１、Ｑ１１３、Ｓ１１６、Ｈ１１７、Ｅ１２０、Ｑ１２４、Ｈ１２５、Ｋ１２６、Ｓ１３４、Ｐ１３９、Ｌ１４０、Ｓ１４８、Ａ１５０、Ｄ１５１、Ｋ１５２、Ｇ１５３、Ｉ１５４、Ｃ１６２、Ｒ１６７、Ｉ１６８、Ｈ１７１、Ｐ１７９、Ｖ１８６、Ｌ１９３、Ｉ１９５、Ｌ１９８、Ａ１９９、Ｅ２０２、Ａ２０５、Ｓ２０６、Ｅ２１０、Ｖ２１１、Ｋ２１５、Ｆ２１６、Ｄ２１７、Ａ２１８、Ｓ２１９、Ｃ２４５、Ｌ２４６、Ａ２５０、Ｔ２５４、Ｔ２５７、Ｔ２７５、Ｖ２８０、Ｒ２８２、Ｌ３００、Ｔ３１０、Ａ３１３、Ｎ３１５、Ｋ３１６、Ｎ３１９、Ｋ３２０、Ａ３４５、Ｓ３５７、Ｄ３５８、Ｑ３５９、Ｒ３６１、Ｋ３６２、Ｌ３６３、Ｌ３６５、Ｅ３６６、Ｙ３６９、Ａ３７１、Ａ３７４、Ｌ３７５、Ｓ３８１、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｗ３９１、Ｌ３９３、Ｈ３９５、Ｖ３９７、Ｄ４００、Ａ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０５、Ｅ４０６、Ｈ４０９、Ｑ４１２、Ｑ４１３、Ｔ４１４、Ｒ４１６、Ｌ４１７、４１９
　配列３～６０の中で最もアミノ酸置換の数が多いのは、配列３３の９０個であり、配列１の野生型酵素とは、アミノ酸配列の同一性が７８％である。
　また、下記の表１０に示す、配列１の野生型酵素より至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性が高い１３個の配列の中で、最もアミノ酸置換の数が多いのは、配列３２の８４個であり、配列１のアミノ酸配列との同一性は８０％である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　表１１には、配列１の野生型酵素より反応温度７０℃と５０℃におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高い５２個の配列の番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１２には、配列１の野生型酵素より６０℃で１時間保温後の残存活性が高い１７個の配列の番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１３には、配列１の野生型酵素より反応温度８０℃と至適温度におけるＤ－アルロースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）が高い５６個の配列の番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、微生物由来の従来のＬ－ラムノースイソメラーゼと比べて、特に高い耐熱性を有し、かつ高活性であることが特徴である。たとえば、従来のシュードモナス　スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＬ－ラムノースイソメラーゼは至適温度が６０℃であるのに対して、本発明の酵素は７０℃と高く、しかも６０℃で１０分間加熱処理した後の残存活性も８０％以上という熱安定性を有するので、工業的生産での使用に適している。
　また、基質がＤ－アルロースである場合に、６０℃でｍｇタンパク質当たり２．２６Ｕの高いＤ－アロースへの転換活性を有し、本発明によりＤ－アロースの大量生産の道を拓くものである。
　また、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼは、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができ、固定化酵素を用いることで、連続的で大量の異性化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするアルドースの大量生産ができる。
　さらに、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼのアミノ酸置換変異体には、変異前の本酵素より酵素活性あるいは耐熱性が高いものが多数包含されている。
　したがって、本発明のＬ－ラムノースイソメラーゼとその変異体、およびその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品、農薬産業における工業的意義が極めて大きい。

 

Claims (19)

  1. 　エルビニア(Ｅｒｗｉｎｉａ)属に属する微生物由来のＬ－ラムノースイソメラーゼであって、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで測定したサブユニットの分子質量が４８ｋＤａであり、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するＬ－ラムノースイソメラーゼ。
    　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
    　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
  2. 　下記（Ｃ）および（Ｄ）の理化学的性質を有する、請求項１に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
    　（Ｃ）反応至適ｐＨは９である。
    　（Ｄ）反応至適温度は７０℃である。
  3. 　エルビニア属に属する微生物がエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)である、請求項１または２に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
  4. 　エルビニア属に属する微生物が特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として国際寄託されているエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３である、請求項１ないし３のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ。
  5. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
  6. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体であるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列のＫ３、Ｌ４、Ｉ５、Ｙ９、Ｅ１０、Ｌ１１、Ｙ１６、Ｄ１８、Ｖ１９、Ｉ２１、Ｖ２３、Ｑ２５、Ｖ２６、Ｍ２７、Ｔ２８、Ｇ３２、I３３、Ｒ４６、Ｎ５２、Ｅ５４、Ｒ６８、Ｈ７３、Ａ７７、Ｉ７９、Ｅ８０、Ｋ８１、Ｍ８３、Ａ８９、Ｄ１０２、Ｔ１０３、Ｅ１０６、Ｄ１０８、Ａ１０９、Ｅ１１１、Ｑ１１３、Ｓ１１６、Ｈ１１７、Ｑ１２４、Ｈ１２５、Ｋ１２６、Ｓ１３４、Ｓ１４８、Ｄ１５１、Ｋ１５２、Ｇ１５３、Ｃ１６２、Ｉ１６８、Ｈ１７１、Ｐ１７９、Ｖ１８６、Ｌ１９３、Ｉ１９５、Ｌ１９８、Ａ１９９、Ｅ２０２、Ａ２０５、Ｓ２０６、Ｖ２１１、Ｆ２１６、Ｄ２１７、Ａ２１８、Ｓ２１９、Ｃ２４５、Ｌ２４６、Ａ２５０、Ｔ２５７、Ｔ２７５、Ｖ２８０、Ｌ３００、Ｔ３１０、Ａ３１３、Ｎ３１５、Ｋ３１６、Ｎ３１９、Ｋ３２０、Ａ３４５、Ｓ３５７、Ｄ３５８、Ｑ３５９、Ｒ３６１、Ｋ３６２、Ｌ３６５、Ｅ３６６、Ａ３７１、Ｌ３７５、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｗ３９１、Ｌ３９３、Ｈ３９５、Ｖ３９７、Ｄ４００、Ａ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０５、Ｅ４０６、Ｈ４０９、Ｑ４１２、Ｑ４１３、Ｔ４１４、Ｒ４１６、Ｌ４１７、４１９から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、至適温度におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性が高いタンパク質。
    　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
    　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
  7. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ酸置換変異体であるタンパク質であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と７８％以上の同一性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列のＫ３、Ｌ４、Ｉ５、Ｙ９、Ｅ１０、Ｌ１１、Ｙ１６、Ｄ１８、Ｖ１９、Ｉ２１、Ｖ２３、Ｅ２４、Ｑ２５、Ｖ２６、Ｍ２７、Ｔ２８、Ｇ３２、I３３、Ｒ４６、Ｎ５２、Ｅ５４、Ｒ６８、Ｈ７３、Ａ７７、Ｉ７９、Ｅ８０、Ｋ８１、Ａ８２、Ｍ８３、Ｓ８４、Ａ８９、Ｋ９０、Ｉ９７、Ｄ１０２、Ｔ１０３、Ｅ１０６、Ｄ１０８、Ａ１０９、Ｅ１１１、Ｑ１１３、Ｓ１１６、Ｈ１１７、Ｅ１２０、Ｑ１２４、Ｈ１２５、Ｋ１２６、Ｓ１３４、Ｐ１３９、Ｌ１４０、Ｓ１４８、Ａ１５０、Ｄ１５１、Ｋ１５２、Ｇ１５３、Ｉ１５４、Ｃ１６２、Ｒ１６７、Ｉ１６８、Ｈ１７１、Ｐ１７９、Ｖ１８６、Ｌ１９３、Ｉ１９５、Ｌ１９８、Ａ１９９、Ｅ２０２、Ａ２０５、Ｓ２０６、Ｅ２１０、Ｖ２１１、Ｋ２１５、Ｆ２１６、Ｄ２１７、Ａ２１８、Ｓ２１９、Ｃ２４５、Ｌ２４６、Ａ２５０、Ｔ２５４、Ｔ２５７、Ｔ２７５、Ｖ２８０、Ｒ２８２、Ｌ３００、Ｔ３１０、Ａ３１３、Ｎ３１５、Ｋ３１６、Ｎ３１９、Ｋ３２０、Ａ３４５、Ｓ３５７、Ｄ３５８、Ｑ３５９、Ｒ３６１、Ｋ３６２、Ｌ３６３、Ｌ３６５、Ｅ３６６、Ｙ３６９、Ａ３７１、Ａ３７４、Ｌ３７５、Ｓ３８１、Ｖ３８７、Ａ３９０、Ｗ３９１、Ｌ３９３、Ｈ３９５、Ｖ３９７、Ｄ４００、Ａ４０１、Ｓ４０２、Ｓ４０５、Ｅ４０６、Ｈ４０９、Ｑ４１２、Ｑ４１３、Ｔ４１４、Ｒ４１６、Ｌ４１７、４１９から選ばれる少なくとも１つの部位のアミノ酸置換を有し、下記（Ａ）および（Ｂ）のＬ－ラムノースイソメラーゼ活性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質より、反応温度７０℃と５０℃におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）が高いか、６０℃で１時間保温後の残存活性が高いか、または反応温度８０℃と至適温度におけるＬ－ラムノースイソメラーゼ活性の比（Ｔ８０／至適温度）が高いタンパク質。
    　（Ａ）アルドースのＣ１のＣＨＯ基とＣ２のＯＨ基を認識して反応し、Ｃ１のＣＨＯ基をＯＨ基に、Ｃ２のＯＨ基をＣＯ基に変換するか、あるいは、ケトースのＣ１のＯＨ基とＣ２のＣＯ基を認識して反応し、Ｃ１のＯＨ基をＣＨＯ基に、Ｃ２のＣＯ基をＯＨ基に変換するイソメラーゼ活性を有する。
    　（Ｂ）Ｌ－ラムノースとＬ－ラムニュロース間、Ｌ－リキソースとＬ－キシルロース間、Ｌ－マンノースとＬ－フラクトース間、Ｄ－リボースとＤ－リブロース間、Ｌ－タロースとＬ－タガトース間、及びＤ－アロースとＤ－アルロース間の異性化反応を触媒する活性を有する。
  8. 　請求項５ないし７のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  9. 　配列番号２で表される塩基配列若しくはその相補的配列含むＤＮＡ。
  10. 　請求項８または９に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
  11. 　請求項１０に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換宿主細胞。
  12. 　請求項１ないし４のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼを生産する、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３１４２として国際寄託されているエルビニア　ビリンゲ(Ｅｒｗｉｎｉａ　ｂｉｌｌｉｎｇｉａｅ)　ＧｕａＬ２１８－３。
  13. 　請求項１ないし４のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ、または請求項５ないし７のいずれかに記載のタンパク質が担体に固定化されている、固定化タンパク質。
  14. 　請求項１ないし４のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼが菌体破砕物中に存在する粗酵素の状態で、または請求項５ないし７のいずれかに記載のタンパク質が形質転換宿主細胞の、菌体破砕物中に存在する粗タンパク質の状態で担体に固定化されている、固定化タンパク質。
  15. 　前記担体が、イオン交換樹脂または合成吸着剤である請求項１３または１４に記載の固定化タンパク質。
  16. 　前記担体が、ＷＡ３０、ＦＰＡ５４、またはＦＰＡ９５である請求項１５に記載の固定化タンパク質。
  17. 請求項１ないし４のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼを生産するエルビニア属微生物、または請求項１１に記載の形質転換宿主細胞を培地中で培養し、微生物菌体中に当該Ｌ－ラムノースイソメラーゼを蓄積させ、これを採取するＬ－ラムノースイソメラーゼの製造方法。
  18. 前記培地がＬ－ラムノースを添加した無機塩培地である、請求項１７に記載のＬ－ラムノースイソメラーゼの製造方法。
  19. 　アルドースまたはケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし４のいずれかに記載のＬ－ラムノースイソメラーゼ、請求項５ないし７のいずれかに記載のタンパク質、または請求項１３ないし１６のいずれかに記載の固定化タンパク質を作用させて、対応するケトースまたはアルドースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースまたはアルドースの製造方法。

     
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