KR102187354B1 - 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 효소를 생산하는 균주, 및 이들의 사이코스 제조에 있어서의 용도가 제공된다.

Description

사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법{Psicose epimerase and method of psicose using the same}

본 발명은 사이코스 에피머화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 및 상기 효소단백질 또는 균주를 이용한 사이코스 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.

사이코스는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머로써 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있다. 그러나 과당과 달리 체내에서 흡수 시 거의 대사되지 않으며 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능성 당으로 다양한 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. 따라서 사이코스의 감미료로서의 관심이 높아지고 있으나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 ‹š문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 생산하는 기술의 개발이 필요하다.

기존의 사이코스 생산은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법이 있으며 최근에 알려진 가장 효율적인 방법으로는 아그로박테리움 투머페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스를 생산하는 것과 같은 생물학적 방법에 의한 생산 방법으로 나누어진다. 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 것이 문제가 되고 있으며 생물학적인 방법 역시 수율이 낮고 생산 비용이 높다는 문제점이 있다.

이에, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 수율과 안정성으로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 일예는 과당을 사이코스로 전환하는 효소 단백질 및 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는 기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 높은 마이크로박테리움 속 균주가 가지고 있는 전체 유전자 중에서 과당을 사이코스로 전환할 수 있는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 밝히고, 상기 야생형 효소의 아미노산 변이를 유도하여 효소 활성 및/또는 반응 조건을 변경한 특성을 갖는 사이코스 에피머화 효소를 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 야생형 효소, 변이효소 또는 이를 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 용도를 개발하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 마이크로박테리움 속 균주의 야생형 사이코스 에피머화 효소 단백질, 상기 단백질의 변이체, 상기 야생형 효소 및 변이 효소의 유전자, 그리고 상기 효소 단백질 또는 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 용도를 제공한다. 상기 균주는 야생형 효소를 생산하는 자연에서 분리한 균주 또는 돌연변이를 유도한 변이 균주이거나, 또는 상기 야생형 효소 또는 변이 효소를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 균주일 수 있다.

본 발명의 일예는 마이크로박테리움 속 균주에서 유래된 효소로서 야생형 효소 및 이의 변이형 효소를 포함하며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열의 N-말단부터 34, 64, 75, 105, 108, 109. 155, 177 및 209에 위치하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 포함하는, 사이코스 에피머화 효소 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일예는 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는, 효소 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당 함유 기질로부터 사이코스를 제조하는 사이코스 제조용 조성물에 관한 것이다. 상기 균주는 야생형 효소를 생산하는 자연에서 분리한 균주 또는 돌연변이를 유도한 변이 균주이거나, 또는 상기 야생형 효소 또는 변이 효소를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 균주일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 효소 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당 함유 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스 생산 방법에 관한 것이다. 상기 균주는 야생형 효소를 생산하는 자연에서 분리한 균주 또는 돌연변이를 유도한 변이 균주이거나, 또는 상기 야생형 효소 또는 변이 효소를 암호화하는 유전자를 도입한 재조합 균주일 수 있다.

또한, 본 발명의 일예는 4.0 내지 5.1 범위의 pI 값, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 5.1 범위의 pI값을 가진 사이코스 에피머화 효소를 포함하며 과당 함유 기질로부터 사이코스를 생산하는, 사이코스 생산용 조성물 및 상기 효소를 이용하여 과당 함유 기질과 반응하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 마이크로박테리움 속 균주의 사이코스 에피머화 효소 단백질을 제공한다. 상기 효소 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질일 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 예컨대, 상기 단백질 또는 효소는 마이크로박테리움 속 균주, 바람직하게는 Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans 및 Microbacterium phyllosphaerae로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주에서 얻어진 야생형(wild type)의 사이코스 에피머화 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 마이크로박테리움 속 균주에서 얻어진 야생형(wild type)의 사이코스 에피머화 효소 단백질의 아미노산 서열과 93% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 추가 일예는, 마이크로박테리움 속 균주에서 얻어진 야생형(wild type)의 사이코스 에피머화 효소 단백질에서 과당을 사이코스로 전환하는 활성(예컨대 D-사이코스 3-에피머화 활성)이 유지되는 한, 서열번호 1의 아미노산 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된 경우 등을 포함하는 변이 효소 단백질을 제공한다. 상기 변이 효소 단백질은 사이코스 전환 활성이 야생형 효소에 비해 높거나, 비교적 낮은 pH 및/또는 비교적 낮은 온도 범위에서 효소 반응을 수행하거나, 높은 열안정성 등의 특성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 효소 변이체는 사이코스 에피머화 효소에서 서열번호 1을 갖는 아미노산 서열의 N-말단으로부터 34번 이소류신(I), 64번 류신(L), 75번 세린(S), 105번 발린(V), 108번 발린(S), 109번 알라닌(A), 155번 발린(V), 177번 히스티딘(H), 207번 히스티딘(H), 및 209번 세린(S)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 치환된 것일 수 있다.

예를 들면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환 가능한 아미노산은 Pro, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Tyr, Trp, Phe, Asp, Glu, Met 및 Cys으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산일 수 있으며, 구체적으로 Pro, Leu, Ile, Phe, Asp, Met 및 Cys으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 변이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 치환 아미노산을 포함하는 것인 효소 단백질일 수 있다:

34 번 아미노산은 Leu, Ser 또는 Tyr이며,

64 번 아미노산은 Ile, Ser 또는 Tyr이며,

75 번 아미노산은 Pro, Trp 또는 Phe이며,

105 번 아미노산은 Pro, Trp 또는 Phe이며,

108 번 아미노산은 Asp 또는 Glu이며,

109 번 아미노산은 Phe, Trp, Met, Val, Leu 또는 Ile이며,

155 번 아미노산은 Leu, Ile, Met, Phe 또는 Trp이며,

177 번 아미노산은 Met, Val, Leu, Ile 또는 Phe이며,

209 번 아미노산은 Cys, Met 또는 Thr이다.

따라서, 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이형 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 위치의 아미노산을 포함하는 것인 효소 단백질일 수 있다:

34 번 아미노산은 Ile, Leu, Ser 또는 Tyr이며,

64 번 아미노산은 Leu, Ile, Ser 또는 Tyr이며,

75 번 아미노산은 Ser, Pro, Trp 또는 Phe이며,

105 번 아미노산은 Val, Pro, Trp 또는 Phe이며,

108 번 아미노산은 Ser, Asp 또는 Glu이며,

109 번 아미노산은 Ala, Phe, Trp, Met, Val, Leu 또는 Ile이며,

155 번 아미노산은 Val, Leu, Ile, Met, Phe 또는 Trp이며,

177 번 아미노산은 His, Met, Val, Leu, Ile 또는 Phe이며,

209 번 아미노산은 Ser, Cys, Met 또는 Thr이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이형 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 위치의 아미노산을 포함하는 것인 효소 단백질일 수 있다:

34 번 아미노산은 Ile 또는 Leu이며,

64 번 아미노산은 Leu 또는 Ile이며,

75 번 아미노산은 Ser 또는 Pro이며,

105 번 아미노산은 Val 또는 Pro이며,

108 번 아미노산은 Ser 또는 Asp이며,

109 번 아미노산은 Ala 또는 Phe이며,

155 번 아미노산은 Val 또는 Leu이며,

177 번 아미노산은 His 또는 Met이며,

209 번 아미노산은 Ser 또는 Cys이다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 효소 단백질 및 이의 변이 효소는 pI 값이 5.1이하, 예를 들면 5.05이하, 5.0이하, 4.99이하, 4.99이하, 4.90 이하일 수 있으며, pI값의 하한치는 4.0이상, 바람직하게는 4.5 이상 일 수 있다. 효소 단백질의 pI 값이 낮으므로 과당 함유 원료로부터 사이코스를 생산하는 전환 반응에서 pH 조건을 비교적 낮은 값으로 안정적으로 유지할 수 있어 유리하며, 특히 고정화 반응에도 더욱 바람직하다.

본 발명의 일예에서, 상기 변이 효소 단백질은 야생형 효소 단백질의 전환 활성 100을 기준으로, 상대적 활성이 100을 초과하는 것일 수 있으며, 예를 들면 102 이상, 103 이상 또는 105 이상일 수 있으며, 바람직하게는 110 이상일 수 있다. 상기 효소 전환 활성의 상한선는 효소 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 800 이하일 수 있다. 상기 효소 단백질의 상대적인 전환 활성은 예를 들면, 효소를 0.3 unit/ml 농도로 40 %(w/v) D-프럭토스 기질에 첨가 후 50 mM PIPES 완충액(pH7.0) 및 60℃에서 5분간 반응시켜 측정한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일예에서, 상기 변이 효소 단백질은 열안정성 척도로서 효소의 반감기(분)이 120 내지 180 범위일 수 있으며, 이는 기존에 야생효소가 90분이거나 알려진 다른 효소보다 휠씬 오랜 안정성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 예를 들면, 50 mM의 과당을 기질로 하여 1 mM CoCl₂와 효소 0.3 unit/ml이 포함된 용액에서 pH 6.0 및 60℃ 조건 하에서 10분 동안 반응시켜 효소 활성을 측정한 것이다. 이러한 우수한 열안정성은 효소 안정성에 기여하여 대량 생산 시에 생산성을 증가시키는 장점이 있다.

본 발명의 일예는, 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 예는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는, 즉 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 재조합 균주를 제공한다. 상기 재조합 균주는 상기 단백질을 발현할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴린뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론, T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터로 형질전환 시킬 수 있는 숙주 세포는 상기 단백질을 발현(과발현)시킬 수 있는 발현 시스템을 갖는 모든 미생물 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α또는 W3110 등을 예시할 수 있으며, 예컨대, BL21(DE3) 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 효소 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 효소 단백질이다. 따라서, 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이 효소 또는 이를 발현하는 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 예는, 상기 효소 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 제조용 조성물을 제공한다.

상기 사이코스 제조용 조성물은 과당을 기질로 하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것으로, 상기 재조합 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

다른 예는 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이 효소를 암호화하는, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물 (이하, '효소 단백질 등')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여 사용되는 단백질의 양은 사이코스 전환 효율을 고려하여 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 2.0mg/ml일 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여 기질로서 사용되는 과당의 농도는 용해성 및 전환 수율 등을 고려하여 선택할 수 있으며, 과당은 이성화 반응 산물, 과당을 용매에 용해하여 사용할 수 있으며, 예를 들면 전체 반응물 기준으로 10 (w/v)% 이상, 20(w/v)% 이상, 30 (w/v)% 이상, 또는 40(w/v)% 이상으로 사용할 수 있다.

효소 단백질의 최적 조건을 고려할 때, 상기 반응은 pH 5 이상, 예를 들면 pH 4.5 내지 pH 8, pH 5 내지 pH 8, 또는 pH 5.5 내지 pH 7에서 수행할 수 있다. 상기 반응은 30℃ 이상, 또는 40℃ 이상, 예를 들면 40 내지 85℃ 또는 40 내지 65℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 효소 반응의 시간은 과당에서 사이코스 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 사이코스 전환 활성을 고려하여 선정될 수 있으며, 예를 들면 전체 반응물을 기준으로 1mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 1 내지 50mg(dcw)/ml에서 수행할 수 있다.

상기 사이코스 전환효소 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 사이코스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 사이코스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 칼슘 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 망간 이온, 마그네슘 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 사이코스 생산 수율 증진 효과를 고려하여 반응에 적절한 금속 이온 농도를 선정할 수 있으며, 예를 들면 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 이상으로 할 수 있다. 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 상기 효소 단백질 등과 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다.

바람직한 다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은, 본 발명에 따른 야생형 효소 및 변이 효소 단백질을 발현하는 균주를 배양 및 회수하는 단계; 및 상기 균주 또는 상기 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 균주의 배양 단계는 사용되는 균주(숙주세포)의 특성에 따라 관련 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 4.0 내지 5.1 범위의 pI 값, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 5.1 범위의 pI값을 가진 사이코스 에피머화 효소를 포함하며 과당 함유 기질로부터 사이코스를 생산하는, 사이코스 생산용 조성물 및 상기 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당 함유 기질로부터 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 사이코스 에피머화 효소가 상기 범위의 pI 값을 갖는 경우, 사이코스의 대량 생산을 위한 균주 또는 효소의 고정화 공정 및 이를 이용한 사이코스로의 전환 공정에서 해당 효소의 최적 활성을 유지할 수 있어서 생산 효율을 극대화 시킬 수 있는 장점을 갖는다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 마이코박테리움속 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 효소 및 이로부터 유래된 변이형 효소일 수 있으며, 구체적인 효소에 대해서는 상술한 바와 같다.

상기 사이코스 에피머화 효소는 효소 단백질, 또는 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 제공될 수 있다. 상기 사이코스 에피머화 효소는 효소 단백질 또는 효소 단백질을 발현하는 균주가 담체에 고정화되어 제공될 수 있으며, 상기 담체는 알긴산 또는 이의 염일 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 사이코스 에피머화 효소 단백질은 사이코스를 생산하는 활성을 보유한 효소로서, 산업적으로 적용 가능한 조건에서 열 안정성이 매우 우수하고 반감기가 길며 높은 수율로 과당으로부터 사이코스의 대량생산이 가능하다. 따라서 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소와 이를 이용한 사이코스의 생산방법은 다양한 식품, 의약 및 화장품용 소재 산업에서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)으로 확인한 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 정제 과정을 나타내는 SDS-PAGE 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 활성을 첨가된 금속 이온의 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 온도에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 pH에 따른 활성을 보여주는 그래프이다 (■ Mcilvaine buffer, ●: Glycine-NaOH buffer).
도 6은 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 60 ℃ 온도에서 효소에 대한 열안정성을 확인하기 위한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질의 60 ℃에서 효소의 활성을 시간별로 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질을 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산 효율(사이코스 전환율)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 변이 효소 단백질 제조를 위하여 SWISS-MODEL를 사용한 Homology modeling 결과 도면이다.
도 10은 본 발명에 따른 야생형 효소 단백질(MDPE 효소)에 대한 단백질 3차 구조이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 사이코스 생산 마이코박테리움속 균주 분리 및 특성

1-1: 과당을 사이코스로 전환하는 미생물의 분리

과당을 사이코스로 전환하는 균주를 분리하기 위해 1% (w/v) 사이코스가 첨가된 Mineral salt broth (KH₂PO₄ 2.4 g/L, K2HPO4 5.6 g/L, (NH₄)₂SO₄ 2.6 g/L, MgSO₄7H₂O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L)를 사용하였다.

식품 (예를 들어, 브로콜리, 인삼, 식용꽃 등)을 선정하여, 각각의 식품을 1g을 채취하고 MSP broth에 첨가 후 30?에서 24시간 배양하여 증균을 실시하였다. 그 다음, 배양액 100 microliter를 취해 한천 배지에 도말한 후 30?에서 콜로니가 확인될 때까지 배양하였다. 상기 한천 배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별하여 MSP broth에 접종 후, 30℃에서 24시간 진탕 배양하고 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50 mM PIPES(piperazine-N, N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액(pH 7.0) 100 microliter에 넣어 부유시키고, 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하여 파쇄액을 수득하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10 mM 과당 및 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로 전환되었는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 10cm의 실리카겔(Silica gel 60F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 부비피로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 10분간 3번씩 전개하여 수행하였다.

상기 TLC 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 0.1%(w/v) 사이코스가 첨가된 MS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며, 원심분리 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 넣어 부유시키고, 70℃에서 1시간 동안 반응하였다.

그 다음, 상기 반응 결과물을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었고, 종의 균주 중에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 1종을 최종 선정하였다.

분리된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 확인하였다. 분리 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'->3')은 서열번호 3과 같으며 Microbacterium foliorum DSM12966과 99.5% 동일함을 확인하였고, Microbacterium foliorum SYG27B로 명명하였다. 상기 균주는 2015년 9월 24일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11774P를 부여받았다.

1-2: 균체반응을 이용한 최적 온도

상기에서 분리된 균주를 다양한 온도 조건하에서 균체와 기질을 반응시키고 그에 따른 사이코스 전환 활성을 비교하였다.

400g/L 과당과 1mM 망간 금속이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH7.0)에 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg(dcw)/mL로 하여, 50 내지 80℃ 범위에서 온도를 변화시키면서 1시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

반응온도 (℃)	상대활성-Relative activity (%)
50	54
60	66
I65	86
70	97
75	100
80	88

표 1에서 나타난 바와 같이, Microbacterium foliorum은 70℃의 온도까지는 반응 온도가 증가함에 따라 상대 활성이 증가하였고, 80℃의 온도에서 상대 활성이 감소함을 확인하였다.

1-3: 균주의 사이코스 생산성

실시예 1-1에서 분리된 Microbacterium foliorum SYG27B 균주의 균체 농도 20mg/mL, 과당 농도 400g/L 온도 70℃ 및 pH 7.0 조건하에서 반응 시간별 활성을 확인하였다. 상기 반응은 12시간 동안 진행하였으며, 일정 간격으로 사이코스 생산성을 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.

반응시간 (hr)	Microbacterium foliorum Relative activity (%)
1	8.4
2	13.9
4	18.5
6	20.2
8	24.8
10	26.4
12	27.1
14	27.1

표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, Microbacterium foliorum SYG27B는 반응 시간이 지날수록 사이코스 전환율이 증가하였으며, 특히 70℃에서 12시간 반응 후 사이코스 전환율이 약 27%로 최대로 나타내었으며, 이때 사이코스 생산량은 약 75g/L로 확인되었다.

실시예 2: 사이코스 전환 효소의 분리

실시예 1-1에서 사이코스 전환 활성을 나타내는 분리 균체를, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)를 포함하는 50 mM PIPES 완충 용액 (pH 7.0)에 혼탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 40분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 조효소로 사용하였다. 조효소를 50-60% 포화도의 고체 황산암모늄[(NH₄)₂SO₄]을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 회수한 다음 50 mM PIPES 완충 용액 (pH 7.0)에서 12시간 투석하여 부분 정제 효소를 획득하였다.

부분 정제된 효소는 60℃에서 10분 동안 열 처리 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 다음 상등액을 회수하여 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충 용액으로 평형화시킨 후, Hi-trap Q ion exchange chromatography column (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 실시하였다. 결합 단백질은 NaCl을 사용하여 1.0 M까지 농도 구배를 주어 용출시킨 후 각 분획의 활성을 측정하고 활성이 높은 분획을 모아 농축하였다.

Hi-trap Q에 의해 분리한 시료는 10 mM sodium phosphate (pH 6.8) 완충 용액에 평형화시킨 후, Biogel hydroxyapatite column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 실시하였다. 상기 결합된 단백질을 10-100 mM sodium phosphate (pH 6.8)로 농도 구배를 주어 용출시킨 후, 각 분획의 활성을 측정하고 활성이 높은 분획을 모아 농축하였다.

Biogel hydroxyapatite column에 의해 분리한 시료는 1.5 M ammonium sulfate를 포함한 50 mM sodium phosphate (pH 7.0)으로 평형화한 다음 Hi-trap phenyl column (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 흡착시키고 1.5 M ammonium sulfate 농도 구배법을 적용하여 분획을 획득하였다.

각 정제 단계별 정제 정도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 사용하였다. SDS-PAGE는 12% polyacrylamide gel을 사용하였고 20 mA를 주어 실시하였다. 상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, 정제된 단백질이 약 30 kDa의 분자량을 가짐을 확인하였다.

상기 정제된 단백질을 0.004 mg/ml의 농도로 과당 50 mM과 55℃ 온도조건 하에서 10분 동안 반응시킨 후, 얻어진 결과물에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석 결과 (HPLC 조건은 실시예 1과 동일), 상기 정제된 단백질은 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 정제된 단백질이 과당으로부터 사이코스를 생산하는 D-psicose epimerase의 활성을 가짐을 알 수 있다.

상기 정제된 효소 단백질의 아미노산 서열을 이메스(E-MASS.Co)방법으로 분석하였으며, 그 결과 얻어진 아미노산 서열을 서열번호 1에 표시하였다.

실시예 3: 효소의 생산 및 정제

3-1: 효소 생산

실시예 2에서 얻어진 마이크로박테리움 폴리오럼(microbacterium foliorum)로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서(서열번호 2)를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

상기 합성된 폴리뉴클레오티드를 제한효소 Not I과 Nde I을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/사이코스 에피머화 효소(pET-MDPE)를 제조하였다. heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제조된 재조합 벡터 pET-MDPE로 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도(OD)가 1.5에 도 달할 때까지 37℃, 200rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37℃의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-Dgalactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16℃ 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다. 상기 과발현이 유도된 배양액을 원심분리기 4000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 하기하는 효소 정제에 사용하였다.

3-2: 효소 정제

실시예 3-1에서 회수된 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl and 300mM NaCl at pH7.4, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4 ℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni- NTA컬럼(NiNTA Superflow. Qiagen)에 적용시킨 다음, 50mM Tris_HCl and 300mM NaCl pH7.4에 20 mM imidazol과 300 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려 주었다. 상기 50mM Tris_HCl and 300mM NaCl at pH 8.0, 300 mM imidazol을 흘려주는 과정에 의하여 목적 단백질을 분리 정제하였다. 상기 분리 정제된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50mM PIPES pH 7.0)으로 전환한 다음 실험에 사용하였다. 또한, 상기 분리 (부분) 정제된 목적단백질인 사이코스 에피머화 효소는 SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 32.8 kDa인 것으로 확인되었다.

3-3: 효소의 금속 요구성 분석

실시예 3-1에서 정제된 단백질(효소)에 금속이온 CuCl₂, MnCl₂, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, NiSO₄, 또는 CoCl₂를 각각 1 mM씩 처리하여 효소 활성을 측정하였다. 상기 효소 활성 측정은 상기 금속 이온 존재 하에서 50mM 과당 과 효소 0.3 unit/ml이 50mM Mcilavine 완충용액 (pH6.0)에서 60℃, 5분간 반응한 것을 측정한 것이다. 상기 반응 후 100 ℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지시켰다. 상기 효소 활성은 기질인 50mM 과당과 1mM Co^{2 +}을 함유한 50mM Mcilavine 완충용액 pH6.0을 60℃에서 효소와 반응시켜 분당 1 micromole의 사이코스를 생산하는 양을 1 unit으로 정의하였다. 대조군(Non)으로 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

상기 효소 활성은 생산된 사이코스 양(mM)을 사용된 효소양과 반응시간으로 나누어서 계산하였으며, 사이코스 양은 HPLC로 분석하였다. 상기 HPLC 분석은 87C(BIO-RAD) 컬럼을 사용하여 80℃에서, 이동상으로 물 100%(v/v)를 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(Agilent 1260 TID)로 사이코스를 검출하여 사이코스 생산성을 분석하였다.

상기 측정된 각 금속 이온을 처리한 경우의 효소 활성을 대조군에서의 효소 활성과 비교하여 도 3에 나타냈다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 3-1의 효소는 망간이온 및 코발트이온 첨가에 의하여 활성이 증가하는 것으로 나타나 금속 이온 요구성이 있음을 알 수 있다.

3-4: 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석

실시예 3-1에서 정제된 단백질(효소)의 pH 및 온도변화에 따른 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 과당 기질을 반응시키고 효소 활성을 확인하였다.

이 때 활성측정은, 상기 실시예 3-3에 기재된 방법을 참조하여, 50 mM 과당과 효소 0.3 unit/ml을 사용하여 pH 5 내지 9.5 및 온도 40 내지 80℃ 범위에서 10분간 이루어졌으며, 그 후 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 먼저 pH를 7로 하고 온도를 40 내지 80℃ 범위에서 변화시키며 상기 실시예 3-3와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 Y축의 상대적 활성은 가장 좋게 나온 효소 활성을 100으로 하였을 때 상대값을 의미한다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, 상기 효소는 40 내지 65℃, 구체적으로 50 내지 65℃ 범위에서 80% 이상의 활성을 나타냈으며, 특히 60℃에서 최대 활성을 보임을 알 수 있다.

pH 변화에 따른 활성을 알아보기 위해, 실시예 2.2에 기재된 방법을 참조하여, 60℃에서, 50 mM 소듐 시트레이트(sodium citrate) pH 5-6.5, 50 mM Tris-HCl pH 7-9, 및 50 mM 글라이신 NaOH pH 9.5의 완충용액을 각각 사용하여 효소 활성을 측정 하였다. 상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인되는 바와 같이, pH 5.5 이상에서 80~100의 활성을 보였고, 그 중 pH6.0에서 효소 활성이 특히 높게 나타났다.

3-5: 효소의 열 안정성 분석

온도변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 3-1에서 정제된 효소를 60℃에서 일정시간(180분) 열처리 한 후, 50 mM의 과당을 기질로 하여 1 mM CoCl₂와 효소 0.3 unit/ml이 포함된 50 mM Mcilvaine 완충용액에서 pH 6.0 및 60℃ 조건 하에서 10분 동안 반응시켜 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 100℃에서 5분간 가열하여 중지시켰다. 상기 열처리 시간에 따라서 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 3-1에서 정제된 효소의 반감기는 60℃에서 90분으로 계산되었다. 이는 기존에 보고된 대부분의 사이코스 3-에피 머화 효소들에 비해 매우 높은 값으로, 본 발명에 따른 사이코스 3-에피머화 효소가 산업적으로 반응이 용이한 온도에서 열 안정성이 우수함을 확인할 수 있다.

3-6: 효소의 역가(specific activity)분석

시간변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 반응 속도를 확인하기 위해, 상시 실시예 3에서 정제된 효소를 50 mM의 과당을 기질로 하여 1 mM CoCl₂와 효소 0.3 unit/ml이 포함된 50 mM Mcilvaine 완충용약에서 pH 6.0 및 60℃ 조건 하에서 0, 1, 2, 5분 간격으로 반응을 실시 한 후, 효소 활성은 100℃에서 5분간 가열하여 중지시켰다.

얻어진 결과를 도 7에 나타냈으며, 역가(specific acitivity)는 약 150U/mg으로 확인되었다. 역가는 효소 1mg이 분당 생성되는 사이코스 mole 단위이다.

3-6: 효소에 의한 사이코스 생산

고농도의 사이코스를 생산하기 위하여, 실시예 3-1에서 정제한 D-사이코스 3-에피머화 효소 0.1mg/ml 의 농도로 50℃, 50 mM Mcilvaine 완충용액 pH 6.0 및 1 mM CoCl₂의 조건 하에서 고농도(400 g/L)의 과당과 반응시켰다. 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 상기 반응 결과 생산된 사이코스 생산량을 측정하여 과당에서 사이코스로의 전환율을 측정하였다. 사용된 과당이 고농도이기 때문에 각 시간별로 샘플링한 용액을 20배로 희석하여 HPLC 분석을 진행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 0.1 mg/ml의 농도에서 사이코스 최종 생산량 이 118.6g/L이며, 사이코스 전환율이 약 30% 정도이다.

3-7: 효소의 pI 측정

실시예 3-1에서 정제한 D-사이코스 3-에피머화 효소의 pI값을 측정하고자, 단백질의 isoelectric focusing(2차원 전기영동)방법으로 실험을 수행하였다.

그 결과 분리된 야생형 효소의 pI 값은 4.88이었으며, 이러한 pI 값은 알려진 Clostrium cellulolyticum의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.41, Agrobacterium tumefaciens 의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.88, Treponema primitia의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.93, Ruminococcus sp. 의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.24에 비해 낮음을 알 수 있었다.

실시예 4: 변이 효소 단백질의 제조

4-1: 3차원 구조의 상동성 모델링

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사이코스 에피머화 효소의 변이 효소를 제조하기 위하여, 먼저, NCBI 웹사이트(BLAST) 도구 및 사용하는 다른 생물 유래의 효소 및 배열 정렬 도구 배열 정렬(sequence alignment) 도구 ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)을 사용해서 다른 생물 유래의 효소들을 비교하였다.

또한, 상기 효소 단백질의 3차원 구조의 상동성 모델링을, SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)을 통해 단백질 3차원 구조 상동성 모델(homology model)을 생성하였다(Singh, P. K.. et al, (2012). Indian journal of microbiology 52(3): 373-380). 주형(Template) 단백질 구조는 SWISS-MODEL 서버에서 단백질 데이터 뱅크(Protein data bank: PDB)의 주형(Template) 검색을 통해서 상기 에피머화 효소와 매우 유사한 단백질 구조를 주형으로 선택하였다. 상기 변이 효소 단백질 제조를 위하여 SWISS-MODEL를 사용한 Homology modeling 결과를 도 9에 나타내고, 상기 야생형 단백질 구조를 도 10에서 표시하였다.

4-2: 알라닌 스캐닝 돌연변이 및 도킹 결합 분석

실시예 4-1에서 수행한 상동 유전자들 간의 아미노산 서열 분석 및 활성부위 3차 구조 모델 분석을 기초로 선정된 아미노산들을 알라닌으로 치환 변이하여, 이러한 재조합 변이효소들을 대장균에서 생산한 후 각 변이부위들의 특성을 분석하였다. 상기 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석 후 재설계된 활성부위 구조 및 D-프럭토스 간 도킹 시뮬레이션을 통해 기능적으로 중요할 것으로 예측되는 아미노산들을 선별하여 D-사이코스 C3-에피머화 전환반응의 단위활성 향상을 위해 개량 타겟 부위를 디자인하였다. 알라닌 스캐닝 돌연변이를 통해 활성이 완전 소실되는 아미노산 부위 (촉매금속이온 결합 잔기 및 탈양성자화/양성자화(deprotonation/protonation) 관여 촉매 잔기로 추정)는 활성 개량을 위한 타겟 부위에서 배제하였다.

4-3: 기능성 효소의 신속한 직접 진화를 위한 반복 포화 돌연변이 (Iterative saturation mutagenesis ( ISM ))

야생형 효소의 발현을 위해, 대장균 BL21(DE3) 발현을 위해 제작된 재조합발현벡터(pET21a의 Not I 및 Nde I 제한효소 부위에 야생형 효소의 유전자를 도입하고 야생형의 C-말단에 6xHis-tag이 결합한 재조합효소를 발현함)를 변이주 라이브러리 제작을 위한 포화돌연변이법의 주형(template)으로 사용하였다.

변이분포 다양성 및 변이체 수율 등을 고려하여 역방향(inversed) PCR 기반 포화 돌연변이법을 사용하였고(2014. Anal. Biochem. 449:90-98), 제작된 변이주 라이브러리의 스크리닝 규모를 최소화(포화돌연변이 시 도입되는 코돈 수를 최소화함)하기 위해 종결코돈을 배제하고, 대장균의 희귀코돈(rare codons)이 최소화된 NNK, NTB, DBK, NRT, NDT, VMA, ATG 및 TGG 혼합 프라이머를(2012.Biotechniques 52:149-158, 2007.Nature Protocols Vol.2, No.4, 891-903) 디자인하여 사용하였다. 시퀸스 위치에 따른 사이코스 3-에피머화 효소에 대한 변이체 프라이머를 하기 표 3에 나타냈다.

서열번호	변이 위치	방향	Primer
4	I34L	정방향	GCGGGTTTCGACCTG NDT GAATTCCCGCTGATGGAC
5	I34L	역방향	GTCCATCAGCGGGAATTC CAG CAGGTCGAAACCCGC
6	L64I	정방향	GCGGTTTCTGCGTCT NDT GGTCTGTCTGGTGCGAC
7	L64I	역방향	GTCGCACCAGACAGACC AAT AGACGCAGAAACCGC
8	S75P	정방향	CGACCGACGTTACCTCT HCN GACCCGGCGGTTG
9	S75P	역방향	CAACCGCCGGGTC CGG AGAGGTAACGTCGGTCG
10	V105P	정방향	GTCGTCACTTCTGCGGT NCN ATCTACTCTGCGATGCAGAAATAC
11	V105P	역방향	GTATTTCTGCATCGCAGAGTAGAT CGG ACCGCAGAAGTGACGAC
12	S108D	정방향	CACTTCTGCGGTGTTATCTAC NAN GCGATGCAGAAATACATGG
13	S108D	역방향	CCATGTATTTCTGCATCGC ATC GTAGATAACACCGCAGAAGTG
14	A109F	정방향	CTGCGGTGTTATCTACTCT NTN ATGCAGAAATACATGGACCC
15	A109F	역방향	GGGTCCATGTATTTCTGCATA AAA GAGTAGATAACACCGCAG
16	V155L	정방향	GTTAACCGTTACGAAACCAAC HCN CTGAACACCGCGCG
17	V155L	역방향	CGCGCGGTGTTCAG CAA GTTGGTTTCGTAACGGTTAAC
18	H177M	정방향	CGTCCGAACCTGGGTATC ATG CTGGACACCTACCACATG
19	H177M	역방향	CATGTGGTAGGTGTCCAG CAT GATACCCAGGTTCGGACG
20	S209C	정방향	GTTACGTTCACATCGGTGAA NDT CACCGTGGTTACCTGG
21	S209C	역방향	CCAGGTAACCACGGTG GCA TTCACCGATGTGAACGTAAC

상기 표 3에 기재된 프라이머 서열에서, n은 a, t, g 또는 c이고, d는 a, t 또는 g이고, h는 a, t 또는 c이다.

상세하게는, 각각의 변위 부위의 앞쪽염기 15bp~20bp와 변위 부위를 치환할 염기 3bp(각각 NDT, NCN, NAN, NTN, DBK 및 ATG), 뒤쪽염기 15bp~20bp로 총 길이는 35~40bp로 하여 혼합 프라이머를 제작 이용하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 10분 신장을 30회 반복한 후, 72℃에서 60분간 신장반응을 수행하였다. 변이 부위별로 포화돌연변이 라이브러리를 제작 후 라이브러리별 변이주를 무작위 선발(<변이 11개)하고 염기서열을 분석하여 아미노산 변이분포를 평가하였다. 이의 분석결과를 기반으로 라이브러리별 서열 범위(sequence coverage) 80% 이상의 스크리닝 규모를 설정하였다 (2003. Nucleic Acids Res. 15;31:e30).

4-4: 고활성 변이효소 스크리닝

실시예 4-4에서 얻어진 포화돌연변이 라이브러리에서 변이효소를 대량으로 고속 스크리닝하기 위해 D-과당을 특이적으로 정량화할 수 있는 발색 측정법을 이용하였다.

상세하게는, D-fructose dehydrogenase 분석 방법(SIGMA-ALDRICH, assay kit) 을 위해서 배양액과 기질반응을 9 : 1 비율로　혼합한 후 70℃에서 1시간 반응하여 분석 키트 시약을 첨가하여 30 ℃ 온도에서 20분간 반응을 실시한 후, ELISA reader 600 nm에서 측정하여 OD 값으로 비교 분석하였다.야생형 효소(서열번호 1)와 상대활성 비교 시 활성(D-프럭토스 전환 D-사이코스 생성)이 증가된 변이 부위 9위치의 변이체들을 1차 선발하였고, 해당 유전자들은 염기서열 분석 후 아미노산 변이정보를 분석하였다. 구체적으로 상기 변이 위치의 아미노산을 다양한 아미노산으로 치환한 후에, 각각 변이 효소의 사이코스 전환 활성을 분석한 결과를 하기 표 4에 나타냈다.

효소	상대활성(%)
야생형(WT)	100
I34L	135
I34S	105
I34Y	110
L64I	129
L64S	108

상기 1차 선발된 변이효소들은 정제(His-tag 친화 크로마토그래피) 효소액을 이용하여 프럭토스와 반응시킨 후 반응산물을 HPLC 분석법(컬럼 Bio-Rad Aminex-87C, 컬럼 분석온도 80℃, 이동상 H₂O, 유속 0.6 ml/min, Refractive Index 검출기)을 이용하여 야생형 효소 대비 D-프럭토스 전환 D-사이코스 생성 활성이 증가된 변이 효소 9종을 최종 선발하였다.

상기 선발된 변이 효소 9종의 변이 아미노산 위치 및 치환 아미노산의 종류를 하기 표 5에 나타냈다. 하기 표 5에 나타난 아미노산 위치는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N-말단부터 개수한 아미노산 위치를 나타낸다.

아미노산 위치	Original	Variant	상대활성(%)
34	Isoleucine(I)	Leucine(L)	135
64	Leucine(L)	Isoleucine(I)	129
155	Valine(V)	Leucine(L)	150
75	Serine(S)	Proline(P)	110
105	Valine(V)	Proline(P)	105
209	Serine(S)	Cystein(C)	110
177	Histidine(H)	Methionine(M)	150
108	Serine(S)	Aspartate(D)	125
109	Alanine(A)	Phenylalnine(F)	135

실시예 5: 변이 효소의 활성 및 특성 분석

야생형 효소에 대한 변이효소의 상대활성을 평가하기 위하여, 실시예 3과 동일한 방법으로, 실시예 4에서 얻어진 각 변이 효소를 대장균 BL21(DE3)에서 발현한 후 정제(His-tag 친화 크로마토그래피)하였다.

각 변이 효소를 0.3 unit/ml 농도로 40 %(w/v) D-프럭토스 기질에 첨가 후 50 mM PIPES 완충액(pH7.0) 및 60℃에서 5분간 반응시켜 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 변이 효소의 활성에 대한, 변이 효소의 상대활성을 측정하였다. 상기 측정된 변이 효소의 상대적 활성을 표 5에 나타냈다.

또한, 표 5의 9개 변이 효소에 대한 열안정성, 금속이온 요구성, 반응속도(Kinetic parameter) 분석을 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 변이 효소의 열안정성 평가 결과를 하기 표 6에 나타냈다.

Mutation	시간(min)
	반감기(60℃)	반감기(70℃)
WT	90	30
V34P	130	75
S64C	120	60
S105P	180	90

본원에 사용된 '열안정성'은 상승된 온도에 노출된 후, 활성을 보유하는 효소의 능력을 지칭한다. 비-말토제닉 엑소아밀라아제와 같은 효소의 열안정성은 반감기에 의해 측정된다. 반감기 (t1/2)는 정의된 조건하에서 효소 활성의 절반이 불활성되는 동안의 시간(분)이다. 반감기 값은 잔류 사이코스 활성을 측정함으로써 계산된다.

또한, 변이 효소의 금속 이온 요구성을 평가한 결과, H177M 변이 효소의 경우 야생형의 금속 요구성에 대한 상대 활성이 100인 경우에 비하여, 약 150의 상대활성을 나타내었다.

실시예 4에서 얻어진 각 변이 효소에 대해서, 상기 실시예 3-7의 실험방법과 동일한 방법으로 효소의 pI값을 측정하였다.

그 결과 변이 효소 S108D의 pI 값은 4.77이었으며, 이러한 pI 값은 알려진 Clostrium cellulolyticum의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.41, Agrobacterium tumefaciens 의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.88, Treponema primitia의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.93, Ruminococcus sp.의 사이코스 에피머화 효소의 pI=5.24에 비해 낮음을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11774P 20150924

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Psicose epimerase and method of psicose using the same <130> DPP20172153KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type enzyme <400> 1 Met Asn Ile Gly Cys His Gly Leu Val Trp Thr Gly His Phe Asp Ala 1 5 10 15 Asp Gly Ile Arg Leu Ala Ser Glu Gln Thr Lys Ala Ala Gly Phe Asp 20 25 30 Leu Ile Glu Phe Pro Leu Met Asp Pro Phe Thr Phe Asp Val Ala Ala 35 40 45 Ala Lys Glu Ala Leu Glu Glu His Asp Leu Ala Val Ser Ala Ser Leu 50 55 60 Gly Leu Ser Gly Ala Thr Asp Val Thr Ser Ser Asp Pro Ala Val Val 65 70 75 80 Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu Met Lys Ala Val Asp Val Leu Ala Glu 85 90 95 Leu Gly Gly Arg His Phe Cys Gly Val Ile Tyr Ser Ala Met Gln Lys 100 105 110 Tyr Met Asp Pro Val Thr Thr Glu Gly Leu Glu Ser Ser Arg Arg Thr 115 120 125 Ile Ala Arg Val Ala Asp His Ala Ala Glu Arg Gly Ile Ser Val Ser 130 135 140 Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Leu Asn Thr Ala Arg 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Val Asp Arg Pro Asn Leu Gly Ile 165 170 175 His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ser Asp Met Phe Ala 180 185 190 Pro Val Leu Asp Ala Ala Pro Ala Leu Arg Tyr Val His Ile Gly Glu 195 200 205 Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Thr Val Asp Phe Asp Asn Phe 210 215 220 Phe Lys Ala Leu Gly Arg Ile Gly Tyr Asp Gly Pro Ile Val Phe Glu 225 230 235 240 Ser Phe Ser Ser Ala Val Val Ala Pro Asp Leu Ser Arg Met Leu Gly 245 250 255 Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Asn Val Glu Leu Gly Ala His Ala 260 265 270 Asn Ala Tyr Ile Arg Asp Lys Leu Val Ala Val Asp Ser Ile Arg Leu 275 280 285 His <210> 2 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding wild type enzyme <400> 2 atgaacatcg gatgccacgg gctcgtctgg accggacact tcgatgccga cggcatccga 60 ctctcggcgg agcagacgaa ggcggcaggc ttcgacctga tcgagttccc gctcatggat 120 ccgttcacgt tcgatgtcgc cgccgcgaag gaggcgctcg aagagcacga cctcgccgtc 180 agcgcctcgc tcggtctctc gggggcgacg gatgtgacca gctctgatcc ggcagtcgtc 240 gccgcgggcg aggcgctgct gatgaaggcc gtagatgtgc tggccgagct gggcggccgg 300 cacttctgcg gagtgatcta cagcgcgatg cagaagtaca tggacccggt gacgacagaa 360 gggctcgaga gcagccgtcg caccatcgcc cgcgtcgcgg atcacgcggc cgagcgaggg 420 atctcggtct cgctcgaggt cgtgaaccgc tatgagacca acgtgctgaa caccgcgcgg 480 caggcactcg cctacctcgc ggaggtcgat cggccgaacc tcggcatcca cctcgacacg 540 taccacatga acatcgagga gtcggatatg ttcgcgccgg tcctcgatgc cgcacccgcc 600 ctccgctacg tgcacatcgg cgagagccac cgcggctatc tcggcaccgg aacggtcgac 660 ttcgacaact tcttcaaggc gctggggcgc atcggctatg acggcccgat cgtgttcgag 720 tcgttctcct cggcggtggt cgcccccgac ctcagccgga tgctcggcat ctggcgcaac 780 ctgtggaccg acaacgtcga gctcggtgcg cacgccaacg cctacatccg cgacaagctc 840 gtcgcggtcg actcgatcag gctgcactga 870 <210> 3 <211> 1466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microbacterium foliorum <400> 3 gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggtgaacacg gagcttgctc 60 tgtgggatca gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa cctacccctg actctgggat 120 aagcgctgga aacggcgtct aatactggat acgagtggcg accgcatggt cagctactgg 180 aaagatttat tggttgggga tgggctcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 240 caccaaggcg tcgacgggta gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg 360 atgcagcaac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt ttagcaggga 420 agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaaa agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt agggcgcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 540 tttgtcgcgt ctgctgtgaa atccggaggc tcaacctccg gcctgcagtg ggtacgggca 600 gactagagtg cggtagggga gattggaatt cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc 660 aggaggaaca ccgatggcga aggcagatct ctgggccgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gggtggggag caaacaggct tagataccct ggtagtccac cccgtaaacg ttgggaacta 780 gttgtggggt ccattccacg gattccgtga cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg 840 ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggcgga 900 gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tatacgagaa 960 cgggccagaa atggtcaact ctttggacac tcgtaaacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttctatgttg 1080 ccagcacgta atggtgggaa ctcatgggat actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg 1140 gatgacgtca aatcatcatg ccccttatgt cttgggcttc acgcatgcta caatggccgg 1200 tacaaagggc tgcaataccg cgaggtggag cgaatcccaa aaagccggtc ccagttcgga 1260 ttgaggtctg caactcgacc tcatgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg 1320 ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcaagtcatg aaagtcggta 1380 acacctgaag ccggtggcct aacccttgtg gagggagccg tcgaaggtgg gatcggtaat 1440 taggactaag tcgtaacaag gtaacc 1466 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme I34L wherein n is a, t, g or c and d is a, t or g <400> 4 gcgggtttcg acctgndtga attcccgctg atggac 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme I34L <400> 5 gtccatcagc gggaattcca gcaggtcgaa acccgc 36 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme L64I wherein n is a, t, g or c and d is a, t or g <400> 6 gcggtttctg cgtctndtgg tctgtctggt gcgac 35 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme L64I <400> 7 gtcgcaccag acagaccaat agacgcagaa accgc 35 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme S75P wherein n is a, t, g or c, and h is a, t or c. <400> 8 cgaccgacgt tacctcthcn gacccggcgg ttg 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme S75P <400> 9 caaccgccgg gtccggagag gtaacgtcgg tcg 33 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme V105P wherein n is a, t, g or c <400> 10 gtcgtcactt ctgcggtncn atctactctg cgatgcagaa atac 44 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme V105P <400> 11 gtatttctgc atcgcagagt agatcggacc gcagaagtga cgac 44 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme S108D wherein n is a, t, g or c <400> 12 cacttctgcg gtgttatcta cnangcgatg cagaaataca tgg 43 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme S108D <400> 13 ccatgtattt ctgcatcgca tcgtagataa caccgcagaa gtg 43 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme A109F wherein n is a, t, g or c. <400> 14 ctgcggtgtt atctactctn tnatgcagaa atacatggac cc 42 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme A109F <400> 15 gggtccatgt atttctgcat aaaagagtag ataacaccgc ag 42 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme V155L wherein n is a, t, g or c and h is a, t or c <400> 16 gttaaccgtt acgaaaccaa chcnctgaac accgcgcg 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme V155L <400> 17 cgcgcggtgt tcagcaagtt ggtttcgtaa cggttaac 38 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme H177M <400> 18 cgtccgaacc tgggtatcat gctggacacc taccacatg 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme H177M <400> 19 catgtggtag gtgtccagca tgatacccag gttcggacg 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mutated enzyme S209C wherein n is a, t, g or c, and d is a, t or g <400> 20 gttacgttca catcggtgaa ndtcaccgtg gttacctgg 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mutated enzyme S209C <400> 21 ccaggtaacc acggtggcat tcaccgatgt gaacgtaac 39

Claims (22)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열의 N-말단부터 34, 64, 75, 105, 108, 109, 155, 177 및 209에 위치하는 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서 치환된 아미노산 서열을 포함하는,
   상기 치환된 아미노산은, Pro, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Tyr, Trp, Phe, Asp, Glu, Met 및 Cys으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산인 것이며,
   망간 또는 코발트에 의한 사이코스 에피머화 효소의 활성이 증가하는 특징을 갖는 것인,
   사이코스 에피머화 효소 단백질.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 치환된 아미노산은 Pro, Leu, Ile, Phe, Asp, Met 및 Cys으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산인 것인 효소 단백질.
4. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 치환 아미노산을 포함하는 것인 효소 단백질:
   34 번 아미노산은 Leu, Ser 또는 Tyr이며,
   64 번 아미노산은 Ile, Ser 또는 Tyr이며,
   75 번 아미노산은 Pro, Trp 또는 Phe이며,
   105 번 아미노산은 Pro, Trp 또는 Phe이며,
   108 번 아미노산은 Asp 또는 Glu이며,
   109 번 아미노산은 Phe, Trp, Met, Val, Leu 또는 Ile이며,
   155 번 아미노산은 Leu, Ile, Met, Phe 또는 Trp이며,
   177 번 아미노산은 Met,Val,Leu,Ile 또는 Phe이며,
   209 번 아미노산은 Cys, Met 또는 Thr이다.
5. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하기 위치의 아미노산을 포함하는 것인 효소 단백질:
   34 번 아미노산은 Ile 또는 Leu이며,
   64 번 아미노산은 Leu 또는 Ile이며,
   75 번 아미노산은 Ser 또는 Pro이며,
   105 번 아미노산은 Val 또는 Pro이며,
   108 번 아미노산은 Ser 또는 Asp이며,
   109 번 아미노산은 Ala 또는 Phe이며,
   155 번 아미노산은 Val 또는 Leu이며,
   177 번 아미노산은 His 또는 Met이며,
   209 번 아미노산은 Ser 또는 Cys이다.
6. 제1항에 있어서, 상기 치환된 아미노산 서열을 포함하는 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질에 대비 상대적인 효소 활성(%)이 102이상인, 효소 단백질.
7. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질의 pI가 4.0 내지 5.1인 것인 효소 단백질.
8. 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
9. 제8항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주.
11. 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당 함유 기질로부터 사이코스를 제조하는 사이코스 제조용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 망간 이온, 코발트 이온, 및 마그네슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는, 사이코스 제조용 조성물.
13. 제1항, 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당 함유 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스 생산 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 효소 단백질 또는 균주는 담체에 고정화된 것인, 사이코스 생산 방법.
15. 제13항에 있어서, 상기 반응은 pH 4.5 내지 pH 8의 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스 생산 방법.
16. 제13항에 있어서, 상기 반응은 40 내지 85℃의 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스 생산 방법.
17. 제13항에 있어서, 상기 과당 함유 기질에 포함된 과당의 농도는 55 내지 99%(w/w)인, 사이코스 생산 방법.
18. 삭제
19. 제11항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 마이코박테리움속 균주에서 유래된 것인 사이코스 생산용 조성물.
20. 삭제
21. 제11항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 효소 단백질 또는 효소 단백질을 발현하는 균주가 담체에 고정화되어 제공되는 것인 사이코스 생산용 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 담체는 알긴산 또는 이의 염인, 사이코스 생산용 조성물.

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