KR101539097B1

KR101539097B1 - 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR101539097B1
Application number: KR1020130164686A
Authority: KR
Inventors: 한은진; 김혜정; 안신혜; 전세희; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-07-23
Also published as: US20170211109A1; JP6339680B2; KR20150076051A; US9951361B2; EP3088515A4; CN105849260A; ES2750552T3; EP3088515B1; JP2017500873A; CN105849261B; EP3087180A4; JP2017501729A; CN105849261A; WO2015099256A1; EP3088515A1; US9701953B2; EP3087180A1; CN105849260B; WO2015099246A1; US20160304853A1

Abstract

사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 및 이들의 사이코스 제조에 있어서의 용도가 제공된다.

Description

사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법{Polynucleotide encoding psicose epimerase and method of producing psicos using the same}

사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 및 이들의 사이코스 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.

사이코스는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머로써 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있다. 그러나 과당과 달리 체내에서 흡수 시 거의 대사되지 않으며 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능성 당으로 다양한 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. (Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, and H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., and K. Izumori. 2004. D-Psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127.)

따라서 사이코스의 감미료로서의 관심이 높아지고 있으나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 ?문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 생산하는 기술의 개발이 필요하다.

기존의 사이코스 생산은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법이 있으며 최근에 알려진 가장 효율적인 방법으로는 아그로박테리움 투머페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스를 생산하는 것과 같은 생물학적 방법에 의한 생산 방법으로 나누어진다. 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 것이 문제가 되고 있으며 생물학적인 방법 역시 수율이 낮고 생산 비용이 높다는 문제점이 있다.

따라서 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 일례는 과당을 사이코스로 전환하는 효소의 아미노산 서열을 제공한다.

다른 예는 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 높은 신규한 Ensifer adhaerens 균주를 토양으로부터 분리 및 동정하였다(Ensifer adhaerens SYG29; 기탁번호: KCCM11405P). Ensifer adhaerens가 가지고 있는 전체 유전자 중에서 과당을 사이코스로 전환할 수 있는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 밝히고자 연구를 진행하여, 그 염기서열을 최초로 밝혔다.

또한 이에 따라 확보한 폴리뉴클레오타이드를 재조합 벡터에 삽입하고 발현시켜 과당으로부터 사이코스를 생성하는 활성을 갖는 효소를 확보함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 기능이 밝혀지지 않은 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 확인하고, 상기 단백질이 D-사이코스 3-에피머화 효소 활성을 가지며 고수율로 사이코스를 제조할 수 있음을 확인하여 완성된 것으로, 상기 유전자 및 단백질의 사이코스 생산에 있어서의 용도 및 상기 단백질의 D-사이코스 3-에피머화 효소로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지는 단백질일 수 있다. 따라서, 다른 예는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며 과당을 사이코르로 전환시키는 활성을 갖는 사이코스 에피머화 효소를 제공한다. 상기 효소는 D-사이코스 3-에피머화 활성을 갖는 효소일 수 있다. 예컨대, 상기 단백질 또는 효소는 Ensifer adhaerens에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질 또는 효소는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 과당을 사이코스로 전환하는 활성(예컨대 D-사이코스 3-에피머화 활성)이 유지되는 한, 이에 한정되지 않고 서열번호 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 경우 등을 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 단백질 또는 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 유지하고, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 최소한 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 효소는 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 27 내지 33kDa, 예컨대, 29 내지 31kDa 일 수 있다.

다른 예는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 예는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는, 즉 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 재조합 균주를 제공한다. 상기 재조합 균주는 상기 단백질을 발현할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예컨대, 서열번호 2의 염기 서열, 또는 상기 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 2 의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 2의 염기 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖고, 이로부터 암호화된 단백질이 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 유지하는 것을 의미한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 염기서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴린뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론, T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 대장균 내 발현에 적합한 pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있다.

상기 재조합 벡터로 형질전환 시킬 수 있는 숙주 세포는 상기 단백질을 발현(과발현)시킬 수 있는 발현 시스템을 갖는 모든 미생물 중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등을 예시할 수 있으며, 예컨대, BL21(DE3) 균주를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.

상기 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 효소 단백질이다. 따라서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이를 발현하는 재조합 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 예는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 제조용 조성물을 제공한다. 상기 사이코스 제조용 조성물은 과당을 기질로 하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것으로, 상기 재조합 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 재조합 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소 단백질을 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

다른 예는 상기 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물 (이하, '효소 단백질 등')로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 과당과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질 등을 과당과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질 등을 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 사용되는 단백질의 양은 전체 반응물 기준으로 0.001 mg/ml 내지 2.0mg/ml, 0.003mg/ml 내지 2.0mg/ml, 0.003 mg/ml 내지 1.0mg/ml, 0.01 mg/ml 내지 2.0 mg/ml, 또는 0.01mg/ml 내지 1.0mg/ml일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 사이코스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 80%(w/v), 예컨대, 55 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 효소 단백질은 알칼리 조건으로 갈수록 활성이 증가하며, 약 pH 7 이상, 또는 약 pH 7.5 이상, 예컨대, pH 7.5 내지 10의 범위에서 90% 이상의 활성을 유지한다 (도 5 참조). 이와 같은 효소 단백질의 최적 조건을 고려할 때, 상기 반응은 pH 7 이상 또는 pH 7.5 이상, 예컨대, pH 7 내지 11, pH 7 내지 10, pH 7 내지 9, pH 7.5 내지 11, pH 7.5 내지 10, 또는 pH 7.5 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 70℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 70℃, 예컨대, 42 내지 65℃, 45 내지 62℃, 50 내지 60℃, 또는 52 내지 57℃의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반응 시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 48 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48 시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36 시간, 3 내지 24 시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 재조합 균주를 사용하는 경우, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 사이코스 전환효소 활성을 갖는 효소 단백질은 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효소 단백질에 의한 반응을 금속 이온 존재 하에서 수행함으로써 사이코스의 생산 수율을 증진시킬 수 있다. 사이코스 생산 수율에 기여할 수 있는 금속이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 칼슘 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 망간 이온, 마그네슘 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.1mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.1mM 내지 5mM, 예컨대, 0.1 내지 2mM, 또는 0.5 mM 내지 1.5mM 범위로 할 수 있다.

따라서, 상기 사이코스 제조용 조성물은 상기한 금속 이온을 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 함량은 상기한 바와 같다. 또한, 상기 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류와 첨가량은 상기한 바와 같다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 상기 효소 단백질 등과 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온이 배양물에 첨가되거나 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수 있다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은, 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 사이코스 에피머화 효소 단백질을 준비 및 정제하는 단계; 및 상기 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

바람직한 다른 일 구현 예에 있어서, 상기 사이코스의 생산 방법은, 서열번호 1 의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 발현하는 재조합 균주를 배양 및 회수 하는 단계; 및 상기 재조합 균주 또는 상기 재조합 균주로부터 분리된 효소 단백질을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양 단계는 사용되는 균주(숙주세포)의 특성에 따라 관련 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있지만 이 방법들에 한정된 것은 아니다. 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 예컨대, 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지, TB 배지 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 재조합 균주의 배양물은 일반적으로 숙주 세포(예컨대, 대장균)을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 상기 재조합 균주를 35℃ 내지 37℃ 및 150 내지 250rpm 조건 하에서 진탕 배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한, 상기 효소 단백질의 과발현을 유도하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용하는 유도 물질을 첨가할 수 있다. 예를 들면, 상기 유도 요소가 lac 오페론 또는 trc 포로모터인 경우, Lactose 나 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토티오피라노시드)일 수 있으며, 상기 유도 시기는 당업자에 의하여 배양의 적절한 시기에 이루어질 수 있다.

상기 재조합 균주는 상기 얻어진 배양물을 원심분리 및/또는 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균주를 균질화시키고 원심 분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다. 예컨대, 회수된 균주를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 니켈-NTA 컬럼(Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 250mM 이미다졸의 농도로 효소 단백질을 회수할 수 있다.

상기 과당과 반응시키는 단계는 상기 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다. 예컨대 pH 7 이상 또는 pH 7.5 이상, 예컨대, pH 7 내지 11, pH 7 내지 10, pH 7 내지 9, pH 7.5 내지 11, pH 7.5 내지 10, 또는 pH 7.5 내지 9, 및/또는 40 내지 70℃, 예컨대, 42 내지 65℃, 45 내지 62℃, 50 내지 60℃, 또는 52 내지 57℃의 온도 조건하에 이루어지는 것일 수 있다. 상기 과당은 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대 50 내지 75%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 상기 범위로 과당을 사용함으로써 보다 경제적이며 효율적으로 사이코스를 생산할 수 있다.

또한 재조합 균주를 사용할 경우 바람직하게는 과당과 반응시키기 전에 상기 회수된 균체를 예컨대, 0.85%(w/v) NaCl 등을 사용하여 2회 이상 세척하여 사용할 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 과당과 반응시키는 단계는 망간 및 마그네슘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속의 이온을 더욱 첨가하여 이루어질 수 있다. 상기 금속 이온은 0.1mM 내지 5mM, 예컨대, 0.1 내지 2mM, 또는 0.5 mM 내지 1.5mM 범위로 첨가할 수 있다. 상기 범위에 미달할 경우 활성 증가 효과를 충분히 얻을 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 사용되는 양에 비해 얻게 되는 활성 증대 효과가 미미하여 바람직하지 않다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 사이코스 에피머화 효소 단백질은 사이코스를 생산하는 활성을 보유한 효소로써, 산업적으로 적용 가능한 조건에서 열 안정성이 매우 우수하고 반감기가 길며 높은 수율로 과당으로부터 사이코스의 대량생산이 가능하다. 따라서 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소와 이를 이용한 사이코스의 생산방법은 다양한 식품, 의약 및 화장품용 소재 산업에서 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 일 실시예의 정제 과정을 나타내는 SDS-PAGE 도면이다 (lane1: 조효소, lane2: 황산암모늄, lane3: 열처리, lane 4: Hi-trap Q, lane 5,6: Hydroxyapatite, lane 7,8,9,10: Hi-trap phenyl).
도 2는 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 첨가된 금속 이온의 종류에 따라 보여주는 그래프이다.
도 4은 일 실시예의 D-아시코스 3-에피머화 효소의 온도에 따른 활성을 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 pH에 따른 활성을 보여주는 그래프이다 (■: Mcilvaine buffer, ●: Glycine-NaOH buffer).
도 6는 일 실시예의 50℃ 및 60℃에서의 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 시간 별로 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시예의 Lineweaver-Burk 이중역수 작도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산 효율(사이코스 전환율)을 보여주는 그래프이다.
도 9은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 고농도 과당으로부터의 사이코스 생산성을 HPLC에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10는 실시예 1에서 사용된 균주가 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 HPLC 분석으로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 기탁균주 KCCM11405P의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'->3')을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 가지는 토양유래 미생물 Ensifer adhaerens 의 배양

Ensifer adhaerens 균주(Ensifer adhaerens SYG29; 기탁번호: KCCM11405P)를 1% 사이코스가 첨가된 최소배지(KH₂PO₄ 2.4 g/L, K₂HPO₄ 5.6 g/L, (NH₄)₂·SO₄ 2.6 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L)를 사용하여 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 상기 얻어진 배양물을 4,000rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 균체만 회수하였다.

상기 균주는 다음과 같은 과정으로 선별된 사이코스 생산 균주이다:

근권토양 1g을 0.85%(w/v) NaCl 10mL에 현탁하고, 100ul(microliter)를 취해 한천배지에 도말한 후 30℃에서 배양하였다. 상기 한천배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별한 후, 최소배지(KH₂PO₄ 2.4g/L, K₂HPO₄ 5.6g/L, (NH₄)₂·SO₄ 2.6g/L, MgSO₄·7H₂O 0.1g/L, yeast extract 1g/L)에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양하고, 원심분리 한 후, 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50mM PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액 (pH 8.0) 100㎕에 넣어 부유시키고, 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10mM 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 8시간 동안 반응시켰다.

박층 크로마토그래피 (TLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로의 전환이 이루어졌는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 5cm의 실리카겔(Silica gel 60 F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 조건으로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 3분 30초간 2번씩 전개하여 수행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6ml/min로 하였다.

상기 TLC 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 1%(w/v) 과당과 0.05%(w/v) 사이코스가 첨가된 최소배지에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며 원심분리 한 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 균체 농도 40mg-dcw/ml 조건에서 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES buffer (pH 8.0)를 넣어 부유시키고, 70℃에서 6시간 동안 균체와 과당과의 반응을 실시하였다. 상기 반응 결과물을 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시키고 HPLC를 통하여 사이코스 생산을 확인하였다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 앞서 설명한 조건(용매는: 물, 온도: 80℃, 유속: 0.6ml/min)으로 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 확인된 바와 같이, HPLC 분석을 통해 과당에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 1종을 최종 선정하였다.

상기 균주는 2013년 3월 29일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11405P를 부여 받았다. 상기 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'->3')은 도 11에 나타내었다.

실시예 2. Ensifer adhaerens 유래의 사이코스 전환 효소의 정제

상기 실시예 1에서 회수된 균체를 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)를 포함하는 50 mM PIPES 완충 용액 (pH 7.0)에 혼탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 40분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 조효소로 사용하였다.

조효소를 50-60% 포화도의 고체 황산암모늄[(NH₄)₂·SO₄]을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 회수한 다음 50 mM PIPES 완충 용액 (pH 7.0)에서 12시간 투석하여 부분 정제 효소를 획득하였다.

부분 정제된 효소는 60℃에서 10분 동안 열 처리 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 다음 상등액을 회수하여 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충 용액으로 평형화시킨 후, Hi-trap Q ion exchange chromatography column (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 실시하였다. 결합 단백질은 NaCl을 사용하여 1.0 M까지 농도 구배를 주어 용출시킨 후 각 분획의 활성을 측정하고 활성이 높은 분획을 모아 농축하였다.

Hi-trap Q에 의해 분리한 시료는 10 mM sodium phosphate (pH 6.8) 완충 용액에 평형화시킨 후, Biogel hydroxyapatite column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 실시하였다. 상기 결합된 단백질을 10-100 mM sodium phosphate (pH 6.8)로 농도 구배를 주어 용출시킨 후, 각 분획의 활성을 측정하고 활성이 높은 분획을 모아 농축하였다.

Biogel hydroxyapatite column에 의해 분리한 시료는 1.5 M ammonium sulfate를 포함한 50 mM sodium phosphate (pH 7.0)으로 평형화한 다음 Hi-trap phenyl column (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 흡착시키고 1.5-0 M ammonium sulfate 농도구배법을 적용하여 분획을 획득하였다.

상기 방법으로 Ensifer adhearens 균주로부터 효소를 5단계 절차에 의해 균일하게 정제하여 그 결과를 표 1에 요약하였다.

정제 단계	전체 활성 (U)	총 단백질 (mg)	특이 활성 (U/mg)	활성 회수 (%)	정제인자 (배수)
조효소	257.34	1286.7	0.20	100	1
황산암모늄	211.01	376.8	0.56	82.01	2.8
열처리	186.12	282	0.66	72.32	3.3
Hi-trap Q	170.27	48.1	3.54	66.17	17.7
Hydroxyapatite	19.8	2.2	9.00	7.7	45
Hi-trap phenyl	11.90	0.13	30.5	4.62	152.5

각 정제 단계별 정제 정도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 사용하였다. SDS-PAGE는 12% polyacrylamide gel을 사용하였고 20 mA를 주어 실시하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보여지는 바와 같이, 정제된 단백질이 약 30 kDa의 분자량을 가짐을 확인하였다 (도 1). 상기 정제된 단백질을 0.004 mg/ml의 농도로 과당 50 mM과 55℃ 조건 하에서 10분 동안 반응시킨 후, 얻어진 결과물에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 HPLC 분석을 수행하였다. HPLC 분석 결과 (HPLC 조건은 실시예 1과 동일), 상기 정제된 단백질은 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 정제된 단백질이 과당으로부터 사이코스를 생산하는 D-psicose epimerase의 활성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 3. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 N-말단 아미노산 서열의 결정

상기에서 정제된 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 이메스(E-Mass.Co)에 의뢰하여 분석하였다. N-말단의 처음 44개의 아미노산 잔기는 MQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPA이었다. 효소의 아미노산 서열을 GenBank에 대한 BLAST 조사(NCBI)를 통하여 분석하였다. 그 결과 상기 정제된 단백질은 시노리조비움 속(Sinorhizobium fredii NGR234)의 D-tagatose epimerase (accession number; YP002823363.1)와 약 80%의 높은 상동성을 나타내었다.

실시예 4. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 유전자 분리

4-1. 단백질을 암호화하는 DNA 를 증폭시키기 위한 합성 DNA 프라이머의 제조

사이코스 전환 효소활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 증폭시키기 위한 합성 DNA 프라이머를 제조하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다. 상기 실시예 3에서의 Ensifer adhaerens 유래 사이코스 전환 효소의 N-말단 아미노산 서열의 protein blast(NCBI) 분석 결과를 바탕으로 80% 이상의 상동성이 있는 효소(Accession Nos.: YP002823363.1, YP006398480.1, YP005192599.1, NP437010.1)를 선별하여 해당 효소들이 5' 및 3' 말단에 인접한 부위에 각각 sugar ABC transporter 및 carbohydrate kinase 를 코딩하는 DNA서열을 공통적으로 갖는 구조임을 확인하였다.

이에, 본 발명의 D-사이코스 3-에피머화 효소활성을 갖는 단백질을 암호화하는 전체 DNA 서열(full DNA sequence)를 찾기 위해 상기 공통적으로 존재하는 sugar ABC transporter 및 carbohydrate kinase 구조 유전자를 포함하는 사이코스 전환효소의 전체 서열을 확보하고, 해당 사이코스 전환 효소활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 증폭시키기 위해서 아래의 서열 번호 4, 5, 6 및 7의 염기서열을 갖는 혼합 프라이머를 제작하였다.

서열번호 4: 5' ACA TGA TCG GCT CCA ATC TC 3'

서열번호 5: 5' TAT TTG ATG AAG TCG CGT GC 3'

서열번호 6: 5' GCA CGC GAC TTC ATC AAA TA 3'

서열번호 7: 5' GGC CGA GAT ACC AGC GCG C 3'

4-2. Ensifer adhaerens 유래 염색체 DNA ( chromosomal DNA )를 사용한 PCR 에 의한 사이코스 전환 효소의 일부를 함유하는 DNA 단편의 취득

상기 실시예 1에서 준비된 균주의 배양액 5ml을 원심분리하여 집균하여 Genomic DNA extraction kit (Bioneer.Co.)를 사용하여, 설명서 방법에 근거하여, 균체로부터 염색체 DNA를 취득하였다. 주형으로서 Ensifer adhaerens (Ensifer adhaerens SYG29; 기탁번호: KCCM11405P) 유래 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 사용하고, 각각 서열번호 4과 5, 및 6과 7에 기재된 염기서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여, PCR 기술로 증폭을 수행하였다. 증폭은 Thermal Cycler (Perkin Elmer.Co.)를 사용하여 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 각각 이루어진 30회의 사이클로 실시하였다. 증폭 생성물 확인은 반응액 2 μl를 1% 아가로스 전기영동으로 수행하였다. 그 결과, 약 1 kb의 DNA 단편이 증폭되어 있는 것이 확인되었다.

각각의 DNA 단편의 서열 분석으로 통해 사이코스 전환 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 부분을 확인하였고, 이를 바탕으로 NdeI과 XhoI를 포함하는 합성 프라이머(서열번호 8: 5' AGA TAT ACA TAT GCA GGG TTT TGG CGT CC 3'; 서열번호 9: 5' AAG GCT CGA GGA TCA ATC CGT ATT GCC GGG 3')를 제작하여 상기 Ensifer adhaerens 유래 염색체 DNA(chromosomal DNA)에 대하여 PCR을 수행하였다. 증폭 생성물 확인은 반응액 2 μl를 1% 아가로스 전기영동으로 수행하였다. 그 결과, 약 0.9 kb의 DNA 단편이 증폭되어 있는 것이 확인하였고 서열 분석을 통해 서열번호 2에 나타내었다.

또한 DNA 단편의 서열 분석을 통해 promoter로 예상되는 DNA 서열을 확보하였는데 이를 서열번호 3에 나타내었다.

4-3. D- 사이코스 3- 에피머화 효소 유전자의 클로닝

PCR 증폭 기술로 확보한 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET21a(Nobagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a/사이코스 3-에피머화 효소(pET-EDPE)를 제작하였다. (도 2 참조). 상기 제작된 재조합 벡터를 heat shock 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환하여 재조합 균주를 제조하였다.

형질 전환된 재조합 균주를 5 ml LB-ampicilline 배지(Difco)에 10⁴ CFU/ml 의 양으로 접종한 후, 600 nm에서의 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37℃, 200 rpm에서 진탕 배양하고, 이를 다시 200 ml LB-ampicilline 배지에 접종, 37℃의 진탕 배양기에서 배양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 0.1 mM의 IPTG(Isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 이 때 과 발현 유도시점부터 배양조건은 16℃, 150 rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지하였다.

이후 원심분리기 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 2회 세척 후 효소 정제에 사용하였다.

실시예 5. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 정제 및 특성 확인

5-1. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 정제

상기 실시예 4-3에서 회수된 균체를 lysis buffer(50 mM Tris-HCl 300 mM NaCl pH 7.0, 10 mM imidazol)에 혼탁시킨 후, 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4℃에서 20분간 파쇄하였다. 파쇄액을 13000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형 시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 50 mM Tris-HCl 300 mm NaCl pH 7.0에 20 mM imidazol과 250 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 마지막 과정인 50 mM Tris-HCl 300 mM NaCl pH 7.0, 250 mM imidazol을 흘려줌으로써 목적 단백질을 정제하였다. 용출된 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액(50 mM PIPES pH 7.0)으로 전환한 다음 실험에 사용하였다.

5-2. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 금속이온 요구성 분석

상기 실시예 5-1에서 얻어진 D-사이코스 에피머화 효소의 금속이온 요구성을 확인하기 위해 금속이온 MgSO₄ 또는MnCl₂를 각각 1 mM씩 처리하여 효소 활성을 측정하였다.

상기 효소 활성 측정은 상기 금속 이온 존재 하에서 50mM 과당과 효소 0.5 unit/ml이 50 mM PIPES (piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액 (pH 7.0)에서 55℃에서 효소와 반응시켜 분당 1 ?ol의 사이코스를 생산하는 양을 1 unit으로 정의하였다. 대조군(Non)으로 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하였다.

상기 효소 활성은 생산된 사이코스 양(mM)을 사용된 효소양과 반응시간으로 나누어서 계산하였으며, 사이코스 양은 HPLC로 분석하였다. 상기 HPLC 분석은 87C(BIO-RAD) 컬럼을 사용하여 80℃에서, 이동상으로는 물 100%(v/v)를 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며, Refractive Index Detector(Agilent 1260 TID)로 사이코스를 검출하여 사이코스 생산성을 분석하였다.

상기 측정된 각 금속 이온을 처리한 효소 활성을 대조군의 효소 활성과 비교하여 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 5-1의 효소는 망간, 마그네슘 이온에 의해 활성이 증가하는 것으로 나타나 금속 이온 요구성이 있음을 알 수 있다.

5-3. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 온도, pH 변화에 따른 활성 분석

pH 및 온도 변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 활성을 확인하기 위해, 다양한 pH 및 온도에서 효소와 과당 기질을 반응시키고 활성을 확인하였다.

먼저 pH를 7.0으로 하고 온도를 40 내지 70℃ 범위에서 변화시키며 효소 활성을 측정하였다. 상기 효소 활성 측정은 실시예 5-2의 과정을 참조하였다. 상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 효소는 50 내지 60℃ 범위에서 높은 전환율을 나타냈으며, 특히 55℃에서 최대 전환율을 보임을 알 수 있었다. 도 4의 Y축의 상대적 활성은 가장 좋게 나온 효소 활성을 100으로 하였을 때의 상대값을 의미한다.

또한 pH 변환에 따른 활성을 알아보기 위해, 상기한 방법을 참조하여, 55℃에서 Mcilvaine buffuer pH 5.0-9.0, 50 mM Glycine-NaOH pH 9.0-10.0의 완충용액을 각각 사용하여 효소 활성을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 효소는 알칼라인 조건으로 갈수록 높은 활성을 나타내었으며 pH 7.5-10.0의 범위에서 90% 이상의 활성을 유지하였다. 이 때 활성 측정은 50 mM 과당, 효소 0.5 unit/ml으로 각각의 pH와 온도 범위에서 10분간 반응하였으며, 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 중지시켰다.

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 사이코스 3-에피머화 효소는 비교적 넓은 온도 및 pH 범위에서 활성의 변화가 크지 않은 것으로 확인되었으며, 이는 산업적으로 사용하기에 적합한 이점으로, 사이코스 산업화에 유리하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

5-4. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 열 안정성 분석

온도변화에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 5-1에서 정제된 효소를 55℃ 및 60℃에서 일정시간(8시간) 열처리 한 후, 50 mM의 과당을 기질로 하여 1 mM MnCl₂와 효소 0.5 unit/ml이 포함된 50 mM PIPES 완충용약에서 pH 7.0 및 55℃ 조건 하에서 10분 동안 반응시켜 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성은 100℃에서 5분간 가열하여 중지시켰다.

상기 열처리 시간에 따라서 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서와 같이, 실시예 5-1에서 정제된 효소의 반감기는 55℃와 60℃ 각각 약 22시간, 7시간으로 계산 되었다. 이는 기존에 보고된 대부분의 사이코스 3-에피머화 효소들에 비해 매우 높은 값으로, 본 발명에 따른 사이코스 3-에피머화 효소가 산업적으로 반응이 용이한 온도에서 열 안정성이 우수함을 확인 할 수 있다.

5-5. D- 사이코스 3- 에피머화 효소의 반응속도( Kinetic parameter ) 분석

실시예 5-1에서 정제한 Ensifer adhaerens 유래의 사이코스 에피머화 효소의 효소 반응속도를 살펴보기 위해 kinetic parameter 분석을 실시하였다.

기질인 과당의 농도를 10 내지 50 mM 범위에서 변화시키면서, 실시예 5-1의 효소 0.5 unit/ml 및 1 mM MnCl₂이 첨가된 50 mM PIPES 완충용약 pH 7.0 및 55℃ 조건 하에서 반응시켜 효소 활성을 측정하였다. 100℃에서 5분간 가열하여 효소 활성을 중지시켰다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 결과로 효소 반응 속도를 단량체로 계산했을 경우 과당의 Km 값은 18.6mM이고 k_cat은 2511.2 min^-1이었다. 상기 효소 반응 속도는 michaelis-menten equation에 근거하여 계산하였다.

본 발명에 따른 사이코스 3-에피머화 효소의 과당에 대한 촉매효율(catalytic efficiency)은 135 로써, 기존에 발표된 아그로박테리움 투메패시언스 유래의 사이코스 3-에피머화 효소의 촉매효율인 85보다 높은 것으로 나타났다.

5-6. 고농도 과당에서 D- 사이코스 3- 에피머화 효소에 의한 사이코스 생산

고농도의 사이코스를 생산하기 위하여, 실시예 5-1에서 정제한 D-사이코스 3-에피머화 효소 0.1 내지 0.5 mg/ml의 농도로 55℃, 50 mM PIPES 완충용액 pH 7.0 및 1 mM MnCl₂의 조건 하에서 고농도(400 g/L)의 과당과 반응시켰다.

상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 상기 반응 결과 생산된 사이코스 생산량을 측정하여 과당에서 사이코스로의 전환율을 측정하였다. 사용된 과당이 고농도이기 때문에 각 시간별로 샘플링한 용액을 20배로 희석하여 HPLC 분석을 진행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 0.5 mg/ml의 농도에서 사이코스 최종 생산량이 118.6g/L이며, 사이코스 전환율이 약 30% 정도이다.

한편, 상기와 같이 고농도 과당에서의 생물 전환에 의한 사이코스 생산성을 HPLC로 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11405P

20130329

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Polynucleotide encoding psicose epimerase and method of producing psicos using the same <130> DPP20136262KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of D-psicose 3-epimerase originated from Ensifer adhaerens <400> 1 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Ala Val 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Ala 35 40 45 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Glu Ala Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Thr Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Met Ile Lys Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ile Gly Thr Gly Ile 180 185 190 Leu Asp Ala Arg Asp Phe Ile Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Cys Ala Trp Asp Glu Ile Phe Ala 210 215 220 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Arg Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Arg Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 2 <211> 849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of D-psicose 3-epimerase of SEQ ID NO. 1 <400> 2 atgcagggtt ttggcgtcca tacgagcatg tggaccatga attgggatcg ccccggtgcg 60 gagcgcgccg ttgcggcggc ggtaaaatac gccgtcgact tcatcgagat cccgatgctc 120 aatccgccgg cggttgatac tgcccatacc agggcgctgc tggagaaaaa caagctgcgc 180 gcggtctgct cgctcggcct gccggagcgc gcctgggcat ccgtccgacc cgatgccgcg 240 atcgagcatc tgaaggtggc gatcgacaag acggccgatc tcggcggcga ggcgctgtcc 300 ggcgtcatct acggcggcat cggcgagcgc accggcgtgc cgccgactga agccgaatac 360 gacaacattg cccgtgtgct gcaggccgcc gccaagcacg ccaaaacccg cggcatcgaa 420 ctgggtgtcg aggcggtcaa ccgctacgag aaccacctga tcaacaccgg ttggcaagcg 480 gtcgacatga tcaagcgggt gggcgccgac aatgtcttcg tgcatctcga tacctaccac 540 atgaacatcg aggaaaaggg catcggcacc ggcatcctcg atgcacgcga cttcatcaaa 600 tacatccacc tgtccgaaag cgaccgcggc acgcccggct atggcaattg cgcctgggac 660 gagatcttcg cgacgctggc cgcgatcggt ttcaagggtg ggctggcgat ggaaagcttc 720 atcaacatgc cgccggaagt ggcctatggc cttgcggtct ggcggccggt cgccagggac 780 gaagaggaag tgatgggcaa cggcctgccg ttccttagga acaaggcccg gcaatacgga 840 ttgatctag 849 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter for gene of SEQ ID NO. 2 in Ensifer adhaerens <400> 3 gtcgcgacga aattc 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acatgatcgg ctccaatctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tatttgatga agtcgcgtgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcacgcgact tcatcaaata 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggccgagata ccagcgcgc 19 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agatatacat atgcagggtt ttggcgtcc 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaggctcgag gatcaatccg tattgccggg 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 사이코스 에피머화 효소.
제1항의 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오타이드.
제2항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 사이코스 제조용 조성물.
제6항에 있어서, 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 추가로 포함하는, 사이코스 제조용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 반응에 사용되는 과당의 농도는 55 내지 75%(w/w)인, 사이코스 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 반응은 pH 7 내지 10의 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스 생산 방법.
제8항에 있어서, 상기 반응은 40 내지 70℃의 조건 하에서 수행되는 것인, 사이코스 생산 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 사이코스 생산 방법.