KR100832339B1 - 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속균주와 이를 이용한 사이코스 생산법 - Google Patents

과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속균주와 이를 이용한 사이코스 생산법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주, 이 균주의 균체를 이용하여 사이코스를 대량생산하는 방법에 관한 것으로, 식물의 근권 토양으로부터 분리한 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 지닌 신규한 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주(KCTC 10983BP)는 LB 배지에 부가적으로 첨가한 과당을 사이코스로 전환할 뿐만 아니라 배양된 균체를 사용하여 반응액 중의 과당을 사이코스로 직접 전환하여 사이코스를 생산하는 것이 가능하며, 이러한 균체반응을 이용하여 생산된 사이코스는 정제가 간편하다는 효과가 있다.
Figure 112006091496616-pat00001
사이코스, 과당, 시노리조비움속 균주 YB-58, 균체반응, 사이코스 생산

Description

과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 균주와 이를 이용한 사이코스 생산법 {Novel Sinorhizobium sp. YB-58 strain converting fructose into psicose, and method for producing psicose using the same strain}
도 1은 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주에 의해 배지중에 함유된 과당의 전환산물인 사이코스의 박층크로마토그래피의 사진도 이다. 1; 과당, 2; 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주를 LB 배지에서 배양한 배양상등액, 3; 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주를 과당 1%가 첨가된 LB 배지에서 배양한 배양상등액, 4; 사이코스
도 2는 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 균체가 산도(pH)에 따라 과당을 사이코스로 전환하는 상대활성을 나타낸 그래프이다. ○; 50 mM 말레익산(maleic acid)/Tris/수산화나트륨 완충용액으로 조절된 pH 6.0-7.0에서의 시노리조비움 속 YB-58 균주의 균체에 의한 사이코스 전환 상대활성, ●; 50 mM Tris-HCl 완충용액으로 조절된 pH 7.0-9.0에서의 시노리조비움 속 YB-58 균주의 균체에 의한 사이코스 전환 상대활성, □; 50 mM 붕산(boric acid)/NaOH 완충용액으로 조절된 pH 9.0-10.0에서의 시노리조비움 속 YB-58 균주의 균체에 의한 사이코스 전환 상대활성
도 3은 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 균체가 온도에 따라 과당을 사이코스로 전환하는 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 균체농도에 따라 과당을 사이코스로 전환하는 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 톨루엔 처리된 균체와 비처리 균체간의 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 나타낸 그래프이다. □; 톨루엔 처리된 균체반응액내 잔존과당 농도, ○; 톨루엔 처리된 균체반응액내 생성된 사이코스 농도, ■; 톨루엔 비처리 균체반응액내 잔존과당 농도, ●; 톨루엔 비처리 균체반응액내 생성된 사이코스 농도.
도 6은 시노리조비움 속 YB-58균주의 톨루엔 처리균체를 사용하여 반응시간에 따라 고농도의 과당으로부터 사이코스의 생산성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 YB-58 균주, 이의 균체를 사용하여 사이코스를 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 근권 토양으로부터 과당을 사이코스로 전환하는 신규한 시노리조비움 속 균주를 분리, 동정하고 상기 시노리조비움 속 균주 균체를 이용하여 기능성 당인 사이코스를 대량생산에 관한 것이다.
사이코스 (D-Psicose, D-ribo-2-hexulose)는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머 (epimer)로써 일반 당류들처럼 감미를 가지지만 인체내에서 대사가 되지 아서 칼로리는 거의 없어 당뇨 및 비만환자에서 기능성 감미료로 사용될 것으로 기대되는 기능성 당이다. 또한 간에서의 지질합성을 억제하여 복부비만을 감소시키는 기능을 가지고 있어 당뇨병과 동맥경화 치료제로도 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.
기존의 사이코스 생산은 주로 화학적 과정을 거쳐 생산되어졌다. 빌릭(Bilik) 등은 몰리브산 이온의 촉매작용을 활용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 기술을 개발하였으며, 맥도날드(McDonald)는 1,2:4,5-di-o-isppropylidene-beta-D-fructopyranose로부터 3 단계의 화학적 처리과정으로 사이코스를 생산하였으며, 도너(Doner)는 에탄올과 트리에틸아민(triethylamine)과 함께 과당을 가열하는 방법으로 사이코스를 생산하였다. 하지만 이들 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 비용이 많이 소모되면서 그 생산효율은 낮다는 것과 부산물의 과량 발생이 문제가 되고 있다.
생물학적 방법에 의한 사이코스의 생산법도 알려져 있다. 이주모리(Ken Izumori)등은 미생물 세포반응을 활용하여 갈락시톨(galacitol), 디-타가토스(D-tagatose) 또는 디-탈리톨(D-talitol)등으로부터 사이코스를 생산할 수 있다는 것을 보였다. 하지만 이들 기질들 또한 자연계에서 비교적 희귀한 당 또는 당알코올로 그 원가가 높다는 단점이 있다. 최근 까지 알려진 가장 효율적인 사이코스 생산법은 분리미생물 슈도모나스 치코리 ST-24 (Pseudomonas cichorii ST-24)의 디-타가토스-3-에피머라제(D-tagatose- 3-epimerase)를 재조합 대장균에서 생산 정제하여 과당을 사이코스로 효소전환하는 방법이다. 이주모리등은 디-타가토스-3-에피머 라제를 고정화시킨 반응시스템으로 약 25%의 전환율로 사이코스를 생산하였다.
본 발명자들은 상기와 같은 사실을 감안하여 과당을 직접 사이코스로 전환하는 활성이 높은 신규한 시노리조비움 속 균주를 식물의 근권 토양으로부터 분리하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 식물의 근권 토양으로부터 분리한 사이코스를 생산하는 신규한 시노리조비움 속 YB-58 균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 균체를 사용하여 과당로부터 기능성이 우수한 사이코스를 대량생산하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 근권 토양으로부터 다수의 세균을 분리한 후 과당을 1% 첨가한 LB 액체배지에서 배양하여 얻은 배양상등액에 잔류한 당을 조사함으로써 사이코스 생산능이 있는 균주를 선발한 후 선발 균주의 균학적 성질을 조사하고, 선발한 균주의 균체와 과당의 반응 조건에 따른 사이코스의 생산성을 조사한 후 과당으로부터 사이코스의 전환능이 높은 반응방법을 확립함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 식물의 근권 토양에서 사이코스를 생산하는 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 분리·동정단계; 상기 균주의 생육온도, 형태학적·생화학적 특성 조사단계; 상기 균주의 균체를 사용하여 과당의 사이코스로 전환능의 조사단계; 상기 균주의 균체 농도 및 기질인 과당의 농도에 따른 사이코스 생산능의 조사단계; 상기 균주의 균체 반응을 위한 최적 온도 및 최적 pH 조사단계; 상기 사이코스의 대량생산을 위한 조건확립단계로 구성된다.
본 발명 균주를 분리하고 배양하기 위해 사용된 LB 배지는 1L 당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 5 g을 함유함을 특징으로 한다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명 사이코스 전환균주의 분리·동정
본 발명에서 과당을 사이코스로 전환하는 미생물을 분리하기 위해 식물의 근권토양 1 g 을 생리식염수 10 mL에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 LB 한천배지에 도말한 후 28℃에서 배양하였다. 고체 한천배지에서 형성된 콜로니 중에서 모양과 크기가 다른 균주를 분리한 후 이를 1% 과당과 0.01% 염화망간이 첨가된 LB 액체배지에 접종하여 28℃에서 48시간 진탕배양하고 배양상등액을 취하여 박층크로마토그라피로 분석하였다. 전개용매로는 클로로포름, 초산, 증류수 (4.3:5:0.7 (v/v)) 혼합용액을 사용하였으며 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 9 ml 에탄올, 0.5 ml 파라-아니스알데히드 (para-anisaldehyde), 0.5 ml 황산과 빙초산 몇 방울 을 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, 120℃에서 10분간 방치하였다. 그 결과 도 1과 같이 한 균주의 배양액에서 사이코스가 관찰되어 이 균주를 YB-58 로 명명하였다.
상기에서 분리된 사이코스를 생산하는 균주 YB-58을 다양한 온도에서 배양하면서 생육 최적온도를 조사한 결과 29℃에서 가장 빠른 성장을 보였으며 37℃ 이상에서는 성장하지 못하였다. 분리 균주의 동정은 형태학적, 생화학적 특성 및 16S 리보좀 RNA(16S rRNA)의 염기서열을 조사함으로써 실시하였다. 분리균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열은 서열목록 1과 같으며, Sinorhizobium adhaerens, Sinorhizobium sp. BK1 등과 100% 동일성을 보여 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주로 명명하였다. 분리 균주의 형태적 특성은 그람음성 간균이며, 생화학적 특성은 표 1에서 나타난 바와 같으며, 본 발명에서 분리한 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주는 한국생명공학연구원내 유전자 은행에 2006년 9월 11일자로 기탁번호 KCTC 10983BP로 기탁하였다.
시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주의 생화학적 특징
구 분 반응
질산염의 환원능 양성
L-트립토판의 분해능 음성
D-글루코스의 발효능 음성
아르기닌 디하이드로라아제 (Arginine dihydrolase) 음성
유라제 (Uease) 양성
베타-글루코시다제 (β-glucosidase) 양성
젤라틴 가수분해능 음성
베타-갈락토시다제 (β-galactosidase) 양성
D-글루코스의 이용능 양성
L-아라비노스의 이용능 양성
D-만노스의 이용능 양성
D-만니톨의 이용능 양성
N-아세틸 글루코자민의 이용능 양성
D-말토스의 이용능 양성
글루코네이트칼륨 (Potassium gluconate) 이용능 음성
카르릭산 (Capric acid) 이용능 음성
아디픽산 (adipic acid) 이용능 음성
말릭산 (malic acid) 이용능 양성
구연산나트륨 (trisodium citrate) 이용능 음성
페닐조산 (phenylacetic acid) 이용능 음성
옥시다제 (oxidase) 양성
실시예 2 : 본발명 시노리조비움 속 YB-58 균주의 균체를 이용한 사이코스 생산 반응특성
본 발명 시노리조비움 속 YB-58 균주의 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는데 있어서 반응온도와 pH에 따른 전환활성을 조사하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. 우선 YB-58 균주를 LB 액상배지, 28℃에서 15시간 배양하여 원심분리한 후 배양상등액을 제거하고 침전된 균체를 0.85% 생리식염수에 현탁하고 원심분리하였다. 침전된 균체 수소이온농도가 다른 완충용액에 각각 동일농도의 균체가 되도록 현탁하였다. 이때 사용한 완충용액은 pH6.0-7.0 범위는 50mM 말레익산(maleic acid)/Tris/수산화나트륨, pH7.0-9.0 범위는 50mM Tris-HCl, pH9.0-10.0 범위는 50mM 붕산(boric acid)/수산화나트륨으로 제조하였다. 이들 반응액내의 과당 농도는 최종 100mM 되도록 하였으며, 균체는 80 mg/ml로 하였으며 35℃에서 2시간 반응하였다. 반응 후, 각 반응액은 원심분리하여 상층액의 일부분을 취하여 남은 과당과 생성된 사이코스의 양을 액체고속크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 측정하였다. HPLC는 SCL-10A (Shimadzu, 일본)을 사용하였으며 탐지장치로는 Shimadzu RID-10A, 분리 컬럼으로는 BP-100 Ca2+ 탄화수소컬럼 (Benson Polymeric Inc. USA)을 이용하였다. 용출은 80℃에서 증류수로 하였으며 용출속도는 0.4 ml/분으로 수행하였다. 측정된 사이코스와 과당의 양을 기준으로 각 반응액에서 상대적인 전환 활성을 계산하여 도2에 나타내었다. 도2에서와 같이 본발명 YB-58균주의 균체반응의 최적 수소이온농도는 pH8.5로 나타났다.
균체반응의 최적온도를 결정하기 위하여 위에서 사용된 pH8.5의 완충용액에 현탁된 균체반응액을 30 - 50℃ 범위의 온도에서 과당으로부터 사이코스로의 전환 활성을 측정하였다. 이때 사용된 균체는 80 mg/ml로 하였으며 기질로 과당 100mM을 사용하여 각각의 온도에서 2시간동안 반응시켰다. 도3에 나타낸바와 같이 YB-58균주의 균체반응에 의한 전환반응은 40℃에서 최고의 활성을 나타내었다.
균체반응에서 사용되는 균체의 농도에 따른 전환반응의 효율을 측정하기 위하여 균체양을 20-120 mg/ml의 농도범위로 사용하였다. 이때 반응액은 100mM 과당을 포함하며, pH8.5 완충용액을 사용하고, 반응의 온도는 40℃이며 반응시간은 2시간으로 하였다. 도4에 나타낸 바와 같이 60 mg/ml 이상의 균체농도 이상에서는 전환활성이 더 이상 증가하지 않아 이 농도를 가장 효율적인 균체농도로 결정하였다.
실시예 3. 본발명 시노리조비움 속 YB-58 균주의 톨루엔 전처리 균체의 사이코스 전환반응
박테리아에 톨루엔을 처리하여 세포 내외부 물질의 투과성을 증대시키는 방법이 알려져 있으며 이는 세포내에 있는 효소에 의한 생물전환과 물질생성의 공정에 종종 사용되는 방법이다 (Canovas et al. 2005; Flores et al. 1994). 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorizobium) YB-58 균주의 균체반응 효율을 증대시키기 위해 톨루엔으로 처리된 균체를 사용하여 실시예 2를 통해 사이코스 전환효율이 높도독 확립된 균체 반응 최적조건 (pH8.5, 40℃, 과당 100mM, 균체 60 mg/ml)하에서 톨루엔으로 처리되지 않은 균체와 함께 과당으로부터 사이코스 전환반응을 실시하고 이를 비교하였다. 톨루엔처리는 50mM Tris-HCl 완충용액에 현탁된 균체에 톨루엔이 최종 10% (w/w)되도록 첨가하고 30℃에서 15분간 150 rpm의 속도록 진탕하여 반응시켰다. 이와같이 처리된 현탁액은 원심분리(12,000g, 5분, 4oC)하여 침전된 균체를 50mM Tris-Cl (pH8.5) 완충용액으로 2회 세척한 후 동일한 완충용액으로 현탁시키고 상기에서 확립된 반응 최적조건 (pH8.5, 40℃, 과당 100mM, 균체 60 mg/ml)에서 18시간 까지 반응시키면서 시간별로 생성된 사이코스의 농도와 남아있는 과당의 농도를 HPLC법으로 측정하였다. 도5에 나타낸 바와같이 톨루엔을 처리한 균체를 사용하였을 때 톨루엔 처리를 하지 않은 균체에 비해 사이코스의 생산성이 2.5-4.8배 증가된 결과를 보였다.
실시예 4. 기질의 양에 따른 생산성조사 및 최적조건에서의 반응
본 발명 시노리조비움 속 (Sinorizobium) YB-58 균주의 톨루엔으로 처리된 균체를 사용하여 반응액중에 기질인 과당의 양을 달리 첨가하였을 때 사이코스 생산성을 조사하였다. 반응조건은 실시예 2에서 확립된 조건으로 하였으며, 오직 과당의 농도만을 변화시켜 반응을 실시하였는데 그 결과 과당의 농도가 200mM 이하에서는 사이코스 전환율이 약 14%로 일정하였으나 200mM 이상의 농도에서는 그 전환율이 점차 감소하여 1M의 과당이 첨가된 경우에는 12.8% (23g/l), 2M에서는 10.5% (38g/l), 3M에서는 7.6% (41g/l), 3.9M에서는 5.3% (37g/l)의 전환율과 생산성을 나타내었다. 균체반응에 의한 사이코스 대량생산을 위해서는 그 전환율은 저농도의 과당에서 보다는 낮지만 생산성은 3M의 과당을 기질로 사용하였을 때 가장 높았다. 따라서 사이코스의 대량생산을 위해 3M의 과당을 기질로 사용하여 실시예 2에서 확립된 최적 반응조건에서 톨루엔 처리한 균체로 반응을 실시하면서 반응시간에 따른 사이코스의 생산성을 조사한 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 14시간 반응시 최대 생산성에 이른다는 사실을 확인함으로써 본 발명 시노리조비움 속 (Sinorizobium) YB-58 균주의 톨루엔으로 처리된 균체로 사이코스의 대량생산 조건을 최종적으로 확립할 수 있었다.
상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 사이코스를 생산하는 신규한 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 균주 및 이로부터 사이코스를 대량생산하는 방법에 관한 것으로, 식물의 근권 토양으로부터 분리한 사이코스의 생산능이 있는 신규한 시노리조비움 속(Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP 균주를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 신규한 시노리조비움 속(Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP의 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하여 기능성이 우수한 사이코스를 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있어 식품산업에 매우 유용한 발명인 것이다.
본 발명 사이코스 생성균주 YB-58의 16S 리보좀 알엔에이 (RNA)의 유전자 염기서열 1 TCGAGCGCCC CGCAAGGGGA GCGGCAGACG GGTGAGTAAC GCGTGGGAAT CTACCCTTTT 61 CTACGGAATA ACGCAGGGAA ACTTGTGCTA ATACCGTATA CGCCCTTCGG GGGAAAGATT 121 TATCGGGAAA GGATGAGCCC GCGTTGGATT AGCTAGTTGG TGGGGTAAAG GCCTACCAAG 181 GCGACGATCC ATAGCTGGTC TGAGAGGATG ATCAGCCACA TTGGGACTGA GACACGGCCC 241 AAACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGGACAAT GGGCGCAAGC CTGATCCAGC 301 CATGCCGCGT GAGTGATGAA GGCCCTAGGG TTGTAAAGCT CTTTCACCGG TGAAGATAAT 361 GACGGTAACC GGAGAAGAAG CCCCGGCTAA CTTCGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGAAG 421 GGGGCTAGCG TTGTTCGGAA TTACTGGGCG TAAAGCGCAC GTAGGCGGAC ATTTAAGTCA 481 GGGGTGAAAT CCCGGGGCTC AACCCCGGAA CTGCCTTTGA TACTGGGTGT CTAGAGTATG 541 GAAGAGGTGA GTGGAATTCC GAGTGTAGAG GTGAAATTCG TAGATATTCG GAGGAACACC 601 AGTGGCGAAG GCGGCTCACT GGTCCATTAC TGACGCTGAG GTGCGAAAGC GTGGGGAGCA 661 AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC CGTAAACGAT GAATGTTAGC CGTCGGGCAG 721 TTTACTGTTC GGTGGCGCAG CTAACGCATT AAACATTCCG CCTGGGGAGT ACGGTCGCAA 781 GATTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT 841 CGAAGCAACG CGCAGAACCT TACCAGCCCT TGACATCCCG ATCGCGGATT ACGGAGACGT 901 TTTCCTTCAG TTCGGCTGGA TCGGAGACAG GTGCTGCATG GCTGTCGTCA GCTCGTGTCG 961 TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTCG CCCTTAGTTG CCAGCATTTA 1021 GTTGGGCACT CTAAGGGGAC TGCCGGTGAT AAGCCGAGAG GAAGGTGGGG ATGACGTCAA 1081 GTCCTCATGG CCCTTACGGG CTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGTGGTG ACAGTGGGCA 1141 GCGAGACCGC GAGGTCGAGC TAATCTCCAA AAGCCATCTC AGTTCGGATT GCACTCTGCA 1201 ACTCGAGTGC ATGAAGTTGG AATCGCTAGT AATCGCAGAT CAGCATGCTG CGGTGAATAC 1261 GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGGGA GTTGGTTCTA CCCGAAGGTA 1321 GTGCGCTAAC CGCAAGGAGG

Claims (5)

  1. 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 지닌 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP.
  2. 제 1 항의 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP 균주의 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 방법.
  3. 제 1 항의 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP 균주를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하여 사이코스를 생산하는 방법.
  4. 제 1 항의 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP 균주의 균체에 톨루엔을 처리한 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 방법.
  5. 50 mM Tris 완충용액 (pH 8.5)과 3M 과당과 제 1 항의 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP 균주의 톨루엔 처리 균체 (60 mg/ml)를 포함한 반응액을 40℃에서 14시간 반응하여 고농도의 과당을 사이코스로 전환함을 특징으로 하는 사이코스의 대량 생산 방법.
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