WO2023090495A1 - 열 안정성이 우수한 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법 - Google Patents

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epimerase
amino acid
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epimerase variant
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김태균
김백중
정다한
조승우
김학준
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    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to allulose epimerase variants and the like, and more particularly, to Flavonifractor plautii Conversion rate and thermal stability of fructose to allulose compared to D-allulose 3-epimerase derived from This improved allulose epimerase variant and various inventions derived therefrom are directed.
  • D-allulose is also called D-psicose as an epimer of carbon 3 of fructose.
  • D-allulose has 70% sweetness compared to sugar (Oshima 2006), but only 0.3% energy, so it is a functional monosaccharide that can be applied as a low-calorie sweetener for diet foods (Matsuo et al. 2002).
  • D-allulose has the function of suppressing glucose absorption and blood sugar, so it can be applied to food and beverages for diabetic patients and food and beverages for reception, and through inhibition of enzyme activity involved in lipid synthesis in the liver. Since it can suppress abdominal fat accumulation, it can be used in various functional foods such as health foods (Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011).
  • D-tagatose 3-epimerase derived from Rhizobium speroides was inserted into E. coli to transform it, and then D-tagatose 3-epimerase expressed in the transformed E. coli was transformed. Allulose was produced from fructose.
  • Korean Patent Registration No. 10-0744479 discloses a method for producing allulose by an allulose epimerase derived from Agrobacterium tumefaciens.
  • Korean Patent Registration No. 10-0832339 discloses Sinorhizobium YB-58 KCTC 10983BP having an activity of converting fructose into allulose and a method of converting fructose into allulose using the same.
  • Korean Patent Registration No. 10-1106253 discloses E.
  • Korean Patent Registration No. 10-1339443 discloses ketose 3-epimerase derived from a microorganism belonging to the genus Rhizobium .
  • a method for converting fructose into allulose using the same is disclosed, and Korean Patent Registration No.
  • 10-1318422 discloses D-allulose 3-epimerase derived from Clostridiuim scindens and A method for producing allulose from fructose using this is disclosed, and Korean Patent Registration No. 10-1473918 discloses a D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii and the same A method for producing allulose from fructose using
  • wild-type D-allulose 3-epimerase derived from microorganisms does not have a high conversion rate of fructose to allulose and has low thermal stability, so it is rapidly deactivated at the optimum activation temperature, making it unsuitable for industrialization. not. Therefore, it is necessary to develop a novel D-allulose 3-epimerase mutant with improved conversion rate of fructose to allulose or thermal stability compared to wild type D-allulose 3-epimerase derived from microorganisms. do.
  • 10-2014-0021974 related to D-allulose 3-epimerase variants discloses Treponema monia showing fast allulose conversion rate and stability at high temperature by inducing mutations at the gene level.
  • ZAS-1-derived D-allulose 3-epimerase is disclosed, and
  • Korean Patent Registration No. 10-1203856 discloses a mutation of wild-type allulose epimerase derived from Agrobacterium tumefaciens. Allulose epimerase variants with improved thermal stability obtained through In addition, Korean Patent Registration No.
  • 10-2254411 discloses glycine, an amino acid residue present at position 216 in the amino acid sequence of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii ( A novel allulose epimerase variant in which Gly) is substituted with serine (Ser) is disclosed, and Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 discloses wild-type D-derived from Flavonifractor plautii .
  • the present invention was derived under the background of the prior art, and the first object of the present invention is the conversion rate and heat of fructose to allulose compared to wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii. It is to provide a novel D-allulose 3-epimerase variant with improved stability.
  • a second object of the present invention is to provide a method for preparing a novel D-allulose 3-epimerase variant or various elements necessary for preparing a novel D-allulose 3-epimerase variant.
  • a third object of the present invention is to provide a method for producing allulose from fructose or various elements necessary for producing allulose from fructose.
  • glycine an amino acid residue present at position 216 in the amino acid sequence of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii, is serine (Ser) [Republic of Korea Registered Patent Publication No. 10-2254411 (2021.05.14)] for a novel allulose epimerase variant substituted with, and wild-type derived from Flavonifractor plautii
  • Ser serine
  • a patent application has been filed for a novel allulose epimerase variant in which methionine (Met) at position 234 is substituted with isoleucine (Ile) [Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 (2021.11.04)].
  • the allulose epimerase variants disclosed in Korean Patent Registration No. 10-2254411 and Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 are wild-type D-allulose 3-epi derived from Flavonifractor plautii Thermal stability is improved compared to merase, but when the conversion reaction of fructose to allulose is carried out for a long time at a high temperature of 60 ° C.
  • the inventors of the present invention utilize protein structure prediction technology to improve the conversion rate and thermal stability of fructose to allulose of the allulose epimerase variant disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 to improve the conversion rate and thermal stability Additional amino acid residue position candidates expected to be related to improvement are derived, and only when the amino acid residue at a specific position among them is substituted with another amino acid residue Conversion rate of fructose to allulose and thermal stability are improved. completed the present invention.
  • the present invention provides an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a recombinant strain transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the present invention cultivates a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a recombinant strain transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide to obtain an allulose epimerase variant expressing; and isolating the allulose epimerase variant from the lysate of the recombinant strain in which the allulose epimerase variant is expressed.
  • the present invention provides a composition for producing allulose comprising an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention is a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a recombinant strain transformed by a recombinant vector containing the polynucleotide, a culture of the recombinant strain, or the recombinant
  • Provided is a composition for producing allulose comprising a lysate of the strain.
  • the present invention provides a method for preparing allulose comprising reacting fructose with an allulose epimerase variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a composition comprising the allulose epimerase variant.
  • the present invention is a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a recombinant strain transformed with a recombinant vector containing the polynucleotide, a culture of the recombinant strain, It provides a method for producing allulose comprising the step of reacting with a lysate of the recombinant strain or a composition containing any one or more of them.
  • the novel allulose epimerase variant according to the present invention is a wild-type D-allulose 3-epimerase or D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I derived from Flavonifractor plautii. Conversion activity of fructose into allulose is higher than that of fructose, and thermal stability is excellent, especially under high temperature conditions of 60°C or higher, so contamination can be prevented and production time can be reduced during the industrial-level enzymatic conversion reaction for mass production of allulose. and can reduce production costs.
  • Figure 1 shows a total of four amino acid residue positions selected as substitution candidates to improve the conversion rate of fructose to allulose and thermal stability of the D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I by the inventors of the present invention.
  • Allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I is the amino acid sequence (SEQ ID NO: In 1), tryptophan (Trp) at position 29 is substituted with lysine (Lys), alanine (Als) at position 77 is substituted with serine (Ser), and glycine (Gly) at position 216 is substituted with It is substituted with serine (Ser) and at the same time methionine (Met) present at the 234th position is substituted with isoleucine (Ile).
  • the allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I is a wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii or a variant W29K/G216S/M234I thereof. It has a higher conversion activity of fructose into allulose than , and has excellent thermal stability, especially under high temperature conditions of 60°C or higher.
  • the D-allulose 3-epimerase variant W29K/G216S/M234I is 29 of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii.
  • Tryptophan (Trp) at position 216 is substituted with lysine (Lys), glycine (Gly) at position 216 is replaced with serine (Ser), and methionine (Met) at position 234 is replaced with isoleucine (Ile). ), and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the preparation method and characteristics are disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405.
  • the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I is a poly encoding W29K / G216S / M234I
  • a variant of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii PCR is performed using a nucleotide (consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4) as a template and an oligonucleotide having a predetermined nucleotide sequence as a primer pair, and then using the pair of amplified mutant fragments as a template and the sequence of the restriction enzyme recognition site After performing overlap extension PCR using the introduced oligonucleotide as a primer, and inserting a polynucleotide fragment encoding the amino acid sequence of the allulose epimerase variant into an expression vector to prepare a recombinant expression vector, the recombinant expression vector After transforming the host strain to prepare a
  • polynucleotide encoding W29K/G216S/M234I which is a variant of the D-allulose 3-epimerase (consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4), is a wild type derived from Flavonifractor plautii .
  • PCR is performed using a polynucleotide encoding D-allulose 3-epimerase (consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2) as a template and an oligonucleotide having a predetermined nucleotide sequence as a primer pair, and then amplified mutant It can be produced by performing overlap extension PCR using a pair of fragments as templates and oligonucleotides into which sequences of restriction enzyme recognition sites have been introduced as primers.
  • the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I according to the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but the equivalent range of allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I according to the present invention must be It is not limited to this.
  • the equivalent range of the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I according to the present invention is SEQ ID NO: 5, as long as the activity of converting fructose to allulose and thermal stability at high temperatures of 60 ° C. or higher are maintained.
  • Some amino acids in the amino acid sequence may be substituted, inserted and/or deleted.
  • substitution of the amino acid is preferably performed by a conservative amino acid replacement that does not change the properties of the protein.
  • modification of the amino acid may be achieved by glycosylation, acetylation, phosphorylation, and the like.
  • the equivalent range of the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I according to the present invention increases the structural stability against heat, pH, etc. by mutation or modification on the amino acid sequence, or for the conversion of fructose to allulose. It may contain proteins with increased activity.
  • the equivalent range of the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I according to the present invention is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more of the amino acid sequence of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5 It may contain an amino acid sequence having a homology of at least 99% or more.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for preparing the novel allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I or various elements required to prepare the novel allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I .
  • Various elements required to prepare the novel allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I include a polynucleotide, a primer pair, a recombinant vector, and a recombinant strain.
  • the polynucleotide is a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, preferably consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • polynucleotide refers to any polyribonucleotide (RNA) or polydeoxyribonucleotide (DNA) that is non-modified or modified.
  • the polynucleotide includes single- or double-stranded DNA, DNA as a mixture of single- and double-stranded regions, single- and double-stranded RNA, RNA as a mixture of single- and double-stranded regions, or hybrid molecules thereof.
  • the equivalent range of the polynucleotide encoding the allulose epimerase variant includes a sequence having substantial identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the substantial identity is determined by aligning the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and any other sequence so as to correspond as much as possible, and analyzing the sequence so that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 is 70% or more, 90% or more, or having 98% or more sequence homology.
  • a person skilled in the art can substitute, add, or delete one or more bases in the nucleotide sequence of the polynucleotide using a genetic recombination technique known in the art to obtain the same identity within the range having substantial homology. It will be readily appreciated that polynucleotides encoding active allulose epimerase variants can be prepared. Comparison of such homology can be performed by calculating homology between two or more sequences as a percentage (%) using a commercially available computer program.
  • the primer pair is for synthesizing a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, encoding W29K / G216S / M234I, a variant of D-allulose 3-epimerase
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • template it is composed of a forward primer and a reverse primer having the following nucleotide sequence.
  • the recombinant vector includes a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the recombinant vector may be provided in the form of inserting a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant into a cloning vector or an expression vector using a known standard method.
  • the term "cloning vector" used in the present invention is defined as a material capable of transporting a DNA fragment into a host cell and reproducing it.
  • the cloning vector may further include a polyadenylation signal, a transcription termination sequence, and multiple cloning sites.
  • the multiple cloning site includes at least one endonuclease restriction enzyme restriction site.
  • the cloning vector may further include a promoter.
  • the polynucleotide encoding the allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I may be located upstream of the polyadenylation signal and transcription termination sequence.
  • the term "expression vector” used in the present invention is defined as a DNA sequence necessary for transcription and translation of the cloned DNA in an appropriate host.
  • expression vector refers to a genetic construct comprising essential regulatory elements operably linked to an insert such that the insert is expressed when present in cells of an individual.
  • the expression vectors can be prepared and purified using standard recombinant DNA techniques.
  • the type of the expression vector is not particularly limited as long as it expresses a desired gene in various host cells such as prokaryotic and eukaryotic cells and produces a desired protein, but retains a promoter showing strong activity and strong expression power in a natural state.
  • a vector capable of producing a large amount of a foreign protein having a similar form is preferred.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a gene encoding a desired protein, and a stop codon terminator.
  • promoter means a minimal sequence sufficient to direct transcription.
  • the promoter may include a promoter configuration sufficient to allow expression of a regulatable promoter-dependent gene induced by a cell type specific or external signal or agent, such a configuration located at the 5' or 3' portion of the gene. can do.
  • promoters include both conserved promoters and inducible promoters.
  • Promoter sequences may be of prokaryotic, eukaryotic or viral origin.
  • operably linked means the association of polynucleotide sequences on a single polynucleotide so that the function of one is regulated by the other.
  • a promoter when a promoter is capable of controlling expression of a coding sequence (i.e., when the coding sequence is under the transcriptional control of the promoter), the promoter operates in conjunction with the coding sequence, or the ribosome binding site is capable of facilitating translation. If located, the ribosome binding site is operatively linked to a coding sequence. Coding sequences can be operatively linked to regulatory sequences in either the sense or antisense orientation.
  • a recombinant vector according to the present invention is preferably an expression vector.
  • the recombinant strain is transformed with a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or with a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the term "recombinant strain” refers to a cell transformed by introducing a polynucleotide encoding one or more target proteins or an expression vector having the same into a host cell.
  • Methods for preparing transformants by introducing the expression vector into host cells include transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection ( liposemmediated transfection), DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, electroinjection, PEG, etc.
  • Host cells that can be transformed with the expression vector in the present invention are not particularly limited as long as they are known in the art, such as prokaryotic cells, plant cells, insect cells, and animal cells, and preferably have high DNA transduction efficiency.
  • the host cell may be E. coli.
  • E. coli examples include BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5 ⁇ or W3110, but are not limited thereto.
  • Bacillus strains such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Corynebacterium strains such as Corynebacterium glutamicum, Salmonella strains such as Salmonella typhimurium, and other Serratia
  • Bacillus strains such as Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis
  • Corynebacterium strains such as Corynebacterium glutamicum
  • Salmonella strains such as Salmonella typhimurium
  • other Serratia It is also possible to use strains selected from the group consisting of enterobacteriaceae and strains such as Marcessons and various Pseudomonas species.
  • the method for producing the allulose epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I is transformed by a polynucleotide encoding the allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or comprising the polynucleotide culturing the recombinant strain transformed with the recombinant vector to express an allulose epimerase variant; and isolating the psicose epimerase from the lysate of the recombinant strain expressing the allulose epimerase variant.
  • Protein expression by host cells can be induced by using lactose, an inducing factor, IPTG (isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside), etc., and the induction time is such that the amount of protein is maximized.
  • lactose lactose
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • an allulose epimerase variant can be recovered from a lysate of a recombinant strain.
  • Cells used for protein expression can be disrupted by various physical or chemical means such as repeated freeze-thaw, sonication, mechanical disruption, or cell disintegrants, and can be isolated or purified by conventional biochemical separation techniques ( Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA , 1990).
  • methods for separating or purifying proteins expressed by host cells include electrophoresis, centrifugation, gel filtration, precipitation, dialysis, chromatography (ion exchange chromatography, affinity chromatography, immunosorbent affinity chromatography, reverse phase HPLC, gel permeation HPLC), isoelectric focusing and various variations or combinations thereof methods.
  • the step of separating the allulose epimerase variant from the lysate of the recombinant strain may be preferably performed by affinity chromatography using a peptide tag.
  • the peptide tag is known as HA tag, FLAG tag, His tag, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc tag, V5 tag, glutathione-S-transferase (GST) or MBP (maltose binding protein).
  • a variety of tags can be used, preferably a double His tag. His-tagged proteins are specifically trapped on a column of Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) resin and can be eluted with EDTA or imidazole.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing allulose from fructose or various elements required for producing allulose from fructose.
  • Various elements required for producing allulose from the fructose include a composition for producing allulose.
  • composition for producing allulose includes allulose epimerase variant W29K/A77S/G216S/M234I having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • another example of the composition for producing allulose is a recombinant strain transformed with a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a recombinant vector containing the polynucleotide , A culture of the recombinant strain or a lysate of the recombinant strain.
  • the composition for producing allulose may preferably further include at least one selected from the group consisting of manganese ions, nickel ions, and cobalt ions, and more preferably may further include manganese ions or nickel ions.
  • the novel allulose epimerase variant according to the present invention exhibits metalloenzyme properties whose activation is controlled by metal ions, and the reaction by the enzyme is carried out in the presence of specific metal ions such as manganese ions or nickel ions. The production yield of allulose can be increased.
  • one example of a method for preparing allulose from the fructose is to transform fructose with a polynucleotide encoding an allulose epimerase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or to a recombinant vector containing the polynucleotide and reacting with a composition comprising a recombinant strain transformed by, a culture of the recombinant strain, a lysate of the recombinant strain, or any one or more of them.
  • the method for preparing allulose from fructose may further include adding metal ions, and the types of metal ions are as described above.
  • the metal ion may be added to fructose as a substrate or to a mixture of an enzyme variant and fructose.
  • the metal ion is added to the carrier on which the enzyme variant is immobilized (before adding fructose), added to a mixture of the carrier and fructose on which the enzyme variant is immobilized (after addition of fructose), or fructose and fructose when fructose is added. It can be added in the form of a mixture.
  • the metal ion may be added to the culture or culture may be performed in a culture medium to which the metal ion is added.
  • the allulose epimerase variant or the recombinant strain is preferably immobilized on a carrier.
  • the carrier can create an environment in which the activity of the immobilized enzyme can be maintained for a long period of time, and can be selected from all known carriers that can be used for enzyme immobilization.
  • sodium alginate may be used as the carrier.
  • Sodium alginate is a natural colloidal polysaccharide that is abundantly present in the cell walls of seaweed. Formed by beta-1,4 bonds, it can stably immobilize strains or enzymes and can be advantageous in terms of allulose yield.
  • a sodium alginate solution eg, sodium alginate aqueous solution
  • w/v sodium alginate at a concentration of 1.5 to 4.0%
  • the solution can be used for immobilization of recombinant strains.
  • the reaction temperature is 60 to 70 ° C, preferably 60 to 67 ° C, more preferably 60 to 65 ° C, considering the stability and maximum activity of the enzyme variant,
  • the reaction pH is in the range of 6.5 to 8, preferably 6.5 to 7.5, more preferably 6.5 to 7.
  • the concentration of fructose is not particularly limited, but it is preferably 1 to 75% (w / w) based on the total reactants in consideration of productivity and economy, and 4 to 35% (w/w) is more preferred.
  • the concentration of the enzyme variant used in the method for producing allulose from fructose is 0.001 to 0.5 mg/ml, preferably 0.01 to 0.2 mg/ml, more preferably 0.02 to 0.1 mg/ml based on the total reactants.
  • the host strain of the recombinant strain is preferably a food-safe strain.
  • the food-safe strain refers to a GRAS (generally accepted as safe) class strain generally recognized as safe, for example, Saccharomyces sp. strains ( Saccharomyces sp.), Bacillus sp. strains ( Bacillus sp .), It may be selected from Corynebacterium sp. and the like.
  • the strains are industrial microorganisms that produce chemicals having various uses in fields such as feed, medicine, and food. These strains are strains that are easy to genetic manipulation and mass culture, or have high stability under various process conditions.
  • these strains have a relatively rigid cell membrane structure compared to other bacteria, they exhibit biological characteristics in which the cells exist in a stable state even under the influence of osmotic pressure due to high sugar concentration.
  • Specific examples of the GRAS (generally accepted as safe) class strain include Saccharomyces cerevisiae , Bacillus subtilis , and Corynebacterium glutamicum .
  • Example 1 Additional exploration of amino acid substitution sites for improving the conversion rate and thermal stability of D-allulose 3-epimerase
  • Applicant of the present invention is wild-type D-allulose 3-epi to improve the conversion rate of fructose to allulose and thermal stability of wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii
  • tryptophan (Trp) at position 29 is substituted with lysine (Lys)
  • glycine (Gly) at position 216 is substituted with serine (Ser)
  • methionine present at position 234 (Met) previously applied for a patent for a novel D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I substituted with isoleucine (Ile) [Korean Patent Publication No.
  • the wild-type D-allulose 3-epimerase derived from Flavonifractor plautii consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a polynucleotide encoding the wild-type D-allulose 3-epimerase.
  • the fragment consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the D-allulose epimerase variant W29K / G216S / M234I consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the polynucleotide fragment encoding the amino acid sequence of the D-allulose epimerase variant W29K / G216S / M234I It consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the inventors of the present invention modified the amino acid sequence of D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I to improve the conversion rate of fructose to allulose and thermal stability. Based on this, the protein structure was predicted using a homology modeling technique, and amino acid substitution sites were searched. The homology modeling was performed using the Robetta server, and protein structure prediction and analysis were performed using software programs such as Coot, PyMol, and UCSF Chimera. A total of four amino acid residue positions expected to be related to conversion and thermal stability improvement when chemical bonds are changed through three-dimensional structural model analysis of D-allulose epimerase variants W29K/G216S/M234I and amino acids to be substituted at these positions Residues were selected.
  • Figure 1 shows a total of four amino acid residue positions selected as substitution candidates to improve the conversion rate of fructose to allulose and thermal stability of the D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I by the inventors of the present invention.
  • A77 represents alanine (Als) present at position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • E173 represents glutamic acid (Glu) present at position 173 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • W209 represents tryptophan (Trp) present at position 209 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • Q240 represents glutamine (Gln) present at position 240 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • an enzyme variant W29K/A77S/G216S/M234I composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 was prepared by replacing alanine (Als) at position 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with serine (Ser).
  • glutamic acid (Glu) present at position 173 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was substituted with alanine (Ala) to prepare an enzyme variant W29K / E173A / G216S / M234I consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
  • the enzyme variant W29K / W209L / G216S / M234I consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 was prepared by replacing tryptophan (Trp) at position 209 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 with leucine (Leu), and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the enzyme variant W29K/G216S/M234I/Q240D consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 was prepared by replacing glutamine (Gln) at position 240 with aspartic acid (Asp).
  • Example 2 Flavonifractor Flourti ( Flavonifractor plautii ) Production of recombinant vectors and recombinant strains for overexpression of D-allulose 3-epimerase variants
  • a PCR reaction was performed using the primers shown in Table 1 to prepare a gene encoding an allulose epimerase variant derived from Flavonifractor plautii .
  • 1 pM of the oligonucleotide which is the primer of Table 1
  • a reaction solution to which 100 ⁇ M of deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) was added
  • D-allulose epimerase variant W29K used as a template (template) /G216S/M234I polynucleotide (SEQ ID NO: 4) 100 ng was mixed and PCR was performed at 25 to 30 cycles in the presence of 1 unit of pfu-X DNA polymerase mixture (Bioneer) using a thermocycler (TP600, TAKARA BIO Inc., JAPAN) reaction was carried out.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 9 represents a polynucleotide fragment encoding the amino acid sequence of enzyme variant W29K/A77S/G216S/M234I
  • the base sequence of SEQ ID NO: 10 represents the amino acid sequence of enzyme variant W29K/E173A/G216S/M234I.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 11 represents a polynucleotide fragment encoding the amino acid sequence of enzyme variant W29K/W209L/G216S/M234I
  • the base sequence of SEQ ID NO: 12 represents enzyme variant W29K/G216S/M234I/Q240D It represents a polynucleotide fragment encoding the amino acid sequence of.
  • the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 to 12 are composed of nucleotide sequences directly corresponding to the amino acid sequences of the enzyme variants, and the sequence of the restriction enzyme recognition site is omitted for convenience.
  • the prepared polynucleotide fragment was inserted into the same restriction enzyme site of pET28a (Novagen), an expression vector, using restriction enzymes NdeI and XhoI to construct four recombinant expression vectors.
  • the recombinant expression vector was introduced into and transformed into E. coli BL21(DE3) (invitrogen) using the heat shock method (see Sambrook and Russell: Molecular Cloning.), and four recombinant E. coli strains were prepared. A 60% glycerin solution was added to the prepared recombinant E. coli, and stored frozen at -70°C before culturing for enzyme expression.
  • Example 3 Flavonifractor Flourti ( Flavonifractor plautii ) Expression and purification of D-allulose 3-epimerase variants derived from
  • the overexpressed allulose epimerase mutant was isolated in the following manner. First, the culture medium of recombinant E. coli was centrifuged for about 15 minutes at 4100 ⁇ g and 4° C. to remove the supernatant, and the cells of recombinant E. coli were recovered. Thereafter, the recovered recombinant E. coli cells were suspended in lysis buffer (containing 50 mM potassium monophosphate, 300 mM potassium chloride, and 5 mM imidazole), and then treated with a sonicator to disrupt the cells. Thereafter, the cell lysate was centrifuged at 15,814 ⁇ g and 4° C. for about 10 minutes to remove the cell pellet, and only the supernatant was recovered. Thereafter, a purified enzyme solution containing an allulose epimerase variant was separated from the recovered supernatant using a His-tag affinity chromatography column and a desalting column.
  • lysis buffer containing 50 mM potassium monophosphate, 300 mM potassium
  • D-allulose epimerase variant W29K/G216S/M234I [Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 (2021.11.04)] previously filed by the applicant of the present invention and D- Conversion rate of fructose to allulose of four allulose epimerase variants (W29K/A77S/G216S/M234I, W29K/E173A/G216S/M234I, W29K/W209L/G216S/M234I, W29K/G216S/M234I/Q240D) and In order to confirm thermal stability, the enzyme was exposed to a high temperature for a certain period of time, and then the degree of reduction in the conversion activity of fructose to allulose was analyzed.
  • the W29K/G216S/M234I purified enzyme solution obtained in Example 3 of Korean Patent Publication No. 10-2021-0132405 (2021.11.04) (enzyme concentration 0.3 mg/ml) and the obtained in Example 3 of the present invention
  • the purified enzyme solution (enzyme concentration: 0.3 mg/ml) was stored in a constant temperature water bath at 62° C. for 0 hr, 0.5 hr, 1 hr, 1.5 hr, and 2 hr, followed by heat treatment.
  • the heat-treated purified enzyme solution was added to 50 mM PIPES buffer (pH 7.0) containing 10% (w/w) fructose and 1 mM manganese sulfate (MnSO 4 ) metal ions so that the enzyme concentration was 75 ⁇ g/ml. It was reacted for 10 minutes under a temperature condition of 62 ° C. and a shaking condition of 120 rpm using a shaking constant temperature water bath (VS-1205SW1, vision science). Thereafter, the temperature of the reaction product was lowered to 4° C. to stop the reaction, and the supernatant was recovered by centrifugation at 16,600 ⁇ g and 4° C.
  • PIPES buffer pH 7.0
  • MnSO 4 manganese sulfate
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Table 4 shows the conversion rate of fructose to allulose for each heat treatment condition when the D-allulose 3-epimerase variant derived from Flavonifractor plautii was heat-treated.
  • the D-allulose 3-epimerase variant W29K / A77S / G216S / M234I is an allulose of similar or higher fructose than the D-allulose 3-epimerase variant W29K / G216S / M234I regardless of the heat treatment time. showed conversion activity, and especially showed remarkably improved thermal stability.

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Abstract

본 발명은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 특정 위치에 존재하는 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체 및 이의 다양한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소 또는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하기 때문에 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 수준의 효소 전환 반응시 오염을 방지할 수 있고 생산 시간을 단축시킬 수 있으며 생산 비용을 절감시킬 수 있다.

Description

열 안정성이 우수한 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
본 발명은 알룰로스 에피머화 효소 변이체 등에 관한 것으로서, 더 상세하게는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래의 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된 알룰로스 에피머화 효소 변이체 및 이로부터 파생된 다양한 발명들에 관한 것이다.
D-알룰로스(D-allulose)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)로서 D-사이코스(D-psicose)로도 불리운다. D-알룰로스(D-allulose)는 설탕과 비교했을 때 70% 감미도를 갖지만(Oshima 2006) 에너지는 0.3% 밖에 없으므로 다이어트 식품의 저칼로리 감미료로 적용 가능한 기능성 단당류이다(Matsuo et al. 2002). 또한, D-알룰로스(D-allulose)는 포도당 흡수 및 혈당을 억제하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품, 수신용 음식품 등에 응용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성의 억제를 통해 복부 지방 축적을 억제 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다(Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011).
위와 같은 특징으로 알룰로스는 설탕을 대체 할 수 있는 좋은 소스이나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에 식품산업에 적용하기 위해서는 알룰로스를 효율적으로 생산하는 방법이 필요하다. 기존의 알룰로스 생산 방법으로는 주로 화학적 과정을 거쳐 생산되었다. 빌릭(Bilik) 등은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법을 제안하였다. 맥도날드(McDonald)는 1,2:4,5-디-δ-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노스(1,2:4,5-di-δ-isopropylidene-beta-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 알룰로스를 생산하였다. 또한, 도너 (Doner)는 에탄올과 트리메틸아민과 함께 과당을 가열하여 알룰로스를 생산하였다. 그러나 이들 화학적 생산방법은 비용이 많이 소모되는 반면 그 효율은 낮고 또한 부산물들이 상당량으로 발생한다는 단점이 있다.
생물학적 알룰로스 생산방법으로는 미생물의 세포반응을 이용하여 갈락티톨 (galactitol), D-타가토스 또는 D-탈리톨 등으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 제안되었다(Ken Izumori). 그러나 이 방법은 기질이 희소당에 속하기 때문에 산업적 생산에 응용하기 힘들다. 산업화에 가장 효율적인 방법은 D-케토오스 3-에피머화 효소군 중 과당을 알룰로스로 전환하는 효소를 찾는 방법이다. 기존에 발표된 내용은 크로스트리디움 셀루로리티쿰 H(10)(Mu et al. 2011), 아그로박테리움 투메패시언스(Kim et al. 2006), 슈도모나스 치코리(Itoh at al. 1994), 리조비움 스페로이데스 (Zhang et al. 2009) 유래의 D-타가토스 3-에피머화 효소를 대장균에 삽입하여 형질전환 시킨 후 형질전환 된 대장균에서 발현된 D-타가토스 3-에피머화 효소를 사용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하였다.
효소를 사용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 기술과 관련하여, 대한민국 등록특허공보 제10-0744479호에는 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 알룰로스 에피머화 효소에 의한 알룰로스의 생산 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0832339호에는 과당을 알룰로스로 전환하는 활성을 지닌 시노리조비움 속 (Sinorhizobium) YB-58 KCTC 10983BP와 이를 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1106253호에는 과당의 알룰로스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 아그로박테리움 투메패시엔스 C58의 알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대장균 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1339443호에는 리조븀속(genus Rhizobium)에 속하는 미생물로부터 유래하는 케토오스 3-에피머라아제(ketose 3-epimerase) 및 이를 이용하여 과당을 알룰로스로 전환하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1318422호에는 크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens)로부터 유래된 D-알룰로스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1473918호에는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래하는 D-알룰로스 3-에피머화 효소 및 이를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 미생물로부터 유래한 야생형(Wild type)의 D-알룰로스 3-에피머화 효소는 과당의 알룰로스로의 전환율이 높지 않고, 열 안정성이 낮아 최적 활성 온도에서 실활되는 속도가 빨라 산업화에 적당하지 않다. 따라서, 미생물로부터 유래한 야생형(Wild type)의 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 또는 열 안정성이 향상된 신규한 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 개발이 필요하다. D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0021974호에는 유전자 수준에서 돌연변이를 유도하여 높은 온도에서의 빠른 알룰로스 전환속도와 안정성을 보이는 트레포네마 프리미티아 ZAS-1 유래의 D-알룰로스 3-에피머화 효소가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1203856호에는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 알룰로스 에피머화 효소의 변이를 통해 수득한 열 안정성이 향상된 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-2254411호에는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기인 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호에는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명은 첫 번째 목적은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제공하는데에 있다.
본 발명의 두 번째 목적은 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제조하는 방법 또는 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.
본 발명의 세 번째 목적은 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법 또는 과당으로부터 알룰로스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들을 제공하는데에 있다.
본 발명의 출원인은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 216번째 위치에 존재하는 아미노산 잔기인 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체에 대해 특허출원하여 등록받은 바 있고[대한민국 등록특허공보 제10-2254411호(2021.05.14)], 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체에 대해 특허출원하였다[대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호(2021.11.04)]. 상기 대한민국 등록특허공보 제10-2254411호 및 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호에 개시된 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소에 비해 열 안정성이 개선되었으나, 60℃ 이상의 고온에서 과당의 알룰로스로의 전환 반응을 장시간 동안 진행하는 경우 효소 활성이 떨어지고, 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 관점에서 여전히 개선될 필요가 있다. 본 발명의 발명자는 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호에 개시된 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성을 향상시키기 위해 단백질 구조 예측 기술을 활용하여 전환율 및 열 안정성 향상과 관련될 것으로 예상되는 아미노산 잔기 위치 후보들을 추가로 도출하고, 이 중 특정 위치의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 경우에만 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성이 향상된다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 첫 번째 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열 로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 제공한다.
상기 두 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열 로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열 로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계를 포함하는 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 제조방법을 제공한다.
상기 세 번째 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 과당을 서열번호 5 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 과당을 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소 또는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하기 때문에 알룰로스의 대량 생산을 위한 산업화 수준의 효소 전환 반응시 오염을 방지할 수 있고 생산 시간을 단축시킬 수 있으며 생산 비용을 절감시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 발명자들이 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상시키기 위해 치환 후보로 선정한 총 4개의 아미노산 잔기 위치를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 과당을 알룰로스로 전환시킬 수 있는 신규 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체(이하, '알룰로스 에피머화 효소 변이체'라 한다)에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 77번째 위치에 존재하는 알라닌(Als)이 세린(Ser)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것이다. 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소 또는 이의 변이체인 W29K/G216S/M234I에 비해 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 높고, 특히 60℃ 이상의 고온 조건에서 열 안정성이 매우 우수하다. 상기 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열(서열번호 1) 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 것으로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호에 제조방법 및 특성이 개시되어 있다. 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 변이체인 W29K/G216S/M234I를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4의 염기 서열로 이루어짐)를 주형으로 하고 소정의 염기 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 PCR을 수행하고, 이후 증폭된 변이체 단편의 쌍을 주형으로 하고 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 overlap extentention PCR을 수행하고, 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 또한, 상기 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 변이체인 W29K/G216S/M234I를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4의 염기 서열로 이루어짐)는 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2의 염기 서열로 이루어짐)를 주형으로 하고 소정의 염기 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 PCR을 수행하고, 이후 증폭된 변이체 단편의 쌍을 주형으로 하고 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 overlap extentention PCR을 수행하여 제작될 수 있다. 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 균등 범위가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 균등 범위는 과당을 알룰로스로 전환하는 활성 및 60℃ 이상의 고온에서 열 안정성이 유지되는 한, 서열번호 5의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 과당의 알룰로스로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 균등 범위는 서열번호 5의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95%이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 제조하는 방법 또는 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 폴리뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 재조합 벡터, 재조합 균주 등이 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 바람직하게는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진다. 본 발명에서 사용하는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형(non-modified) 또는 변형된(modified) 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일-및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA 또는 이들의 하이브리드 분자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 균등 범위는 서열번호 9의 염기 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은 서열번호 9의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 서열이 서열번호 9의 염기 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다. 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열 중 하나 또는 그 이상의 염기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일한 활성을 갖는 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 것으로서, D-알룰로스 3-에피머화 효소의 변이체인 W29K/G216S/M234I를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4의 염기 서열로 이루어짐)를 템플레이트(주형)로 이용하는 경우 다음과 같은 염기 서열을 가진 순방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된다.
A77S
* 순방향 프라이머 염기 서열(5'→3')
AATACGACCTGAGCAGCGACGATCCGGCGGTG
* 역방향 프라이머 염기 서열(5'→3')
GATCGTCGCTGCTCAGGTCGTATTTGGCCTCCA
또한, 상기 재조합 벡터는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 재조합 벡터는 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지의 표준 방법을 사용하여 클로닝 벡터나 발현 벡터 내로 삽입한 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "클로닝 벡터"는 숙주 세포 내로 DNA 단편을 운반하고 이를 재생산할 수 있는 물질로 정의된다. 본 발명에서 클로닝 벡터는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal), 전사 종결 서열(transcription termination sequence) 및 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)는 적어도 하나의 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 절단위치(restriction site)를 포함한다. 또한, 클로닝 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명에서 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐레이션 시그널(polyadenylation signal) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 상류(upstream)에 위치할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "발현 벡터"는 적절한 숙주 안에서 클로닝된 DNA의 전사와 번역을 위해 필요한 DNA 서열로 정의된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 용어 "발현 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA, 추가적 발현 조절 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한, 상기 프로모터에는 세포 유형 특이적 또는 외부의 신호 또는 제제에 의해 유도되는 조절 가능한 프로모터 의존적 유전자를 발현하도록 하는데에 충분한 프로모터 구성이 포함될 수 있으며, 이러한 구성들은 유전자의 5' 또는 3' 부분에 위치할 수 있다. 상기 프로모터에는 보존적 프로모터 및 유도적 프로모터 둘 다 포함된다. 프로모터 서열은 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 "작동가능하게 연결된"은 단일 폴리뉴클레오티드 상의 폴리뉴클레오티드 서열 연관성으로 하나의 기능이 다른 것에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있는 경우(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있는 경우) 프로모터는 코딩 서열과 연결되어 작동되거나, 리보좀 결합 자리가 번역을 촉진시킬 수 있도록 위치하고 있다면, 리보좀 결합 자리는 코딩 서열에 연결되어 작동되는 것이다. 코딩 서열은 센스 방향 또는 안티센스 방향에서 조절 서열에 연결되어 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다.
또한, 상기 재조합 균주는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것이다. 본 발명에서 사용하는 용어, "재조합 균주"는 하나 이상의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 갖는 발현 벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 세포를 의미한다. 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposemmediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리방법, 유전자 총(gene gun) 등을 이용하는 방법, 열충격(heat shock) 방법 등이 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포로는 원핵 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 등 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 대장균일 수 있다. 상기 대장균으로 BL21, JM109, K-12, LE392, RR1, DH5α 또는 W3110 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 외에도, 상기 숙주 세포로서 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아속 균주, 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬라속 균주, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등으로 이루어진 군에서 선택된 균주를 사용하여도 무방하다.
또한, 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 제조방법은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 사이코스 에피머화 효소를 분리하는 단계를 포함한다. 숙주 세포에 의한 단백질의 발현은 락토스(Lactose), 유도 인자인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 등을 사용하여 발현을 유도할 수 있고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절할 수 있다. 본 발명에서 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 재조합 균주의 파쇄물로부터 회수될 수 있다. 단백질 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학적 분리 기술에 의해서 분리 또는 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 예를 들어, 숙주 세포에 의해 발현된 단백질의 분리 또는 정제 방법으로는 전기영동, 원심분리, 겔 여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 또는 복합 방법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 한편, 본 발명에서 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계는 바람직하게는 펩티드 태그를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 수행될 수 있다. 상기 펩티드 태그로는 HA 태그, FLAG 태그, His 태그, BCCP (biotin carboxyl carrier protein), c-myc 태그, V5 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) 또는 MBP(maltose binding protein) 등과 같이 공지의 다양한 태그를 사용할 수 있으며, 이중 His 태그인 것이 바람직하다. His-태깅된 단백질은 Ni-NTA(니켈-니트릴로트리아세트산) 수지의 칼럼 상에 특이적으로 트랩핑되며, EDTA 또는 이미다졸에 의해 용출될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법 또는 과당으로부터 알룰로스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들에 관한 것이다. 상기 과당으로부터 알루로스를 제조하기 위해 필요한 다양한 요소들로는 알룰로스 생산용 조성물이 있다.
상기 알룰로스 생산용 조성물의 일 예는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 포함한다. 또한, 상기 알룰로스 생산용 조성물의 다른 예는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함한다. 이때, 상기 알룰로스 생산용 조성물은 바람직하게는 망간 이온, 니켈 이온 및 코발트 이온으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 망간 이온 또는 니켈 이온을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 신규 알룰로스 에피머화 효소 변이체는 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속효소(metalloenzyme) 특성을 나타내며, 상기 효소에 의한 반응을 망간 이온 또는 니켈 이온과 같은 특정 금속 이온의 존재 하에서 수행함으로써 알룰로스의 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법의 일 예는 과당을 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환 되거나 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함한다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 금속 이온의 종류는 전술한 바와 같다. 일 예로, 상기 금속 이온은 기질인 과당에 첨가되거나, 효소 변이체와 과당의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또한, 다른 예로 상기 금속 이온은 효소 변이체가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 효소 변이체가 고정화된 담체와 과당의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 첨가될 수 있다. 재조합 균주를 사용하는 경우, 상기 금속 이온이 배양물에 첨가되거나 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 배양이 수행될 수도 있다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 재조합 균주는 바람직하게는 담체에 고정화된다. 상기 담체는 고정된 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체로 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소를 안정적으로 고정시킬 수 있고 알룰로스 수율 측면에서 유리할 수 있다. 일 예로, 알룰로스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 바람직하게는 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 재조합 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 반응 온도는 60~70℃, 바람직하게는 60~67℃, 효소 변이체의 안정성 및 최대 활성을 고려할 때 더 바람직하게는 60~65℃의 범위이고, 반응 pH는 6.5~8, 바람직하게는 6.5~7.5, 더 바람직하게는 6.5~7의 범위이다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 과당의 농도는 특별히 제한되지 않으나, 생산성 내지 경제성을 고려할 때 전체 반응물을 기준으로 1~75%(w/w)인 것이 바람직하고, 4~35%(w/w)인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 방법에서 사용되는 효소 변이체의 농도는 전체 반응물 기준으로 0.001~0.5 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.01~0.2 ㎎/㎖, 더 바람직하게는 0.02~0.1 ㎎/㎖일 수 있다. 또한, 재조합 균주를 이용하여 과당으로부터 알룰로스를 제조하는 경우 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe)급 균주를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces sp.), 바실러스속 균주(Bacillus sp.), 코리네박테리움속 균주(Corynebacterium sp.) 등에서 선택될 수 있다. 상기 균주들은 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 균주들은 유전자 조작 및 대량 배양에 용이하거나, 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이다. 또한, 이러한 균주들은 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 보유하고 있기 때문에 높은 당 농도 등에 의한 삼투압의 영향 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 GRAS(generally accepted as safe)급 균주의 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1 : D-알룰로스 3-에피머화 효소의 전환율 및 열 안정성 향상을 위한 아미노산 치환 위치 추가 탐색
본 발명의 출원인은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상을 위해 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소의 아미노산 서열 중 29번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)이 라이신(Lys)으로 치환되고 216번째 위치에 존재하는 글리신(Gly)이 세린(Ser)으로 치환되고 동시에 234번째 위치에 존재하는 메티오닌(Met)이 이소류신(Ile)으로 치환된 신규 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I에 대해 이전에 특허출원하였다[대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호(2021.11.04)]. 상기 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)에서 유래한 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 야생형 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진다. 또한, 상기 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편은 서열번호 4의 염기 서열로 이루어진다.
본 발명의 발명자들은 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성을 향상시키기 위해 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 아미노산 서열을 기반으로 호몰로지 모델링 기법을 이용하여 단백질 구조를 예측하고, 아미노산 치환 위치를 탐색하였다. 상기 호몰로지 모델링은 Robetta 서버를 이용하여 수행되었고, 단백질 구조 예측 및 분석은 Coot, PyMol, UCSF Chimera와 같은 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행되었다. D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 3차원 구조 모델 분석을 통해 화학 결합의 변화시 전환율 및 열 안정성 향상과 관련될 것으로 예상되는 총 4개의 아미노산 잔기 위치 및 상기 위치로 치환될 아미노산 잔기를 선정하였다.
도 1은 본 발명의 발명자들이 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 향상시키기 위해 치환 후보로 선정한 총 4개의 아미노산 잔기 위치를 나타낸 것이다. 도 1에서 "A77"은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 77번째 위치에 존재하는 알라닌(Als)을 나타내고, "E173"은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 173번째 위치에 존재하는 글루탐산(Glu)을 나타내고, "W209"는 서열번호 3의 아미노산 서열 중 209번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 나타내고, "Q240"은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 240번째 위치에 존재하는 글루타민(Gln)을 나타낸다.
또한, 후술하는 바와 같이 서열번호 3의 아미노산 서열 중 77번째 위치에 존재하는 알라닌(Als)을 세린(Ser)으로 치환하여 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I를 제작하였고, 서열번호 3의 아미노산 서열 중 173번째 위치에 존재하는 글루탐산(Glu)을 알라닌(Ala)으로 치환하여 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/E173A/G216S/M234I를 제작하였고, 서열번호 3의 아미노산 서열 중 209번째 위치에 존재하는 트립토판(Trp)을 류신(Leu)으로 치환하여 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/W209L/G216S/M234I를 제작하였고, 서열번호 3의 아미노산 서열 중 240번째 위치에 존재하는 글루타민(Gln)을 아스파트산(Asp)으로 치환하여 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 효소 변이체 W29K/G216S/M234I/Q240D를 제작하였다.
실시예 2 : 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii ) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 과발현을 위한 재조합 벡터 및 재조합 균주 제작
D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)를 기반으로 overlap extension polymerase chain reaction 방법을 이용하여 효소 변이체 4종(W29K/A77S/G216S/M234I, W29K/E173A/G216S/M234I, W29K/W209L/G216S/M234I, W29K/G216S/M234I/Q240D)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하였다.
먼저, 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제작하기 위해 하기 표 1에 보이는 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로, 100μM의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)가 첨가된 반응액에 표 1의 프라이머인 올리고뉴클레오티드 1pM, 템플레이트(주형)로 이용되는 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 폴리뉴클레오티드(서열번호 4) 100ng을 혼합하고 Thermocycler(TP600, TAKARA BIO Inc., JAPAN)를 이용하여 pfu-X DNA 폴리머라제 혼합물(Bioneer) 1 유니트의 존재 하에 25~30주기로 PCR 반응을 수행하였다.
프라이머 설명 프라이머 염기 서열(5'→3')
A77S 순방향 프라이머 AATACGACCTGAGCAGCGACGATCCGGCGGTG
A77S 역방향 프라이머 GATCGTCGCTGCTCAGGTCGTATTTGGCCTCCA
E173A 순방향 프라이머 AAGAGGGCGTGGCGTTTGTCAAGCGCCTGGGC
E173A 역방향 프라이머 CGCTTGACAAACGCCACGCCCTCTTTGGCGGT
W209L 순방향 프라이머 AGGCGGGCCCCCTGCTGGGGCATTTCCACGTG
W209L 역방향 프라이머 AATGCCCCAGCAGGGGGCCCGCCTCCAGAATG
Q240D 순방향 프라이머 GCCGCCCTCAAGGATGTGAACTACCAGGGGGCC
Q240D 역방향 프라이머 CTGGTAGTTCACATCCTTGAGGGCGGCGGCAAT
프라이머 조합을 통해 변이체 단편을 증폭한 뒤, 각각의 쌍을 주형으로 하고 NdeI과 XhoI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 overlap extentention PCR을 통해 최종적으로 효소 변이체 4종(W29K/A77S/G216S/M234I, W29K/E173A/G216S/M234I, W29K/W209L/G216S/M234I, W29K/G216S/M234I/Q240D)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하였다. 하기 표 2에 제한 효소 인식 부위의 서열을 도입하기 위해 사용된 프라이머의 염기 서열을 나타내었다.
프라이머 설명 프라이머 염기 서열(5'→3')
NdeI 순방향 프라이머 GCATGCCATATGAACCCGATTGGAATGCA
XhoI 역방향 프라이머 GCATGCCTCGAGCGCGGTCAGCTCCTTGAGGA
서열번호 9의 염기 서열은 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 10의 염기 서열은 효소 변이체 W29K/E173A/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 11의 염기 서열은 효소 변이체 W29K/W209L/G216S/M234I의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내고, 서열번호 12의 염기 서열은 효소 변이체 W29K/G216S/M234I/Q240D의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 나타낸다. 서열번호 9 내지 12의 염기 서열은 효소 변이체의 아미노산 서열에 직접 대응되는 염기 서열로 구성되어 있고, 편의상 제한 효소 인식 부위의 서열을 생략하였다.
이후, 제작된 폴리뉴클레오티드 단편을 제한효소 NdeI과 XhoI을 사용하여 발현벡터인 pET28a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 발현 벡터 4종을 제작하였다. 또한, 열충격(heat shock) 방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning. 참조)을 사용하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)에 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질전환하고, 재조합 대장균 4종을 제작하였다. 제작한 재조합 대장균에 60% 글리세린 용액을 첨가하고, 효소 발현을 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 3 : 플라보니프랙터 플라우티( Flavonifractor plautii ) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 발현 및 정제
하기 표 3의 조성(배지 1L 기준)을 가진 단백질 발현용 배지 150㎖가 수용된 1L 용량의 플라스크에 실시예 2에서 제작한 재조합 대장균 1㎖를 접종하고 진탕 배양기로 32℃의 온도 조건 및 140 rpm의 진탕 조건을 유지하면서 24 hr 동안 배양하였다. 배지에 포함된 1% 락토스(Lactose)로 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 과발현을 유도하였다.
배지 성분 함량 배지 성분 함량
글리세롤(Glycerol) 9.0 중량% MgSO4 0.1 중량%
락토스(Lactose) 1.0 중량% FeSO4 10.0 ppm
(NH4)2SO4 0.6 중량% MnSO4 10.0 ppm
KH2PO4 0.5 중량% ZnSO4 10.0 ppm
YPA 1.5 중량% 소포제(네오린) 1.0 drop
이후, 과발현된 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 다음과 같은 방법으로 분리하였다. 먼저, 재조합 대장균의 배양액을 4100×g 및 4℃의 조건에서 약 15분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 재조합 대장균의 균체를 회수하였다. 이후, 회수된 재조합 대장균의 균체를 lysis buffer(50mM 제1인산칼륨, 300mM 염화칼륨, 5mM 이미다졸 함유)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기(Sonicator)로 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이후, 세포 파쇄액을 15,814×g 및 4℃의 조건에서 약 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 제거하고 상등액만을 회수하였다. 이후, 히스티딘 태그(His-tag) 친화 크로마토그래피 컬럼 및 탈염(desalting) 컬럼을 이용해 회수한 상등액으로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 함유한 정제 효소액을 분리하였다.
실시예 4 : D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성 확인
본 발명의 출원인이 이전에 특허출원한 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I[대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호(2021.11.04)] 및 본 발명에서 새롭게 제작한 D-알룰로스 에피머화 효소 변이체 4종(W29K/A77S/G216S/M234I, W29K/E173A/G216S/M234I, W29K/W209L/G216S/M234I, W29K/G216S/M234I/Q240D)의 과당의 알룰로스로의 전환율 및 열 안정성을 확인하기 위해 효소를 고온에 일정 시간 동안 노출시킨 후 과당의 알룰로스로의 전환 활성이 감소하는 정도를 분석하였다. 구체적으로 대한민국 공개특허공보 제10-2021-0132405호(2021.11.04)의 실시예 3에서 수득한 W29K/G216S/M234I 정제 효소액(효소 농도 0.3 ㎎/㎖) 및 본 발명의 실시예 3에서 수득한 정제 효소액(효소 농도 0.3 ㎎/㎖)을 62℃의 항온 수조에서 0 hr, 0.5 hr, 1 hr, 1.5 hr 및 2 hr 동안 보관하여 열처리 하였다. 이후, 10%(w/w) 과당 및 1mM 황산망간(MnSO4)의 금속 이온이 포함된 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)에 열처리된 정제 효소액을 효소 농도가 75 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 진탕 항온 수조(VS-1205SW1, 비전과학)를 이용하여 62℃의 온도 조건 및 120 rpm의 진탕 조건에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 반응 생성액의 온도를 4℃로 낮추어 반응을 정지시키고 16,600×g 및 4℃의 조건에서 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이후, 당 분석 컬럼(Benson, 미국)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(SP930D pump, 영린기기; MIDAS 자동시료주입기, Spark Holland 社) 및 굴절지수 검출기(2414 refractive index detector, Waters 社)를 이용하여 상등액 내 알룰로스 농도 및 과당 농도를 측정하고, 측정된 결과로부터 과당의 알룰로스로의 전환율을 계산한 후, 전환율을 효소 활성의 지표로 사용하였다.
하기 표 4에 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체를 열처리 하였을 때 열처리 조건별 과당의 알룰로스로의 전환율을 나타내었다.
62℃에서의 열처리 시간 알룰로스 에피머화 효소변이체의 열처리 시간별 과당의 알룰로스로의 전환율(%)
W29K/G216G/M234I W29K/A77S/G216S/M234I W29K/E173A/G216S/M234I W29K/W209L/G216S/M234I W29K/G216S/M234I/Q240D
0 hr 9.88 9.86 9.08 9.47 8.78
0.5 hr 6.59 7.31 5.73 6.29 6.01
1 hr 5.69 6.09 4.55 5.44 5.01
1.5 hr 4.50 4.88 3.66 4.38 4.15
2 hr 4.06 4.33 3.32 3.92 3.70
상기 표 4에서 보이는 바와 같이 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I의 아미노산 서열을 기반으로 새롭게 제작한 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) 유래 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 중 대부분은 W29K/G216S/M234I 보다 과당의 알룰로스로의 전환 활성 및 열 안정성이 더 낮은 것으로 나타났다. 한편, D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 W29K/A77S/G216S/M234I는 열처리 시간과 관계없이 D-알룰로스 3-에피머화 효소 변이체 W29K/G216S/M234I과 유사하거나 더 높은 과당의 알룰로스로의 전환 활성을 보였고, 특히 현저하게 향상된 열 안정성을 나타내었다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 알룰로스 에피머화 효소 변이체.
  2. 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제2항의 폴리뉴클레오티드, 제3항의 폴리뉴클레오티드 또는 제4항의 재조합 벡터 중 어느 하나에 의해 형질전환된 재조합 균주.
  6. 제5항의 재조합 균주를 배양하여 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 발현시키는 단계; 및
    상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체가 발현된 재조합 균주의 파쇄물로부터 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 분리하는 단계를 포함하는 알룰로스 에피머화 효소 변이체의 제조방법.
  7. 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 알룰로스 생산용 조성물.
  8. 제5항의 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 상기 재조합 균주의 파쇄물을 포함하는 알룰로스 생산용 조성물.
  9. 과당을 제1항의 알룰로스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 알룰로스 에피머화 효소 변이체를 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법.
  10. 과당을 제5항의 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 상기 재조합 균주의 파쇄물 또는 이들 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 알룰로스의 제조방법.
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