KR101339443B1 - 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

신규한 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 상기 효소를 코딩하는 DNA, 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 상기 효소를 이용한 케토오스의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 리조븀속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 상기 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 상기 효소를 이용하여, D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 제조하고, 또한, D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 제조하는 방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

케토오스 3-에피머라아제

Description

케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법 및 용도{KETOSE 3-EPIMERASE, PROCESS FOR PRODUCTION THEREOF, AND USE THEREOF}

본 발명은, 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 상세히는, 리조븀속(genus Rhizobium)에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (1) 및 (2)의 기질 특이성을 갖는 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 이 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA와 형질 전환체, 또한, 이 효소를 이용한 케토오스의 제조 방법에 관한 것이다.

(1) D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성한다. D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성한다.

(2) D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스(D-fructose) 및 D-프시코오스(D-psicose)에 대한 기질 특이성이 가장 높다.

일본 공개특허공보 2001-11090호에는, D-프시코오스가 저칼로리 감미료로서, 저칼로리 음식품의 제조에 유리하게 이용될 수 있는 것이 기재되어 있다. 또한, 일본 공개특허공보 2005-213227호에는, D-프시코오스가 혈당 상승 억제 작용을 하기 때문에, 건강 식품, 당뇨병 환자용 음식품, 수신용(瘦身用) 음식품 등에 유리하게 이용될 수 있는 것이 기재되어 있다.

한편, Ken Izumori 등, Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1037-1039(1993)에는 슈도모나스 시코리이(Pseudomonas cichorii) ST-24 유래의 D-케토헥소오스 3-에피머라아제가 개시되어 있고, 이 효소를 이용함으로써 D-프룩토오스로부터 D-프시코오스를 제조할 수 있는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이 효소는 별명 D-타가토오스 3-에피머라아제라고도 불리는 것처럼, D-타가토오스에 대한 특이성이 가장 높고, D-프룩토오스에 대한 작용은 비교적 약하다고 알려져 있다. 또한, 슈도모나스 시코리이는 식물 병원성 미생물이어서, D-케토헥소오스 3-에피머라아제 생산능이 매우 낮기 때문에, 공업적으로 이용하는 데 있어서 적합하다고는 말할 수 없다. 슈도모나스속에 속하는 미생물과는 다른 케토오스 3-에피머라아제 생산능이 높은 미생물, 및 D-프룩토오스에 대한 특이성이 높고, D-프시코오스의 제조에 적합한 신규 케토오스 3-에피머라아제가 요구되고 있다.

본 발명은, 신규한 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 이 효소를 코딩하는 DNA, 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 이 효소를 이용한 케토오스의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자 등은, 케토오스 3-에피머라아제 생산능을 갖는 슈도모나스속에 속하는 미생물 이외의 미생물에 주목하여, 예의 탐색을 계속해왔다. 그 결과, 신규한 케토오스 3-에피머라아제를 생산하는 리조븀속에 속하는 미생물을 발견했다. 또한, 이 미생물 유래의 신규한 케토오스 3-에피머라아제는, D- 또는 L-케토헥소오스, D- 또는 L-케토펜토오스에도 작용하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스에 대한 에피머화를 촉매하는 폭넓은 기질 특이성을 가지고 있고, 의외로, D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높아, D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조에 적합한 것을 발견했다. 그리고, 리조븀속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 신규 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 이 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체를 확립함과 더불어, 이 효소를 이용한 케토오스의 변환 방법 및 케토오스의 제조 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, 리조븀속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법, 이 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 함유하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 이 효소를 이용하여, D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 제조하고, 또한 D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 제조하는 방법을 제공함으로써 상기 과제를 해결하고자 한다.

리조븀속에 속하는 미생물은 신규한 케토오스 3-에피머라아제 생산능이 비교적 높고, 슈도모나스 시코리이와는 달리 식물 병원성도 갖고 있지 않다. 또한, 이 미생물로부터 얻을 수 있는 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 특히 D-프시코오스 및 D-프룩토오스 사이의 상호 변환을 양호하게 촉매하기 때문에, D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조에 유용하다.

도 1은 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 최적 pH를 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 최적 온도를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.

도 4는 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.

도 5는 재조합형 케토오스 3-에피머라아제 발현용의 재조합 DNA, pETDPE1을 나타내는 도면이다. 도면 중, 검은 굵은 선으로 표시한 부분은, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) ATCC14480 유래의 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA이다.

(도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명)

도 1 내지 4에 있어서,

●: 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하

○: 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하

도 5에 있어서,

f1 ori: f1 파지(phage) 복제 기점

Kan^r: 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자

lacI: lac 리프레서(repressor)

(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)

본 발명에서 말하는 케토헥소오스란, 케토오스 구조를 갖는 6탄당이며, 구체적으로는 프룩토오스, 프시코오스, 타가토오스 및 소르보오스를 의미하고, D- 또는 L-케토헥소오스는 이들의 D-체(D-body) 및 L-체를 의미한다. 또한, 마찬가지로, 본 발명에서 말하는 케토펜토오스란, 케토오스 구조를 갖는 5탄당이며, 구체적으로는 크실로오스(xylose) 및 리불로오스(ribulose)를 의미하고, D- 또는 L-케토펜토오스는 이들의 D-체 및 L-체를 의미한다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성하는 활성을 갖고, D- 또는 L-프룩토오스와 D- 또는 L-프시코오스 사이의 상호 변환, 및, D- 또는 L-타가토오스와 D- 또는 L-소르보오스 사이의 상호 변환을 촉매한다. 또한, D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성하는 활성을 갖고, D- 또는 L-크실로오스와 D- 또는 L-리불로오스 사이의 상호 변환을 촉매한다. 본 발명의 케토헥소오스 3-에피머라아제는, D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높은 효소이다. 본 발명의 효소는 후술하는 리조븀속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 활성은, D-프시코오스를 기질로 하여, D-프룩토오스의 생성량을 측정함으로써 알 수 있다. 구체적으로는, 1mM의 MnCl₂을 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0) 중에 D-프시코오스를 최종 농도 1 ％(w/v)가 되도록 용해한 것을 기질 용액으로 하여, 이 기질 용액 2ml와, 효소액 0.2ml를 혼합하여 45℃에서 30분간 반응을 실행하고, 그 후 끓는 물 배스 중에서 5분간 유지하여 효소를 실활시키고 반응을 정지한다. 이어서, 반응액 1ml를 채취하여, 이것에 탈이온수 1ml 및 NADP 용액(0.3M 트리에탄올아민(triethanolamine)-HCl 완충액(pH 7.6) 500ml에 NADP를 2.37g, ATP를 5.93g, MgSO₄·7H₂O을 1g 용해한 것)을 1ml 첨가하여 혼합한 후, 후술하는 효소액 A와 효소액 B를 0.3M 트리에탄올아민-HCl 완충액(pH 7.6)에 각각 4배 희석한 용액의 등량 혼합액을 40㎕ 첨가 혼합하여, 실온에서 30분간 정치(靜置) 후, 340nm에서의 흡광도를 측정함으로써, 반응에 의해 생성된 D-프룩토오스의 양을 측정한다. 효소액 A는, 0.3M 트리에탄올아민-HCl 완충액(pH 7.6)에 헥소키나아제(hexokinase) 6.7mg, 글루코오스 6-인산 탈수소 효소 82㎕를 첨가해 2ml로 한 용액이다. 효소액 B는, 0.3M 트리에탄올아민-HCl 완충액(pH 7.6)에 포스포글루코오스이소머라아제(phosphoglucoseisomerase)를 4mg 첨가해 2ml로 한 용액이다. 효소 활성 1단위는, 상기 조건하에서, D-프시코오스를 에피머화하여 1분간 1μmol의 D-프룩토오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 리조븀속에 속하고, 케토오스 3-에피머라아제 생산능을 갖는 미생물을 배양하여, 배양액 중에 생성된 케토오스 3-에피머라아제를 채취함으로써 조제할 수 있다. 리조븀속에 속하는 미생물로서는, 예를 들면, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum(biovar trifolii)) ATCC14480 주, 리조븀 프레디이(Rhizobium fredii) ATCC35423주 및 리조븀 멜리로티(Rhizobium meliloti) ATCC9930주 및 이들의 변이주 등을 유리하게 이용할 수 있다. 이들 균주 가운데, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480주는 케토오스 3-에피머라아제의 생산능이 비교적 높아, 본 발명의 효소를 얻는 데 있어서 적합하다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 하기의 이화학적 성질을 가지고 있는 경우가 있다.

(1) 분자량

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어서, 30,000±3,000돌턴을 나타낸다.

(2) 최적 pH

45℃, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하의 조건에서, pH 9.0 내지 9.5

(3) 최적 온도

pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하의 조건에서, 약 50℃

1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서, 약 65℃

(4) pH 안정성

30℃, 60분간 유지, 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하의 조건에서, 적어도 pH 8 내지 10의 범위에서 안정

1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정

(5) 온도 안정성

pH 8.0, 10분간 유지, 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하의 조건에서, 약 50℃ 이하에서 안정

1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서, 약 75℃ 이하에서 안정

(6) 금속 이온에 의한 활성화

Mn^{2 +} 및 Mg^{2 +} 이온에 의해 활성화된다.

또한, 상기 이화학적 성질을 갖는 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제 중의 하나는, 상기 이화학적 성질뿐만 아니라, 그 N말단 아미노산 서열로서, 서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있는 경우가 있다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 통상, 소정의 아미노산 서열을 가지고 있고, 그 일례로서는, 예를 들면, 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 그것에 상동적(相同的)인 아미노산 서열을 들 수 있다. 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 상동적인 아미노산 서열을 갖는 변이체 효소로서는, D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성하고, 또한, D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성하는 효소 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 대하여, 통상, 60％ 이상, 바람직하게는, 70％ 이상, 더 바람직하게 는, 80％ 이상, 보다 더 바람직하게는, 90％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 알맞다.

본 발명의 DNA란, 상기 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 것 전반을 의미한다. 본 발명의 DNA는, 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 것인 한, 그것이 천연 유래의 것이어도, 인위적으로 합성된 것이어도 괜찮다. 천연 공급원으로서는, 예를 들면, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum(biovar trifolii)) ATCC14480, 리조븀 프레디이(Rhizobium fredii) ATCC35423, 리조븀 멜리로티(Rhizobium meliloti) ATCC9930을 함유하는 리조븀속의 미생물을 들 수 있고, 이들의 균체로부터 본 발명의 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 얻을 수 있다. 즉, 이와 같은 미생물을 영양 배지에 접종하여, 호기적 조건하에서 약 1 내지 3일간 배양 후, 배양물로부터 균체를 채취하고, 리조팀(lysoteam)이나 β-글루카나아제(β-Glucanase) 등의 세포벽 용해 효소나 초음파로 처리함으로써 이 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 균체 밖으로 용출(溶出)시킨다. 이 때, 프로테아제(protease) 등의 단백질 분해 효소를 병용하거나, SDS 등의 계면 활성제를 공존시키거나 동결 융해해도 괜찮다. 이와 같이 하여 얻어지는 처리물에, 예를 들면, 페놀 추출, 알코올 침전, 원심분리, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 처리 등의 통상적인 방법을 적용하면 원하는 유전자 DNA를 얻을 수 있다. 본 발명의 DNA를 인위적으로 합성하려면, 예를 들면, 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 근거하여 화학 합성하면 된다. 또한, 상기 DNA를 함유하는 유전자 DNA를 주형으로 하여, 적당한 프라이머가 되는 화학 합성 DNA를 이용하여 PCR 합성하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명의 DNA는, 통상, 소정의 염기서열을 가지고 있고, 그 일례로서는, 예를 들면, 서열표에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 그것에 상동적인 염기서열을 들 수 있다. 서열표에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 상동적인 염기서열을 갖는 변이체 DNA로서는, 코딩되는 효소의 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 있어서 1개 또는 2개 이상의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기서열을 갖는 것을 들 수 있고, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 대하여, 통상, 60％ 이상, 바람직하게는, 70％ 이상, 더 바람직하게는, 80％ 이상, 보다 더 바람직하게는, 90％ 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 갖는 것이 알맞다. 또한, 유전자 코드의 축중(degeneracy)에 근거하여, 그 코딩되는 효소의 아미노산 서열을 변경하지 않고 염기의 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 것도 당연히, 본 발명의 DNA에 포함된다.

본 발명의 DNA를, 자율 복제 가능한, 적당한 벡터(vector)에 삽입하여 재조합 DNA로 하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 재조합 DNA는, 통상, DNA와 자율 복제 가능한 벡터로 이루어지고, DNA를 입수할 수 있으면, 통상적인 방법의 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 조제할 수 있다. 이와 같은 벡터의 예로서는, pBR322, pUC18, pBluescript Ⅱ SK(+), pUB110, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터나 λgt·λC, λgt·λB, ρ11, φ1, φ105 등의 파지 벡터를 들 수 있다. 이 중, 본 발명의 DNA를 대장균에서 발현시키려면, pBR322, pUC18, pBluescript Ⅱ SK(+), λgt·λC 및 λgt·λB가 알맞고, 한편, 고초균(枯草菌)에서 발현시키려면, pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1 및 φ105가 알맞다. pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7은, 재조합 DNA를 2종 이상의 숙주 내에서 복제시킬 경우에 유용하다. DNA를 이와 같은 벡터에 삽입하기 위해서는, 이러한 계통에 있어서 통상 일반적인 방법이 채용된다. 구체적으로는, 먼저, DNA를 함유하는 유전자 DNA와 자율 복제 가능한 벡터를 제한 효소 및/또는 초음파에 의해 절단하고, 이어서, 생성된 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 유전자 DNA 및 벡터의 절단으로 뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한 효소, 특히 Ⅱ형의 제한 효소, 상세히는, Sau 3AI, Eco RI, Hin dⅢ, Bam HI, Sal I, Ｘba I, Sac I, Pst I 등을 사용하면, DNA 단편과 벡터 단편을 연결하는 것이 용이하다. 필요에 따라서, 양자를 어닐링(annealing)한 후, 생체 내 또는 생체 외에서 DNA 리가아제(ligase)를 작용시키면 좋다. 이와 같이 하여 얻어지는 재조합 DNA는, 적당히 숙주에 도입해 형질 전환체로 하여, 이것을 배양함으로써 무한히 복제할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는, 대장균, 고초균, 방선균(放線菌), 효모를 비롯한 적당한 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 형질 전환체를 취득하기 위해서는, 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization)법을 적용하거나, 영양 배지에서 배양하여, 목적으로 하는 케토오스 3-에피머라아제를 생성하는 것을 선택하면 좋다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제 생산능을 갖는 리조븀속에 속하는 미생물 혹은 형질 전환체의 배양 방법은, 통상적인 방법에 따라, 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 등을 함유하는 영양 배지에 1 내지 5일간 정도 배양하고, 바람직하게는, 액체 배지에 통기 교반 등에 의해 호기적 조건하에서 배양하여, 얻어지는 균체, 또는 배양 상청액(上淸液) 등의 배양물로부터 케토오스 3-에피머라아제를 채취하면 좋다. 통상, 배양물을 조(粗) 케토오스 3-에피머라아제로서 이용할 수 있다. 필요하면, 배양물을 여과, 원심분리, 염석(鹽析), 투석(透析), 농축, 동결 건조 등 공지의 방법으로 부분 정제·채취하여, 이용할 수 있다. 또한 고도의 정제를 필요로 할 경우에는, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 전기영동, 또, 모노클로널 항체에 대한 흡착, 용출 등을 조합하여 순도를 높여서 이용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제 또는 케토오스 3-에피머라아제를 발현한 리조븀속 미생물 균체를 공지의 방법에 의해 고정화하여, 반응에 반복해 이용하는 것도, 연속 반응에 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

케토오스 3-에피머라아제가 재조합형 효소일 경우에는, 숙주의 종류에 따라서는 균체 내에 효소가 축적될 수가 있다. 이러한 경우에는, 균체 또는 배양물을 그대로 사용하는 것도 가능하지만, 통상은 사용에 앞서, 필요에 따라서, 침투압 쇼크나 계면활성제에 의해 균체로부터 추출한 후, 또는, 초음파나 세포벽 용해 효소에 의해 균체를 파쇄한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 재조합형 효소를 균체 또는 균체 파쇄물로부터 분리하여 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

케토오스의 변환 반응은, 통상, 다음 조건에서 실행된다. 기질 농도는 1 내지 60％(w／v), 바람직하게는, 약 5 내지 50％(w/v), 반응 온도는 10 내지 70℃, 바람직하게는, 약 30 내지 60℃, 반응 pH는 5 내지 10, 바람직하게는, 약 7 내지 10, 효소 활성은 기질 1g당 1단위 이상, 바람직하게는, 50 내지 5,000단위의 범위로부터 선택된다. 반응 시간은, 적당히 선택할 수 있지만, 경제성을 고려해 볼 때, 배치(batch) 반응의 경우에는, 통상, 5 내지 50시간의 범위가 선택된다.

이렇게 하여 변환시켜 얻어지는 반응 용액은, 원료인 케토오스와 새롭게 생성된 케토오스를 함유하고 있어, 이것을 그대로 감미료, 보습제, 결정 석출 방지제, 광택 부여제 등으로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 통상, 반응 용액은, 통상적인 방법에 따라, 활성탄을 이용하여 탈색하고, H형 및 OH형 이온 변환 수지를 이용해서 탈염, 농축하여 시럽상 제품을 얻는다.

필요하면, 다시, 이 농축액을, 예를 들면, 알칼리 금속형 또는 알칼리 토류 금속형 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해, 새롭게 생성된 케토오스와 원료 케토오스를 분리 정제하고, 새롭게 생성된 케토오스 고함유 획분을 농축하여, 시럽상 제품을 얻을 수 있다. 더욱이, 결정화할 수 있는 케토오스의 경우에는, 결정으로 석출시켜, 결정 제품을 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 이 분리된 원료인 케토오스를, 다시, 변환 반응의 원료로 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 케토오스는, 감미료로서 알맞고, 음식물, 사료, 이료(餌料), 치약, 구중향정, 설하정, 내복약 등의 경구 섭취물의 감미 부여와, 기호성 향상 등에 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 발효용 탄소원, 시약, 화학품·의약품의 원료, 중간체 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

이하, 실험에 의해 본 발명을 상세히 설명한다. 또한 이하의 실험에 있어서는 D-프시코오스를 D-프룩토오스로 변환하는 D-프시코오스 3-에피머라아제 활성을 상기한 활성 측정법에 의해 측정하여, 케토오스 3-에피머라아제 활성으로 표기했 다.

<실험 1: 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 배양>

전분(澱粉) 부분 분해물(상품명 「파인덱스#4」, 마쓰타니 화학 공업 주식회사 판매) 1.5％(w/v), 말토오스(상품명「산말토S」, 주식회사 하야시바라 상사 판매) 0.1％(w/v), 효모 엑스(상품명 「효모 엑스S」, 니폰 제약 주식회사 판매) 0.1％(w/v), 폴리 펩톤(상품명 「폴리 펩톤S」, 니폰 제약 주식회사 판매) 0.5％(w/v), 인산수소2칼륨 0.1％(w/v), 인산2수소나트륨 0.06％(w/v), 황산마그네슘 0.05％(w/v), 황산 제1철 0.001％(w/v), 황산 망간 0.001％(w/v) 및 탈이온수로 이루어지는 액체 배지를 30L-자 퍼멘터(jar fermenter)에 20L 넣고, 120℃, 20분간 멸균한 후, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 종배양액 1％(v/v)를 무균적으로 첨가하여, 통기 교반하면서 27℃에서 72시간 배양했다. 얻어진 배양액 속의 케토오스 3-에피머라아제 활성은 약 1.0단위/ml-배양액이었다.

<실험 2: 케토오스 3-에피머라아제의 정제>

실험 1에서 얻은 배양액 약 10L로부터 원심분리하여 균체를 모으고, 이것을 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0) 1L에 현탁하여, 세포 파쇄기 다이노밀(벳코펜제)을 이용하여 파쇄했다. 얻어진 균체 파쇄 현탁액을 원심분리하여, 상청을 회수해서 균체 파쇄 추출액으로 했다. 균체 파쇄 추출액은, 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0)에 대하여 투석한 후, 세파비즈(Sepabeads) FP-DA13(미쓰비시 화학 주식회사제)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 800ml)에 제공되어, 흡착된 케토오스 3-에피머라아제를 식염 농도 OM∼0.6M의 선형구배(linear gradient)로 용출 시켰다. 얻어진 활성 획분을 회수하고, 최종 농도 1M이 되도록 황산암모늄을 첨가하여, 부틸-토요펄(Butyl-Toyopearl) 650M(토우소 주식회사제)을 이용한 소수 크로마토그래피(겔 용량 100ml)에 제공한 결과, 케토오스 3-에피머라아제는 흡착되지 않고 비흡착 획분으로 용출됐다. 활성 획분을 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0)으로 투석하고, DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S(토우소 주식회사제)를 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔 용량 100ml)에 제공하여, 흡착된 케토오스 3-에피머라아제를 식염 농도 OM∼0.6M의 선형구배로 용출시켰다. 얻어진 활성 획분을 농축하고, 토요펄 HW-55S(토우소 주식회사제)를 이용하는 겔 여과 크로마토그래피(겔 용량 300ml)에 제공하여 활성 획분을 회수했다. 얻어진 활성 획분은, 다시 리소스(resource) PHE(아머샴 바이오사이언스사제)를 이용한 소수 크로마토그래피, 리소스 Q(아머샴 바이오사이언스사제)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 및 수퍼덱스(Superdex) 200 HR26/60(아머샴 바이오사이언스사제)를 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 제공되어 정제되고, 케토오스 3-에피머라아제 정제 표본을 얻었다.

정제 공정을 표 1에 정리했다.

공정	케토헥소오스 3-에피머라아제 활성* (단위)	케토헥소오스 3-에피머라아제 비활성 (단위/mg-단백질)	수율(％)
균체 파쇄 추출액	5,010	0.02	100
세파비즈 용출액	6,060	0.13	121
부틸-토요펄 용출액	2,850	0.17	57
DEAE-토요펄 용출액	2,350	0.31	47
토요펄 HW-55S 용출액	1,020	0.51	20
리소스 PHE 용출액	610	3.5	12
리소스 Q 용출액	270	10.3	5
수퍼덱스 200 용출액	90	41.6	2

*： D-프시코오스 3-에피머라아제 활성

표 1의 결과에서 명확한 바와 같이, 이 정제 공정에 의해, 비활성은 약 2,080배로 상승했다. 정제한 케토오스 3-에피머라아제 표본의 순도를 5 내지 20％(w/v) 농도구배 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 겔 전기영동법에 의해 검정한 결과, 단백질 밴드는 거의 단일이어서, 순도가 높은 표본이었다.

<실험 3: 케토오스 3-에피머라아제의 성질>

<실험 3-1: 분자량>

실험 2의 방법으로 얻은 케토오스 3-에피머라아제 정제 표본을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(5 내지 20％(w/v) 농도구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(니폰 바이오 라드 라보라토리즈 주식회사제)와 비교하여 분자량을 측정한 결과, 케토오스 3-에피머라아제의 분자량은 30,000±3,000돌턴인 것이 판명됐다.

<실험 3-2: 최적 pH 및 최적 온도>

실험 2의 방법으로 얻은 케토오스 3-에피머라아제 정제 표본을 이용하여, 케토오스 3-에피머라아제 활성에 미치는 pH, 온도의 영향을 활성 측정의 방법에 준해서 조사했다. 이들의 결과를 도 1(최적 pH), 도 2(최적 온도)에 나타냈다. 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 최적 pH는, 45℃, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재 하의 조건에서 pH 9.0 내지 9.5였다. 최적 온도는 pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하(도 2에서의 부호 ●)의 조건에서 약 50℃이며, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하(도 2에서의 부호 ○)에서는 약 65℃인 것이 판명됐다.

<실험 3-3: pH 안정성 및 온도 안정성>

실험 2의 방법으로 얻은 케토오스 3-에피머라아제 정제 표본을 이용하여, 케토오스 3-에피머라아제의 pH 안정성 및 온도 안정성을 조사했다. pH 안정성은, 효소를 1mM MnC1₂ 첨가 또는 무첨가의 각 pH의 10mM 완충액 중에서 30℃, 60분간 유지한 후, pH를 8.0으로 조정하여, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구했다. 온도 안정성은, 1mM MnCl₂ 첨가 또는 무첨가의 20mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)을 이용하고, 효소 용액을 각 온도로 10분간 유지하여, 수냉한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구했다. 이들의 결과를 도 3(pH 안정성), 도 4(온도 안정성)에 나타냈다. 도 3에서 명확한 바와 같이, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 pH 안정성은, 1mM Mn^{2 +} 이온의 비존재하(도 3에서의 부호 ●)에서는 적어도 pH 8 내지 10의 범위에서 안정인 것이 판명됐다. pH 10을 넘으면 활성 측정에 있어서, 생성되는 D-프룩토오스의 정량에 지장을 초래하기 때문에, pH 10을 넘는 범위의 안정성은 평가할 수 없었다. 한편, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하(도 3에서 부호○)에서는, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정인 것이 판명됐다. 또한, 도 4에서 명확한 바와 같이, 온도 안정성은, 1mM Mn^{2 +} 이온 비존재하(도 4에서의 ●)에서는 약 50℃ 이하에서 안정이며, 1mM Mn²⁺ 이온 존재하(도 4에서 ○)에서는 약 75℃ 이하에서 안정인 것이 판명됐다.

<실험 3-4: 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향>

실험 2의 방법으로 얻은 정제 효소 표본을 이용하고, 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을, 1mM의 MnCl₂을 함유하지 않는 기질 용액을 이용하여, 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성 측정함으로써 조사했다. 금속염 가운데, 염화철의 2종(FeCl₂ 및 FeCl₃) 및 염화수은(HgCl₂)은 반응액 속의 D-프룩토오스의 정량에 악영향을 끼치기 때문에, 이들 3종의 금속 이온 존재하에서 D-프룩토오스의 생성량에 대해서는, HPLC를 이용해서 정량했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

금속염	상대활성(％)	금속염	상대활성(％)
무첨가	100	MgCl2	141
AlCl3	86	MnCl2	283
BaCl2	96	NiCl2	64
CaCl2	89	PbCl2	69
CoCl2	101	SrCl2	103
CuCl2	60	SnCl2	114
FeCl2*	67	ZnCl2	13
FeCl3*	64	EDTA	97
HgCl2*	35

*： HPLC로 D-프룩토오스를 정량

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제의 활성은, 조사한 15종의 금속 이온 중, Mg²⁺ 및 Mn^{2 +} 이온에 의해, 각각 금속 이온 무첨가 시의 약 140％ 및 약 280％로 활성화되었다. Sn^{2 +} 이온으로는 약간 활성화되고, Co^{2 +} 및 Sr^{2 +} 이온으로는 영향은 나타나지 않았다. Ni^{2 +}, Cu^{2 +}, Pb^{2 +}, Fe^{2 +} 및 Fe^{3 +}의 각 이온으로는 활성이 다소 저해되고, Zn²⁺ 및 Hg^{2 +} 이온으로는 현저하게 저해되었다. 또한, EDTA에 의해서는 저해되지 않았다.

<실험 3-5: N말단 아미노산 서열>

실험 2의 방법으로 얻은 정제 케토오스 3-에피머라아제 표본을 이용하여, 본 효소의 N말단 아미노산 서열을, 프로테인 시퀀서 모델 492HT(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 이용하여 분석한 결과, 서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 즉, 메티오닌―글루탐산-글리신-페닐알라닌-글리신-발린-히스티딘-트레오닌-세린-메티오닌을 가지고 있는 것이 판명됐다.

<실험 4: 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 이것을 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 조제>

케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA를 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480으로부터 클로닝하여, 자율 복제 가능한 재조합 DNA의 제작, 효소를 코딩하는 DNA의 염기서열의 결정, 및 형질 전환체의 조제를 실행했다.

<실험 4-1: 염색체 DNA의 조제>

D-만니톨(D-mannitol) 2w/v％, 효모 엑스(상품명 『Bacto-yeast extract』, Difco사 판매) 0.1w/v％, 펩톤(상품명 『Bacto-peptone』, Difco사 판매) 0.5w/v％, 인산2칼륨 0.1w/v％, 인산1나트륨·2수염 0.1w/v％, 황산마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 이루어지는 액체 배지(pH 7.0)를, 500ml 삼각 플라스크 20개에 50ml씩 넣어, 오토클레이브(autoclave)에서 121℃, 20분간 멸균·냉각하고, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480을 접종하여, 27℃, 230rpm으로 2일간 회전 진탕 배양하였다.

원심분리에 의해 배양물로부터 채취한 균체를 TES 완충액(pH 8.0)에 부유시키고, 리조팀을 0.05％(w/v) 첨가하여, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 처리물을 -80℃에서 1시간 동결 후, TES 완충액(pH 9.0)을 첨가하여 60℃로 가온하고, TES 완충액/페놀 혼액을 첨가해, 얼음물 중에서 냉각하면서 10분간 격렬하게 진탕한 후, 원심분리에 의해 상청을 채취했다. 이 상청에 2배의 냉에탄올을 첨가하고, 침전한 조염색체 DNA를 채취하여, SSC 완충액(pH 7.1)에 용해 후, 리보뉴클레아제와 프로테이나아제를 각각 7.5μg과 125μg 첨가하여, 37℃에서 1시간 유지하여 반응시켰다. 반응물에 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform/isoamyl alcohol) 혼액을 첨가하여 염색체 DNA를 추출하고, 냉에탄올을 첨가해, 생성된 염색체 DNA를 함유하는 침전을 채취했다. 이렇게 하여 얻은 정제 염색체 DNA를 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하고, -80℃에서 동결했다.

<실험 4-2: 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 염기서열의 결정>

실험 3-5에서 얻은 케토오스 3-에피머라아제의 N말단 아미노산 서열(서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)에 근거하여, 동(同) 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 단백질을, 상동성 검색 프로그램 『BLAST』를 이용하여, 데이터 베이스『GenBank』를 대상으로 검색한 결과, N말단 아미노산 서열의 아미노산 잔기 10 잔기 중 9 잔기가 일치하는 시노리조븀 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)1021 유래의 미지의 단백질이 인지되어, 이 단백질도 당질의 에피머라아제로 추측되었다. 또한 상기 미지의 단백질은 서열표에서 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있고, 서열표에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA에 의해 코딩되어 있었다. 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 케토오스 3-에피머라아제의 아미노산 서열이 전체 영역에 걸쳐 상기 미지의 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 높다는 전제를 바탕으로, 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 클로닝을 시험해 보았다.

서열표에서 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열(시노리조븀 멜리로티1021 유래의 미지의 단백질)의 제10 내지 16번째의 아미노산 서열에 근거하여, 센스 프라이머로서 서열표에서 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 합성하고, 동(同) 제179 내지 185번째의 아미노산 서열에 근거하여, 안티 센스 프라이머로서 서열표에서 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 합성했다. 이들 프라이머를 이용하여, 실험 4-1에서 얻은 염색체 DNA를 주형으로 하여 통상적인 방법에 의해 PCR 증폭을 실행한 결과, 약 600bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 이 DNA 단편을 클로닝 벡터 pCR-Script Amp SK+(스트라타진사제)의 제한 효소 Srf I사이트(site)에 클로닝하여, 얻어진 재조합 DNA를 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하였다. 형질 전환체 5클론으로부터 플라스미드를 조제하여 조사한 결과, 모두 목적으로 하는 약 600bp의 DNA 단편을 가지고 있었다. 1클론을 선택하여, 그 재조합 플라스미드를 「pCR12-1」이라고 명명했다.

삭제

재조합 DNA, pCR12-1이 갖는 약 600bp의 DNA 단편의 염기서열을, 통상의 디데옥시법에 의해 해독한 결과, 해독된 345bp의 염기서열이 코딩하는 아미노산 서열은, 상기 시노리조븀 멜리로티1021 유래의 당질의 에피머라아제로 추측되는 미지의 단백질의 부분 아미노산 서열과 약 78％의 높은 상동성을 가지고 있었다. 이 결과에서, 얻어진 DNA 단편은 목적으로 하는 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 일부로 추측되었다.

상기의 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 일부로 추측된 DNA 단편이 제한 효소 Cla I로 절단되지 않는 것을 미리 확인한 후, 실험 4-1에서 얻은 염색체 DNA를 제한 효소 Cla I로 소화하여, 소화물을 셀프 라이게이션(self ligation)시켜 환상화(環狀化) 게놈을 얻었다. 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 일부로 추측된 DNA 단편의 염기서열에 근거하여, 프라이머로서, 서열표에서 서열번호 8 내지 11로 표시되는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 합성했다. 서열표에서 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 각각 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서 이용하여, 상기 환상화 게놈을 주형으로 하여 1차 PCR을 실행하고, 이어서, 서열표에서 서열번호 10 및 11의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 각각 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 하여 2차 PCR을 실행한 결과, 약 1,800bp의 DNA 단편이 증폭되었다.

얻어진 약 1,800bp의 DNA 단편의 염기서열을, 직접, 통상적인 방법의 디데옥시법에 의해 해독하여, 상기 염기서열로 코딩되는 아미노산 서열과 실험 3-5의 방법으로 확인된 케토오스 3-에피머라아제의 N말단 아미노산 서열(서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)을 비교한 결과, 상기 염기서열 가운데 코딩된, 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 제1 내지 10번째의 아미노산 서열과 완전히 일치했다. 이것은, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 케토오스 3-에피머라아제가, 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 282 아미노산 잔기의 아미노산 서열로 이루어지는 것이며, 또한, 상기 효소를 코딩하는 DNA는, 서열표에서 서열번호 3으로 표시되는 사슬 길이 846bp의 염기서열을 갖는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로부터 산출되는 분자량은 약 30,900돌턴이며, 이 값은 실험 3-1에서 측정된 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 케토오스 3-에피머라아제의 분자량 30,000±3,000돌턴과 양호하게 일치했다.

<실험 4-3: 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 재클로닝과 염기서열의 재확인>

실험 4-2에서 결정된 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 염기서열을 확정시킬 목적으로, 이 DNA에서 번역 개시 코돈(codon) 및 종결 코돈을 포함하는 프라이머를 합성하여, 실험 4-1에서 얻은 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실행하고, 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA의 재클로닝을 실행하여, 염기서열을 다시 해석했다. 또한, 상기 프라이머는, 재클론화한 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA를 발현용 벡터에 편입시킬 목적으로, 상기 DNA의 상류에 제한 효소 Nde I 인식 부위를 도입하고, 하류에 제한 효소 Eco RI 인식 부위를 도입하기 위해 설계됐다.

서열표에서 서열번호 12 및 13으로 각각 표시되는 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 합성하여, 각각을 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서 이용하고, 실험 4-1에서 얻은 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실행하여, 증폭 DNA 단편을 벡터 pCR-Script Amp SK+(스트라타진사제)의 제한 효소 Srf I사이트에 클로닝하여, 얻어진 재조합 DNA를 『pCRDPE6』이라고 명명했다. pCRDPE6이 갖는 DNA의 염기서열을 통상적인 방법의 디데옥시법에 의해 결정한 결과, 실험 4-2에서 결정한 서열표에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 완전히 동일한 염기서열을 포함하고 있었다.

<실험 5: 발현용 재조합 DNA, pETDPE1의 제작과 그 형질 전환체에 의한 재조합형 케토오스 3-에피머라아제의 생산>

재조합 DNA 『pCRDPE6』중의 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA를 발현용 벡터에 삽입하고, 대장균에서 재조합형 케토오스 3-에피머라아제를 발현시켜, 그 활성을 조사했다.

<실험 5-1: 발현용 재조합 DNA, pETDPE1의 제작 및 형질 전환체 ETDPE1의 조제>

실험 4-3에서 얻은 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 DNA 『pCRDPE6』을 제한 효소 Nde I 및 Eco RI에 의해 소화하고, 70℃에서 30분간 열처리하여 제한 효소를 실활시켰다. 상기 소화물을 이용하고, 미리 제한 효소 Nde I 및 Eco RI로 소화된 발현 벡터, pET-38b(+)(노바젠사제)에 시판의 키트(상품명 「Ligation Kit Ver.2.1, 다카라주조제)를 이용하여 삽입했다. 이 반응물을 이용해서 대장균 JM1O9(토요방제)를 형질 전환하여, 목적으로 하는 재조합 DNA를 유지하는 형질 전환체를 선택하고, 이 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 단리(單離)하여 『pETDPE1』이라고 명명했다. 이어서, pETDPE1을 도 5에 나타낸다. pETDPE1을 이용하여 발현용 숙주 대장균 Rosetta(DE3)(노바젠사제)를 형질 전환하여 형질 전환체 『ETDPE1』을 조제했다.

<실험 5-2: 형질 전환체 ETDPE1에 의한 재조합형 케토오스 3-에피머라아제의 생산>

10g/l 트립톤(상품명 『Bacto-tryptone』, Difco사 판매), 5g/l 효모 엑스(상품명 『Bacto-yeast extract』, Difco사 판매) 및 10g/l 식염 및 물로 이루어지는 액체 배지를, 500ml 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여, 무균적으로 pH 7.5로 조정한 후, 카나마이신 2mg을 무균적으로 첨가하여 액체 배지를 조제했다. 이 액체 배지에 실험 5-1의 방법으로 얻은 형질 전환체 ETDPE1을 접종하고, 37℃에서 회전 진탕 배양하여 탁도가 약 0.6에 달한 시점에서 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)를 최종 농도 0.4mM이 되도록 첨가하여 케토오스 3-에피머라아제 유전자의 발현을 유도하고, 다시 27℃에서 3시간 배양했다. 얻어진 배양물을, 통상적인 방법에 따라, 원심분리하여 균체를 회수했다. 이어서, 균체를 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음물 중에서 냉각하면서 초음파 호모지나이저(모델 UH-600, 주식회사 SMT제)로 세포 파쇄하여, 그 파쇄물의 원심 상청을 세포 파쇄 가용성 획분으로 했다.

이렇게 하여 조제한 세포 파쇄 가용성 획분에 대해서 케토오스 3-에피머라아제 활성을 측정하여, 활성값을 배양물 1ml당으로 환산했다. 또한, 대조(對照)로서 플라스미드 pET-38b(+)를 유지하는 대장균 Rosetta(DE3)를 상기의 형질 전환체의 경우와 동일 조건으로 배양하고, 마찬가지로 배양물로부터 세포 파쇄 가용성 획분을 조제하여, 케토오스 3-에피머라아제 활성을 측정했다. 이들의 결과를 표 3에 나타낸다.

균주	케토오스 3-에피머라아제 활성 (단위/ml-배양물)
ETDPE1 (본 발명)	8.7
대장균 Rosetta(DE3) pET-38b(+) (대조)	―*

*：「―」은 "검출되지 않음"을 나타낸다.

표 3의 결과에서 명확한 바와 같이, 형질 전환체 ETDPE1은, 재조합형 케토오스 3-에피머라아제를 세포 내에 생산하는 것이 판명됐다. 발현용 벡터만을 유지하는 대조의 대장균에서는 상기 효소 활성은 전혀 나타나지 않았다.

이 실험 5의 방법으로 얻은 세포 파쇄 가용성 획분을, 다시 실험 2에 나타낸 방법에 준하여, 염석, 투석하고, 세파비즈 겔, 부틸-토요펄 겔을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 제공하여 부분 정제하고, 다시 이 부분 정제 효소 표본을 실험 3에 나타낸 방법에 준해서 분석했다. 그 결과, 재조합형 케토오스 3-에피머라아제의 최적 pH는, 45℃, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서 pH 9.0 내지 9.5, 최적 온도는 pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서 약 65℃, pH 안정성은, 1mM Mn²⁺ 이온 존재하, 각 pH로 30℃에서 60분간 유지하는 조건하에서 약 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정, 온도 안정성은, 각 온도에서 pH 8.0으로 10분간 유지하는 조건하에서, Mn^{2 +} 이온 비존재하에서 약 50℃까지, 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서 약 75℃까지 안정이었다. 이들의 이화학적 성질은, 실험 2에 나타난 방법으로 조제된 상기 효소의 그것과 실질적으로 동일했다. 이상의 결과는, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 재조합 DNA 기술에 의해 양호하게 제조할 수 있는 것을 나타내고 있다.

<실험 6: 케토오스 3-에피머라아제의 기질 특이성>

실험 2의 방법으로 얻은 케토오스 3-에피머라아제의 정제 표본을 이용하고, 상기 효소의 기질 특이성을, 각종 D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스를 이용하여 조사했다. D-프룩토오스, D-프시코오스, D-타가토오스, D-소르보오스, D-크실로오스, D-리불로오스, L-프룩토오스, L-프시코오스, L-타가토오스, L-소르보오스, L-크실로오스 또는 L-리불로오스를, 각각 최종 농도 1％(w/v)가 되도록 1mM의 MnCl₂을 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 용해한 것을 기질 용액으로 하여, 실험 2의 방법으로 얻은 케토오스 3-에피머라아제 정제 표본을 D-프시코오스 3-에피머라아제 활성으로서 기질 고형물 1g당 2단위 또는 20단위씩 첨가해, 45℃에서 17시간 반응시켰다. 100℃에서 10분간 유지하여 반응을 정지시킨 후, 각각의 기질로부터 생성된 에피머의 함량을 고속 액체 크로마토그래피(이하, HPLC로 약칭한다.)를 이용하여 측정했다. HPLC는, 칼럼으로 『MCI GEL CKO8EC』 (주식회사 미쓰비시 화학제)를, 용리액으로 물을 이용하여, 칼럼 온도 75℃, 유속 0.6ml／min의 조건으로 실행하고, 검출은 시차 굴절계 RID-10A(주식회사 시마즈 제작소제)를 이용하여 실행하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.

기질		생성 에피머	반응물의 에피머 함량(％)
			효소 작용량(단위/g-기질)
			2	20
D-케토헥소오스	D-프룩토오스	D-프시코오스	17.7	25.8
	D-프시코오스	D-프룩토오스	39.4	74.1
	D-타가토오스	D-소르보오스	0.6	5.3
	D-소르보오스	D-타가토오스	0	0.1
D-케토펜토오스	D-크실로오스	D-리불로오스	2.3	19.6
	D-리불로오스	D-크실로오스	17.1	43.4
L-케토헥소오스	L-프룩토오스	L-프시코오스	0	1.4
	L-프시코오스	L-프룩토오스	1.6	11.3
	L-타가토오스	L-소르보오스	3.2	26.7
	L-소르보오스	L-타가토오스	0	6.2
L-케토펜토오스	L-크실로오스	L-리불로오스	1.6	10.3
	L-리불로오스	L-크실로오스	19.2	58.4

표 4의 결과에서 명확한 바와 같이, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는 시험한 모든 D- 또는 L-케토헥소오스, D- 또는 L-케토펜토오스에 작용하고, 정도의 차는 있지만 3 위치 히드록실기의 아노머를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스, D- 또는 L-케토펜토오스를 생성하는 것이 판명됐다. 효소 작용량이 2단위/g-기질로 적은 경우에 있어서도 D-프시코오스의 약 39％가 D-프룩토오스로 변환되고, 한편, D-프룩토오스의 약 18％가 D-프시코오스로 변환됐기 때문에, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는 시험한 기질 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스 사이의 변환을 가장 양호하게 촉매하는 것이 판명됐다. D-리불로오스 및 D-크실로오스 사이, 또는, L-리불로오스 및 L-크실로오스 사이의 변환도 비교적 양호하게 촉매했지만, D-타가토오스 및 D-소르보오스 사이의 변환은 극히 미미했다.

한편, 상기와 마찬가지로, D-글루코오스, D-갈락토오스, D-만노오스(D-mannose), D-크실로오스, D-리보오스 또는 L-아라비노오스(L-arabinose)를 이용하여, D-알도헥소오스, D- 또는 L-알도펜토오스에 대한 작용도 조사한 결과, 이들 기질에는 상기 케토오스 3-에피머라아제는 전혀 작용하지 않고, 시험한 범위에서는 알도오스에는 작용하지 않는 것이 확인되었다.

<실험 7: 그 밖의 리조븀속에 속하는 미생물 유래의 케토오스 3-에피머라아제>

그 밖의 리조븀속에 속하는 미생물 가운데, 케토오스 3-에피머라아제 생산능이 인지된 리조븀 프레디이(Rhizobium fredii) ATCC35423 및 리조븀 멜리로티(Rhizobium meliloti) ATCC9930을 실험 1의 경우와 마찬가지로 퍼멘터에서 배양했다. 각각의 배양액 약 10L를 이용하여, 실험 2의 경우와 마찬가지로 균체를 파쇄하여, 원심 상청을 회수하고, 계속해서, 투석, 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 제공하여 부분 정제 효소를 조제했다. 얻어진 부분 정제 효소에 대해서 실험 3의 경우와 마찬가지로 효소적 성질을 조사했다. 이들의 결과를, 상기의 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480 유래의 케토오스 3-에피머라아제의 성질 및 공지의 슈도모나스 시코리이 ST-24 유래의 효소의 성질(Ken Izumori 등, Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1037-1039(1993)에서 발췌)과 함께 표 5에 정리했다.

미생물	효소적 성질
	최적 pH	최적 온도	pH 안정성	온도 안정성
리조븀 프레디이 ATCC35423	9.0∼9.5*	50℃ (65℃)*	8.0∼10.0**	50℃ 이하 (75℃ 이하)*
리조븀 멜리로티 ATCC9930	9.0∼9.5*	55℃ (65℃)*	8.0∼10.0**	50℃ 이하 (75℃ 이하)*
리조븀 레구미노사룸 ATCC14480	9.0∼9.5*	50℃ (65℃)*	8.0∼10.0**	50℃ 이하 (75℃ 이하)*
슈도모나스 시코리이 ST-24	7.0∼9.0	약 60℃	5.0∼8.0	50℃ 이하

*: 괄호 내는 1mM Mn^{2 +} 이온 존재하에서의 값

**: 적어도 pH 8.0∼10.0의 범위에서 안정. pH 10을 넘는 조건에서는 불명(不明)

표 5의 결과에서 명확한 바와 같이, 리조븀 프레디이 ATCC35423 및 리조븀 멜리로티 ATCC9930 유래의 케토오스 3-에피머라아제는, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480 유래의 효소와 동등한 효소적 성질을 나타냈다. 이들 리조븀속 미생물 유래 케토오스 3-에피머라아제의 성질은, 종래의 슈도모나스 시코리이 ST-24의 효소의 그것과는 다르다.

리조븀 프레디이 ATCC35423 및 리조븀 멜리로티 ATCC9930 유래의 케토오스 3-에피머라아제에 대해서도 실험 2와 마찬가지로 DEAE-토요펄 공정까지 정제한 부분 정제 효소를 이용하여 실험 6의 경우와 마찬가지로 기질 특이성을 조사한 결과, 상기의 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480 유래의 케토오스 3-에피머라아제와 마찬가지의 결과였다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 실시예에 있어서의 케토오스 3-에피머라아제 활성은, 실험의 항과 마찬가지로 D-프시코오스 3-에피머라아제 활성을 의미한다.

(실시예 1)

<케토오스 3-에피머라아제의 조제>

실험 1에서 이용한 액체 배지를 30L-자 퍼멘터에 약 20L 넣고, 120℃, 20분간 멸균한 후, 리조븀 프레디이 ATCC35423의 종배양액 1％(v/v)를 무균적으로 첨가하여, 통기 교반하면서 27℃에서 60시간 배양했다. 얻어진 배양액 속의 케토오스 3-에피머라아제 활성은 약 0.7단위/ml-배양액이었다. 배양액 약 18L로부터 원심분리하여 균체를 모으고, 이것을 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0) 1.5L에 현탁하여, 세포 파쇄기 다이노밀(벳코펜제)을 이용하여 파쇄했다. 얻어진 균체 파쇄 현탁액을 원심분리하고, 상청을 회수하여 균체 파쇄 추출액으로 했다. 균체 파쇄 추출액은, 실험 2의 방법에 준해서 DEAE-토요펄 650S(토우소 주식회사제)를 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 단계까지 정제하여, 케토오스 3-에피머라아제 부분 정제 효소 표본으로서 총활성으로 약 7,200단위를 얻었다.

(실시예 2)

<케토오스 3-에피머라아제의 조제>

통상적인 방법에 의해, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480을 돌연변이시켜, 케토오스 3-에피머라아제 고생산 변이주를 취득했다. 실험 1에서 이용한 액체 배지를 30L-자 퍼멘터에 약 20L 넣고, 120℃, 20분간 멸균한 후, 상기 변이주의 종배양액 1％(v/v)를 무균적으로 첨가하여, 통기 교반하면서 27℃에서 60시간 배양했다. 얻어진 배양액 속의 케토오스 3-에피머라아제 활성은 약 13단위/ml-배양액이었다. 배양액 약 18L로부터 원심분리하여 균체를 모으고, 이것을 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0) 1.5L에 현탁하여, 세포 파쇄기 다이노밀(벳코펜제)을 이용하여 파쇄했다. 얻어진 균체 파쇄 현탁액을 원심분리하고, 상청을 회수하여 균체 파쇄 추출액으로 했다. 균체 파쇄 추출액은, 실험 2의 방법에 준해서 DEAE-토요펄 650S(토우소 주식회사제)를 이용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피의 단계까지 정제하여, 케토오스 3-에피머라아제 부분 정제 효소 표본으로서 총활성으로 약 82,000단위를 얻었다.

(실시예 3)

<D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조>

D-프룩토오스의 10w/v％ 수용액(pH 8.0, 1mM의 MnCl₂을 함유한다)에, 실시예 1의 방법으로 얻은 리조븀 프레디이 ATCC35423 유래의 부분 정제 케토오스 3-에피머라아제를, D-프룩토오스 1g당 50단위의 비율로 첨가하여, 45℃, 30시간 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 통상적인 방법에 따라, 활성탄을 이용하여 탈색하고, 이어서, H형 이온 교환 수지(상품명 「다이아이온 SK1B」, 미쓰비시 화학 주식회사 제조) 및 OH형 이온 교환 수지(상품명 「다이아이온 WA30」, 미쓰비시 화학 주식회사 제조)를 이용하여 탈염하고, 감압 농축하여 D-프시코오스를 함유하는 투명한 시럽을 얻었다. 본 시럽을, 염형(鹽型) 강산성 양이온 교환 수지(엠버라이트 CR-1310, Na형, 오르가노 주식회사 제조)를 이용하는 칼럼 크로마토그래피로, 분리 정제하고, 농축하여 시럽상의 D-프시코오스를 고형물당 약 23％의 수율로 얻었다. 본 제품의 이화학적 성질은, 표준의 D-프시코오스의 그것과 양호하게 일치했다. 본 제품은, 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화학품, 의약품의 원료 및 중간체 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 효소 반응이 가역적인 반응이기 때문에, 원료로서 D-프시코오스를 이용함으로써, D-프룩토오스를 제품으로서 채취하는 것도 용이하다.

(실시예 4)

<D-크실로오스로부터의 D-리불로오스의 조제>

D-크실로오스의 1％(w/v) 수용액(pH 8.0, 1mM의 MnCl₂을 함유한다)에, 실험 1 및 2의 방법으로 DEAE-토요펄 공정까지 부분 정제한 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480 유래의 케토오스 3-에피머라아제를 D-크실로오스 1g당 20단위의 비율로 첨가하여, 45℃, 50시간 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 실시예 3과 마찬가지로, 탈색, 탈염하고, 감압 농축하여 D-리불로오스를 함유하는 투명한 시럽을 얻었다. 본 시럽을 실시예 3과 마찬가지로 염형 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피로, 분리 정제하고, 농축하여 시럽상의 D-리불로오스를 고형물당 약 16％의 수율로 얻었다. 본 제품의 이화학적 성질은, 표준의 D-리불로오스의 그것과 양호하게 일치했다. 본 제품은, 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화학품, 의약품의 원료 및 중간체 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 효소 반응이 가역적인 반응이기 때문에, 원료로서 D-리불로오스를 이용함으로써, D-크실로오스를 제품으로서 채취하는 것도 용이하다.

(실시예 5)

<L-크실로오스로부터의 L-리불로오스의 조제>

1％(w/v) L-크실로오스 수용액(pH 8.0, 1mM의 MnCl₂을 함유한다)에 대하여, 실시예 1의 방법으로 얻은 리조븀 프레디이 ATCC35423 유래의 부분 정제 케토오스 3-에피머라아제를 L-크실로오스 1g당 100단위의 비율로 첨가하여, 45℃, 50시간 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 실시예 2와 마찬가지로, 탈색, 탈염하고, 감압 농축하여 L-리불로오스를 함유하는 투명한 시럽을 얻었다. 본 시럽을 실시예 3과 마찬가지로 염형 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피로, 분리 정제하고, 농축하여 시럽상의 L-리불로오스를 고형물당 약 25％의 수율로 얻었다. 본 제품의 이화학적 성질은, 표준의 L-리불로오스의 그것과 양호하게 일치했다. 본 제품은, 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화학품, 의약품의 원료 및 중간체 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 효소 반응이 가역적인 반응이기 때문에, 원료로서 L-리불로오스를 이용함으로써, L-크실로오스를 제품으로서 채취하는 것도 용이하다.

(실시예 6)

<L-타가토오스로부터의 L-소르보오스의 조제>

1％(w/v) L-타가토오스 수용액(pH 8.0, 1mM의 MnCl₂을 함유한다)에 대하여, 실시예 2의 방법으로 얻은, 리조븀 레구미노사룸 ATCC14480의 효소 고생산 변이주 유래의 부분 정제 케토오스 3-에피머라아제를 L-타가토오스 1g당 20단위의 비율로 첨가하여, 45℃, 50시간 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 실시예 3과 마찬가지로, 탈색, 탈염하고, 감압 농축하여 L-소르보오스를 함유하는 투명한 시럽을 얻었다. 본 시럽을 실시예 3과 마찬가지로 염형 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피로, 분리 정제하고, 농축하여 시럽상의 L-소르보오스를 고형물당 약 25％의 수율로 얻었다. 본 제품의 이화학적 성질은, 표준의 L-소르보오스의 그것과 양호하게 일치했다. 본 제품은, 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화학품, 의약품의 원료 및 중간체 등으로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 효소 반응이 가역적인 반응이기 때문에, 원료로서 L-소르보오스를 이용함으로써, L-타가토오스를 제품으로서 채취하는 것도 용이하다.

(실시예 7)

<고정화 케토오스 3-에피머라아제>

리조븀 레구미노사룸 ATCC14480을 실험 1과 마찬가지의 방법으로 배양하고, 원심분리하여 케토오스 3-에피머라아제 활성을 발현한 습균체 100g을 얻었다. 이어서, 이 습균체를 20mM 트리스 염산 완충액(pH 8.0)에 용해한 2.5％ 알긴산 나트륨(와코순약 공업 주식회사 판매) 100ml에 혼련했다. 얻어진 균체를 함유하는 슬러리를, 마그네틱 스터러(magnetic stirrer)로 교반한 0.1M CaCl₂ 용액에, 수면으로부터 약 20cm의 높이에서 연속적으로 적하하여, 직경 약 2mm의 구상(球狀)의 겔화물을 조제했다. 이것을 0.1M CaCl₂ 용액 중에 약 2시간 유지한 후, 흡인 여과하여 알긴산 고정화 균체를 회수했다. 이 고정화 균체는 케토오스 3-에피머라아제 활성을 발현하고 있기 때문에, 칼럼에 충전하는 등으로 해서 고정화 케토오스 3-에피머라아제로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라아제는, 유리(遊離)의 D- 또는 L-케토헥소오스, D- 또는 L-케토펜토오스에 작용시켜, 이들 케토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스, D- 또는 L-케토펜토오스를 용이하게 생성한다. 이 반응은, 각종 케토오스, 특히 D-프룩토오스를 원료로 한 D-프시코오스의 대량 생산의 길을 개척하는 것이다. 따라서, 본 발명의 케토오스 3-에피머라아제와 그 제조 방법의 확립은, 제당 산업뿐만 아니라, 이것과 관련되는 식품, 화장품, 의약품 산업에 있어서 그 공업적 의의가 매우 크다.

SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Ketose 3-epimerase, its preparation and uses <130> 10112302 <150> JP2005-329683 <151> 2005-11-15 <150> JP2006-194037 <151> 2006-07-14 <160> 13 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Rhizobium leguminosarum (biovar trifolii) <400> 1 Met Glu Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met 1 5 10 <210> 2 <211> 282 <212> PRT <213> Rhizobium leguminosarum (biovar trifolii) <400> 2 Met Glu Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Ala Gly Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gly Ala Val His Tyr Lys Met 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Ala Leu Leu Asn Ala Pro Ala Val Asp Ala Lys 35 40 45 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu His Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Glu Lys Thr Ala Glu Met Asn Ala 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Phe Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Gln Gly Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Lys Val Leu Asp 115 120 125 Val Ala Ala Lys His Ala Arg Lys His Gly Ile Gln Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Ser Ala Gln Gln Ala 145 150 155 160 Val Asp Met Val Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Ile Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ala Ala Asn Gly Ile 180 185 190 Leu Ile Ala Arg Asp His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Ile Pro Trp Asp Ala Ile Tyr Ala 210 215 220 Ala Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Arg Asp Met Glu Glu Val Met Asp Lys Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Glu Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 3 <211> 846 <212> DNA <213> Rhizobium leguminosarum (biovar trifolii) <400> 3 atg gaa ggt ttc ggc gtt cac acc agc atg tgg acc atg aac tgg gat 48 Met Glu Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 cgc gca ggt gcc gaa aag gcg att gcc gga gcc gtg cac tac aag atg 96 Arg Ala Gly Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gly Ala Val His Tyr Lys Met 20 25 30 gat ttc atc gag atc gcg ctg ctg aac gcg cct gcc gtc gat gcc aaa 144 Asp Phe Ile Glu Ile Ala Leu Leu Asn Ala Pro Ala Val Asp Ala Lys 35 40 45 cac acc cgc gcc ctg ctt gaa aag aat aag ctg cgc gcc gtc tgc tcg 192 His Thr Arg Ala Leu Leu Glu Lys Asn Lys Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 ctc ggc ctg ccg gaa cat gcc tgg gcc tcg gtc cgc ccg gat gcc gca 240 Leu Gly Leu Pro Glu His Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 atc gag cac ctg aag gtt gcg atc gaa aag act gca gaa atg aac gcc 288 Ile Glu His Leu Lys Val Ala Ile Glu Lys Thr Ala Glu Met Asn Ala 85 90 95 gag gcc ctg tcc ggc gtc atc ttc ggc ggc atc ggc gag cgc acc ggc 336 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Phe Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 gtg cca ccg acg cag ggc gaa tac gac aac atc gcc aag gtg ctc gac 384 Val Pro Pro Thr Gln Gly Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Lys Val Leu Asp 115 120 125 gta gcg gca aag cat gct agg aag cac ggc atc cag ctc ggc gtc gag 432 Val Ala Ala Lys His Ala Arg Lys His Gly Ile Gln Leu Gly Val Glu 130 135 140 gcc gtg aac cgc tat gag aac cac ctg atc aac tcg gcg cag cag gcc 480 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Ser Ala Gln Gln Ala 145 150 155 160 gtc gac atg gtg gag cgc gtc ggc gcg gat aac atc ttc gtt cac ctc 528 Val Asp Met Val Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Ile Phe Val His Leu 165 170 175 gac acc tac cac atg aat atc gag gaa aag ggt gcg gca aat ggc atc 576 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Ala Ala Asn Gly Ile 180 185 190 ctg atc gcc cgc gat cac ctg aag tac atc cat ctt tcg gaa agc gac 624 Leu Ile Ala Arg Asp His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 cgc ggc aca ccg ggc tac ggc aac atc ccg tgg gat gcg atc tat gcc 672 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Asn Ile Pro Trp Asp Ala Ile Tyr Ala 210 215 220 gcg ctc gcc gca atc ggc ttc aag ggc ggg ctt gcg atg gaa agc ttc 720 Ala Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 atc aac atg ccg cct gag gtc gcc tat ggc ctg gcc gtc tgg cgc ccc 768 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 gtt gca cgc gat atg gaa gag gtc atg gac aag ggc ctg ccg ttc ctg 816 Val Ala Arg Asp Met Glu Glu Val Met Asp Lys Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 cgc aat aag gcg gaa caa tac ggt ctc atc 846 Arg Asn Lys Ala Glu Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Sinorhizobium meliloti 1021 <400> 4 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Lys Val 20 25 30 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Glu 35 40 45 His Thr Arg Gly Leu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Glu Ala Ala 65 70 75 80 Ile Asp His Leu Lys Ile Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 Val Pro Pro Thr Val Glu Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Ser Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 Val Lys Met Ile Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Val Gly Lys Gly Ile 180 185 190 Leu Asp Ala Arg Glu His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Thr Cys Gly Trp Asp Glu Ile Phe Ser 210 215 220 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 Val Ala Lys Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 Arg Asn Lys Ala Thr Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 5 <211> 846 <212> DNA <213> Sinorhizobium meliloti 1021 <400> 5 atg cag ggt ttt ggc gtt cat acg agc atg tgg aca atg aat tgg gac 48 Met Gln Gly Phe Gly Val His Thr Ser Met Trp Thr Met Asn Trp Asp 1 5 10 15 cgt ccc ggc gcc gaa cgg gcg gta gcc gca gcg gtc aaa tac aag gtc 96 Arg Pro Gly Ala Glu Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Lys Tyr Lys Val 20 25 30 gat ttc atc gag atc ccg atg ctc aat ccg cct gcc gtc gac acg gag 144 Asp Phe Ile Glu Ile Pro Met Leu Asn Pro Pro Ala Val Asp Thr Glu 35 40 45 cac acc cgt ggc ctc ctc gag aaa agc cgt ctg cgc gcg gtc tgc tcg 192 His Thr Arg Gly Leu Leu Glu Lys Ser Arg Leu Arg Ala Val Cys Ser 50 55 60 ctc ggc ctg ccg gag cgg gcc tgg gcc tcg gtt cgg ccc gag gcg gcg 240 Leu Gly Leu Pro Glu Arg Ala Trp Ala Ser Val Arg Pro Glu Ala Ala 65 70 75 80 atc gac cat ctg aag atc gcg atc gac aag act gcc gat ctc ggc ggc 288 Ile Asp His Leu Lys Ile Ala Ile Asp Lys Thr Ala Asp Leu Gly Gly 85 90 95 gag gcg ctg tcg ggc gtc atc tat ggc ggc atc ggc gag cgc acc ggc 336 Glu Ala Leu Ser Gly Val Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Gly 100 105 110 gtg ccg ccg acc gtc gag gag tat gac aat atc gcc cgc gtg ctg cag 384 Val Pro Pro Thr Val Glu Glu Tyr Asp Asn Ile Ala Arg Val Leu Gln 115 120 125 gcc gcg gcc aag cac gcc aag tcg cgc ggc atc gag ctt ggc gtc gaa 432 Ala Ala Ala Lys His Ala Lys Ser Arg Gly Ile Glu Leu Gly Val Glu 130 135 140 gcc gtc aac cgc tac gag aac cac ctg atc aat acc ggc tgg cag gcg 480 Ala Val Asn Arg Tyr Glu Asn His Leu Ile Asn Thr Gly Trp Gln Ala 145 150 155 160 gtc aag atg atc gag cgg gtc gga gcc gac aac gtc ttc gtg cac ctc 528 Val Lys Met Ile Glu Arg Val Gly Ala Asp Asn Val Phe Val His Leu 165 170 175 gat acc tat cac atg aac atc gag gaa aag ggc gtc ggc aaa ggt atc 576 Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Lys Gly Val Gly Lys Gly Ile 180 185 190 ctc gat gcc cgc gag cac ctg aaa tac atc cat ctt tcc gaa agc gac 624 Leu Asp Ala Arg Glu His Leu Lys Tyr Ile His Leu Ser Glu Ser Asp 195 200 205 cgc ggc acg ccg ggc tac ggc acc tgc ggc tgg gac gag att ttc tcg 672 Arg Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Thr Cys Gly Trp Asp Glu Ile Phe Ser 210 215 220 acg ctt gcg gcg atc ggc ttc aag ggc ggc ctc gcc atg gaa agc ttc 720 Thr Leu Ala Ala Ile Gly Phe Lys Gly Gly Leu Ala Met Glu Ser Phe 225 230 235 240 atc aac atg ccg ccg gaa gtg gcc tat ggc ctc gcc gtc tgg cgc ccg 768 Ile Asn Met Pro Pro Glu Val Ala Tyr Gly Leu Ala Val Trp Arg Pro 245 250 255 gtc gca aag gac gag gaa gag gtg atg ggc aac ggc ctg ccg ttc ctg 816 Val Ala Lys Asp Glu Glu Glu Val Met Gly Asn Gly Leu Pro Phe Leu 260 265 270 cgc aac aag gcc acg cag tac ggc ctg atc 846 Arg Asn Lys Ala Thr Gln Tyr Gly Leu Ile 275 280 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 atgtggacna tgaaytggga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tcytcdatrt tcatrtgrta 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 tcaactcggc gcagcaggcc gtcgac 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 tgacgccgga cagggcctcg gcgttc 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 tggtggagcg cgtcggcgcg gataac 26 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 gcagtctttt cgatcgcaac cttcag 26 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 aaaaacatat ggaaggtttc ggcgttcaca ccag 34 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 aaaaagaatt ctcagatgag accgtattgt tccgc 35

Claims (17)

1. 리조븀속(genus Rhizobium)에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (1) 및 (2)의 기질 특이성을 가짐과 동시에, 하기 (3)~(8)의 이화학적 성질을 가지는 케토오스 3-에피머라아제(ketose 3-epimerase)：

   (1) D- 또는 L-케토헥소오스(ketohexose)의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성. D- 또는 L-케토펜토오스(ketopentose)의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성；

   (2) D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스(D-fructose) 및 D-프시코오스(D-psicose)에 대한 기질 특이성이 가장 높음.

   (3) 분자량

   SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어서, 30,000±3,000돌턴을 나타냄.

   (4) 최적 pH

   45℃, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 존재하의 조건에서, pH 9.0 내지 9.5

   (5) 최적 온도

   pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃

   1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 65℃

   (6) pH 안정성

   30℃, 60분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 적어도 pH 8 내지 10의 범위에서 안정

   1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정

   (7) 온도 안정성

   pH 8.0, 10분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃ 이하에서 안정

   1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 75℃ 이하에서 안정

   (8) 금속 이온에 의한 활성화

   Mn²⁺ 또는 Mg²⁺ 이온에 의해 활성화
2. 제1항에 있어서, 리조븀속에 속하는 미생물이, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum), 리조븀 프레디이(Rhizobium fredii) 및 리조븀 멜리로티(Rhizobium meliloti) 중 어느 하나인 케토오스 3-에피머라아제.
3. 제2항에 있어서, 리조븀 레구미노사룸이, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum(biovar trifolii)) ATCC14480인 케토오스 3-에피머라아제.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 N말단 아미노산 서열로서 갖는 케토오스 3-에피머라아제.
6. 제1항에 있어서,

   서열표에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 케토오스 3-에피머라아제.
7. 제6항에 기재된 케토오스 3-에피머라아제를 코딩하는 DNA.
8. 제7항에 있어서, 서열표에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA.
9. 삭제
10. 제7항에 있어서, 리조븀속에 속하는 미생물에 유래하는 DNA.
11. 제7항에 기재된 DNA와, 자율 복제 가능한 벡터를 함유하여 이루어지는 재조합 DNA.
12. 제11항에 기재된 재조합 DNA를 숙주에 도입하여 이루어지는 형질 전환체.
13. 리조븀속에 속하고, 케토오스 3-에피머라아제 생산능을 갖는 미생물을, 영양 배지에서 배양하여 제1항에 기재된 케토오스 3-에피머라아제를 생성시켜, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 케토오스 3-에피머라아제의 제조 방법.
14. 제12항에 기재된 형질 전환체를 배양하여, 배양물로부터 재조합형 케토오스 3-에피머라아제를 채취하는 것을 특징으로 하는 재조합형 케토오스 3-에피머라아제의 제조 방법.
15. D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스로부터 선택되는 1종 이상의 케토오스를 함유하는 용액에, 리조븀(Rhizobium)속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (1) 및 (2)의 기질 특이성을 갖는 동시에 하기 (3)~(8)의 이화학적 성질을 가지는 케토오스 3-에피머라아제를 작용시켜, 상기 케토오스의 3 위치를 에피머화하는 것을 특징으로 하는 케토오스의 변환 방법.

    (1) D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성. D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성；

    (2) D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높음.

    (3) 분자량

    SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어서, 30,000±3,000돌턴을 나타냄.

    (4) 최적 pH

    45℃, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 존재하의 조건에서, pH 9.0 내지 9.5

    (5) 최적 온도

    pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 65℃

    (6) pH 안정성

    30℃, 60분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 적어도 pH 8 내지 10의 범위에서 안정

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정

    (7) 온도 안정성

    pH 8.0, 10분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃ 이하에서 안정

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 75℃ 이하에서 안정

    (8) 금속 이온에 의한 활성화

    Mn²⁺ 또는 Mg²⁺ 이온에 의해 활성화
16. D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스로부터 선택되는 1종 이상의 케토오스를 함유하는 용액에, 리조븀(Rhizobium)속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (1) 및 (2)의 기질 특이성을 갖는 동시에, 하기 (3)~(8)의 이화학적 성질을 가지는 케토오스 3-에피머라아제를 작용시켜서 상기 케토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 케토오스를 생성시켜, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 케토오스의 제조 방법;

    (1) D- 또는 L-케토헥소오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소오스를 생성. D- 또는 L-케토펜토오스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토오스를 생성；

    (2) D- 또는 L-케토헥소오스 및 D- 또는 L-케토펜토오스 중에서는 D-프룩토오스(D-fructose) 및 D-프시코오스(D-psicose)에 대한 기질 특이성이 가장 높음.

    (3) 분자량

    SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 있어서, 30,000±3,000돌턴을 나타냄.

    (4) 최적 pH

    45℃, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 존재하의 조건에서, pH 9.0 내지 9.5

    (5) 최적 온도

    pH 8.0, 30분간 반응, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 65℃

    (6) pH 안정성

    30℃, 60분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 적어도 pH 8 내지 10의 범위에서 안정

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, pH 4.5 내지 9.5의 범위에서 안정

    (7) 온도 안정성

    pH 8.0, 10분간 유지, 1mM Mn²⁺ 이온 비존재하의 조건에서, 50℃ 이하에서 안정

    1mM Mn²⁺ 이온 존재하에서, 75℃ 이하에서 안정

    (8) 금속 이온에 의한 활성화

    Mn²⁺ 또는 Mg²⁺ 이온에 의해 활성화
17. 제16항에 있어서, 케토오스를 채취하는 방법이, 염형(鹽型) 강산성 양이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 케토오스를 채취하는 방법인 것을 특징으로 하는 케토오스의 제조 방법.

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