KR101883351B1

KR101883351B1 - 과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체

Info

Publication number: KR101883351B1
Application number: KR1020160174252A
Authority: KR
Inventors: 신홍식; 오덕근; 김민지
Original assignee: (주)케비젠; 신홍식
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2018-07-30
Also published as: KR20180071533A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 59번째, 128번째, 296번째, 300번째 또는 334번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 과당(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 이용하면 간단한 공정으로 타가토스를 생산할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체{Hexuronate C4-epimerase variant having improved productivity of tagatose from fructose}

본 발명은 과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소의 변이체 효소에 관한 것이다.

타가토스(D-tagatose)는 과당(D-fructose)의 C4 에피머로서 감미료의 기준인 설탕과 거의 유사한 감미도와 가장 유사한 감미의 질을 갖고 있다고 알려진 물질이다. 또한 체내 흡수과정 중에 거의 대사가 되지않는 비열량(non-caloric) 감미료로서 섭취한 양의 15~20%가 체내에 흡수되는데, 이는 인간이 갖는 자체적인 소화 능력이 아닌 대장 내 미생물에 의한 분해로 인한 흡수이므로 혈당 수치에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 당뇨병 환자에게 혈당 조절 효과를 기대할 수 있고, 충치를 유발하지 않는 기능적 특성을 가지고 있어 어린이들이 좋아하는 초콜릿, 껌, 빵, 사탕 등에 설탕 대신 넣어 어린이들이 안심하고 섭취할 수 있게 해주는 건강 감미료이며, 설탕 과잉으로 인한 질병의 예방에도 기여할 수 있는 물질로서 많은 관심을 받고 있다. 또한 타가토스는 끓는점이 134℃, pH 2-7로 열과 pH에 대한 안정성이 높아서 대부분의 인공 감미료와 달리 잘 파괴되지 않고 설탕과 가장 유사한 물리적, 화학적 성질을 가지며 특히 가열시 갈색화 반응(browning reaction)의 특성이 과당과 비슷한 케토스(ketose)이므로 대체당으로서 중요한 특징을 갖는다. 또한 설탕 대체 감미료로 가장 많이 이용되고 있는 당알코올류 등을 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는데 반하여 타가토스는 설사 유발 부작용이 없는 장점이 있다.

이와 같은 이유로 타가토스는 식품보조제 및 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다. 이는 유제품이나 일부 식물에 미량 함유되어 있는 희소당(rare sugar)이고 현재는 L-아라비노스 이성화효소(L-arabinose isomerase)를 이용한 생물전환법으로 갈락토오스를 이성화해서 타가토스를 생산하고 있으나 갈락토오스의 가격이 과당보다 매우 비싸고 전구물질인 유당(lactose)의 수급이 불안정 하고 낙농시장의 변동에 따라 공급가액의 변화폭이 크기 때문에 안정적이고 지속적인 타가로스의 대량 생산 확보에 어려움이 제기되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 수급이 안정적이고 원가가 낮은 포도당이나 과당을 기질로 하여 효소를 이용한 타가토스 생산 방법이 연구되고 있는 실정이다.

한편, 한국등록특허 제0464061호에는 '아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1550796호에는 써모토가 속(Thermotoga sp.) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소를 이용한 '타가토스의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소 단백질 코딩 유전자를 변이시킨 후, 돌연변이 효소 변이체를 발현시키고 분리 및 정제하였다. 그 후, 야생형 효소와 변이체 효소를 이용하여 과당(fructose)을 기질로 한 타가토스 생산량을 비교한 결과, 변이체 효소에서 야생형 효소에 비해 타가토스 생산능력이 향상된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 59번째, 128번째, 296번째, 300번째 또는 334번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 과당(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 과당에 처리하는 단계를 포함하는 타가토스의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 유효성분으로 함유하는, 과당에서 타가토스를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 타가토스 생산에 있어 기질로 가격 변동이 크지 않은 보편화된 원료인 과당을 사용하므로, 제조원가를 절감시킬 수 있으며, 타가토스를 얻는 단일 단계의 공정을 가능케하여 생산 경비를 절감시킬 수 있어 생산 효과를 극대화할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 방법을 통해 생산된 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 기질(과당) 농도 10 g/ℓ에서 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형(wild)와 128번 아미노산이 치환된 돌연변이 효소들의 타가토스 생산능을 비교한 결과이다.
도 2는 다양한 농도의 기질 조건에서 본 발명의 헥수론산 C4-에피머화 효소의 S128D 돌연변이 효소에 의한 타가토스 생산량(●)과 전환율(○)을 나타낸 것이다.
도 3은 기질 농도 75 g/ℓ에서 야생형의 헥수론산 C4-에피머화 효소(●)와 본 발명의 S128D 돌연변이 효소(○)에 의한 타가토스의 생산량을 시간별로 나타낸 것이다.
도 4는 기질 농도 100 g/ℓ의 조건에서 다양한 헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소의 타가토스 생산량을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 59번째, 128번째, 296번째, 300번째 또는 334번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 과당(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 변이체를 제공한다.

본 발명의 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 헥수론산 C4-에피머화 효소는 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소로, 본 발명에서는 현재까지 단당 기질에서 효소 특성이 규명되지 않은 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소로 추정되는 유전자 또는 단백질에 대응되는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 헥수론산 C4-에피머화 추정 효소를 과발현시켜 효소의 특성을 규명한 결과, 기질 특이성이 과당의 4번 탄소 에피머화 작용을 나타냄을 확인하였다. 본 발명의 상기 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰 유래의 헥수론산 C4-에피머화 효소의 유전자는 기존에 서열분석을 통해 유전자 정보는 알려져 있었지만 효소활성과 관련하여 보고된 바는 없었으며, 상기 유전자를 갖는 효소 단백질이 과당을 타가토스로 전화시키는 활성이 있음은 본 발명에서 최초로 입증하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 128번째 아미노산인 세린(S, serine)이 아스파르트산(D, aspartic acid)으로 치환된 변이체(S128D); 서열번호 1의 아미노산 서열 중 334번째 아미노산인 루신(L,lucine)이 발린(V, valine)으로 치환된 변이체(L334V); 서열번호 1의 아미노산 서열 중 296번째 아미노산인 아스파라긴(N, asparagine)이 글루탐산(G, glutamic acid)으로 치환된 변이체(N296G); 서열번호 1의 아미노산 서열 중 59번째 아미노산인 아스파르트산(D)이 아스파라긴(N)으로 치환된 변이체(D59N); 및 서열번호 1의 아미노산 서열 중 300번째 아미노산인 페닐알라닌(F, phenylalanine)이 세린(S)으로 치환된 변이체(F300S)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 128번째 아미노산인 세린이 아스파르트산으로 치환된 변이체(S128D), 상기 S128D 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 334번째 아미노산인 루신이 발린으로 치환된 변이체(S128D/L334V), 상기 S128D/L334V 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 296번째 아미노산인 아스파라긴이 글루탐산으로 치환된 변이체(S128D/N296G/L334V), 상기 S128D/N296G/L334V 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 59번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴으로 치환된 변이체(D59N/S128D/N296G/L334V) 또는 상기 D59N/S128D/N296G/L334V 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 300번째 아미노산인 페닐알라닌이 세린으로 치환된 변이체(D59N/S128D/N296G/F300S/L334V)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 과당을 타가토스로 전환시켜줄 수 있는 것이라면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 내 일부 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 변이체일 수 있다.

본 발명의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자는 S128D 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, S128D/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, S128D/N296G/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D59N/S128D/N296G/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 D59N/S128D/N296G/F300S/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 합성 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983, J. Mol. Biol., 166:557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자는 S128D 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, S128D/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, S128D/N296G/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D59N/S128D/N296G/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 D59N/S128D/N296G/F300S/L334V 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 생산하는 방법은 재조합 단백질의 발현 및 분리·정제에 관한 당업계에 주지된 통상의 방법을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 S128D, S128D/L334V, S128D/N296G/L334V, D59N/S128D/N296G/L334V 또는 D59N/S128D/N296G/F300S/L334V일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 과당에 처리하는 단계를 포함하는 과당에서 타가토스의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 타가토스의 생산 방법에 있어서, 상기 기질로 사용되는 과당의 농도는, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체와 과당의 혼합물 중량 기준 10~80%(w/w)의 범위로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 최적 효소 활성을 위해 상기 기질농도 외에, pH 8.0~9.0 그리고 55~65℃의 온도 조건에서 효소반응이 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 유효성분으로 함유하는, 과당에서 타가토스를 생산하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 128D, S128D/L334V, S128D/N296G/L334V, D59N/S128D/N296G/L334V 또는 D59N/S128D/N296G/F300S/L334V의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 함유하므로, 기질인 과당의 4번 탄소 에피머화 작용을 통해 타가토스를 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase)를 제조하기 위하여, 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 균주로부터 유래한 헥수론산 C4-에피머화 효소를 먼저 분리하였다.

구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 써모언에어로박테리움 써모사카로리티쿰 DSM 571 균주를 선별하고, 이로부터 유래한 헥수론산 C4-에피머화 효소(Genebank Accession Number ADL69856.1; 서열번호 1)의 공지된 DNA 염기서열(서열번호 2)을 기초로 하여 하기의 프라이머를 고안하였다.

정방향 프라이머 : 5'-CATATGATGATAGGGAATGTTTTGTCC-3' (서열번호 3)

역방향 프라이머 : 5'-CGCTCGAGTTATTTTTCATAGTATATTTC-3' (서열번호 4)

상기 프라이머는 각각 Nde I과 Xho I 제한효소 절단부분을 포함하는 염기서열로 설계되었다. 상기 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 대량으로 얻은 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자는 제한효소 Nde I 및 Xho I을 사용하여 플라스미드 벡터 pET 29b(Novagen, 독일)에 삽입하여 pET 29b/헥수론산 C4-에피머화 효소의 재조합 벡터를 제작하였다.

헥수론산 C4-에피머화 효소의 유전자를 돌연변이(error-prone PCR)시켜 타가토스 생산 능력이 높은 효소를 얻었고 이 효소의 아미노산 서열을 분석한 결과 128번째 아미노산이 세린(serine, S)에서 아스파르트산(aspartic acid, D)으로 치환된 것(S128D)을 확인하였다. Quick-Change 키트(Stratagene, 미국)를 이용하여 헥수론산 C4-에피머화 효소의 128번 위치의 아미노산에 특정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발하여 pET 29b/헥수론산 C4-에피머화 효소 돌연변이벡터를 제작하였다.

상기와 같이 제작하여 얻은 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 ER 2566 균주에 형질전환하였다. 또한, 형질전환된 미생물은 20% 글리세린 용액을 첨가하여 타가토스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 헥수론산 C4-에피머화 효소 및 돌연변이 효소의 제조

헥수론산 C4-에피머화 효소 및 돌연변이 효소를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작하고, 냉동 보관된 재조합 대장균 ER 2566 균주를 3㎖의 LB 배지가 들어있는 시험관에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0가 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 종균 배양된 배양액을 LB 배지 500㎖이 들어있는 2ℓ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 또한, 배양액의 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때, 0.1mM IPTG를 첨가하여 헥수론산 C4-에피머화 효소의 대량 발현을 유도하였다. 상기 본 배양의 조건은 IPTG 첨가 전에는 교반 속도 200rpm 및 배양 온도 37℃로 유지하였고, IPTG를 첨가한 후에는 교반 속도는 150rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하여 배양하였다.

상기와 같이 과발현되어 생산된 헥수론산 C4-에피머화 효소 및 돌연변이 효소는, 다음의 방법으로 분리하였다. 먼저, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 6,000×g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상등액은 제거한 후, 회수된 세포 침전물을 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척한 다음, 50mM 제1인산나트륨, 300mM 염화나트륨, 10mM 이미다졸 및 0.1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 파쇄기(sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000×g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 상등액만을 얻어 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system, Bio-Rad Laboratories, 미국) 방법으로 히스티딘 태그(His-tag)를 이용한 HisTrap HP 흡착 칼럼을 장착하여 타가토스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였다.

실시예 3. 헥수론산 C4-에피머화 효소와 돌연변이 효소의 과당에 대한 활성 비교

헥수론산 C4-에피머화 효소 및 돌연변이 효소의 과당에 대한 활성을 분석하였다. 효소 활성 분석은 10g/ℓ 과당을 기질로 사용하고, 1mM 황산니켈(NiSO₄)의 금속 이온이 포함된 100mM 인산칼륨 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 60℃에서 16시간 동안 수행하였고, 13,000×g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상기 반응을 정지시켰다. 또한, 효소 활성의 측정 시 타가토스 농도 및 과당 농도는 Shodex-sp0810 칼럼(Shodex, 일본)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Shimadzu C-R6A, Shimadzu, 일본)의 굴절지수 검출기(refractive index detector, Shimadzu RID-6A)를 이용하여 진행되었다.

그 결과, S128D 돌연변이 효소에서 야생형 효소에 비해 과당을 기질로 하였을 때 효소 활성이 2.5배 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 4. 헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소를 이용한 다양한 농도의 과당으로부터 타가토스로의 전환 효율 비교

헥수론산 C4-에피머화 효소의 돌연변이 효소(S128D)를 이용한 타가토스의 생산 방법을 개발하기 위하여, pH 7.0 및 60℃의 조건에서 다양한 농도의 과당을 기질로 하여 타가토스의 생산량을 측정하였다.

그 결과, 과당의 농도 증가에 의존적으로 타가토스의 생산량은 증가되는 것으로 관찰되었으나(도 2 -●-), 과당에서 타가토스로의 전환율은 과당의 농도가 증가할수록 감소되는 것으로 확인되었다(도 2 -○-). 특히 기질인 과당의 농도가 75g/ℓ 이상인 조건에서는 과당에서 타가토스로의 전환율이 5% 이하로 확인되어, 타가토스 생산을 위한 기질의 농도는 75g/ℓ 이상을 사용하는 것이 비효율적인 것으로 판단되었다.

또한, 헥수론산 C4-에머피화 효소의 야생형과 S128D 돌연변이 효소의 타가토스 생산량을 75g/ℓ의 과당 조건에서 시간별로 측정하였다.

그 결과, 야생형 효소는 16시간 이후부터 타가토스의 생산량이 더 이상 증가되지 않는 것으로 확인되었으며, S128D 돌연변이 효소의 경우는 반응 24시간 후에 가장 높은 타가토스 생산량을 보인 후 더 이상 증가되지 않고 미비하게 감소되는 것으로 확인되었다. 반응 48시간 후에 75g/ℓ의 과당에서 생산되는 타가토스의 양이 야생형 효소에서는 1.1g/ℓ(도 3 -●-), S128D 돌연변이 효소는 4.4g/ℓ로 확인되었다(도 3 -○-).

상기의 결과를 통해 헥수론산 C4-에피머화 효소의 돌연변이 효소인 S128D 돌연변이 효소가 야생형 헥수론산 C4-에피머화 효소보다 높은 타가토스 전환 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소를 이용한 타가토스 생산 방법

헥수론산 C4-에피머화 효소의 돌연변이 효소인 S128D 효소의 유전자를 기본으로 하여 돌연변이(error-prone PCR)시켜 타가토스 생산 능력이 더 높은 돌연변이 효소 D59N, N296G, F300S 및 L334V를 얻었고, 타가토스 생산 능력이 보다 더 높은 활성을 지닌 효소를 얻기 위하여 돌연변이 잔기를 조합하는 특정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 수행하였다.

상기 제작방법을 통해 제작된 헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소는 전술한 실시예 2의 방법에 따라 효소 단백질의 발현 및 분리, 정제를 수행하였다. 또한, 제작된 여러 돌연변이 효소를 사용하여 pH 7.0, 60℃ 조건 및 100 g/ℓ의 과당을 기질로 사용하여 타가토스의 생산량을 측정하였다.

그 결과, 반응 48시간 후에 S128D, S128D/L334V, S128D/N296G/L334V, S128D/D59N/N296G/L334V 및 S128D/D59N/N296G/F300S/L334V 돌연변이 효소가 100g/ℓ의 과당에서 생산하는 타가토스 양은 각각 4.5, 9.7, 20.4, 26.3 및 30.0g/ℓ으로 확인되었다(표 1 및 도 4). 이의 결과는 헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소인 S128D 돌연변이 효소에 추가로 D59N, N296G, F300S 또는 L334V의 돌연변이가 추가될 경우에 과당에서 타가토스로의 전환이 보다 높은 효율로 일어났음을 의미하였으며, 다양한 돌연변이 효소체를 제작하여 최대의 타가토스 생산수율을 보이는 돌연변이 효소체를 확인하였으므로, 추후 타가토스 생산에 있어서 효소 변이체를 유용하게 활용할 수 있을 것으로 판단되었다.

헥수론산 C4-에피머화 돌연변이 효소체의 타가토스 생산량

돌연변이 효소체	과당 (g/ℓ)	타가토스(g/ℓ)
S128D	100	4.5
S128D/D59N	100	8.2
S128D/N296G	100	9.4
S128D/F300S	100	6.2
S128D/L334V	100	9.7
S128D/D59N/L334V	100	15.8
S128D/N296G/L334V	100	20.4
S128D/D59N/N296G/L334V	100	26.3
S128D/N296G/F300S/L334V	100	22.0
S128D/D59N/N296G/F300S/L334V	100	30.0

<110> CHEBIGEN INC. SIN, Hong sig <120> Hexuronate C4-epimerase variant having improved productivity of tagatose from fructose <130> PN16446 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 483 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 1 Met Ile Gly Asn Val Leu Ser Thr Leu Glu Glu Asn Gly Phe Lys Val 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gly Glu Asn Ile Tyr Ile Phe Val 20 25 30 Val Lys Arg Gln Asn Glu Lys Met Val Gly Ile Leu Ser Ser Ser Asp 35 40 45 Val Lys Leu Asn Gly Ala Tyr Phe Ser Glu Asp Lys Asn Val Ser Asp 50 55 60 Lys Leu Arg Leu Asn Ile Tyr Pro Phe Thr Phe Glu Asn Tyr Val Thr 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Phe His Ile Gly Pro Thr Val Cys Arg Gly Asn Ser 85 90 95 Ser Phe Gly Thr Gly Asp Arg Leu Gly Leu Val Thr Ala Ala Gln Leu 100 105 110 Thr Ala Leu Lys Lys Tyr Asp Val Phe Pro Ile Leu Ala Gln Gln Ser 115 120 125 Pro Arg Glu Leu Ile Lys Thr Asn Arg Asp Phe Lys Asp Val Leu Leu 130 135 140 Lys Val Val Leu Gly Val Leu Glu Thr Gly Tyr Ile Gly His Phe Gly 145 150 155 160 Ala Asp Ala Asp His Ile Lys Asp Glu Tyr Asn Leu Leu Glu Gly Ile 165 170 175 Asn Ala Gly Tyr Thr Met Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Glu Gln Leu Ile 180 185 190 Asp Ile Ser Ser Leu Asn Ala Ser Glu Met Arg Asn Lys Ala Gln Glu 195 200 205 Leu Ser Gln Val Ser Lys Asp Ile Ile Lys Asp Phe Ser Gly Lys Lys 210 215 220 Leu Asp Ile Ile Ser Asp Ser Gly Tyr Val Val Ser Glu Glu Glu Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Ala Val Ala Tyr Glu Asn Ala Met Lys Phe Val Asp Lys 245 250 255 Val Asn Asn Ile Leu Lys Glu Lys Leu Ser Asp Phe Asp Met Glu Ile 260 265 270 Ser Ile Asp Glu Gly Gly Lys Val Thr Thr Leu Glu Asp His Leu Tyr 275 280 285 Val Ala Glu Tyr Leu His Arg Asn Gly Ile Asp Phe Phe Ser Ile Ala 290 295 300 Pro Lys Phe Pro Gly Glu Phe Glu Lys Ala Val Asp Tyr Ile Gly Asp 305 310 315 320 Leu Asp Glu Phe Leu Leu Glu Leu Lys Lys His Tyr Gln Leu Ser Arg 325 330 335 Met Ile Gly Gly Tyr Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe 340 345 350 Ser Ile Tyr Arg Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Lys Asn Phe His Ile 355 360 365 Lys Thr Ser Gly Thr Ser Trp Leu Gln Ala Val Asn Leu Ile Tyr Lys 370 375 380 Phe Asp Lys Glu Phe Tyr Arg Lys Leu Tyr Lys Ile Ala Leu Ser Asn 385 390 395 400 Leu Glu Glu Ser Lys Lys Ser Tyr Lys Val Leu Ile Lys Lys Asp Asp 405 410 415 Phe Lys Asp Glu Pro Glu Leu Asp Asn Pro Glu Phe Thr Leu Arg Pro 420 425 430 Glu Ile Lys Gln Leu Phe His Ile Ser Phe Gly Val Leu Leu Asp Leu 435 440 445 Lys Gly Lys Glu Ile Lys Asp Met Leu Asn Asp Tyr Glu Glu Glu His 450 455 460 Tyr Lys Met Val Ser Asp Asn Ile Glu Asn His Leu Lys Glu Ile Tyr 465 470 475 480 Tyr Glu Lys <210> 2 <211> 1452 <212> DNA <213> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 2 atgataggga atgttttgtc cacgttggaa gagaatggat ttaaagttta ccctgattct 60 ctaaggaaac taggagaaaa tatatatata ttcgtcgtta aaaggcaaaa tgaaaaaatg 120 gtcggcattc tgtcttctag cgatgtaaaa cttaatgggg catatttttc tgaagataaa 180 aacgtcagtg ataagttgcg tttaaacata tatccattta cttttgaaaa ttacgttaca 240 ttaaatggca aatttcatat agggcctaca gtttgcagag gaaattcctc atttggaact 300 ggtgatagac tcggacttgt tacagcagct caattaaccg cattaaaaaa atacgatgtt 360 tttccaatat tagcacagca atctccaaga gagcttataa agacaaatag agattttaaa 420 gacgtccttt taaaggtggt gctgggggta ttagagacag gatatatagg acattttggt 480 gcagatgcag atcatatcaa ggacgaatat aacttattgg aaggtataaa tgcaggatat 540 acaatgtaca cattggactt aagcgaacag ctaattgata tcagcagttt aaatgcatca 600 gagatgagaa acaaagctca agaattatct caggtaagca aagacataat taaagatttt 660 agcggtaaaa aattagacat aatttcagat agtggatatg tcgtatcaga agaggaactc 720 tataaatcgg cggttgctta tgaaaatgct atgaagtttg tggataaagt aaataacatt 780 ttaaaagaaa aattaagtga ttttgacatg gagatatcta tagatgaggg tggaaaggta 840 acgactttgg aggaccattt gtatgtagca gaatatctcc acagaaacgg catagatttc 900 ttcagcatag caccgaaatt tcctggggaa tttgaaaagg ctgttgacta cattggagat 960 ttggatgaat ttttgttaga gctcaaaaaa cattaccagt tgtcaaggat gataggcggg 1020 tacaagataa gccttcattc aggaagcgat aagttcagca tttacaggat atttagcgat 1080 attactgaga aaaattttca tataaagaca tcaggtacaa gctggctgca ggctgtaaat 1140 ctgatttaca agtttgacaa agaattctac agaaaactgt ataaaatcgc tttatcaaat 1200 ctggaagaaa gcaagaaatc ttacaaggtt ttgattaaaa aagatgattt taaagatgag 1260 ccggaacttg acaatcctga atttacattg agaccagaga taaagcagct tttccacata 1320 tcttttggcg ttttgcttga cttaaaagga aaagagatta aagatatgct taatgattat 1380 gaagaagagc attataaaat ggtttctgat aacatagaaa atcatttgaa agaaatatac 1440 tatgaaaaat aa 1452 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catatgatga tagggaatgt tttgtcc 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgctcgagtt atttttcata gtatatttc 29

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열 중 128번째 아미노산이 치환되고, 59번째, 296번째, 300번째 또는 334번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 추가로 치환된 것을 특징으로 하는 과당(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 변이체로서,
상기 128번째 아미노산은 세린(S, serine)이 아스파르트산(D, aspartic acid)으로 치환된 것을 특징으로 하며, 59번째 아미노산은 아스파르트산(D)이 아스파라긴(N, asparagine)으로 치환된 것을 특징으로 하며, 296번째 아미노산은 아스파라긴(N)이 글루탐산(G, glutamic acid)으로 치환된 것을 특징으로 하며, 300번째 아미노산은 페닐알라닌(F, phenylalanine)이 세린(S)으로 치환된 것을 특징으로 하며, 334번째 아미노산은 루신(L, lucine)이 발린(V, valine)으로 치환된 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 S128D; S128D/L334V; S128D/N296G/L334V; D59N/S128D/N296G/L334V; 또는 D59N/S128D/N296G/F300S/L334V인 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제1항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자.
제4항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제5항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 생산 방법.
제7항의 방법에 의해 생산된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제1항, 제3항 및 제8항 중 어느 한 항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 과당(fructose)에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 과당에서 타가토스(tagatose)를 생산하는 방법.
제1항, 제3항 및 제8항 중 어느 한 항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 유효성분으로 함유하는, 과당(fructose)에서 타가토스(tagatose)를 생산하기 위한 조성물.