JP2018521653A - 転換活性が高められたヘキスロン酸c4−エピメラーゼ変異体及びこれを用いたd−タガトースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
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- 配列番号1のアミノ酸配列で構成されたヘキスロン酸C4−エピメラーゼ(Hexuronate C4−epimerase)のN−末端から403番チロシン(Y)のアミノ酸残基、125番セリン(S)のアミノ酸残基、185番セリン(S)のアミノ酸残基、267番バリン(V)のアミノ酸残基、268番セリン(S)のアミノ酸残基、272番スレオニン(T)のアミノ酸残基、306番トリプトファン(W)のアミノ酸残基と386番アルギニン(R)のアミノ酸残基が変異された、ヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記403番チロシン(Y)のアミノ酸残基は、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リシン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、スレオニン(T)、バリン(V)またはトリプトファン(W)で置換され、
前記125番セリン(S)のアミノ酸残基は、システイン(C)、チロシン(Y)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)で置換され、
前記185番セリン(S)のアミノ酸残基は、アラニン(A)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、リシン(K)、グルタミン(Q)またはアルギニン(R)で置換され、
前記267番バリン(V)のアミノ酸残基は、メチオニン(M)で置換され、
前記268番セリン(S)のアミノ酸残基は、システイン(C)またはスレオニン(T)で置換され、
前記272番スレオニン(T)のアミノ酸残基は、アラニン(A)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、リシン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)またはバリン(V)で置換され、
前記306番トリプトファン(W)のアミノ酸残基は、フェニルアラニン(F)、ヒスチジン(H)、メチオニン(M)またはバリン(V)で置換され、
前記386番アルギニン(R)のアミノ酸残基は、プロリン(P)またはバリン(V)で置換されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記C4−エピメラーゼ変異体は、97番スレオニン(T)、126番バリン(V)、145番トリプトファン(W)、163番バリン(V)、164番リシン(K)、166番プロリン(P)、231番アスパラギン酸(D)、241番バリン(V)、276番スレオニン(T)、337番リシン(K)、366番アラニン(A)、402番セリン(S)、429番アスパラギン酸(D)、および440番チロシン(Y)からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記97番スレオニン(T)は、アラニン(A)またはロイシン(L)で置換され、
前記126番バリン(V)は、フェニルアラニン(F)、ロイシン(L)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、スレオニン(T)、アラニン(A)、グリシン(G)またはアルギニン(R)で置換されて、
前記145番トリプトファン(W)は、アラニン(A)で置換され、
前記163番バリン(V)は、アラニン(A)、メチオニン(M)またはグルタミン(Q)で置換され、
前記164番リシン(K)は、メチオニン(M)で置換され、
前記166番プロリン(P)は、アルギニン(R)で置換され、
前記231番アスパラギン酸(D)は、アルギニン(R)で置換され、
前記241番バリン(V)は、アスパラギン(N)、スレオニン(T)またはシステイン(S)で置換され、
前記276番スレオニン(T)は、グルタミン酸(E)またはアラニン(A)で置換され、
前記337番リシン(K)は、グルタミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、アスパラギン(N)、プロリン(P)、セリン(S)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)またはチロシン(Y)で置換されて、
前記366番アラニン(A)は、セリン(S)、グリシン(G)、またはシステイン(C)で置換され、
前記402番セリン(S)は、フェニルアラニン(F)、システイン(C)またはチロシン(Y)で置換され、
前記429番アスパラギン酸(D)は、プロリン(P)で置換され、
前記440番チロシン(Y)は、アラニン(A)で置換されたことを特徴とする、請求項3に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記97番スレオニン(T)のアミノ酸残基がさらに変異されたC4−エピメラーゼ変異体は、164番リシン(K)、166番アスパラギン酸(D)、および231番アスパラギン酸(D)からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項3に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記164番リシン(K)は、メチオニン(M)で置換され、
前記166番アスパラギン酸(D)は、アルギニン(R)で置換され、
前記231番アスパラギン酸(D)は、アルギニン(R)で置換されたことを特徴とする、請求項5に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記163番バリン(V)のアミノ酸残基がさらに変異されたC4−エピメラーゼ変異体は、231番アスパラギン酸(D)のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項3に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記231番アスパラギン酸(D)は、アルギニン(R)で置換されたことを特徴とする、請求項7に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。
- 前記337番リシン(K)のアミノ酸残基がさらに変異されたC4−エピメラーゼ変異体は、
157番グリシン(G)、160番アラニン(A)、167番グルタミン酸(E)、177番フェニルアラニン(F)、218番グリシン(G)、295番フェニルアラニン(F)、302番フェニルアラニン(F)、361番フェニルアラニン(F)、366番アラニン(A)および441番グリシン(G)からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸残基がさらに変異されたことを特徴とする、請求項3に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 前記157番グリシン(G)は、アルギニン(R)で置換され、
前記160番アラニン(A)は、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、アルギニン(R)またはチロシン(Y)で置換され、
前記167番グルタミン酸(E)は、アラニン(A)、トリプトファン(W)、イソロイシン(I)、リシン(K)、メチオニン(M)、バリン(V)またはセリン(S)で置換され、
前記177番フェニルアラニン(F)は、チロシン(Y)、ヒスチジン(H)またはロイシン(L)で置換され、
前記218番グリシン(G)は、イソロイシン(I)、セリン(S)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、またはシステイン(C)で置換され、
前記295番フェニルアラニン(F)は、システイン(C)、アルギニン(R)またはチロシン(Y)で置換され、
前記302番フェニルアラニン(F)は、システイン(C)で置換され、
前記361番フェニルアラニン(F)は、リシン(K)、グルタミン酸(E)、バリン(V)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、グルタミン(Q)、ロイシン(L)またはシステイン(C)で置換され、
前記366番アラニン(A)は、セリン(S)で置換され、
前記441番グリシン(G)は、グルタミン酸(E)、トリプトファン(W)、ヒスチジン(H)、リシン(K)、アラニン(A)、アルギニン(R)、セリン(S)またはフェニルアラニン(F)で置換されたことを特徴とする、請求項9に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体。 - 請求項1ないし10のいずれか一つに記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体を暗号化する核酸。
- 請求項11に記載の核酸を含む形質転換体。
- 請求項1ないし10のいずれか一つに記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体を含む、タガトース生産用の組成物。
- 請求項1に記載のヘキスロン酸C4−エピメラーゼ変異体、請求項12に記載の形質転換体、または請求項13に記載のD−タガトース生産用の組成物とD−フルクトース(D−fructose)を反応させて前記D−フルクトースをエピマー化(epimerization)する工程を備える、D−タガトースの製造方法。
- 前記エピマー化する工程は、金属塩が存在する条件で行われることを特徴とする、請求項14に記載のD−タガトースの製造方法。
- 前記エピマー化する工程の前に、砂糖を酵素で加水分解してD−フルクトースを得る工程またはブドウ糖を酵素で異性化する工程をさらに備えることを特徴とする、請求項14に記載のD−タガトースの製造方法。
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