KR20170015250A

KR20170015250A - 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 제조 방법

Info

Publication number: KR20170015250A
Application number: KR1020160097499A
Authority: KR
Inventors: 양성재; 김양희; 박일향; 이영미; 조현국; 김성보; 박승원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2017-02-08
Also published as: US10196626B2; KR20170141176A; JP2018521653A; WO2017018863A1; US20180245062A1; CN108138161B; EP3333260A1; CN108138161A; EP3333260A4; US20190136223A1; US10544409B2; HK1250049A1

Abstract

본 출원은 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase)의 전환 활성이 향상된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 D-타가토스의 제조 방법{HEXURONATE C4-EPIMERASE VARIANTS WITH IMPROVED CONVERSION ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCTION OF D-TAGATOSE USING THEM}

본 출원은 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용하여 D-타가토스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

타가토스는 우유, 치즈, 카카오 등의 식품, 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며 GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 여러 제품 적용 시 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 대체감미료로 이용될 수 있다.

종래 알려진 타가토스의 생산 방법은 갈락토스를 주원료로 한 화학적(촉매 반응)방법과 생물학적(이성화 효소반응) 방법이 있다(대한민국 공개특허 제2009-0082774호 참조). 그러나 갈락토스의 기초 원료가 되는 유당은 국제 시장에서의 원유(原乳) 및 유당의 생산량, 수요 및 공급량 등에 따라 가격의 불안정성이 존재하여, 타가토스 생산 원료의 안정적 수급에 한계가 있다. 따라서, 보편화된 일반당(설탕, 포도당, 과당 등)을 원료로 타가토스를 제조할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0082774호(2009.07.31 공개)

없음

본 출원의 목적은, 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공하는 것이다. 구체적 양태로 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 306번 트립토판(W) 및 386번 아르기닌(R) 위치가 돌연변이된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공하는 것을 포함할 수 있다.

본 출원의 다른 목적은, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 형질전환체, 또는 본원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 D-타가토스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체, 본원의 형질전환체, 또는 본원의 타가토스 생산용 조성물과, D-프럭토스(D-fructose)를 접촉시켜 에피머화시키는 것을 포함하는, D-타가토스의 제조 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 출원 내용에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 일 양태로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 9번 히스티딘(H), 21번 타이로신(Y), 60번 글루탐산(E), 62번 발린(V), 68번 글루탐산(E), 77번 류신(L), 91번 류신(L), 97번 트레오닌(T), 125번 세린(S), 126번 발린(V), 140번 류신(L), 141번 아스파르트산(D), 145번 트립토판(W), 149번 글루타민(Q), 157번 글라이신(G), 158번 알라닌(A), 160번 알라닌(A), 163번 발린(V), 164번 라이신(K), 166번 프롤린(P), 167번 글루탐산(E), 168번 아스파르트산(D), 175번 글루탐산(E), 176번 글라이신(G), 177번 페닐알라닌(F), 185번 세린(S), 202번 메티오닌(M), 218번 글라이신(G), 221번 타이로신(Y), 231번 아스파트산(D), 241번 발린(V), 242번 타이로신(Y), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 276번 트레오닌(T), 284번 발린(V), 295번 페닐알라닌(F), 297번 페닐알라닌(F), 302번 페닐알라닌(F), 306번 트립토판(W), 316번 류신(L), 337번 라이신(K), 351번 프롤린(P), 361번 페닐알라닌(F), 366번 알라닌(A), 386번 아르기닌(R), 388번 이소류신(I), 402번 세린(S), 403번 티로신(Y), 415번 발린(V), 429번 아스파르트산(D), 440번 타이로신(Y) 및 441번 글라이신(G)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공한다[아래 표 2 내지 5 참조].

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 403번 타이로신(Y) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 403번 타이로신(Y) 아미노산 잔기는 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 또는 트립토판(W)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 위치 외에 125번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 125번 세린(S) 아미노산 잔기는 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y) 및 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 306번 트립토판(W), 및 386번 알기닌(R)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 185번 세린(S)은 라이신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 글루타민(Q), 알라닌(A) 또는 글라이신(G)으로 치환될 수 있고; 267번 발린(V)은 메티오닌(M)으로 치환될 수 있고; 268번 세린(S)은 시스테인(C) 또는 트레오닌(T)으로 치환될 수 있고; 272번 트레오닌(T)은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있고; 306번 트립토판(W)은 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있고; 386번 알기닌(R)은 프롤린(P) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 268번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이때 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 추가적으로 164번 라이신(K), 168번 아스파르트산(D), 175번 글루탐산(E), 297번 아스파라긴(N) 및 388번 이소류신(I)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로, 168번 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)으로, 175번 글루탐산(E)은 글라이신(G)으로, 297번 아스파라긴(N)은 라이신(K)으로, 388번 이소류신(I) 발린(V)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 267번 발린(V) 및 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 C4-에피머화 효소 변이체는 351번 프롤린(P)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 351번 프롤린(P)은 세린(S)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 185번 세린(S), 267번 발린(V) 및 306번 트립토판(W) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이때 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 68번 글루탐산(E)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 68번 글루탐산(E)은 글라이신(G)로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 267번 발린(V), 268번 세린(S) 및 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 60번 글루탐산(E), 202번 메티오닌(M), 221번 타이로신(Y) 및 242번 타이로신(Y) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 60번 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로, 202번 메티오닌(M)은 트레오닌(T)으로, 221번 타이로신(Y)는 페닐알라닌(F)으로, 242번 타이로신(Y)은 페닐알라닌(F)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S) 및 272번 트레오닌(T)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 91번 류신(L), 141번 아스파르트산(D) 및 176번 글라이신(G)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 91번 류신(L)는 트립토판(W), 이소류신(I) 또는 아스파라긴(N)으로, 141번 아스파르트산(D)은 페닐알라닌(F)로, 176번 글라이신(G)은 히스티딘(H), 페닐알라닌(F) 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T) 및 306번 트립토판(W) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 284번 발린(V) 및 415번 발린(V) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 284번 발린(V)은 알라닌(A)으로, 그리고 415번 발린(V)은 글루탐산(E)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 외에, 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T) 및 306번 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 166번 프롤린(P) 또는 231번 아스파르트산(D)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 166번 프롤린(P)은 아르기닌(R)으로, 그리고 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T) 및 386번 트립토판(W) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 126번 발린(V)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 126번 발린(V)은 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 이소류신(I), 류신(L), 프롤린(P), 아스파라긴(R) 또는 트레오닌(T)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 403번 타이로신(Y) 아미노산 잔기, 125번 세린(S) 아미노산 잔기, 185번 세린(S) 아미노산 잔기, 267번 발린(V) 아미노산 잔기, 268번 세린(S) 아미노산 잔기, 272번 트레오닌(T) 아미노산 잔기, 306번 트립토판(W) 및 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 돌연변이된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T) 및 386번 트립토판(W) 아미노산 잔기 외에, 97번 트레오닌(T), 126번 발린(V), 145번 트립토판(W), 163번 발린(V), 164번 라이신(K), 166번 프롤린(P), 231번 아스파르트산(D), 241번 발린(V), 276번 트레오닌(T), 337번 라이신(K), 366번 알라닌(A), 402번 세린(S), 429번 아스파르트산(D) 또는 440번 타이로신(Y) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 각각 독립적으로, 97번 트레오닌(T)은 알라닌(A) 또는 류신(L)로 치환될 수 있고; 126번 발린(V)은 페닐알라닌(F), 류신(L), 프롤린(P), 이소류신(I), 트레오닌(T), 알라닌(A), 글라이신(G) 또는 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고; 145번 트립토판(W)은 알라닌(A)으로 치환될 수 있고; 163번 발린(V)은 알라닌(A), 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)으로 치환될 수 있고; 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로 치환될 수 있고; 166번 프롤린(P)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고; 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고; 241번 발린(V)은 아스파라긴(N), 트레오닌(T) 또는 시스테인(S)으로 치환될 수 있고; 276번 트레오닌(T)은 글루탐산(E) 또는 알라닌(A)으로 치환될 수 있고; 337번 라이신(K)은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W) 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있고; 366번 알라닌(A)은 세린(S), 글라이신(G) 또는 시스테인(C)로 치환될 수 있고; 402번 S(세린)은 페닐알라닌(F), 시스테인(C) 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있고; 429번 아스파르트산(D)은 프롤린(P)로 치환될 수 있고, 440번 타이로신(Y)은 알라닌(A)로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 386번 트립토판(W) 및 97번 트레오닌(T) 아미노산 잔기 외에 164번 라이신(K), 166번 아스파르트산(D) 또는 231번 아스파르트산(D) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로 치환될 수 있고; 166번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고; 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 386번 트립토판(W) 및 163번 발린(V) 아미노산 잔기 외에, 231번 아스파르트산(D) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 것일 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 386번 트립토판(W) 및 337번 라이신(K) 아미노산 잔기 외에, 157번 글라이신(G), 160번 알라닌(A), 167번 글루탐산(E), 177번 페닐알라닌(F), 218번 글라이신(G), 295번 페닐알라닌(F), 302번 페닐알라닌(F), 361번 페닐알라닌(F), 366번 알라닌(A) 또는 441번 글라이신(G) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 157번 글라이신(G)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고; 160번 알라닌(A)은 류신(L), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R) 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있고; 167번 글루탐산(E)은 알라닌(A), 트립토판(W), 이소류신(I), 라이신(K), 메티오닌(M), 발린(V) 또는 세린(S)으로 치환될 수 있고; 177번 페닐알라닌(F)은 타이로신(Y), 히스티딘(H) 또는 류신(L)으로 치환될 수 있고; 218번 글라이신(G)은 이소류신(I), 세린(S), 류신(L), 페닐알라닌(F) 또는 시스테인(C)로 치환될 수 있고; 295번 페닐알라닌(F)은 시스테인(C), 아르기닌(R) 또는 타이로신(Y)으로 치환될 수 있고; 302번 페닐알라닌(F)은 시스테인(C)으로 치환될 수 있고; 361번 페닐알라닌(F)은 라이신(K), 글루탐산(E), 발린(V), 트립토판(W), 타이로신(Y), 메티오닌(M), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 시스테인(C)으로 치환될 수 있고; 366번 알라닌(A)이 세린(S)으로 치환될 수 있고; 441번 글라이신(G)은 글루탐산(E), 트립토판(W), 히스티딘(H), 라이신(K), 알라닌(A), 아르기닌(R), 세린(S) 또는 페닐알라닌(F)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 77번 류신(L), 158번 알라닌(A), 또는 이의 조합의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 77번 류신(L)은 프롤린(P) 또는 아르기닌(R)로, 그리고 158번 알라닌(A)은 트레오닌(T)으로 치환될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 403번 타이로신(Y), 125번 세린(S), 77번 류신(L) 아미노산 잔기 및 158번 알라닌(A) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 386번 아르기닌(R)은 프롤린(P) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 185번 세린(S) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 185번 위치 외에 125번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 185번 세린(S) 및 125번 세린(S) 위치 외에, 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T) 또는 이의 조합의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 267번 발린(V), 306번 트립토판(W) 또는 이의 조합의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 일 구현예에서, 185번 세린(S), 125번 세린(S), 268번 세린(S), 272번 트레오닌(T), 267번 발린(V) 및 306번 트립토판(W) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는, 386번 아르기닌(R)이 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 272번 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 272번 트레오닌(T) 아미노산 잔기 외에 125번 세린(S), 267번 발린(V) 및 268번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 231번 아스파르트산(D) 또는 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)로 치환될 수 있고, 386번 아르기닌(R)은 프롤린(P) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 272번 트레오닌(T), 125번 세린(S), 185번 세린(S), 267번 발린(V), 268번 세린(S) 및 386 R 아미노산 잔기 외에, 97번 트레오닌(T), 149번 글루타민(Q), 166번 프롤린(P) 또는 351번 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 97번 트레오닌(T)은 알라닌(A) 또는 류신(L)으로 치환될 수 있고, 149번 글루타민(Q)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고, 166번 프롤린(P)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고, 351번 프롤린(P)은 세린(S)으로 치환될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 272번 트레오닌(T), 125번 세린(S), 267번 발린(V) 및 268번 세린(S) 아미노산 잔기 외에, 164번 라이신(K), 168번 아스파르트산(D) 및 175번 글루탐산(E)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로 치환될 수 있고, 168번 아스파르트산(D)은 글루탐산(E)로 치환될 수 있고, 175번 글루탐산(E)는 글라이신(G)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 77번 류신(L) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 77번 류신(L) 아미노산 잔기 외에, 125번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 류신(L) 아미노산 잔기 외에, 158번 알라닌(A) 또는 351번 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 158번 알라닌(A)는 트레오닌(T)으로 치환될 수 있고, 351번 프롤린(P)는 세린(S)으로 치환될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 77번 류신(L), 125번 세린(S) 및 158 알라닌(A) 아미노산 잔기 외에 9번 히스티딘(H), 60번 글루탐산(E) 및 415번 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의9번 히스티딘(H)은 타이로신(Y)로 치환될 수 있고, 60번 글루탐산(E)은 아스파르트산(D)으로 치환될 수 있고, 415번 발린(V)은 글루탐산(E)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 158번 알라닌(A) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 158번 알라닌(A) 아미노산 잔기 외에 125번 세린 (S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 158번 알라닌(A) 및 125번 세린 (S) 아미노산 잔기 외에 149번 글루타민(Q), 267번 발린(V) 또는 351번 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 149번 글루타민(Q)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고, 267번 발린(V)은 메티오닌(M)으로 치환될 수 있고, 351번 프롤린(P)은 세린(S)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 351번 프롤린(P) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 351번 프롤린(P) 아미노산 잔기 외에 125번 세린(S) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 351번 프롤린(P), 125번 세린(S) 아미노산 잔기 외에 267V 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있으며, 이러한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 21번 타이로신(Y), 62번 발린(V), 149번 글루타민(Q) 및 316번 류신(L)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 21번 타이로신(Y)은 페닐알라닌(F)으로 치환될 수 있고, 62번 발린(V)은 이소류신(I)으로 치환될 수 있고, 149번 글루타민(Q)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있고, 316번 류신(L)은 페닐알라닌(F)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 헥수론산 C4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 125번 세린(S), 164번 라이신(K), 168번 아스파르트산(D) 및 175번 글루탐산(E) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

일 구현예에서, 본 출원의 125번 세린(S), 164번 라이신(K), 168번 아스파르트산(D) 및 175번 글루탐산(E) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 140번 류신(L), 386번 아르기닌(R), 268번 세린(S) 및 297번 아스파라긴(N)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 140번 류신(L)은 프롤린(P)으로, 386번 아르기닌(R)이 프롤린(P) 또는 발린(V)으로 치환될 수 있고, 268번 세린(S)은 시스테인(C) 또는 트레오닌(T)으로, 297번 아스파라긴(N)은 라이신(K)으로 치환될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 헥수론산 C4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 125번 세린(S), 149번 글루타민(Q) 및 267번 발린(V) 아미노산 잔기가 돌연변이된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체일 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 야생형 헥수론산 C4-에피머화 효소의 아미노산 서열(서열번호 1)에서 표 2 내지 5에 개시되어 있는 변이된 아미노산 잔기 위치 및 치환된 아미노산 잔기로부터 도출할 수 있는 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 3, 표 3의 M125 변이체)로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체, 또는 이러한 아미노산 서열을 갖는 변이체와 비교하여 50% 이상의 유전적 상동성을 가지며, 일 구현예에 따르면 60%, 70%, 75%, 80%의 유전적 상동성을 가질 수 있으며, 다른 구현예에 따르면 85%, 90%, 95%의 상동성을 가질 수 있고, 또 다른 구현예에 따르면 97% 또는 99%의 상동성을 가지는 폴리펩티드 모이티를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 출원에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질(예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질(예, 미오신 경쇄 등)을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 21%(일 구현예에 따르면, 적어도 약 50%, 다른 구현예에 따르면 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).

본원에 기술된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 D-프럭토스의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환시키는 C4-에피머화 단위활성이 향상되어, D-프럭토스로부터 D-타가토스를 생산할 수 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는, 고온성 로도써머스(Rhodothermus)속, 써모언에러로박터(Thermoanaerobacter) 속, 써모토가(Thermotoga)속, 또는 디티오글로무스(Dictyoglomus)속에 포함되는, 고온성 미생물의 헥수론산 C4-에피머화 효소로부터 유래한 것일 수 있다. 구체적으로 써모토가(Thermotoga)속 미생물의 헥수론산 C4-에피머화 효소로부터 유래한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 또는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)의 헥수론산 C4-에피머화 효소로부터 유래한 것일 수 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소는 중온성 미생물(mesophile)이 생산하는 효소와 동일한 기능을 가지면서 극한 반응(고온 등) 조건에서 안정하게 반응을 수행할 수 있으며, 중온성 미생물에 대한 오염방지, 기질의 용해도가 낮은 물질의 용해도 증가, 반응속도의 증가 등 많은 장점을 가지고 있기 때문에 중온성 효소를 이용한 산업적인 단점을 극복할 수 있는 장점이 있다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체들은본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 발현하는 DNA(예컨대, 서열번호 4)로 E. coli 등의 균주에 형질전환시키고, 이를 배양하여 배양물을 수득하고, 상기 배양물을 파쇄하여, 컬럼 등을 통해 정제한 것일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterum glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등이 있다.

본 출원의 다른 구현예에 따르면, 본 출원은 본원에 기재된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 형질전환체, 또는 본원에 기재된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 D-타가토스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 구현예는, 본원에 기재된 C4-에피머화 효소 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다. 본 출원에서 용어, "벡터"는 유기체, 예컨데 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨데, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 출원에서 용어 "형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말하고, "형질전환체"는 핵산이 이의 게놈 내 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 유기체를 말한다. 형질전환체는 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 구체적으로는 엔테로박테리아과 미생물 또는 코리네형 미생물 등, 더욱 구체적으로는 에스케리키아속 미생물, 세라티아속 미생물 등을 들 수 있으며, 가장 구체적으로는 대장균일 수 있다.

유기체 내로 형질전환시키는 방법은 상기 핵산을 유기체 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 일예로, 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있고, 이로 제한되지 않는다.

헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 D-타가토스 생산용 조성물은 D-타가토스 샌산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물 내 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는, 조성물의 고형 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 70 중량% 범위로 포함될 수 있다.

본 출원의 또 다른 구현예에 따르면, 본 출원은 본원에 기재된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체, 본원에 기재된 형질전환체, 또는 본원에 기재된 타가토스 생산용 조성물과, D-프럭토스(D-fructose)를 접촉시켜 상기 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계을 포함하는, D-타가토스의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 출원의 양태에 따른 D-타가토스의 제조 방법에 대해 설명한다.

본 출원의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체, 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환체, 또는 이를 포함하는 D-타가토스 생산용 조성물은 D-프럭토스와 접촉하여 D-프럭토스의 4번 탄소 위치를 에피머화시킬 수 있다.

단당류는 일반적으로 알도헥소오스(aldohexose)와 케토헥소오스(ketohexose)로 분류될 수 있다. 본 출원에서의 원료인 D-프럭토스는 케토헥소오스의 일 예로, 이를 사용하여, D-타가토스를 제조할 수 있다.

상기 D-프럭토스는 설탕의 가수분해에 의해 제조되거나, 포도당을 이성질화하여 제조된 것일 수 있다. 이를 통해, 프럭토스, 설탕 및 포도당과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율로 타가토스를 제조할 수 있어 타가토스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.

본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계는 pH 5 내지 8, 다른 구현예에 따르면pH 6 내지 8에서 실시할 수 있다. 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계는 60 내지 85, 다른 구현예에 따르면 80 내지 85 범위에서 실시할 수 있다. 상기 pH 또는 온도 조건에서 본 출원의 변이체 효소처리 시, 상대적으로 고온에서 반응을 진행시킬 수 있어 제조공정 중 미생물 오염을 최소화할 수 있고, 기질로 사용되는 과당의 용해도를 증가시킬 수 있으며, 효소의 반응속도 및 전환율을 극대화할 수 있다.

또한, 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계는, 10 내지 50%(w/v) D-프럭토스 농도에서 실시할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 D-프럭토스 농도는 20 내지 50%(w/v), 다른 구현예에 따르면 20 내지 40%(w/v)에서 실시할 수 있다. 본 출원의 변이체 효소는 고농도의 D-프럭토스로부터 D-타가토스를 생산할 수 있어, 경제적이고 효율적으로 D-타가토스를 생산할 수 있는 장점이 있다.

상기 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계는 금속염 존재 하에 이루어지는 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본 출원의 금속염은 NiSO₄, NiCl₂, CoCl₂, MnCl₂, 및 ZnSO₄로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 다른 구현예에서, ZnSO₄를 사용할 수 있다. 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계가 금속염 존재 하에 이루어짐으로써, 전환활성이 향상된 효과를 얻을 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원 제조방법은 본 출원의D-프럭토스를 에피머화시키는 단계 전 설탕을 가수분해하여 D-프럭토스를 얻는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 가수분해에 사용되는 효소는 β-프룩토푸라노시다아제, 인버타아제, 사카라제 등을 포함하는 β-D-프룩토시다아제; 수크라아제, α-글루코시다아제 및 α-D-글루코하이드롤라아제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계 전, 포도당을 이성질화하여 D-프럭토스를 얻는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 이성질화 효소는 글루코스 아이소머라아제 또는 포스포글루코 아이소머라아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계 이후 에피머화 반응물을 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 에피머화 반응물을 수득하는 단계 이후 수득된 에피머화 반응물을 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 에피머화 반응물을 정제하는 단계 이후 상기 정제된 에피머화 반응물을 결정화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 에피머화 반응물을 정제하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정 및 이온 정제 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 에피머화 반응물을 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 출원은 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 둘 다를 실시하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 에피머화 반응물을 얻을 수 있다.

상기 정제된 에피머화 반응물은, 농축 후 SMB 크로마토그래피 공정을 통해 순수한 타가토스액을 수득한 후에 결정화하는 공정을 진행할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 결정화하는 단계 전에 상기 분리 수득한 타가토스 액을 농축시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 정제된 타가토스 반응물의 농도를 약 2.5 내지 3배로 농축하는 것일 수 있으며, 상기 농축시키는 단계를 통해 보다 효율적으로 결정화를 할 수 있다.

결정화하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 이용한 결정화 방법을 사용할 수 있다. 상기 결정화 단계를 통해, 최종적으로 정제된 D-타가토스를 고수율로 얻을 수 있다.

본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 제조방법은 본 출원의 정제 단계 후 미반응된 D-프럭토스를 에피머화시키는 단계에 재사용하거나, 본 출원의 결정화 단계 후 결정이 분리된 모액을 상기 정제 단계에 재사용하거나, 또는 이 둘 다를 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계를 통해 D-타가토스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 D-프럭토스의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.

본원에서 상기 용어 "n번 탄소 위치"란, IUPAC에서 규정하는 탄소 번호를 매기는 규칙에 따라 정해진 탄소 위치를 의미하며, 이는 Cn으로 표현할 수 있다. 이 때, n은 1 이상인 정수를 말한다. 예를 들어, "4번 탄소 위치에서 에피머화"되는 것을 "C4-에피머화"로 나타낼 수 있다.

본원에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 n번 위치의 아미노산 잔기(X)는, n X로 간략히 나타낼 수 있다.

또한, 본원에서 돌연변이되는 아미노산 잔기에서 치환되는 아미노산에 대한 언급이 별도로 없다면, 본원의 다른 부분에서 언급된 해당 위치의 아미노산 잔기에서의 치환 가능한 아미노산을 고려할 수 있다.

본원에서 아미노산은 아래와 같은 약어로 표시될 수 있다:

아미노산 종류	약어
알라닌(alanine)	A
아르기닌(arginine)	R
아스파라긴(asparagines)	N
아스파르트산(aspartic acid)	D
시스테인(cystein)	C
글루탐산(glutamic acid)	E
글루타민(glutamine)	Q
글라이신(glycine)	G
히스티딘(histidine)	H
이소류신(isoleucine)	I
류신(leucine)	L
라이신(lycine)	K
메티오닌(methionine)	M
페닐알라닌(phenylalanine)	F
프롤린(proline)	P
세린(serine)	S
트레오닌(threonine)	T
트립토판(tryptophan)	W
타이로신(tyrosine)	Y
발린(valine)	V

본 출원은 D-프럭토스의 4번 탄소 위치를 에피머화하여 D-타가토스로 전환하는 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소(hexuronate C4-epimerase) 변이체를 제조하고 이를 이용함으로써, 보편화된 원료인 D-프럭토스를 사용하여 D-타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있다. 또한, 제조원가가 절감되어 경제적이면서도 높은 수율로 D-타가토스의 제조가 가능하다.

이하, 실시예를 기술함으로써 본 출원을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 출원의 일 예시에 불과하며, 본 출원의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예

실시예 1. 개량 타겟 부위 디자인 및 분석

써모토가 네아폴리타나 (Thermotoga neapolitana) 유래 헥수론산 C4-에피머화 효소(이하, 야생형이라 함)의 아미노산과 상동성을 보유하는 상동유전자 (ortholog, 다른 미생물 종에서 동일한 기능을 가질 것으로 예측되는 상동유전자)의 활성부위 3차 구조 모델 분석을 기초로 기능적으로 중요할 것으로 예측되는 아미노산들을 1차 선정하였고, 이들에 대한 알라닌 스캐닝 돌연변이(alanine-scanning mutagenesis) 분석 후 재설계된(refining) 활성부위 구조 및 D-프럭토스 간 도킹모델 분석 결과를 기반으로 D-프럭토스 C4-에피머화 전환반응의 단위활성 향상을 위해 개량 타겟 부위를 디자인하였다. 이를 상세하게 설명하면 하기와 같다.

1-1. 상동유전자 ( ortholog ) 분석

야생형의 아미노산 서열(서열번호 1)과 상동성을 보유하는 상동유전자(ortholog)를 GenBank 유전자 데이터베이스를 이용하여 선별[서열 범위(sequence coverage) 80% 및 호몰로지(homology) 50% 이상의 상동유전자 약 60 개]하였고. 선별된 상동유전자들의 아미노산 서열간 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment) 분석을 통해 야생형의 아미노산 서열상 기능적으로 중요할 것으로 예측되는 보존 아미노산 잔기들을 동정하였다.

1-2. 효소 3차 구조 모델 분석

단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 데이터베이스 내에 야생형 및 상동유전자들과 30% 이상의 아미노산 서열 상동성(Identity)을 보이는 단백질 구조가 없어 호몰로지 모델링 방법에 의한 야생형의 3차 3차 구조 모델 예측의 정확성이 낮을 것이 예상되는바, 다양한 모델링 서버(RaptorX, Robetta, ModWeb, M4T, HHpred, PHYRE2, ITASSER 및 SWISS-MODEL)를 통해 얻은 3차 구조 모델들간의 활성부위를 비교 분석하여 동일하게 예측되는 구조부위에 대한 정보를 획득하였다.

1-3. 알라닌 스캐닝 돌연변이 및 도킹 결합 분석

상술한 상동유전자들 간의 아미노산 서열 분석 및 활성부위 3차 구조 모델 분석을 기초로 선정된 아미노산들을 알라닌으로 치환 변이하여, 이러한 재조합 변이효소들을 대장균에서 생산한 후 각 변이부위들의 특성을 분석하였다. 상기 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석 후 재설계된 활성부위 구조 및 D-프럭토스 간 도킹 시뮬레이션을 통해 기능적으로 중요할 것으로 예측되는 아미노산들을 선별하여 D-프럭토스 C4-에피머화 전환반응의 단위활성 향상을 위해 개량 타겟 부위를 디자인하였다. 알라닌 스캐닝 돌연변이를 통해 활성이 완전 소실되는 아미노산 부위[촉매금속이온 결합 잔기 및 탈양성자화/양성자화(deprotonation/protonation) 관여 촉매 잔기로 추정]는 활성 개량을 위한 타겟 부위에서 배제하였다.

실시예 2. 변이효소 제작 및 활성개량 변이효소 선별

실시예 1에서 디자인한 타겟 부위(야생형 헥수론산 C4-에피머화 효소의 N-말단으로부터 9, 21, 60, 62, 68, 77, 91, 97, 125, 126, 140, 141, 145, 149, 157, 158, 160, 163, 164, 166, 167, 168, 175, 176, 177, 185, 202, 218, 221, 231, 241, 242, 267, 268, 272, 276, 284, 295, 297, 302, 306, 316, 337, 351, 361, 366, 386, 388, 402, 403, 415, 429, 440 및 441번 위치의 아미노산 잔기) 54곳의 단일부위 포화돌연변이 라이브러리(single-site saturation mutagenesis library)를 제작하고, 단위활성이 개량되는 변이 부위 및 아미노산들을 스크리닝 선별하였다. 선발된 개량 부위의 정보들을 통합하여 다중 변이효소를 제작 후 D-프럭토스 C4-에피머화 전환반응의 단위활성이 향상된 변이효소를 개발하였다.

2-1. 포화 돌연변이 (saturation mutagenesis )

야생형 효소 유전자 야생형의 대장균 BL21(DE3) 발현을 위해 제작된 재조합발현벡터(pET21a의 NdeI 및 XhoI 제한효소 부위에 야생형을 도입하고 야생형의 C-말단에 6xHis-tag이 결합한 재조합효소를 발현함)를 변이주 라이브러리 제작을 위한 포화돌연변이법의 주형(template)으로 사용하였다. 변이분포 다양성 및 변이체 수율 등을 고려하여 역방향(inversed) PCR 기반 포화 돌연변이법을 사용하였고(2014. Anal. Biochem. 449:90-98), 제작된 변이주 라이브러리의 스크리닝 규모를 최소화(포화돌연변이 시 도입되는 코돈 수를 최소화함)하기 위해 종결코돈을 배제하고, 대장균의 희귀코돈(rare codons)이 최소화된 NDT, VMA, ATG 및 TGG 혼합 프라이머를(2012. Biotechniques 52:149-158) 디자인하여 사용하였다. 상세하게는, 각각의 변위 부위의 앞쪽염기 15bp와 변위 부위를 치환할 염기 3bp(각각 NDT, VMA, ATG 및 TGG), 뒤쪽염기 15bp로 총 길이는 33bp로 하여 혼합 프라이머를 제작 이용하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 10분 신장을 30회 반복한 후, 72℃에서 60분간 신장반응을 수행하였다. 변이 부위별로 포화돌연변이 라이브러리를 제작 후 라이브러리별 변이주를 무작위 선발(<변이 11개)하고 염기서열을 분석하여 아미노산 변이분포를 평가하였다. 이의 분석결과를 기반으로 라이브러리별 서열 범위(sequence coverage) 90% 이상의 스크리닝 규모를 설정하였다(2003. Nucleic Acids Res. 15;31:e30)

2-2. 활성개량 변이효소 스크리닝 및 다중 변이효소 제작

제작된 포화돌연변이 라이브러리에서 활성개량 변이효소를 대량으로 고속 스크리닝 하기 위해 D-프럭토스를 특이적으로 정량화 할 수 있는 발색 측정법을 이용하였다. 상세하게는 70% 폴린-치오칼토 용액(folin-ciocalteu reagent, SIGMA-ALDRICH)과 기질반응 완료액을 15 : 1 비율로　혼합한 후 80℃에서 5분간 반응하여 900 nm에서 측정하여　OD 값으로 비교 분석하였다.

야생형 효소(서열번호 1)와 상대활성 비교 시 활성(D-프럭토스 전환 D-타가토스 생성)이 증가된 변이 부위 54곳의 변이체들을 1차 선발하였고, 해당 유전자들은 염기서열 분석 후 아미노산 변이정보를 분석하였다(표 2 내지 표 5).

상기 1차 선발된 변이효소들은 정제(His-tag 친화 크로마토그래피) 효소액을 이용하여 프럭토스와 반응시킨 후 반응산물을 HPLC 분석법(컬럼 Shodex SUGAR SP-G, 컬럼 분석온도 80℃, 이동상 H₂O, 유속 0.6 ml/min, Refractive Index 검출기)을 이용하여 야생형 효소 대비 D-프럭토스 전환 D-타가토스 생성 활성이 증가된 변이주 222종을 최종 선발하였다.

실시예 3. 활성개량 변이효소 특성 비교 평가

단위활성이 개량된 단일부위에 대한 변이효소 및 이들이 조합된 다중부위에 대한 변이효소에 대해 D-프럭토스 C4-에피머화의 상대활성을 평가하기 위하여 각 효소를 대장균 BL21(DE3)에서 발현 후 정제(His-tag 친화 크로마토그래피)하였으며, 각 효소를 10 unit/ml 농도로 30 %(w/v) D-프럭토스 기질에 첨가 후 pH 7.0[50 mM 인산칼륨(potassium phosphate) 완충액] 및 60℃에서 2시간 반응시켜 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana) 유래 야생형 재조합효소(야생형, 서열번호 1)와 비교한 D-프럭토스 C4-에피머화의 상대활성을 측정하였다.

상기 결과로부터 본 출원의 C4-에피머화 효소 변이체들이 D-프럭토스 C4-에피머화 활성이 야생형 효소보다 증가하였음을 확인할 수 있고, 특히 M 184의 효소 변이체는 약 20배 단위 활성이 증가한 것으로 분석되어 야생형 효소에 비하여 타가토스 제조 활성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11731P

수탁일자 : 20150717

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> HEXURONATE C4-EPIMERASE VARIANTS WITH IMPROVED CONVERSION ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCTION OF D-TAGATOSE USING THEM <130> P16-0840 <150> KR 2015/0107436 <151> 2015-07-29 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 481 <212> PRT <213> A wild type of Hexuronate C4-epimerase <400> 1 Met Val Leu Lys Val Phe Lys Asp His Phe Gly Arg Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 Tyr Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Lys Asp Ser Leu Ser Phe Phe Leu Thr 20 25 30 Lys Gly Glu Glu Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Gly Glu Lys Ala Pro 35 40 45 Glu Gly Leu Ser Phe Phe Lys Lys Gln Arg Val Glu Gly Val Ser Phe 50 55 60 Phe Phe Cys Glu Arg Asn His Glu Asn Leu Glu Val Leu Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly 85 90 95 Thr Gly Asp Arg Leu Gly Ile Thr Thr Pro Ala His Val Arg Ala Leu 100 105 110 Lys Asp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Thr Gly Arg Thr Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Ala Thr 130 135 140 Trp Gly Val Phe Gln Glu Gly Tyr Ser Glu Gly Phe Gly Ala Asp Ala 145 150 155 160 Asp His Val Lys Arg Pro Glu Asp Leu Val Ser Ala Ala Arg Glu Gly 165 170 175 Phe Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Ser Asp His Val Arg Asn Leu Ser 180 185 190 Lys Leu Ser Glu Arg Glu Lys Asn Glu Met Phe Glu Glu Ile Leu Lys 195 200 205 Lys Glu Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Leu Gly Lys Lys Tyr Thr Val Leu 210 215 220 Gly Glu Arg Leu Glu Phe Asp Glu Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ala Leu 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Ala His Val Asp Met Met Tyr Gln Ile Leu 245 250 255 Lys Asp Glu Thr Pro Asp Phe Asp Phe Glu Val Ser Val Asp Glu Thr 260 265 270 Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Phe His Ile Phe Val Val Glu Glu Leu 275 280 285 Arg Arg Arg Gly Val Glu Phe Thr Asn Leu Ala Leu Arg Phe Ile Gly 290 295 300 Glu Trp Glu Lys Gly Ile Asp Tyr Lys Gly Asp Leu Ala Gln Phe Glu 305 310 315 320 Arg Glu Ile Lys Met His Ala Glu Ile Ala Arg Met Phe Glu Gly Tyr 325 330 335 Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro Ala 340 345 350 Phe Ala Ser Ala Thr Gly Gly Leu Phe His Val Lys Thr Ala Gly Thr 355 360 365 Ser Tyr Leu Glu Ala Val Lys Val Ile Ser Met Val Asn Pro Glu Leu 370 375 380 Phe Arg Glu Ile Tyr Arg Cys Ala Leu Asp His Phe Glu Glu Asp Arg 385 390 395 400 Lys Ser Tyr His Ile Ser Ala Asp Leu Ser Lys Val Pro Glu Val Glu 405 410 415 Lys Val Lys Asp Glu Asp Leu Pro Gly Leu Phe Glu Asp Ile Asn Val 420 425 430 Arg Gln Leu Ile His Val Thr Tyr Gly Ser Val Leu Lys Asp Ala Ser 435 440 445 Leu Lys Glu Arg Leu Phe Lys Thr Leu Glu Gln Asn Glu Glu Leu Phe 450 455 460 Tyr Glu Thr Val Ala Lys His Ile Lys Arg His Val Asp Leu Leu Lys 465 470 475 480 Gly <210> 2 <211> 1446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide suquence of a wild type of hexuronate C4-epimerase <400> 2 atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60 tatagagaaa aggattctct ctctttcttc ttgacaaagg gagaggaagg aaaaattctg 120 gtagtggctg gagaaaaggc acctgagggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggtggag 180 ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240 tttccagatc tcaaaccagt tcgagcggga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300 ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360 tttgcgcagc agtcggtgag ggagaacgag agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420 gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcagacgcc 480 gatcacgtga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540 acaatcgatc cttcggatca tgtgaggaat ctttcaaaac tcagtgaaag agaaaagaac 600 gagatgttcg aggaaatact gaaaaaagag cgaatcgaca ggatctatct tgggaaaaaa 660 tacaccgtcc tcggtgaaag actggagttc gacgagaaaa atttgaggga tgctgctctg 720 gtgtactatg atgcgatcgc ccacgtggat atgatgtatc aaattttgaa agacgaaacc 780 ccggatttcg acttcgaagt gtcagttgac gaaacagaaa ctcccacgag tcctctcttc 840 cacattttcg ttgtggaaga actcagacga agaggtgtgg agttcaccaa tcttgccctg 900 agattcatcg gcgaatggga aaagggaata gattacaagg gggatcttgc acagttcgag 960 agagaaatca aaatgcacgc agaaatcgca aggatgttcg aaggatacaa aatatcactc 1020 cactctggaa gcgacaaatt ttccgtgtat cctgcttttg cttccgcgac aggaggcctt 1080 ttccacgtga agacagccgg aacgagttat cttgaggcgg tgaaggtcat atccatggtc 1140 aacccggagc tcttccggga gatctacagg tgtgctctcg atcactttga ggaagacaga 1200 aagtcctatc acatatctgc ggatctgtcg aaagttccgg aagtagagaa agtgaaagat 1260 gaagatcttc caggtctttt tgaagacatc aacgtgagac agttgatcca tgtcacctat 1320 ggctctgttc tgaaagatgc atctttgaaa gaacggctgt ttaagacgct tgaacaaaat 1380 gaggaactct tctacgagac cgtggcaaaa catataaaaa ggcacgtaga cctgttgaag 1440 gggtga 1446 <210> 3 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A variant of hexuronate C4-epimerase <400> 3 Met Val Leu Lys Val Phe Lys Asp His Phe Gly Arg Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 Tyr Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Lys Asp Ser Leu Ser Phe Phe Leu Thr 20 25 30 Lys Gly Glu Glu Gly Lys Ile Leu Val Val Ala Gly Glu Lys Ala Pro 35 40 45 Glu Gly Leu Ser Phe Phe Lys Lys Gln Arg Val Glu Gly Val Ser Phe 50 55 60 Phe Phe Cys Glu Arg Asn His Glu Asn Leu Glu Val Leu Arg Lys Tyr 65 70 75 80 Phe Pro Asp Leu Lys Pro Val Arg Ala Gly Leu Arg Ala Ser Phe Gly 85 90 95 Thr Gly Asp Arg Leu Gly Ile Thr Thr Pro Ala His Val Arg Ala Leu 100 105 110 Lys Asp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Asp Val Arg Glu 115 120 125 Asn Glu Arg Thr Gly Arg Thr Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Ala Thr 130 135 140 Trp Gly Val Phe Gln Glu Gly Tyr Ser Glu Gly Phe Gly Ala Asp Ala 145 150 155 160 Asp His Val Lys Arg Pro Glu Asp Leu Val Ser Ala Ala Arg Glu Gly 165 170 175 Phe Thr Met Phe Thr Ile Asp Pro Gln Asp His Val Arg Asn Leu Ser 180 185 190 Lys Leu Ser Glu Arg Glu Lys Asn Glu Met Phe Glu Glu Ile Leu Lys 195 200 205 Lys Glu Arg Ile Asp Arg Ile Tyr Leu Gly Lys Lys Tyr Thr Val Leu 210 215 220 Gly Glu Arg Leu Glu Phe Asp Glu Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ala Leu 225 230 235 240 Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Ala His Val Asp Met Met Tyr Gln Ile Leu 245 250 255 Lys Asp Glu Thr Pro Asp Phe Asp Phe Glu Met Thr Val Asp Glu Asp 260 265 270 Glu Thr Pro Thr Ser Pro Leu Phe His Ile Phe Val Val Glu Glu Leu 275 280 285 Arg Arg Arg Gly Val Glu Phe Thr Asn Leu Ala Leu Arg Phe Ile Gly 290 295 300 Glu Met Glu Lys Gly Ile Asp Tyr Lys Gly Asp Leu Ala Gln Phe Glu 305 310 315 320 Arg Glu Ile Lys Met His Ala Glu Ile Ala Arg Met Phe Glu Gly Tyr 325 330 335 Lys Ile Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro Ala 340 345 350 Phe Ala Ser Ala Thr Gly Gly Leu Phe His Val Lys Thr Ala Gly Thr 355 360 365 Ser Tyr Leu Glu Ala Val Lys Val Ile Ser Met Val Asn Pro Glu Leu 370 375 380 Phe Val Glu Ile Tyr Arg Cys Ala Leu Asp His Phe Glu Glu Asp Arg 385 390 395 400 Lys Ser Thr His Ile Ser Ala Asp Leu Ser Lys Val Pro Glu Val Glu 405 410 415 Lys Val Lys Asp Glu Asp Leu Pro Gly Leu Phe Glu Asp Ile Asn Val 420 425 430 Arg Gln Leu Ile His Val Thr Tyr Gly Ser Val Leu Lys Asp Ala Ser 435 440 445 Leu Lys Glu Arg Leu Phe Lys Thr Leu Glu Gln Asn Glu Glu Leu Phe 450 455 460 Tyr Glu Thr Val Ala Lys His Ile Lys Arg His Val Asp Leu Leu Lys 465 470 475 480 Gly <210> 4 <211> 1446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of a variant of hexuronate C4-epimerase <400> 4 atggtcttga aagtgttcaa agatcacttt ggaaggggat acgaagttta cgaaaagtct 60 tatagagaaa aggattctct ctctttcttc ttgacaaagg gagaggaagg aaaaattctg 120 gtagtggctg gagaaaaggc acctgagggt ctgtcgtttt tcaaaaaaca gcgggtggag 180 ggtgtttcgt tctttttctg tgagagaaat catgagaact tggaagttct cagaaaatac 240 tttccagatc tcaaaccagt tcgagcggga ttgagagcgt cttttggaac aggtgacaga 300 ctcggtatca ccacaccggc tcacgtgagg gcgttgaagg attcagggct ttttcccatc 360 tttgcgcagc aggacgtgag ggagaacgag agaacgggaa ggacctggag agatgtgctg 420 gacgatgcca catggggagt tttccaggag ggatacagtg agggattcgg agcagacgcc 480 gatcacgtga agcggccgga ggatcttgtt tcggctgcaa gggaaggttt caccatgttc 540 acaatcgatc ctcaggatca tgtgaggaat ctttcaaaac tcagtgaaag agaaaagaac 600 gagatgttcg aggaaatact gaaaaaagag cgaatcgaca ggatctatct tgggaaaaaa 660 tacaccgtcc tcggtgaaag actggagttc gacgagaaaa atttgaggga tgctgctctg 720 gtgtactatg atgcgatcgc ccacgtggat atgatgtatc aaattttgaa agacgaaacc 780 ccggatttcg acttcgaaat gacagttgac gaagatgaaa ctcccacgag tcctctcttc 840 cacattttcg ttgtggaaga actcagacga agaggtgtgg agttcaccaa tcttgccctg 900 agattcatcg gcgaaatgga aaagggaata gattacaagg gggatcttgc acagttcgag 960 agagaaatca aaatgcacgc agaaatcgca aggatgttcg aaggatacaa aatatcactc 1020 cactctggaa gcgacaaatt ttccgtgtat cctgcttttg cttccgcgac aggaggcctt 1080 ttccacgtga agacagccgg aacgagttat cttgaggcgg tgaaggtcat atccatggtc 1140 aacccggagc tcttcgttga gatctacagg tgtgctctcg atcactttga ggaagacaga 1200 aagtccacac acatatctgc ggatctgtcg aaagttccgg aagtagagaa agtgaaagat 1260 gaagatcttc caggtctttt tgaagacatc aacgtgagac agttgatcca tgtcacctat 1320 ggctctgttc tgaaagatgc atctttgaaa gaacggctgt ttaagacgct tgaacaaaat 1380 gaggaactct tctacgagac cgtggcaaaa catataaaaa ggcacgtaga cctgttgaag 1440 gggtga 1446

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 헥수론산 C4-에피머화 효소(Hexuronate C4-epimerase)의 N-말단으로부터 403번 타이로신(Y) 아미노산 잔기, 125번 세린(S) 아미노산 잔기, 185번 세린(S) 아미노산 잔기, 267번 발린(V) 아미노산 잔기, 268번 세린(S) 아미노산 잔기, 272번 트레오닌(T) 아미노산 잔기, 306번 트립토판(W) 아미노산 잔기 및 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기가 돌연변이된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 1 항에 있어서,
상기 403번 타이로신(Y) 아미노산 잔기는 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V) 또는 트립토판(W)으로 치환되고,
상기 125번 세린(S) 아미노산 잔기는 시스테인(C), 타이로신(Y), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고,
상기 185번 세린(S) 아미노산 잔기는 알라닌(A), 글라이신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 글루타민(Q) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고,
상기 267번 발린(V) 아미노산 잔기는 메티오닌(M)으로 치환되고,
상기 268번 세린(S) 아미노산 잔기는 시스테인(C) 또는 트레오닌(T)로 치환되고,
상기 272번 트레오닌(T) 아미노산 잔기는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글라이신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 라이신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S) 또는 발린(V)로 치환되고,
상기 306번 트립토판(W) 아미노산 잔기는 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 메티오닌(M) 또는 발린(V)으로 치환되고,
상기 386번 아르기닌(R) 아미노산 잔기는 프롤린(P) 또는 발린(V)으로 치환된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 1 항에 있어서, 상기 C4-에피머화 효소 변이체는 97번 트레오닌(T), 126번 발린(V), 145번 트립토판(W), 163번 발린(V), 164번 라이신(K), 166번 프롤린(P), 231번 아스파르트산(D), 241번 발린(V), 276번 트레오닌(T), 337번 라이신(K), 366번 알라닌(A), 402번 세린(S), 429번 아스파르트산(D) 및 440번 타이로신(Y)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 3 항에 있어서, 상기 97번 트레오닌(T)은 알라닌(A) 또는 류신(L)으로 치환되고,
상기 126번 발린(V)은 페닐알라닌(F), 류신(L), 프롤린(P), 이소류신(I), 트레오닌(T), 알라닌(A), 글라이신(G) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고,
상기 145번 트립토판(W)은 알라닌(A)으로 치환되고,
상기 163번 발린(V)은 알라닌(A), 메티오닌(M) 또는 글루타민(Q)으로 치환되고,
상기 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로 치환되고,
상기 166번 프롤린(P)은 아르기닌(R)으로 치환되고,
상기 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환되고,
상기 241번 발린(V)은 아스파라긴(N), 트레오닌(T) 또는 시스테인(S)로 치환되고,
상기 276번 트레오닌(T)은 글루탐산(E) 또는 알라닌(A)으로 치환되고,
상기 337번 라이신(K)은 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W) 또는 타이로신(Y)으로 치환되고,
상기 366번 알라닌(A)은 세린(S), 글라이신(G) 또는 시스테인(C)로 치환되고,
상기 402번 세린(S)은 페닐알라닌(F), 시스테인(C) 또는 타이로신(Y)으로 치환되고,
상기 429번 아스파르트산(D)은 프롤린(P)로 치환되고,
상기 440번 타이로신(Y)은 알라닌(A)으로 치환된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 3 항에 있어서, 상기 97번 트레오닌(T) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 C4-에피머화 효소 변이체는 164번 라이신(K), 166번 아스파르트산(D) 및 231번 아스파르트산(D)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 , 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 5 항에 있어서, 상기 164번 라이신(K)은 메티오닌(M)으로 치환되고,
상기 166번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환되고,상기 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환된 , 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 3 항에 있어서, 상기 163번 발린(V) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 C4-에피머화 효소 변이체는 231번 아스파르트산(D) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 , 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 7 항에 있어서, 상기 231번 아스파르트산(D)은 아르기닌(R)으로 치환된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 3 항에 있어서, 상기 337번 라이신(K) 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 C4-에피머화 효소 변이체는, 157번 글라이신(G), 160번 알라닌(A), 167번 글루탐산(E), 177번 페닐알라닌(F), 218번 글라이신(G), 295번 페닐알라닌(F), 302번 페닐알라닌(F), 361번 페닐알라닌(F), 366번 알라닌(A) 및 441번 글라이신(G)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이된 , 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 9 항에 있어서, 상기 157번 글라이신(G)은 아르기닌(R)으로 치환되고,
상기 160번 알라닌(A)은 류신(L), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R) 또는 타이로신(Y)으로 치환되고,
상기 167번 글루탐산(E)은 알라닌(A), 트립토판(W), 이소류신(I), 라이신(K), 메티오닌(M), 발린(V) 또는 세린(S)으로 치환되고,
상기 177번 페닐알라닌(F)은 타이로신(Y), 히스티딘(H) 또는 류신(L)으로 치환되고,
상기 218번 글라이신(G)은 이소류신(I), 세린(S), 류신(L), 페닐알라닌(F) 또는 시스테인(C)으로 치환되고,
상기 295번 페닐알라닌(F)은 시스테인(C), 아르기닌(R) 또는 타이로신(Y)으로 치환되고,
상기 302번 페닐알라닌(F)은 시스테인(C)으로 치환되고,
상기 361번 페닐알라닌(F)은 라이신(K), 글루탐산(E), 발린(V), 트립토판(W), 타이로신(Y), 메티오닌(M), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 시스테인(C)으로 치환되고,
상기 366번 알라닌(A)이 세린(S)으로 치환되고,
상기 441번 글라이신(G)이 글루탐산(E), 트립토판(W), 히스티딘(H), 라이신(K), 알라닌(A), 아르기닌(R), 세린(S) 또는 페닐알라닌(F)으로 치환된, 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산.
제 11 항에 따른 핵산을 포함하는 형질전환체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 포함하는 타가토스 생산용 조성물.
제 1 항의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체, 제 12 항의 형질전환체, 또는 제 13 항의 D-타가토스 생산용 조성물과 D-프럭토스(D-fructose)를 접촉시켜 상기 D-프럭토스를 에피머화(epimerization)시키는 단계를 포함하는, D-타가토스 제조방법.
제 14 항에 있어서, 에피머화시키는 단계는 금속염의 존재하에 이루어지는, D-타가토스 제조방법.
제 14 항에 있어서, 에피머화시키는 단계 이전에 설탕을 효소로 가수분해하여 D-프럭토즈를 얻는 단계 또는 포도당을 효소로 이성질화하는 단계를 추가로 포함하는, D-타가토스 제조방법.