KR102131638B1 - 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 - Google Patents
과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102131638B1 KR102131638B1 KR1020180159870A KR20180159870A KR102131638B1 KR 102131638 B1 KR102131638 B1 KR 102131638B1 KR 1020180159870 A KR1020180159870 A KR 1020180159870A KR 20180159870 A KR20180159870 A KR 20180159870A KR 102131638 B1 KR102131638 B1 KR 102131638B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- lys
- leu
- glu
- asp
- phe
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체에 관한 것으로, 특정 아미노산 잔기가 치환됨으로써 야생형 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공하며, 본 발명에 의한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 증가함에 따라 타가토스의 대량생산을 가능하게 할 수 있다.
Description
본 발명은 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체에 관한 것으로, 구체적으로는 특정 아미노산 잔기가 치환됨으로써 야생형 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체에 관한 것이다.
감미료는 단맛을 느끼게 하는 조미료 및 식품첨가물로 정의될 수 있으며, 일반적으로 탄수화물 중 식이섬유를 제외한 당류와 고감미를 가지는 식품첨가물이 이에 해당한다. 가장 대표적인 감미료로서 설탕을 꼽을 수 있으며, 지난 십 수 세기 동안 인류는 설탕의 단맛에 길들여져 왔다. 설탕은 포도당과 과당이 α-1,2 결합된 이당류로서, 낮은 비용으로 식품에 이상적인 감미를 부여할 뿐 아니라, 풍미와 색택을 증진시키고, 보존성을 높이는 등 가공식품에 큰 역할을 수행해 왔다.
그러나 최근 급증하고 있는 비만과 당뇨병의 주된 원인을 생활수준의 향상에 따른 설탕이 다량 함유된 고열량 식품의 과잉 섭취에 두고 있다. 이에 따라 ‘저칼로리 식품소재’나 ‘건강 기능성’ 등이 식품산업의 새로운 제품 개발 핵심어 (keywords)로 등장하고 있다. 특히 열량 감소를 위한 노력은 고감미도, 저(무)칼로리, 기능성을 지닌 대체감미료의 개발과 더불어 글로벌 식품소재화 및 상품화까지 확대 적용하고자 하는 움직임으로 연결되고 있다.
타가토스는 우유, 치즈, 카카오 등의 식품, 사과와 귤과 같은 단맛이 나는 천연과일에 소량 존재하는 천연감미료, 물리적 성질 또한 설탕과 비슷하다. 타가토스의 칼로리는 1.5 kcal/g으로 설탕의 1/3 수준이며 GI(Glycemic index, 혈당지수)는 3으로 설탕의 5% 수준인데 반해, 설탕과 유사한 단맛을 내면서 다양한 건강 기능성을 가지고 있기 때문에 여러 제품 적용 시 건강과 맛을 동시에 만족시킬 수 있는 대체감미료로 이용될 수 있다.
종래 알려진 헥수론산 C4-에피머화 효소의 특정 위치의 아미노산을 돌연변이 시켜 타가토스를 생산하는 기술은 알려져 있으나(등록특허 제10-1905468호, 공개특허공보 제10-2018-0027962호 등) 산업적 생산을 위하여 타가토스 전환 활성이 보다 높은 효소 또는 이들의 변이체 개발이 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 헥수론산 C4-에피머화 효소의 특정 위치의 아미노산을 특정 아미노산으로 치환시킴으로써 과당에서 타가토스로의 전환 활성이 야생형에 비하여 현저히 증가되는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 또는 367번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 언급되는 아미노산은 하기와 같이 표시될 수 있다;
알라닌(Ala, A), 시스테인(Cys, C) 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 페닐알라닌(Phe, F), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 이소류신(Ile, I), 라이신(Lys, K), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 아스파라긴(Asn, N), 프롤린(Pro, P), 글루타민(Gln, Q), 아르기닌(Arg, R), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 발린(Val, V), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y).
타가토스의 효율적인 생산 공정을 위해서는 고온에서의 효소반응이 가능해야 하므로, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 또는 367번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 고온성 미생물로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum) 으로부터 유래된 것이다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 아미노산인 이소류신(Ile)은 아스파르트산(Asp)으로 치환될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 367번째 아미노산인 알라닌(Ala)은 세린(Ser)으로 치환될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다.
본 발명의 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "핵산"은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말하고, "형질전환체"는 핵산이 이의 게놈 내 이동하여 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 유기체를 말한다. 형질전환체는 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 바람직하게는 엔테로박테리아과 미생물 또는 코리네형 미생물 등, 더욱 구체적으로는 바람직하게는 미생물, 세라티아속 미생물 등을 들 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다.
유기체 내로 형질 전환시키는 방법은 상기 핵산을 유기체 내로 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 구체적으로 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전 (calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 특정 아미노산 잔기가 치환됨으로써 야생형 대비 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체 및 이를 암호화하는 유전자를 제공하며, 본 발명에 의한 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 증가함에 따라 타가토스의 대량생산을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 변이 도입 전의 야생형 헥수론산 C4-에피머화 효소와 과당과의 결합 모드 예측 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 변이 도입 후 헥수론산 C4-에피머화 효소와 과당과의 결합 모드 예측 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체의 정제 효소의 단백질 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 변이 도입 후 헥수론산 C4-에피머화 효소와 과당과의 결합 모드 예측 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체의 정제 효소의 단백질 정제 과정을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 헥수론산 C4-에피머화 효소의 신규 아미노산 치환 위치 탐색 및 선정
헥수론산 C4-에피머화 효소의 효소활성 개선을 위해 아미노산 치환위치 단백질 구조예측 기반 아미노산 치환위치 선정을 위해 단백질 구조예측 및 분석 프로그램(Autodock Vina, Coot, Modeller, PyMol, Refmac5)를 이용하였고, 구체적인 방법은 다음과 같다.
슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum) 유래 헥수론산 C4-에피머화 효소의 아미노산 서열(NCBI accession number WP_013932383.1)을 기반으로 단백질 구조 및 기질인 과당과의 결합 모드를 예측하였다(도 1).
헥수론산 C4-에피머화 효소의 구조는 알려져 있지 않아 호몰로지 모델링 기법을 이용해 단백질 구조의 모델을 생성하였다. 모델링의 주형(template)으로는 헥수론산 C4-에피머화 효소와 구조적으로 유사할 것으로 예상되는 7종의 단백질 구조(Protein Data Bank accession number 4NW4, 4TO8, 5U4N, 3PM6, 1GVF, 3N9R, 4ZVA)가 사용되었으며, 호몰로지 모델링은 Modeller 프로그램을 이용해 수행되었다.
생성된 헥수론산 C4-에피머화 효소의 모델 분석을 통해 기질인 과당의 결합 부위를 확인하였고 Autodock Vina 프로그램을 이용해 과당과의 결합 모드를 예측하였다(도 2). 효소활성이 개선될 수 있도록 극성을 추가로 부여하여 기질과의 결합이 강화될 것으로 예상되는 아미노산 잔기를 탐색한 결과, 서열번호 1의 90번째 아미노산인 이소류신(Ile)을 아스파르트산(Asp)으로(이하, I90D) 치환하거나, 367번째 아미노산인 알라닌(Ala)을 세린(Ser)으로(이하, A367S) 치환하는 것을 후보로 선정하였다.
실시예 2. 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조
헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체의 과발현을 위해 발현 벡터 및 대장균 도입주를 확보하기 위해 헥수론산 C4-에피머화 효소 유전자와 그에 따른 돌연변이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였고 구체적인 방법은 다음과 같다.
발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum) 유래 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체 2종(I90D 또는 A367S)의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 바이오니아(Bioneer.Co.Korea)에 의뢰하여 합성하였다.
합성된 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NdeI과 XhoI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pET28a(Novagen)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였으며, heat shock방법(Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 형질전환하여 재조합 균주를 제조하였다(도 3). 또한, 형질전환된 재조합 균주는 60% 글리세린 용액을 30% 농도가 되도록 첨가하여 타가토스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 -70℃ 냉동 보관하였다.
본 발명의 서열번호 리스트는 하기 표 1과 같다.
| 서열번호 (SEQ ID NO.) |
서열(Sequence) |
| 1 | MKLLEEFLKAFPGRFKVYGSSLRIITDSYFFLGNDGKEKLLFVVGKKGICQLFDGQKIGQIGSNDVLMCKKTHENLLALRKIINLNPTTINKKASFGFGDRIGLATPAHAKVAKDFEVFPIFAQQSVRELSRTGRTYKDVLDDAVWGVFESGYNFEFGADADHVKEIEDLEKASNEGFTMYTVDPSDHIKDVSKLSQKEFQSLYQDNKIRRELEMRYVGKLYKFKDFEFRMTDEEFAEIFVTYIDAIEHVCKCYDVLKAKGKPFDFEVSIDETAVPTTPLAHIFIVKELRRRGIDFKTLALRFSGEWQKGIDYIGDMEMFRKEIITHSKISKELGGYKLSLHSGSDKFSVYPIFSEATEGEFHVKTAGTNYLEAIRVVAVKDPELYREIHKFALTKFEQDRKSYHVTTDLSKIPDVDKMKNEELVKLLDMPDSRQLIHITYGSVLTAKDENGRWLFKERILKVLQENEDLHYDFVEKHMRKHLSLLGLERRIEK |
| 2 | atgaaactgctggaagagttcctgaaagctttcccgggcagatttaaggtgtatggcagcagcctgcgcattattaccgattcctatttctttctgggaaatgatggaaaagaaaaactgctgtttgtggtggggaagaaaggcatttgtcagctgttcgatgggcagaagattggccagatagggagcaatgacgttctgatgtgcaagaaaacgcatgaaaacctgctggccctgcgcaagatcatcaatctgaacccgaccaccataaataaaaaagcgagctttggctttggcgaccgcattggcctcgcaacccctgcacacgctaaagtggcgaaagattttgaggtatttccgatttttgcacagcagagcgtgcgggaactgagcagaaccggccgcacctataaggacgtacttgatgatgccgtctggggcgtttttgaaagcggctataactttgaattcggcgctgatgctgatcacgttaaagagatcgaagatctggaaaaagcatccaatgaggggtttacgatgtatactgtggatcccagcgaccatattaaggacgtgtcgaaactgagtcagaaagagtttcaatctctgtatcaagataacaaaattcggcgagagctggaaatgcggtacgtcggcaaactatacaaattcaaggatttcgaatttcgcatgacagatgaagagttcgccgagatctttgttacttatatcgatgctattgaacatgtctgcaaatgttacgatgtactaaaagccaaaggcaaaccttttgattttgaagtgagcattgatgagaccgcggtcccaacgaccccactggcccatatttttatcgtgaaagagctgcgccgacgcggcatagacttcaaaaccttagcactgcgctttagcggcgaatggcaaaagggcatcgattacatcggcgatatggaaatgtttaggaaagaaattatcacccattcaaaaatttcgaaagaactggggggctataagctgagcctccatagcggctccgataagtttagcgtttatccgattttctcggaggcgacggaaggcgagtttcatgtgaaaaccgcgggcacgaattatctggaagcaattcgcgtggtagccgtgaaagaccctgagctgtatcgtgaaatacacaaattcgcgctgaccaagttcgagcaagaccgcaaaagctaccatgtgaccaccgatctgagcaaaataccagacgtggacaagatgaagaatgaagagttggtcaaactgttagacatgccggacagccgccagctgatacatatcacctatggcagcgtgctcaccgcgaaggatgaaaacggccgctggctgtttaaagagcgcatactgaaagtcctgcaggaaaatgaagacctgcattacgatttcgttgaaaaacacatgcgcaaacacctgagcttactgggcctggaacgccgcattgaaaaa |
| 3 | MKLLEEFLKAFPGRFKVYGSSLRIITDSYFFLGNDGKEKLLFVVGKKGICQLFDGQKIGQIGSNDVLMCKKTHENLLALRKIINLNPTTDNKKASFGFGDRIGLATPAHAKVAKDFEVFPIFAQQSVRELSRTGRTYKDVLDDAVWGVFESGYNFEFGADADHVKEIEDLEKASNEGFTMYTVDPSDHIKDVSKLSQKEFQSLYQDNKIRRELEMRYVGKLYKFKDFEFRMTDEEFAEIFVTYIDAIEHVCKCYDVLKAKGKPFDFEVSIDETAVPTTPLAHIFIVKELRRRGIDFKTLALRFSGEWQKGIDYIGDMEMFRKEIITHSKISKELGGYKLSLHSGSDKFSVYPIFSEATEGEFHVKTAGTNYLEAIRVVAVKDPELYREIHKFALTKFEQDRKSYHVTTDLSKIPDVDKMKNEELVKLLDMPDSRQLIHITYGSVLTAKDENGRWLFKERILKVLQENEDLHYDFVEKHMRKHLSLLGLERRIEK |
| 4 | atgaaactgctggaagagttcctgaaagctttcccgggcagatttaaggtgtatggcagcagcctgcgcattattaccgattcctatttctttctgggaaatgatggaaaagaaaaactgctgtttgtggtggggaagaaaggcatttgtcagctgttcgatgggcagaagattggccagatagggagcaatgacgttctgatgtgcaagaaaacgcatgaaaacctgctggccctgcgcaagatcatcaatctgaacccgaccaccgataataaaaaagcgagctttggctttggcgaccgcattggcctcgcaacccctgcacacgctaaagtggcgaaagattttgaggtatttccgatttttgcacagcagagcgtgcgggaactgagcagaaccggccgcacctataaggacgtacttgatgatgccgtctggggcgtttttgaaagcggctataactttgaattcggcgctgatgctgatcacgttaaagagatcgaagatctggaaaaagcatccaatgaggggtttacgatgtatactgtggatcccagcgaccatattaaggacgtgtcgaaactgagtcagaaagagtttcaatctctgtatcaagataacaaaattcggcgagagctggaaatgcggtacgtcggcaaactatacaaattcaaggatttcgaatttcgcatgacagatgaagagttcgccgagatctttgttacttatatcgatgctattgaacatgtctgcaaatgttacgatgtactaaaagccaaaggcaaaccttttgattttgaagtgagcattgatgagaccgcggtcccaacgaccccactggcccatatttttatcgtgaaagagctgcgccgacgcggcatagacttcaaaaccttagcactgcgctttagcggcgaatggcaaaagggcatcgattacatcggcgatatggaaatgtttaggaaagaaattatcacccattcaaaaatttcgaaagaactggggggctataagctgagcctccatagcggctccgataagtttagcgtttatccgattttctcggaggcgacggaaggcgagtttcatgtgaaaaccgcgggcacgaattatctggaagcaattcgcgtggtagccgtgaaagaccctgagctgtatcgtgaaatacacaaattcgcgctgaccaagttcgagcaagaccgcaaaagctaccatgtgaccaccgatctgagcaaaataccagacgtggacaagatgaagaatgaagagttggtcaaactgttagacatgccggacagccgccagctgatacatatcacctatggcagcgtgctcaccgcgaaggatgaaaacggccgctggctgtttaaagagcgcatactgaaagtcctgcaggaaaatgaagacctgcattacgatttcgttgaaaaacacatgcgcaaacacctgagcttactgggcctggaacgccgcattgaaaaa |
| 5 | MKLLEEFLKAFPGRFKVYGSSLRIITDSYFFLGNDGKEKLLFVVGKKGICQLFDGQKIGQIGSNDVLMCKKTHENLLALRKIINLNPTTINKKASFGFGDRIGLATPAHAKVAKDFEVFPIFAQQSVRELSRTGRTYKDVLDDAVWGVFESGYNFEFGADADHVKEIEDLEKASNEGFTMYTVDPSDHIKDVSKLSQKEFQSLYQDNKIRRELEMRYVGKLYKFKDFEFRMTDEEFAEIFVTYIDAIEHVCKCYDVLKAKGKPFDFEVSIDETAVPTTPLAHIFIVKELRRRGIDFKTLALRFSGEWQKGIDYIGDMEMFRKEIITHSKISKELGGYKLSLHSGSDKFSVYPIFSEATEGEFHVKTSGTNYLEAIRVVAVKDPELYREIHKFALTKFEQDRKSYHVTTDLSKIPDVDKMKNEELVKLLDMPDSRQLIHITYGSVLTAKDENGRWLFKERILKVLQENEDLHYDFVEKHMRKHLSLLGLERRIEK |
| 6 | atgaaactgctggaagagttcctgaaagctttcccgggcagatttaaggtgtatggcagcagcctgcgcattattaccgattcctatttctttctgggaaatgatggaaaagaaaaactgctgtttgtggtggggaagaaaggcatttgtcagctgttcgatgggcagaagattggccagatagggagcaatgacgttctgatgtgcaagaaaacgcatgaaaacctgctggccctgcgcaagatcatcaatctgaacccgaccaccataaataaaaaagcgagctttggctttggcgaccgcattggcctcgcaacccctgcacacgctaaagtggcgaaagattttgaggtatttccgatttttgcacagcagagcgtgcgggaactgagcagaaccggccgcacctataaggacgtacttgatgatgccgtctggggcgtttttgaaagcggctataactttgaattcggcgctgatgctgatcacgttaaagagatcgaagatctggaaaaagcatccaatgaggggtttacgatgtatactgtggatcccagcgaccatattaaggacgtgtcgaaactgagtcagaaagagtttcaatctctgtatcaagataacaaaattcggcgagagctggaaatgcggtacgtcggcaaactatacaaattcaaggatttcgaatttcgcatgacagatgaagagttcgccgagatctttgttacttatatcgatgctattgaacatgtctgcaaatgttacgatgtactaaaagccaaaggcaaaccttttgattttgaagtgagcattgatgagaccgcggtcccaacgaccccactggcccatatttttatcgtgaaagagctgcgccgacgcggcatagacttcaaaaccttagcactgcgctttagcggcgaatggcaaaagggcatcgattacatcggcgatatggaaatgtttaggaaagaaattatcacccattcaaaaatttcgaaagaactggggggctataagctgagcctccatagcggctccgataagtttagcgtttatccgattttctcggaggcgacggaaggcgagtttcatgtgaaaaccagcggcacgaattatctggaagcaattcgcgtggtagccgtgaaagaccctgagctgtatcgtgaaatacacaaattcgcgctgaccaagttcgagcaagaccgcaaaagctaccatgtgaccaccgatctgagcaaaataccagacgtggacaagatgaagaatgaagagttggtcaaactgttagacatgccggacagccgccagctgatacatatcacctatggcagcgtgctcaccgcgaaggatgaaaacggccgctggctgtttaaagagcgcatactgaaagtcctgcaggaaaatgaagacctgcattacgatttcgttgaaaaacacatgcgcaaacacctgagcttactgggcctggaacgccgcattgaaaaa |
야생형 헥수론산 C4-에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기서열은 서열번호 2의 서열로 이루어진다. 서열번호 1의 90번째 아미노산인 이소류신(Ile)이 아스파르트산(Asp)으로 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 염기서열은 서열번호 4의 서열로 이루어진다.
서열번호 1의 367번째 아미노산인 알라닌(Ala)이 세린(Ser)으로 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 서열번호 5의 서열을 암호화하는 DNA 염기서열은 서열번호 6의 서열로 이루어진다.
실시예 3. 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체 제조
헥수론산 C4-에피머화 효소의 효소반응을 위한 정제 효소를 확보하기 위해 상기 실시예 2에서 제조된 헥수론산 C4-에피머화 효소의 발현벡터가 형질전환된 재조합 대장균을 이용하여 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체를 제조하였고 구체적인 방법은 다음과 같다.
헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체를 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제작하고 냉동 보관된 재조합 대장균 1 ml을 150 ml의 단백질 발현용 배지가 들어있는 1 L 플라스크에 접종하고 진탕 배양기로 32℃, 140 rpm을 유지하여 24시간 동안 배양하였다. 단백질 발현용 배지의 조성비는 표 2에 나타내었다.
배지에 포함된 1% lactose로 헥수론산 C4-에피머화 효소의 대량 발현을 유도하였다.
상기와 같이 과발현되어 생산된 헥수론산 C4-에피머화 효소는 다음의 방법으로 분리하였다. 먼저, 상기 형질전환된 균주의 배양액을 4100×g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 상등액은 제거한 후, 50 mM 제1인산칼륨, 300 mM 염화칼륨, 5 mM 이미다졸을 첨가하여 초음파 파쇄기(sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 15,814×g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 세포 펠렛은 제거한 다음 상등액만을 얻어 히스티딘 태그(His-tag) 친화 크로마토그래피 컬럼 및 탈염(desalting) 컬럼을 이용해 타가토스 생산에 사용되는 효소액으로서 분리하였고 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4의 M은 단백질 size marker, I는 단백질 발현 후 세포 파쇄물, S는 세포 파쇄물의 상등액, P는 세포 파쇄물의 펠렛, A는 단백질 정제 과정 1, B는 단백질 정제 과정 2, C는 단백질 정제 과정 3, E는 최종적으로 정제된 헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체(59.8kDa)를 나타낸 것이다.
<실험예 1> 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 효소활성 확인
헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체의 효소활성을 확인하기 위해 야생형을 비교예로 하여 실험을 진행하였다.
헥수론산 C4-에피머화 효소의 야생형 및 변이체의 정제 효소, 기질(2% 과당), 금속 이온(1 mM NiSO4)을 준비하였고, 구체적인 실험과정은 다음과 같다.
효소활성 분석은 정제효소 1.0 mg/ml, 20 g/L 과당 및 1mM 황산니켈(NiSO4)의 금속 이온이 포함된 10 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.0)을 사용하였고, 진탕 항온 수조(VS-1205SW1, 비전과학)에서 70℃, 120 rpm으로 16시간 동안 수행하였고, 16,600×g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상기 반응을 정지시켰다. 또한, 효소활성 측정 시 타가토스 농도 및 과당 농도는 Shodex-sp0810 칼럼(Shodex, 일본)이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(SP930D pump, 영린기기; MIDAS 자동시료주입기, Spark Holland 社) 및 굴절지수 검출기(2414 refractive index detector, Waters 社)를 이용하여 분석하였고 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
분석 결과, I90D 또는 A367S 변이체에서 야생형 효소에 비해 과당을 기질로 하였을 때 효소 활성이 개선되어 과장에서 타가토스의 전환율이 야생형보다 약 34.8 내지 45.6%이상 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
<110> DAESANG CORPORATION
<120> HEXURONATE C4-EPIMERASE VARIANTS WITH IMPROVED CONVERSION
ACTIVITY FROM FRUCTOSE TO TAGATOSE
<130> 18-11217
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 494
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> A wild type of Hexuronate C4-epimerase
<400> 1
Met Lys Leu Leu Glu Glu Phe Leu Lys Ala Phe Pro Gly Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ser Ser Leu Arg Ile Ile Thr Asp Ser Tyr Phe Phe Leu
20 25 30
Gly Asn Asp Gly Lys Glu Lys Leu Leu Phe Val Val Gly Lys Lys Gly
35 40 45
Ile Cys Gln Leu Phe Asp Gly Gln Lys Ile Gly Gln Ile Gly Ser Asn
50 55 60
Asp Val Leu Met Cys Lys Lys Thr His Glu Asn Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Lys Ile Ile Asn Leu Asn Pro Thr Thr Ile Asn Lys Lys Ala Ser Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Asp Arg Ile Gly Leu Ala Thr Pro Ala His Ala Lys Val
100 105 110
Ala Lys Asp Phe Glu Val Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg
115 120 125
Glu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr Tyr Lys Asp Val Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Val Trp Gly Val Phe Glu Ser Gly Tyr Asn Phe Glu Phe Gly Ala Asp
145 150 155 160
Ala Asp His Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Ser Asn Glu
165 170 175
Gly Phe Thr Met Tyr Thr Val Asp Pro Ser Asp His Ile Lys Asp Val
180 185 190
Ser Lys Leu Ser Gln Lys Glu Phe Gln Ser Leu Tyr Gln Asp Asn Lys
195 200 205
Ile Arg Arg Glu Leu Glu Met Arg Tyr Val Gly Lys Leu Tyr Lys Phe
210 215 220
Lys Asp Phe Glu Phe Arg Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Glu Ile Phe
225 230 235 240
Val Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Glu His Val Cys Lys Cys Tyr Asp Val
245 250 255
Leu Lys Ala Lys Gly Lys Pro Phe Asp Phe Glu Val Ser Ile Asp Glu
260 265 270
Thr Ala Val Pro Thr Thr Pro Leu Ala His Ile Phe Ile Val Lys Glu
275 280 285
Leu Arg Arg Arg Gly Ile Asp Phe Lys Thr Leu Ala Leu Arg Phe Ser
290 295 300
Gly Glu Trp Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Ile Gly Asp Met Glu Met Phe
305 310 315 320
Arg Lys Glu Ile Ile Thr His Ser Lys Ile Ser Lys Glu Leu Gly Gly
325 330 335
Tyr Lys Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro
340 345 350
Ile Phe Ser Glu Ala Thr Glu Gly Glu Phe His Val Lys Thr Ala Gly
355 360 365
Thr Asn Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Val Val Ala Val Lys Asp Pro Glu
370 375 380
Leu Tyr Arg Glu Ile His Lys Phe Ala Leu Thr Lys Phe Glu Gln Asp
385 390 395 400
Arg Lys Ser Tyr His Val Thr Thr Asp Leu Ser Lys Ile Pro Asp Val
405 410 415
Asp Lys Met Lys Asn Glu Glu Leu Val Lys Leu Leu Asp Met Pro Asp
420 425 430
Ser Arg Gln Leu Ile His Ile Thr Tyr Gly Ser Val Leu Thr Ala Lys
435 440 445
Asp Glu Asn Gly Arg Trp Leu Phe Lys Glu Arg Ile Leu Lys Val Leu
450 455 460
Gln Glu Asn Glu Asp Leu His Tyr Asp Phe Val Glu Lys His Met Arg
465 470 475 480
Lys His Leu Ser Leu Leu Gly Leu Glu Arg Arg Ile Glu Lys
485 490
<210> 2
<211> 1482
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> DNA suquence of a wild type of hexuronate C4-epimerase
<400> 2
atgaaactgc tggaagagtt cctgaaagct ttcccgggca gatttaaggt gtatggcagc 60
agcctgcgca ttattaccga ttcctatttc tttctgggaa atgatggaaa agaaaaactg 120
ctgtttgtgg tggggaagaa aggcatttgt cagctgttcg atgggcagaa gattggccag 180
atagggagca atgacgttct gatgtgcaag aaaacgcatg aaaacctgct ggccctgcgc 240
aagatcatca atctgaaccc gaccaccata aataaaaaag cgagctttgg ctttggcgac 300
cgcattggcc tcgcaacccc tgcacacgct aaagtggcga aagattttga ggtatttccg 360
atttttgcac agcagagcgt gcgggaactg agcagaaccg gccgcaccta taaggacgta 420
cttgatgatg ccgtctgggg cgtttttgaa agcggctata actttgaatt cggcgctgat 480
gctgatcacg ttaaagagat cgaagatctg gaaaaagcat ccaatgaggg gtttacgatg 540
tatactgtgg atcccagcga ccatattaag gacgtgtcga aactgagtca gaaagagttt 600
caatctctgt atcaagataa caaaattcgg cgagagctgg aaatgcggta cgtcggcaaa 660
ctatacaaat tcaaggattt cgaatttcgc atgacagatg aagagttcgc cgagatcttt 720
gttacttata tcgatgctat tgaacatgtc tgcaaatgtt acgatgtact aaaagccaaa 780
ggcaaacctt ttgattttga agtgagcatt gatgagaccg cggtcccaac gaccccactg 840
gcccatattt ttatcgtgaa agagctgcgc cgacgcggca tagacttcaa aaccttagca 900
ctgcgcttta gcggcgaatg gcaaaagggc atcgattaca tcggcgatat ggaaatgttt 960
aggaaagaaa ttatcaccca ttcaaaaatt tcgaaagaac tggggggcta taagctgagc 1020
ctccatagcg gctccgataa gtttagcgtt tatccgattt tctcggaggc gacggaaggc 1080
gagtttcatg tgaaaaccgc gggcacgaat tatctggaag caattcgcgt ggtagccgtg 1140
aaagaccctg agctgtatcg tgaaatacac aaattcgcgc tgaccaagtt cgagcaagac 1200
cgcaaaagct accatgtgac caccgatctg agcaaaatac cagacgtgga caagatgaag 1260
aatgaagagt tggtcaaact gttagacatg ccggacagcc gccagctgat acatatcacc 1320
tatggcagcg tgctcaccgc gaaggatgaa aacggccgct ggctgtttaa agagcgcata 1380
ctgaaagtcc tgcaggaaaa tgaagacctg cattacgatt tcgttgaaaa acacatgcgc 1440
aaacacctga gcttactggg cctggaacgc cgcattgaaa aa 1482
<210> 3
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A variant of hexuronate C4-epimerase
<400> 3
Met Lys Leu Leu Glu Glu Phe Leu Lys Ala Phe Pro Gly Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ser Ser Leu Arg Ile Ile Thr Asp Ser Tyr Phe Phe Leu
20 25 30
Gly Asn Asp Gly Lys Glu Lys Leu Leu Phe Val Val Gly Lys Lys Gly
35 40 45
Ile Cys Gln Leu Phe Asp Gly Gln Lys Ile Gly Gln Ile Gly Ser Asn
50 55 60
Asp Val Leu Met Cys Lys Lys Thr His Glu Asn Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Lys Ile Ile Asn Leu Asn Pro Thr Thr Asp Asn Lys Lys Ala Ser Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Asp Arg Ile Gly Leu Ala Thr Pro Ala His Ala Lys Val
100 105 110
Ala Lys Asp Phe Glu Val Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg
115 120 125
Glu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr Tyr Lys Asp Val Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Val Trp Gly Val Phe Glu Ser Gly Tyr Asn Phe Glu Phe Gly Ala Asp
145 150 155 160
Ala Asp His Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Ser Asn Glu
165 170 175
Gly Phe Thr Met Tyr Thr Val Asp Pro Ser Asp His Ile Lys Asp Val
180 185 190
Ser Lys Leu Ser Gln Lys Glu Phe Gln Ser Leu Tyr Gln Asp Asn Lys
195 200 205
Ile Arg Arg Glu Leu Glu Met Arg Tyr Val Gly Lys Leu Tyr Lys Phe
210 215 220
Lys Asp Phe Glu Phe Arg Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Glu Ile Phe
225 230 235 240
Val Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Glu His Val Cys Lys Cys Tyr Asp Val
245 250 255
Leu Lys Ala Lys Gly Lys Pro Phe Asp Phe Glu Val Ser Ile Asp Glu
260 265 270
Thr Ala Val Pro Thr Thr Pro Leu Ala His Ile Phe Ile Val Lys Glu
275 280 285
Leu Arg Arg Arg Gly Ile Asp Phe Lys Thr Leu Ala Leu Arg Phe Ser
290 295 300
Gly Glu Trp Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Ile Gly Asp Met Glu Met Phe
305 310 315 320
Arg Lys Glu Ile Ile Thr His Ser Lys Ile Ser Lys Glu Leu Gly Gly
325 330 335
Tyr Lys Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro
340 345 350
Ile Phe Ser Glu Ala Thr Glu Gly Glu Phe His Val Lys Thr Ala Gly
355 360 365
Thr Asn Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Val Val Ala Val Lys Asp Pro Glu
370 375 380
Leu Tyr Arg Glu Ile His Lys Phe Ala Leu Thr Lys Phe Glu Gln Asp
385 390 395 400
Arg Lys Ser Tyr His Val Thr Thr Asp Leu Ser Lys Ile Pro Asp Val
405 410 415
Asp Lys Met Lys Asn Glu Glu Leu Val Lys Leu Leu Asp Met Pro Asp
420 425 430
Ser Arg Gln Leu Ile His Ile Thr Tyr Gly Ser Val Leu Thr Ala Lys
435 440 445
Asp Glu Asn Gly Arg Trp Leu Phe Lys Glu Arg Ile Leu Lys Val Leu
450 455 460
Gln Glu Asn Glu Asp Leu His Tyr Asp Phe Val Glu Lys His Met Arg
465 470 475 480
Lys His Leu Ser Leu Leu Gly Leu Glu Arg Arg Ile Glu Lys
485 490
<210> 4
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of a variant of hexuronate C4-epimerase
<400> 4
atgaaactgc tggaagagtt cctgaaagct ttcccgggca gatttaaggt gtatggcagc 60
agcctgcgca ttattaccga ttcctatttc tttctgggaa atgatggaaa agaaaaactg 120
ctgtttgtgg tggggaagaa aggcatttgt cagctgttcg atgggcagaa gattggccag 180
atagggagca atgacgttct gatgtgcaag aaaacgcatg aaaacctgct ggccctgcgc 240
aagatcatca atctgaaccc gaccaccgat aataaaaaag cgagctttgg ctttggcgac 300
cgcattggcc tcgcaacccc tgcacacgct aaagtggcga aagattttga ggtatttccg 360
atttttgcac agcagagcgt gcgggaactg agcagaaccg gccgcaccta taaggacgta 420
cttgatgatg ccgtctgggg cgtttttgaa agcggctata actttgaatt cggcgctgat 480
gctgatcacg ttaaagagat cgaagatctg gaaaaagcat ccaatgaggg gtttacgatg 540
tatactgtgg atcccagcga ccatattaag gacgtgtcga aactgagtca gaaagagttt 600
caatctctgt atcaagataa caaaattcgg cgagagctgg aaatgcggta cgtcggcaaa 660
ctatacaaat tcaaggattt cgaatttcgc atgacagatg aagagttcgc cgagatcttt 720
gttacttata tcgatgctat tgaacatgtc tgcaaatgtt acgatgtact aaaagccaaa 780
ggcaaacctt ttgattttga agtgagcatt gatgagaccg cggtcccaac gaccccactg 840
gcccatattt ttatcgtgaa agagctgcgc cgacgcggca tagacttcaa aaccttagca 900
ctgcgcttta gcggcgaatg gcaaaagggc atcgattaca tcggcgatat ggaaatgttt 960
aggaaagaaa ttatcaccca ttcaaaaatt tcgaaagaac tggggggcta taagctgagc 1020
ctccatagcg gctccgataa gtttagcgtt tatccgattt tctcggaggc gacggaaggc 1080
gagtttcatg tgaaaaccgc gggcacgaat tatctggaag caattcgcgt ggtagccgtg 1140
aaagaccctg agctgtatcg tgaaatacac aaattcgcgc tgaccaagtt cgagcaagac 1200
cgcaaaagct accatgtgac caccgatctg agcaaaatac cagacgtgga caagatgaag 1260
aatgaagagt tggtcaaact gttagacatg ccggacagcc gccagctgat acatatcacc 1320
tatggcagcg tgctcaccgc gaaggatgaa aacggccgct ggctgtttaa agagcgcata 1380
ctgaaagtcc tgcaggaaaa tgaagacctg cattacgatt tcgttgaaaa acacatgcgc 1440
aaacacctga gcttactggg cctggaacgc cgcattgaaa aa 1482
<210> 5
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A variant of hexuronate C4-epimerase
<400> 5
Met Lys Leu Leu Glu Glu Phe Leu Lys Ala Phe Pro Gly Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ser Ser Leu Arg Ile Ile Thr Asp Ser Tyr Phe Phe Leu
20 25 30
Gly Asn Asp Gly Lys Glu Lys Leu Leu Phe Val Val Gly Lys Lys Gly
35 40 45
Ile Cys Gln Leu Phe Asp Gly Gln Lys Ile Gly Gln Ile Gly Ser Asn
50 55 60
Asp Val Leu Met Cys Lys Lys Thr His Glu Asn Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Lys Ile Ile Asn Leu Asn Pro Thr Thr Ile Asn Lys Lys Ala Ser Phe
85 90 95
Gly Phe Gly Asp Arg Ile Gly Leu Ala Thr Pro Ala His Ala Lys Val
100 105 110
Ala Lys Asp Phe Glu Val Phe Pro Ile Phe Ala Gln Gln Ser Val Arg
115 120 125
Glu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Thr Tyr Lys Asp Val Leu Asp Asp Ala
130 135 140
Val Trp Gly Val Phe Glu Ser Gly Tyr Asn Phe Glu Phe Gly Ala Asp
145 150 155 160
Ala Asp His Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu Glu Lys Ala Ser Asn Glu
165 170 175
Gly Phe Thr Met Tyr Thr Val Asp Pro Ser Asp His Ile Lys Asp Val
180 185 190
Ser Lys Leu Ser Gln Lys Glu Phe Gln Ser Leu Tyr Gln Asp Asn Lys
195 200 205
Ile Arg Arg Glu Leu Glu Met Arg Tyr Val Gly Lys Leu Tyr Lys Phe
210 215 220
Lys Asp Phe Glu Phe Arg Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Glu Ile Phe
225 230 235 240
Val Thr Tyr Ile Asp Ala Ile Glu His Val Cys Lys Cys Tyr Asp Val
245 250 255
Leu Lys Ala Lys Gly Lys Pro Phe Asp Phe Glu Val Ser Ile Asp Glu
260 265 270
Thr Ala Val Pro Thr Thr Pro Leu Ala His Ile Phe Ile Val Lys Glu
275 280 285
Leu Arg Arg Arg Gly Ile Asp Phe Lys Thr Leu Ala Leu Arg Phe Ser
290 295 300
Gly Glu Trp Gln Lys Gly Ile Asp Tyr Ile Gly Asp Met Glu Met Phe
305 310 315 320
Arg Lys Glu Ile Ile Thr His Ser Lys Ile Ser Lys Glu Leu Gly Gly
325 330 335
Tyr Lys Leu Ser Leu His Ser Gly Ser Asp Lys Phe Ser Val Tyr Pro
340 345 350
Ile Phe Ser Glu Ala Thr Glu Gly Glu Phe His Val Lys Thr Ser Gly
355 360 365
Thr Asn Tyr Leu Glu Ala Ile Arg Val Val Ala Val Lys Asp Pro Glu
370 375 380
Leu Tyr Arg Glu Ile His Lys Phe Ala Leu Thr Lys Phe Glu Gln Asp
385 390 395 400
Arg Lys Ser Tyr His Val Thr Thr Asp Leu Ser Lys Ile Pro Asp Val
405 410 415
Asp Lys Met Lys Asn Glu Glu Leu Val Lys Leu Leu Asp Met Pro Asp
420 425 430
Ser Arg Gln Leu Ile His Ile Thr Tyr Gly Ser Val Leu Thr Ala Lys
435 440 445
Asp Glu Asn Gly Arg Trp Leu Phe Lys Glu Arg Ile Leu Lys Val Leu
450 455 460
Gln Glu Asn Glu Asp Leu His Tyr Asp Phe Val Glu Lys His Met Arg
465 470 475 480
Lys His Leu Ser Leu Leu Gly Leu Glu Arg Arg Ile Glu Lys
485 490
<210> 6
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of a variant of hexuronate C4-epimerase
<400> 6
atgaaactgc tggaagagtt cctgaaagct ttcccgggca gatttaaggt gtatggcagc 60
agcctgcgca ttattaccga ttcctatttc tttctgggaa atgatggaaa agaaaaactg 120
ctgtttgtgg tggggaagaa aggcatttgt cagctgttcg atgggcagaa gattggccag 180
atagggagca atgacgttct gatgtgcaag aaaacgcatg aaaacctgct ggccctgcgc 240
aagatcatca atctgaaccc gaccaccata aataaaaaag cgagctttgg ctttggcgac 300
cgcattggcc tcgcaacccc tgcacacgct aaagtggcga aagattttga ggtatttccg 360
atttttgcac agcagagcgt gcgggaactg agcagaaccg gccgcaccta taaggacgta 420
cttgatgatg ccgtctgggg cgtttttgaa agcggctata actttgaatt cggcgctgat 480
gctgatcacg ttaaagagat cgaagatctg gaaaaagcat ccaatgaggg gtttacgatg 540
tatactgtgg atcccagcga ccatattaag gacgtgtcga aactgagtca gaaagagttt 600
caatctctgt atcaagataa caaaattcgg cgagagctgg aaatgcggta cgtcggcaaa 660
ctatacaaat tcaaggattt cgaatttcgc atgacagatg aagagttcgc cgagatcttt 720
gttacttata tcgatgctat tgaacatgtc tgcaaatgtt acgatgtact aaaagccaaa 780
ggcaaacctt ttgattttga agtgagcatt gatgagaccg cggtcccaac gaccccactg 840
gcccatattt ttatcgtgaa agagctgcgc cgacgcggca tagacttcaa aaccttagca 900
ctgcgcttta gcggcgaatg gcaaaagggc atcgattaca tcggcgatat ggaaatgttt 960
aggaaagaaa ttatcaccca ttcaaaaatt tcgaaagaac tggggggcta taagctgagc 1020
ctccatagcg gctccgataa gtttagcgtt tatccgattt tctcggaggc gacggaaggc 1080
gagtttcatg tgaaaaccag cggcacgaat tatctggaag caattcgcgt ggtagccgtg 1140
aaagaccctg agctgtatcg tgaaatacac aaattcgcgc tgaccaagtt cgagcaagac 1200
cgcaaaagct accatgtgac caccgatctg agcaaaatac cagacgtgga caagatgaag 1260
aatgaagagt tggtcaaact gttagacatg ccggacagcc gccagctgat acatatcacc 1320
tatggcagcg tgctcaccgc gaaggatgaa aacggccgct ggctgtttaa agagcgcata 1380
ctgaaagtcc tgcaggaaaa tgaagacctg cattacgatt tcgttgaaaa acacatgcgc 1440
aaacacctga gcttactggg cctggaacgc cgcattgaaa aa 1482
Claims (7)
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 또는 367번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체로써,
상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 아미노산인 이소류신(Ile)이 아스파르트산(Asp)으로 치환된 서열번호 3의 서열로 이루어지는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체. - 서열번호 1의 아미노산 서열 중 90번째 또는 367번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체로써,
상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 367번째 아미노산인 알라닌(Ala)이 세린(Ser)으로 치환된 서열번호 5의 서열로 이루어지는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체는 슈도써모토가 써마룸(Pseudothermotoga thermarum) 유래인 것을 특징으로 하는 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체.
- 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 따른 헥수론산 C4-에피머화 효소 변이체를 암호화하는 핵산.
- 제5항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제6항의 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180159870A KR102131638B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180159870A KR102131638B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200072098A KR20200072098A (ko) | 2020-06-22 |
| KR102131638B1 true KR102131638B1 (ko) | 2020-07-08 |
Family
ID=71142341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180159870A KR102131638B1 (ko) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102131638B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022090272A (ja) | 2020-12-07 | 2022-06-17 | 株式会社ディスコ | ウエーハ生成装置 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018521653A (ja) * | 2015-07-29 | 2018-08-09 | シージェイ チェルジェダン コーポレイション | 転換活性が高められたヘキスロン酸ｃ４−エピメラーゼ変異体及びこれを用いたｄ−タガトースの製造方法 |
| KR101905469B1 (ko) * | 2016-07-29 | 2018-10-10 | 씨제이제일제당 주식회사 | D-타가토스 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 제조 방법 |
| KR101978464B1 (ko) | 2016-09-07 | 2019-05-14 | 주식회사 삼양사 | 프럭토스 4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스 제조 |
| KR101883351B1 (ko) * | 2016-12-20 | 2018-07-30 | (주)케비젠 | 과당에서 타가토스를 생산하는 능력이 개선된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 |
-
2018
- 2018-12-12 KR KR1020180159870A patent/KR102131638B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200072098A (ko) | 2020-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20170141176A (ko) | 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 제조 방법 | |
| US20220235335A1 (en) | Glycosyltransferase Mutant and Use Therefor | |
| KR101946157B1 (ko) | D-타가토스 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 d-타가토스의 제조 방법 | |
| KR20140080282A (ko) | Ｄ-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법 | |
| KR101455624B1 (ko) | 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 | |
| KR101807507B1 (ko) | D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 d-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법 | |
| US10415021B2 (en) | Mutated fucosidase | |
| Schäper et al. | A bifunctional UDP-sugar 4-epimerase supports biosynthesis of multiple cell surface polysaccharides in Sinorhizobium meliloti | |
| KR20160108375A (ko) | 개량형 β-프룩토프라노시다아제 | |
| KR102131638B1 (ko) | 과당으로부터 타가토스로의 전환 활성이 향상된 헥수론산 c4-에피머화 효소 변이체 | |
| KR102123012B1 (ko) | 기능성 감미료의 제조방법 | |
| JP2023506154A (ja) | アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びそれを利用したアルロースの製造方法 | |
| KR101708974B1 (ko) | 신규한 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법 | |
| KR101768748B1 (ko) | 변이된 수크로스이성화효소 및 이의 제조방법 | |
| KR102212488B1 (ko) | 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법 | |
| CN114591939A (zh) | 一种高耐热d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用 | |
| KR102232837B1 (ko) | 글루코실글리세롤 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 글루코실글리세롤 제조방법 | |
| US8691535B2 (en) | Sucrose mutase with improved product specificity | |
| CN113302299A (zh) | 阿洛酮糖差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产阿洛酮糖的方法 | |
| JP7445947B2 (ja) | アラビノースイソメラーゼ変異体 | |
| WO2023058637A1 (ja) | 改良型β－フルクトフラノシダーゼ | |
| KR101617526B1 (ko) | 활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 l-굴로스의 생산 | |
| KR101764840B1 (ko) | 내열성 균주 유래의 효소를 이용한 알로스의 제조방법 | |
| ES2906870T3 (es) | Nuevas glucosa isomerasas mejoradas | |
| KR102232839B1 (ko) | 투라노스 생산 활성을 가지는 신규한 폴리펩티드 및 이를 이용한 투라노스 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GRNT | Written decision to grant |