KR101807507B1 - D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 d-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법 - Google Patents

D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 d-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물, 및 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 포함하는 D-사이코스 생산용 조성물 및 상기 (a)에 상기 (b)를 첨가하는 단계를 포함하는 D-과당에서 D-사이코스를 제조하는 방법 또는 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 D-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 D-사이코스의 제조 방법{Composition for preparing D-psicose comprising D-psicose 3-epimerase and salt, and method for preparing D-psicose using the same}
본 출원은 D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 D-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 D-사이코스의 제조 방법에 관한 것이다.
D-사이코스는 무화과, 건포도와 같은 과일 및 당밀이나 포도당의 이성화 반응 과정 중에 극소량 존재하는 천연당으로 설탕 대비 70%의 감미도를 가진 단당류다. D-사이코스는 과당이나 설탕과는 달리 인체 내에서 대사되지 않아 칼로리가 거의 없으며, 체지방 형성 억제 작용으로 체중 증가에 영향이 적고 지질합성에 관여하는 효소의 활성을 억제하여 복부 비만을 감소시키는 효능이 보고되어 있다(Matuo, T. et al.,Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10, 223-237, 2001 ; Matsuo. T. and K. Izumori. AsiaPac. J. Clin. Nutr., 13, S127, 2004). 또한, 최근에는 D-사이코스가 혈당상승에 영향이 없고, 비우식 및 항우식 기능으로 치아건강에 도움을 준다는 사실도 알려졌다.
이에, D-사이코스는 감미료로서의 관심이 높아지고 있으나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 생산하는 기술의 개발이 필요하다.
종래의 사이코스 생산 방법은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법과 D-사이코스 3-에피머화 효소를 이용하여 과당에서 사이코스를 생산하는 생물학적 방법이 있다. 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 중에 사이코스가 매우 소량 존재하며 비용 및 부산물이 많이 생성된다는 단점이 있으며, 생물학적인 방법 역시 수율이 매우 낮고 생산비용이 높다는 것이 문제가 되고 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 본 출원 이전 포도당을 과당으로 이성화한 후, 이를 D-사이코스 3-에피머화 효소를 생산하는 고정화 균체와 반응시켜 D-사이코스를 경제적으로 생산하는 방법을 보고하였다(대한민국 특허출원 제10-2009-0118465호). 또한, 이렇게 생산된 D-사이코스를 에탄올 등 유기용매를 사용하지 않고, 경제적으로 D-사이코스를 제조하며, 제조 공정 중 흐름성 및 제품으로서의 상품성을 가진 결정상태의 순수한 D-사이코스를 제조하는 방법을 보고한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2010-0027546호).
그러나 상기 D-사이코스 3-에피머화 효소(이하, '사이코스 에피머화 효소'로 기재)를 이용한 D-사이코스 생산 방법(이하, '효소 전환방법'으로 기재)으로는 여전히 수율의 한계가 존재하는바, 산업적 대량 생산을 위한 생산 수율을 높이고, 제조원가를 낮추기 위해 사이코스 에피머화 효소에 의한 과당에서 D-사이코스로의 전환율 상승을 위한 노력이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 사이코스 에피머화 효소에 의한 과당에서 D-사이코스로의 전환율을 개선할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 효소 전환방법에 알루민산염(aluminate) 또는 요오드산염(iodate)을 이용하는 경우 상기 전환율을 현저하게 상승시킬 수 있음을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물, 및 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 포함하는, D-사이코스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은, (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-과당에서 D-사이코스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-사이코스 3-에피머화 효소의 D- 과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 일 양태로서 (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물, 및 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 포함하는 D-사이코스 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소(이하, '사이코스 에피머화 효소'로 기재)는 D-과당을 D-사이코스로 에피머화시키는 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 단백질을 내재적으로 발현하는 균주, 상기 단백질을 발현하도록 형질 전환된 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 상기 배양물로부터 분리된 단백질을 사이코스 에피머화 효소로 사용할 수 있다.
본 출원의 일 구현예로, 본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 카이스티아 그래뉼리(Kaistia granuli) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소 또는 이의 변이체일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 유전적 상동성을 갖는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지는 아미노산 서열로서, 사이코스 에피머화 효소 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열도 본 출원의 아미노산 서열 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 더욱 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상응성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 또한, 상동성은 상동 영역간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태는 슈퍼패밀리 유래 단백질(예, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 다른 종 유래의 상동 단백질(예, 미오신 경쇄 등)을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 단백질의 염기 서열이나 아미노산 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 말한다. 하나의 구체예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩티드 매치가 적어도 70%(일 구현예에 따르면, 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동인 서열은 데이터 은행에서 사용되는 표준 소프트웨어를 사용하거나, 예를 들면 특정한 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이다(예. Sambrook et al., 1989, infra 참고).
본 출원의 다른 구현예로, 본 출원의 균주는 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주는 상기 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 미생물이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11046P (대한민국 공개특허 제10-2011-0035805호), KCCM11204P (대한민국 등록특허 제10-1203856호), KCCM11403P (대한민국 등록특허 제10-1455759호) 또는 KCCM11918P (대한민국 출원번호 제10-2016-0152947호)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 사이코스 에피머화 효소는 기질인 D-과당과 혼합하거나, D-과당을 첨가하여 사용하거나, D-과당에 첨가하여 사용하거나, 상기 효소 자체 또는 상기 효소를 발현하는 균주를 담체에 고정화시켜 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용될 수 있는 담체의 예로는, 아가, 아가로스, k-카라기난, 알지네이트 또는 키토산이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물은 D-과당을 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 D-과당은 0.01 M 내지 10 M, 0.01 M 내지 5 M, 0.01 M 내지 3 M, 0.05 내지 10 M, 0.05 내지 5 M, 0.05 내지 3 M, 0.08 내지 10 M, 0.08 M 내지 5 M, 0.08 M 내지 3 M, 또는 0.1 M 내지 2.8 M의 과당일 수 있다. 본 출원의 염은, 염과 과당의 몰(M) 비율(염의 몰:과당의 몰)이 1:0.01 내지 1, 1:0.05 내지 1, 1:0.1 내지 1, 1:0.1 내지 0.8, 1:0.1 내지 0.6 또는 1:0.2 내지 0.6이 되도록 사용할 수 있다. 염의 몰 비율을 상기 범위로 하면, D-사이코스로의 전환율을 최적 범위로 유지할 수 있다.
본 출원의 조성물을 이용한 경우의 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율은, 본 출원의 염 부재시의 전환율 보다 1.5배 내지 5.0배, 1.8배 내지 5.0배, 2.0배 내지 5.0배, 1.5 내지 3.0배, 1.8배 내지 3.0배, 2.0배 내지 3.0배 증가할 수 있다.
본 출원의 조성물은, 임의로, 사이코스 생산을 촉진하거나 보조할 수 있는 임의의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 성분으로는, 예컨대 망간, 마그네슘, 철, 코발트 및/또는 알루미늄 등과 같은 금속 이온 물질 또는 금속염을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 금속염은 NiSO4, NiCl2, CoCl2, MnCl2, MnSO4 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 금속 이온 물질 또는 금속염은, 0.5 내지 10 mM, 0.5 내지 5 mM 또는 0.5 내지 3 mM로 첨가될 수 있다.
본 출원은 다른 양태로, (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-과당에서 D-사이코스를 제조방법을 제공한다. 본 출원의 또 다른 양태는, (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-사이코스 3-에피머화 효소의 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 출원의 양태에 따른 D-과당에서 D-사이코스를 제조하는 방법 및 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법에 대해 설명한다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 D-과당은 설탕의 가수분해에 의해 제조되거나, 포도당을 이성질화하여 제조된 것일 수 있다. 이를 통해, 프럭토스, 설탕 및 포도당과 같이 보편화되고 저렴한 원료를 사용하여 높은 수율로 D-사이코스를 제조할 수 있어 사이코스의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 단계 (a) 이전, 포도당을 이성질화하여 D-과당을 얻는 단계 (pre-a)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 단계 (pre-a)는 포도당을 이성질화하는 활성을 가진 단백질(예컨대, 글루코스 아이소머라아제 또는 포스포글루코 아이소머라아제)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 염의 첨가 이전, 이후 또는 동시에 D-과당을 첨가하는 단계 (c)를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 본 출원의 염의 첨가와 동시에 D-과당을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 염과 상기 D-과당이 혼합되지 않은 상태에서 별도로 동시에 첨가할 수 있고, 또는 상기 염과 상기 D-과당을 혼합하여 동시에 첨가할 수 있다.
본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 염의 첨가 이전, 이후 또는 동시에 임의의 사이코스 생산을 촉진하거나 보조할 수 있는 성분을 첨가하는 단계 (c')를 추가적으로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 성분은 금속 이온 물질(예컨대, 망간, 마그네슘, 철, 코발트 및/또는 알루미늄 등) 또는 금속염일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 금속염은 NiSO4, NiCl2, CoCl2, MnCl2, MnSO4 및 ZnSO4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 상기 단계 (b), (c) 또는 (c') 이후 D-과당의 에피머화 반응을 실시하는 단계 (d)를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 출원의 반응은 pH 7 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 7.8 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 8.5, pH 7.8 내지 8.5, pH 7.8 내지 8.3 또는 pH 8.0에서 실시할 수 있다. 또한, 본 출원의 반응은 30 내지 65℃, 40 내지 65℃, 50 내지 65℃, 50 내지 60℃, 53 내지 57℃ 또는 55℃의 온도에서 실시할 수 있다. 더불어, 본 출원의 반응은 2 시간 이상 또는 3 시간 이상 및/또는 16시간 이하, 24시간 이하, 36 시간 이하, 또는 48 시간 이하 동안 실시할 수 있다.
본 출원의 또 다른 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 단계 (b), (c), (c') 또는 (d) 이후 D-사이코스를 분리 및/또는 정제하는 단계 (e)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 정제 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본 출원의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 분별 결정, 이온 정제, 투석, 침전, 흡착 및 전기영동 등을 들 수 있다. 상기 정제 방법은 하나만 실시될 수도 있으며, 두 가지 이상의 방법을 함께 실시할 수도 있다. 예를 들어, 크로마토그래피를 통해 D-사이코스를 정제할 수 있으며, 상기 크로마토그래피에 의한 당의 분리는 분리하고자 하는 당과 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 정제하는 단계의 전 또는 후에 탈색, 탈염 또는 이의 조합을 실시하는 단계 (f)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 탈색 및/또는 탈염을 실시함으로써, 불순물 없이 보다 정제된 D-사이코스를 얻을 수 있다.
본 출원의 또 다른 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 단계 (b), (c), (c'), (d), (e) 또는 (f) 이후 D-사이코스를 결정화하는 단계 (g)를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 결정화 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 통상적으로 사용하는 결정화 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 냉각결정화 방법을 이용한 결정화 방법을 사용할 수 있다. 상기 결정화 단계를 통해, 최종적으로 정제된 D-사이코스를 고수율로 얻을 수 있다.
본 출원의 어떠한 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 결정화하는 단계 전에 수득한 D-사이코스 액을 농축시키는 단계 (pre-g)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 농축은 정제된 D-사이코스의 농도를 약 2.5 내지 3배로 농축하는 것일 수 있으며, 상기 농축시키는 단계를 통해 보다 효율적으로 결정화를 할 수 있다.
본 출원의 또 다른 구현예에 따르면, 본 출원의 방법은 각각, 본 출원의 정제 단계 (e) 이후 미반응된 D-과당 에피머화시키는 단계 (d)에 재사용하거나, 본 출원의 결정화 단계 (g) 이후 결정이 분리된 모액을 상기 정제 단계 (e)에 재사용하거나, 또는 이의 조합을 실시하는 단계 (h)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계를 통해 D-사이코스를 더욱 고수율로 수득할 수 있으며 버려지는 D-과당의 양을 절감할 수 있어 경제적 이점이 있다.
본 출원의 D-과당에서 D-사이코스를 제조하는 방법 및 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법은 본 출원의 D-사이코스 생산용 조성물과 효소, 균주, 배양물 및 염을 공통으로 하는바, 공통된 사항에 대하여 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 D-사이코스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경친화적이며, 효소반응 전환율 증대를 위해 간단히 알루민산염(aluminate), 요오드산염(iodate) 등을 첨가함으로써 이전에 비해 생산 수율이 현저하게 증가되므로 생산 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 본 출원의 비교예 1의 D-과당에서 D-사이코스로의 D-사이코스 3-에피머화 효소 전환반응, 실시예 1-1(도 1a는 D-과당 농도: 0.1 M, 도 1b는 D-과당 농도 1.7 M, 도 1c는 D-과당 농도: 2.8 M) 및 실시예 1-2(도 1d)의 알루민산염 첨가하여 효소 전환반응 시의 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 2는 본 출원의 비교예 2의 D-과당에서 D-사이코스로의 D-사이코스 3-에피머화 효소 전환반응, 실시예 2-1(도 2a) 및 실시예 2-2(도 2b)의 요오드산염 첨가하여 효소 전환반응 시의 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 3은 본 출원의 D-사이코스 3-에피머화 효소 반응 시 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율(%)을 나타낸 그래프이다. 도 3a는 비교예 1, 실시예 1-1 및 2-1에 대한 그래프이고, 도 3b는 비교예 2, 실시예 1-2 및 2-2에 대한 그래프를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
1. 비교예 : 효소 전환방법을 이용한 D- 사이코스 생산
비교예 1
아그로박테리움 투메파시엔스 유래 사이코스 에피머화 효소의 변이체를 발현하는 재조합 균주로 공지(대한민국 등록특허 제10-1455759호)되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰(KCCM11403P)을 이용하여 효소 전환반응을 진행하였다. 0.1 M 과당을 물에 용해시킨 후 10 mM MnCl2를 첨가하여 효소 전환반응을 위한 원료를 제조하고, 이에 상기 균주[20 %(w/w)]를 첨가하여 pH 8.0, 55℃ 조건 하에 3시간 동안 반응을 진행하였다.
이후, HPLC 분석을 통해 상기 사이코스 에피머화 효소의 기질(D-과당)과 생성물(D-사이코스)의 피크 면적(area)값을 비교 정량하여 전환율을 계산하였으며, 상기 HPLC 분석은 80℃로 설정된 컬럼(Bio-Rad,Aminex HPX-87C column)에 시료를 주입한 후, 이동상 용매로 물을 0.6 ml/min 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다.
그 결과, 상기 효소전환 방법에 의한 D-사이코스로의 전환율은 25%임을 확인할 수 있었다(표 1).
비교예 2
카이스티아 그래눌리 유래 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 효소 전환반응을 진행하였다. 상기 효소는 서열번호 4의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 재조합 균주[(E. coli BL21(DE3)/KGDPE(KCCM11918P)]를 5 ml LB-암피실린(ampicilline) 배지(Difco)에 각각 접종하여, 600 nm에서 흡광도가 1.5에 도달할 때까지 37°C, 200 rpm에서 진탕배양한 후, 이 배양액을 500 ml LB-암피실린 배지에 접종하여 본 배양을 실시하였다. 이후, D-사이코스 3-에피머화 효소의 과발현 유도를 위하여 600 nm에서 흡광도가 0.7 이 될 때, 0.5 mM IPTG를 첨가하고 16°C, 150 rpm으로 조정하여 16시간 동안 배양하여 효소를 대량 발현시켰다. 발현된 효소의 정제를 위하여, 8000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척한 다음 용해 완충액(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.0 300 mM NaCl)에 혼탁시킨 후 음파진동기를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000 rpm 으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 미리 용해 완충액으로 평형시킨 Ni-NTA컬럼(Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 20 mM 이미다졸(imidazole)과 250 mM 이미다졸이 함유된 완충용액(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.0)을 순차적으로 흘려주어 정제된 효소를 획득하였으며, SDS-PAGE를 통하여 효소의 단량체의 크기가 약 32 kDa임을 확인하였다.
0.1 M 과당을 물에 용해시킨 후, 10 mM MnCl2를 첨가하여 효소 전환반응을 위한 효소반응액을 제조하고, 이에 상기 정제 효소 0.4 mg/ml를 첨가하여 pH 8.0, 55℃ 조건 하에 3시간 동안 반응을 진행하였다.
이후, HPLC 분석을 통해 상기 사이코스 에피머화 효소의 기질(과당)과 생성물(사이코스)의 피크 면적(area)값을 비교 정량하여 전환율을 계산하였으며, 상기 HPLC 분석은 80℃로 설정된 컬럼(Bio-Rad,Aminex HPX-87C column)에 시료를 주입한 후, 이동상 용매로 물을 0.6 ml/min 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다.
그 결과, 상기 효소전환 방법에 의한 D-사이코스로의 전환율은 25%임을 확인할 수 있었다(표 2).
2. 실시예 1: 알루민산염 ( aluminate ) 첨가에 따른 D- 사이코스 생산
실시예 1-1
상기 비교예 1의 과당을 함유하는 원료에 포함되는 과당 농도(0.1 M, 1.7 M 및 2.8 M)를 다양화하고, 상기 각각의 원료에 0.05M, 0.85M, 1.4M 나트륨 알루미네이트 (NaAlO2)를 각각 첨가하여 비교예 1과 동일한 조건 하에 D-사이코스로의 전환반응을 실시하였으며, 전환율 역시 비교예 1과 동일하게 분석하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 알루미늄산염인 나트륨 알루미네이트 첨가 시의 전환율은 과당 농도 0.1M에서 비교예 1의 전환율 대비 268%였으며, 과당 농도를 1.7 M 및 2.8 M로 높인 경우의 전환율 역시 비교예 1의 전환율 대비 각각 268% 및 212%이었으므로, D-사이코스 전환반응에서 알루민산염 첨가 시 D-사이코스 전환율이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 1a 내지 도 1c 및 도 3a 참조).
실시예 1-2
상기 비교예 2의 0.1M 과당을 함유하는 효소반응액에 50 mM 나트륨 알루미네이트(NaAlO2)를 첨가하여 비교예 2와 동일한 조건 하에 D-사이코스로의 전환반응을 실시하였으며, 전환율 역시 비교예 2와 동일하게 분석하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 알루민산염인 나트륨알루미네이트 첨가 시의 전환율은 비교예 1의 전환율 대비 200%였는 바, 실시예 1-1과 마찬가지로 D-사이코스 전환반응에서 알루민산염 첨가 시 D-사이코스 전환율이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 1d 및 도 3b).
비교예 1 비교예 2 실시예 1-1 실시예 1-2
과당농도(M) 0.1 0.1 0.1 1.7 2.8 0.1
염 첨가 농도(M) 0 0 0.05 0.85 1.4 0.05
몰농도 비율 - - 0.5 0.5 0.5 0.5
과당 첨가량 (g/L) 18 18 18 300 500 18
D-사이코스 생성량 (g/L) 4.5 4.5 12 201 265 9
전환율(%) 25 25 67 67 53 50
상대 전환율(%) - - 268 268 212 200
3. 실시예 2: 요오드산염 ( iodate ) 첨가에 따른 D- 사이코스 생산
실시예 2-1
상기 비교예 1에서 0.1M 과당을 함유하는 원료에 25 mM 칼륨 요오데이트(KIO3)를 첨가하여 비교예 1과 동일한 조건 하에 D-사이코스로의 전환반응을 실시하였으며, 전환율 역시 비교예 1과 동일하게 분석하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 요오드산염 첨가 시의 전환율은 비교예 1의 전환율 대비 208%였는 바, D-사이코스 전환반응에서 요오드산염 첨가 시 D-사이코스 전환율이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 2a 및 도 3a 참조).
실시예 2-2
상기 비교예 2에서 0.1M 과당을 함유하는 효소반응액에 25 mM 칼륨 요오데이트(KIO3)를 첨가하여 비교예 1과 동일한 조건 하에 D-사이코스로의 전환반응을 실시하였으며, 전환율 역시 비교예 1과 동일하게 분석하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 요오드산염 첨가 시의 전환율은 비교예 1의 전환율 대비 140%였는 바, D-사이코스 전환반응에서 요오드산염 첨가 시 D-사이코스 전환율이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 2b 및 도 3b).
비교예 1 비교예 2 실시예 2-1 실시예 2-2
과당농도 (M) 0.1 0.1 0.1 0.1
염 첨가 농도 (M) 0 0 0.025 0.025
몰농도 비율 - - 0.25 0.25
과당 첨가량 (g/L) 18 18 18 18
D-사이코스 생성량 (g/L) 4.5 4.5 9.3 6.3
전환율 (%) 25 25 52 35
상대 전환율 (%) - - 208 140
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11918P
수탁일자 : 20161020
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Composition for preparing D-psicose comprising D-psicose 3-epimerase and salt, and method for preparing D-psicose using the same <130> P16-1252 <150> KR 2015/0184869 <151> 2015-12-23 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of the triple-mutant from D-psicose 3-epimerase <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of the double-mutant from D-psicose 3-epimerase <400> 2 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 3 <211> 289 <212> PRT <213> Amino acid sequences of D-psicose 3-epimerase <400> 3 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 4 <211> 297 <212> PRT <213> Amino acid sequence of D-psicose 3-epimerase from Kaistia granuli <400> 4 Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp 1 5 10 15 Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly 20 25 30 Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile 35 40 45 Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp 65 70 75 80 Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr 85 90 95 Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe 100 105 110 Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val 115 120 125 Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr 130 135 140 Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr 145 150 155 160 Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val 165 170 175 Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala 180 185 190 Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr 195 200 205 Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr 210 215 220 Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys 225 230 235 240 Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile 245 250 255 Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg 260 265 270 His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala 275 280 285 Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp 290 295

Claims (5)

  1. (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물, 및 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 포함하는 D-사이코스 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 D-과당을 추가적으로 포함하는, 조성물.
  3. (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-과당에서 D-사이코스를 제조하는 방법.
  4. (a) D-사이코스 3-에피머화 효소, 상기 효소를 발현하는 균주 또는 상기 균주의 배양물에 (b) 알루민산염(aluminate) 및 요오드산염(iodate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염을 첨가하는 단계를 포함하는 D-사이코스 3-에피머화 효소의 D-과당에서 D-사이코스로의 전환율을 증가시키는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 방법은 상기 염의 첨가 이전, 이후 또는 동시에 D-과당을 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.
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