CN109563529A - 包含d-阿洛酮糖3-差向异构酶及盐的用于生成d-阿洛酮糖的组合物以及利用所述组合物生成d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

包含d-阿洛酮糖3-差向异构酶及盐的用于生成d-阿洛酮糖的组合物以及利用所述组合物生成d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于生成D‑阿洛酮糖的组合物，所述组合物包含：(a)D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物；以及(b)选自由铝酸盐及碘酸盐组成的群组的至少一种盐，且本申请涉及一种用于从D‑果糖生成D‑阿洛酮糖的方法或一种增大D‑果糖至D‑阿洛酮糖的转化率的方法，所述方法包括将(b)添加至(a)的步骤。

Description

包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶及盐的用于生成D-阿洛酮糖的 组合物以及利用所述组合物生成D-阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明涉及一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶及盐的用于生成D-阿洛酮糖的组合物以及一种利用所述组合物生成D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种以微量存在于水果(例如，无花果及葡萄干)或糖浆或葡萄糖的异构化产物中的天然糖。D-阿洛酮糖为相对于糖来说甜度为70％的单糖。据报道，D-阿洛酮糖是一种含有较少卡路里或不含卡路里的甜味剂，因为其不进行代谢且因其发挥抑制体脂形成的作用而对体重的增长具有较小影响。据报道，D-阿洛酮糖还抑制在脂质合成中涉及的酶的活性，从而减少腹部肥胖(松尾.T(Matuo.T)等人，亚太地区临床营养学杂志(AsiaPac.J.Clin.Natr.)，10,223-237,2001；松尾.T及K.何森(K.Izumori)，亚太地区临床营养学杂志，13,S127,2004)。根据最近发表的报告，D-阿洛酮糖对高血糖症没有影响且因其无致龋性及抗龋性而有助于牙齿健康。
因此，D-阿洛酮糖作为甜味剂已因其优势而吸引了越来越多的注意。然而，由于D-阿洛酮糖是在自然界中仅以微量存在的稀有单糖，因此需要研发一种可应用于食品行业的用于生产D-阿洛酮糖的高效技术。
用于生产D-阿洛酮糖的传统方法被分为化学方法及生物方法。根据化学方法，基于钼酸盐离子的催化作用自果糖生成阿洛酮糖。化学方法的劣势在于：在对糖浆进行处理或葡萄糖的异构化反应期间仅生成极少量的D-阿洛酮糖，从而产生相当大的成本，且会产生大量的副产物。根据生物方法，利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶从D-果糖生成D-阿洛酮糖。生物方法的问题在于极低的产率及高生产成本。
在致力于解决此类问题时，在本申请提出申请之前，本发明人报告了一种用于经济地生成D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：使葡萄糖异构化为果糖，并使果糖与固定化细菌细胞反应，从而生成D-阿洛酮糖3-差向异构酶(韩国专利申请第10-2009-0118465号)。本发明人还报告了一种无需使用例如乙醇等有机溶剂便可经济地生成处于结晶状态下的纯D-阿洛酮糖的方法。由此方法生成的D-阿洛酮糖在生产期间可流动且具有商业价值(韩国专利申请第10-2010-0027546号)。
然而，利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(也被简单地称为“阿洛酮糖差向异构酶”)生成D-阿洛酮糖的方法(以下，将所述方法简单地称为“酶转化方法”)在产率方面仍受到限制。因此，需要努力增加D-阿洛酮糖的产率用于工业化批量生产并通过阿洛酮糖差向异构酶提高D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率以降低生产成本。
在此种情况下，本发明人认真进行研究以研发出一种利用阿洛酮糖差向异构酶提高D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法，且结果发现在酶转化方法中使用铝酸盐或碘酸盐可显著提高转化率。基于此发现而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种用于生成D-阿洛酮糖的组合物，所述组合物包含：(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物；以及(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
本发明的另一目的是提供一种用于从D-果糖生成D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
本发明的又一目的是提供一种利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法，所述方法包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
技术解决方案
为了实现本发明的上述及其他目的，本发明的一个方面提供一种用于生成D-阿洛酮糖的组合物，所述组合物包含：(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物；以及(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
在本发明的组合物中使用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(以下简单地称为“阿洛酮糖差向异构酶”)可为在D-果糖至D-阿洛酮糖的差向异构化作用中具有活性的任意蛋白质。内源性地表达所述蛋白质的菌株、表达所述蛋白质的所述菌株的转化株、所述菌株的培养物或自所述培养物隔离的蛋白质可被用作阿洛酮糖差向异构酶。
在一个实施例中，阿洛酮糖差向异构酶可为源自致瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或小粒凯斯特亚菌(Kaistia granuli)或其变体的野生型阿洛酮糖差向异构酶。具体来说，阿洛酮糖差向异构酶可为一种与在SEQ ID NO：1、2、3或4中所述的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的同源性的阿洛酮糖差向异构酶。氨基酸序列与在SEQ ID NO：1、2、3或4中所述的氨基酸序列具有同源性且被部分删除、修饰、替换或添加的阿洛酮糖差向异构酶变体也处于本发明的范围内，只要其氨基酸序列在D-果糖至D-阿洛酮糖的差向异构化作用中具有酶活性即可。更具体来说，阿洛酮糖差向异构酶可具有在SEQID NO：1或4中所述的氨基酸序列。
本文中使用的用语“同源性(homology)”是指两个多肽部分之间的同一性百分比。来自一个部分的序列与来自另一个部分的序列之间的对应关系可由所属领域中已知的技术确定。举例来说，同源性可通过利用现成的计算机程序来对齐序列信息并在两个多肽部分之间直接对齐序列信息而获得。同源性也可通过以下方式获得：在同源区域之间形成稳定的双链的条件下对多核苷酸进行杂交，利用单链特异性核酸酶使经杂交的多核苷酸降解，并确定经降解片段的大小。
本文中使用的用语“同源的(homologous)”及其所有的语法形式及拼写变型是指拥有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括来自总科的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)以及来自不同种属的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)。此类蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性，如由其序列相似性所反映。然而，在通常的使用及在本发明中，用语“同源的”在以例如“高度(highly)”等副词修饰时，可指序列相似性且可与或可不与共同进化起源相关。
本文中使用的用语“序列相似性”是指可共享或可不共享共同进化起源的蛋白质的核酸序列或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。在具体实施例中，当至少70％(根据一个实施例为75％、90％、95％、96％、97％或99％)的多肽在两个氨基酸序列的限定长度上匹配时，所述两个氨基酸序列是“实质上同源的”或“实质上相似的”。可通过利用在序列数据库中可获得的标准软件或在例如针对特定系统界定的严格条件下进行的印迹杂交(Southernhybridization)实验中比较序列而辨别实质上同源的序列。界定恰当的杂交条件是在所属领域的技术范围内(参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，引见如下)。
在又一实施例中，表达用于本发明中的阿洛酮糖差向异构酶的菌株可为能够表达对本文中所述的氨基酸序列中的任一者进行编码的基因的任意微生物。具体来说，所述菌株可为谷氨酸棒状杆菌(KCCM11046P，韩国专利公开第10-2011-0035805；KCCM11204P，韩国专利第10-1203856号；KCCM11403P，韩国专利第10-1455759号；或KCCM11918P，韩国专利申请第10-2016-0152947)，但并不仅限于此。
在使用之前，可将阿洛酮糖差向异构酶与D-果糖混合作为基质。作为另外一种选择，在使用之前，可将D-果糖添加至阿洛酮糖差向异构酶，反之亦可。作为另外一种选择，在使用之前，可将酶或表达所述酶的菌株固定于载体(support)上。适用于本发明中的载体的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、鹿角菜胶、褐藻胶及壳聚糖。
本发明的组合物还可包含D-果糖。具体来说，可以0.01M至10M、0.01M至5M、0.01M至3M、0.05M至10M、0.05M至5M、0.05M至3M、0.08M至10M、0.08M至5M、0.08M至3M或0.1M至2.8M的浓度使用D-果糖。可以使得盐对D-果糖的摩尔浓度(M)比处于1:0.01至1:1、1:0.05至1:1、1:0.1至1:1、1:0.1至1:0.8、1:0.1至1:0.6或1:0.2至1:0.6的范围内的量使用盐。在此范围内，D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率可保持在最佳范围内。
与不存在盐的情形相比，在存在盐时，D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率可增大1.5倍至5.0倍、1.8倍至5.0倍、2.0倍至5.0倍、1.5倍至3.0倍、1.8倍至3.0倍或2.0倍至3.0倍。
本发明的组合物还可视情况包含能够促进或辅助生成D-阿洛酮糖的添加剂。所述成分可为例如金属离子(例如，锰、镁、铁、钴和/或铝)或金属盐，但并不仅限于此。所述金属盐是选自由NiSO4、NiCl2、CoCl2、MnCl2、MnSO4、ZnSO4及其混合物组成的群组。可以0.5mM至10mM、0.5mM至5mM或0.5mM至3mM的浓度使用所述金属离子或金属盐。
本发明的另一方面提供一种从D-果糖生成D-阿洛酮糖的方法，所述方法包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。本发明的又一方面提供一种利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法，所述方法包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
现在，将对用于从D-果糖生成D-阿洛酮糖的方法以及用于增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法进行阐述。
根据本发明的一个实施例，可通过蔗糖的水解作用或葡萄糖的异构化作用而生成D-果糖。也就是说，可利用常见且廉价的原材料(例如，果糖、蔗糖及葡萄糖)以高产率生成D-阿洛酮糖，从而使得能够大量生产D-阿洛酮糖。具体来说，在步骤(a)之前，每一方法还可包括(a之前(pre-a))：使D-葡萄糖异构化为D-果糖。在步骤(a之前)，可使用在葡萄糖异构化作用中具有活性的蛋白质。适当的蛋白质的实例包括但不限于葡萄糖异构酶及磷酸葡萄糖异构酶。
根据本发明的一个实施例，每一方法还可包括(c)：在添加盐之前、之后或在添加盐的同时添加D-果糖。根据本发明的一个实施例，每一方法还可包括：在添加盐的同时添加D-果糖。具体来说，可同时分别添加盐及D-果糖。作为另外一种选择，盐可与D-果糖以混合形式添加。
本发明的每一方法还可包括(c’)：添加能够促进或辅助生成阿洛酮糖的添加剂。具体来说，所述添加剂可为金属离子(例如，锰、镁、铁、钴和/或铝)或金属盐。更具体来说，所述金属盐可选自由NiSO4、NiCl2、CoCl2、MnCl2、MnSO4、ZnSO4及其混合物组成的群组。根据本发明的一个实施例，在步骤(b)、(c)或(c’)之后，每一方法还可包括(d)：对D-果糖进行差向异构化。所述反应可在7至9.0的pH下、7.5至9.0的pH下、7.8至9.0的pH下、8.0至9.0的pH下、7.5至8.5的pH下、7.8至8.5的pH下、7.8至8.3的pH下或8.0的pH下进行。所述反应可在30℃至65℃、40℃至65℃、50℃至65℃、50℃至60℃、53℃至57℃或55℃的温度下进行。所述反应可进行至少两个小时、至少三个小时和/或至多16个小时、至多24个小时、至多36个小时或至多48个小时。
根据本发明的另一实施例，在步骤(b)、(c)、(c’)或(d)之后，每一方法还可包括(e)：分离和/或纯化D-阿洛酮糖。对用于纯化D-阿洛酮糖的方法无特别限制。可通过所属领域中已知的任意适当的方法来纯化D-阿洛酮糖。此类纯化方法的非限制性实例包括色谱分析法、分步结晶、离子纯化、透析、沉淀、吸附及电泳，所述方法可独立地或相组合地进行。举例来说，可通过色谱分析法来纯化D-阿洛酮糖。在此种情形中，可基于糖类与贴附至离子树脂的金属离子之间的结合力的差异而分离出目标糖。
根据本发明的每一方法在纯化步骤之前或之后还可包括(f)：漂白和/或脱矿物质处理。漂白和/或脱矿物质处理使得D-阿洛酮糖更纯净且无杂质。
根据本发明的另一实施例，在步骤(b)、(c)、(c’)、(d)、(e)或(f)之后，每一方法还可包括(g)：使D-阿洛酮糖结晶。可使用所属领域中已知的任意适当的结晶方法，对此并无特别限制。举例来说，可在冷却期间使D-阿洛酮糖结晶。作为结晶的结果，可以高产率获得纯化的D-阿洛酮糖。
根据本发明的一个实施例，在结晶之前，每一方法还可包括步骤(g之前(pre-g))：浓缩D-阿洛酮糖溶液。此浓缩使得纯化的D-阿洛酮糖的浓度减小2.5倍至3倍，且使得结晶更高效。
根据本发明的另一实施例，每一方法还可包括(h)：在纯化步骤(e)之后对在差向异构反应步骤(d)中未反应的D-果糖进行再利用和/或对在纯化步骤(e)中结晶步骤(g)之后已自其分离出晶体的母液进行再利用。此种再利用使得能够以更高的产率生产D-阿洛酮糖并减少所浪费的D-果糖的量，因此在经济效益方面是有利的。
用于从D-果糖生成D-阿洛酮糖的方法以及用于增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法与用于生成D-阿洛酮糖的组合物共享酶、菌株、培养物及盐，且因此对其不再进行重复赘述，以免使得本说明书过于复杂。
有利效果
使用源自微生物的酶使得所述用于生成D-阿洛酮糖的方法是环保的。此外，添加铝酸盐或碘酸盐通过酶反应增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率显著增大了D-阿洛酮糖的生产率，因有效地使D-阿洛酮糖的生产最大化。
附图说明
图1示出在比较例1中利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶将D-果糖转化成D-阿洛酮糖时获得的HPLC色谱图以及在实例1-1(图1a：0.1M D-果糖、图1b：1.7M D-果糖以及图1c：2.8M D-果糖)及实例1-2(图1d)中在存在铝酸盐的情况下利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶将D-果糖转化成D-阿洛酮糖时获得的HPLC色谱图。
图2示出在比较例2中利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶将D-果糖转化成D-阿洛酮糖时获得的HPLC色谱图以及在实例2-1(图2a)及实例2-2(图2b)中在存在碘酸盐的情况下利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶将D-果糖转化成D-阿洛酮糖时获得的HPLC色谱图。
图3示出在比较例1及实例1-1及2-1(图3a)以及在比较例2及实例1-2及2-2(图3b)中利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶将D-果糖转化成D-阿洛酮糖的转化率(％)。
具体实施方式
现在将更详细地阐述本发明。本文中未包括的公开内容将由所属领域中的技术人员轻易地认识及理解，因此对其不再进行赘述。
1、比较例：基于酶转化生产D-阿洛酮糖
比较例1
利用谷氨酸棒状杆菌(KCCM11403P)进行酶转化反应，谷氨酸棒状杆菌为已知能够表达源自致瘤农杆菌的阿洛酮糖差向异构酶的变体的组合菌株(参见韩国专利第10-1455759号)。将0.1M D-果糖溶解于水中并向其中添加10mM MnCl2以制备用于酶转化反应的原材料。将菌株(20％w/w)添加至原材料，并使得所述反应在pH 8.0及55℃的温度下进行3小时。
然后，通过在80℃下将样本加载到安美纳斯(Aminex)HPX-87C柱(伯乐公司(Bio-Rad))上并使流动相的水以0.6ml/min的速率流经所述柱而进行HPLC分析。将对应于阿洛酮糖差向异构酶的基质(D-果糖)以及产物(D-阿洛酮糖)的峰值之下的区域进行比较及量化以计算D-果糖的转化率。
作为结果，由酶转化方法得到的至D-阿洛酮糖的转化率为25％(表1)。
比较例2
利用源自小粒凯斯特亚菌的阿洛酮糖差向异构酶进行酶转化反应。所述酶是通过以下步骤生成。首先，在5ml LB-氨苄青霉素培养基(Difco公司)上接种表达SEQ ID NO：4的阿洛酮糖差向异构酶的重组菌株(大肠杆菌BL21(DE3)/KGDPE(KCCM11918P))。将所述接种体在培养箱中在37℃下进行培养，直到达到在600nm下1.5的吸收率。在500ml LB-氨苄青霉素培养基上接种培养肉汤(culture broth)，然后接种主要培养物。当培养物在600nm下的吸收率达到0.7时，添加0.5mM IPTG以诱发D-阿洛酮糖3-差向异构酶的大量表达。在16℃的温度下以150rpm的转速进行搅拌继续培养16小时。为了纯化酶，以8000rpm的转速对培养肉汤进行离心20分钟以收集细菌细胞。以0.85％(w/v)的NaCl对所收集的细菌细胞进行洗涤两次，在裂解缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、pH 7.0、300mM NaCl)中进行悬浮并利用超声波均质机在4℃下进行破坏20分钟。以13,000rpm的转速在4℃下对细胞溶解产物进行离心20分钟。收集上清液，将所述上清液加载到与裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA超流柱(Superflow column)(凯杰公司(Qiagen))上。使含有20mM咪唑的缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、300mM NaCl、pH 7.0)以及含有250mM咪唑的缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、300mM NaCl、pH7.0)依序流经所述柱。在由SDS-PAGE进行确定时，发现酶的单体具有约32kDa的分子量。
将0.1M D-果糖溶解于水中并向其中添加10mM MnCl2以制备用于酶转化反应的酶反应溶液。向酶反应溶液中添加0.4mg/ml的纯化酶。使所述反应在pH 8.0及55℃的温度下进行3小时。
然后，通过在80℃下将样本加载到安美纳斯HPX-87C柱(伯乐公司)上并使流动相的水以0.6ml/min的速率流经所述柱而进行HPLC分析。将对应于阿洛酮糖差向异构酶的基质(D-果糖)以及产物(D-阿洛酮糖)的峰值之下的区域进行比较及量化以计算D-果糖的转化率。
作为结果，由酶转化方法得到的至D-阿洛酮糖的转化率为25％(表2)。
2、实例1：在存在铝酸盐的情况下生产D-阿洛酮糖
实例1-1
除将D-果糖的浓度改变为0.1M、1.7M及2.8M以外，以与比较例1中相同的方式制备了原材料，并将0.05M、0.85M及1.4M铝酸钠(NaAlO2)分别添加至含有0.1M、1.7M及2.8M D-果糖的原材料中。在与比较例1中所述者相同的条件下将D-果糖转化成D-阿洛酮糖。以与比较例1中所述者相同的方式分析D-果糖的转化率。
结果示出于表1中。如自表1可见，在存在铝酸钠的情况下，0.1M D-果糖的转化率比在比较例1中高268％。在存在铝酸钠的情况下，在较高浓度1.7M及2.8M下的D-果糖的转化率分别比在比较例1中高268％及212％，此指示出添加铝酸盐显著地增大了至D-阿洛酮糖的转化率(参见图1a至图1c以及图3a)。
实例1-2
将50mM铝酸钠(NaAlO2)添加至在比较例2中制备的含有0.1M D-果糖的酶反应溶液。在与比较例2中所述者相同的条件下将D-果糖转化成D-阿洛酮糖。以与比较例2中所述者相同的方式分析D-果糖的转化率。
结果示出于表1中。如自表1可见，在存在铝酸钠的情况下，D-果糖的转化率比在比较例1中高200％，此指示出在实例1-1中添加铝酸盐显著地增大了至D-阿洛酮糖的转化率(参见图1d以及图3b)。
[表1]
3、实例2：在存在碘酸盐的情况下生产D-阿洛酮糖
实例2-1
将25mM碘酸钾(KIO3)添加至在比较例1中制备的含有0.1M D-果糖的原材料。在与比较例1中所述者相同的条件下将D-果糖转化成D-阿洛酮糖。以与比较例1中所述者相同的方式分析D-果糖的转化率。
如自表1可见，在存在碘酸钾的情况下，D-果糖的转化率比在比较例1中高208％，此指示出添加碘酸盐显著地增大了至D-阿洛酮糖的转化率(参见图2a以及图3a)。
实例2-2
将25mM碘酸钾(KIO3)添加至在比较例2中制备的含有0.1M D-果糖的原材料。在与比较例1中所述者相同的条件下将D-果糖转化成D-阿洛酮糖。以与比较例1中所述者相同的方式分析果糖的转化率。
如自表1可见，在存在碘酸钾的情况下，D-果糖的转化率比在比较例1中高140％，此指示出添加碘酸盐显著地增大了至D-阿洛酮糖的转化率(参见图2b以及图3b)。
[表2]
尽管已详细阐述了本发明的详情，但对所属领域中的技术人员将显而易见的是这些详情仅为优选的实施例且并不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围由随附权利要求及其等效形式界定。
序列表
<110> CJ 第一制糖
<120> 包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶及盐的用于生成D-阿洛酮糖的组合物以及利用所述组合物生成D-阿洛酮糖的方法
<130> P16-6260
<150> KR 2015/0184869
<151> 2015-12-23
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 289
<212> PRT
<213> 来自D-阿洛酮糖3-差向异构酶的三重突变型的氨基酸序列(Amino acidsequences of the triple-mutant from D-psicose 3-epimerase)
<400> 1
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly
<210> 2
<211> 289
<212> PRT
<213> 来自D-阿洛酮糖3-差向异构酶的双重突变型的氨基酸序列(Amino acidsequences of the double-mutant from D-psicose 3-epimerase)
<400> 2
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly
<210> 3
<211> 289
<212> PRT
<213> 来自D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列(Amino acid sequences of D-psicose 3-epimerase)
<400> 3
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala
1 5 10 15
Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala
65 70 75 80
Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val
85 90 95
Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg
115 120 125
Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly
130 135 140
Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu
145 150 155 160
Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe
195 200 205
His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro
210 215 220
Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala
225 230 235 240
Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met
260 265 270
Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly
275 280 285
Gly
<210> 4
<211> 297
<212> PRT
<213> 来自小粒凯斯特亚菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列(Amino acidsequence of D-psicose 3-epimerase from Kaistia granuli)
<400> 4
Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp
1 5 10 15
Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly
20 25 30
Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile
35 40 45
Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp
65 70 75 80
Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr
85 90 95
Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe
100 105 110
Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val
115 120 125
Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr
130 135 140
Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr
145 150 155 160
Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val
165 170 175
Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala
180 185 190
Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr
195 200 205
Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr
210 215 220
Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys
225 230 235 240
Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile
245 250 255
Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg
260 265 270
His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala
275 280 285
Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp
290 295

Claims (5)

1.一种用于生成D-阿洛酮糖的组合物，包含：(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物；以及(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
2.根据权利要求1所述的组合物，还包括D-果糖。
3.一种用于从D-果糖生成D-阿洛酮糖的方法，包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
4.一种利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶增大D-果糖至D-阿洛酮糖的转化率的方法，包括：于(a)D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述酶的菌株或所述菌株的培养物中添加(b)选自由铝酸盐类及碘酸盐类组成的群组的至少一种盐。
5.根据权利要求3或4所述的方法，还包括在添加所述盐之前、之后或在添加所述盐的同时添加D-果糖。
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