CN110462036A

CN110462036A - 一种新型d-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备d-阿洛酮糖的方法

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Publication number: CN110462036A
Application number: CN201780077035.7A
Authority: CN
Inventors: 金薮珍; 李英美; 金良姬; 金成俌; 朴承源; 赵成捘
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: EP3543336A4; CN110462036B; RU2727903C1; AR110093A1; EP3543336A1; WO2018093153A1; UA126473C2; US11174475B2; KR20180055736A; JP2019535320A; US20200063117A1; KR101919713B1; JP6967599B2; TWI666323B; TW201823456A

Abstract

提供了一种新的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶以及使用该酶制备阿洛酮糖的方法。

Description

一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备D-阿洛酮糖的方法

技术领域

以下公开涉及D-阿洛酮糖3-差向异构酶和使用其制备D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(下文中称为"阿洛酮糖")是一种单糖，已知其是自然界中以非常小的量存在的稀有糖。其热量几乎为零，同时具有将近70％的糖甜度，并且由于其功能如抑制血糖和抑制脂质合成等，作为新的食品成分已经受到了广泛关注。

由于这些特性，阿洛酮糖被考虑在各种食品中用作甜味剂代替糖。然而，由于阿洛酮糖在自然界以非常小的量存在，对有效制备阿洛酮糖的方法的需求日益增加。

一种已知的制备阿洛酮糖的方法包括利用钼酸根离子催化的方法(Bilik,V.,Tihlarik,K.,1973,Reaction of Saccharides Catalyzed by MolybdateIons.IX.Epimerization of Ketohexoses.Chem.Zvesti.28:106–109)，一种通过将乙醇和三乙胺一起加热而由D-果糖制备阿洛酮糖的化学方法(Doner,L.W.,1979,Isomerizationof D-Fructose by Base:Liquid-Chromatographic Evaluation and The Isolation ofD-Psicose.Carbohydr.Res.70:209–216)，和一种使用产生D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物由D-果糖制备阿洛酮糖的生物学方法(韩国专利公开号10-2011-0035805)。通过化学方法制备阿洛酮糖的问题在于，产生大量的副产物，因此，需要进行复杂的纯化。此外，生物方法还存在产率非常低和制备成本高的问题。

在这些情况下，本发明人付出了大量努力来开发一种提高阿洛酮糖的制备产量的方法，并且结果证实，当使用本发明的新的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(下文中称为"阿洛酮糖差向异构酶")时，D-果糖转化为阿洛酮糖的速率(下文中称为从D-果糖转化为阿洛酮糖的转化速率)增加，从而能够显著地提高阿洛酮糖的制备产量，并且完成了本发明。

技术问题

本发明的一个实施方案涉及提供一种新的阿洛酮糖差向异构酶、编码该阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸、包括该多核苷酸的重组载体以及其中导入该载体的微生物。

本发明的另一个实施方案涉及提供一种用于制备D-阿洛酮糖的组合物，其包括阿洛酮糖差向异构酶、表达该阿洛酮糖差向异构酶的微生物或该微生物的培养物，以及一种使用该阿洛酮糖差向异构酶制备D-阿洛酮糖的方法。

技术方案

根据本发明的一个示例性实施方案，提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

在一个示例性实施方案中，该阿洛酮糖差向异构酶可包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多肽。显然，具有将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性和上述同源性的氨基酸序列可以包括这样的情况，其中SEQ ID NO:1的部分氨基酸序列被取代、插入、修饰和/或删除。此外，具有阿洛酮糖差向异构酶活性的多肽也可以包括而不限于由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与编码探针的核苷酸序列的全部或部分的互补序列在严格条件下杂交，所述探针能够从已知基因序列制备，例如本发明的阿洛酮糖差向异构酶。

本文所用的术语"多核苷酸"指多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其中核苷酸单体未经修饰或经修饰，通过共价键形成以长链延伸的核苷酸聚合物。

本文所用的术语"严格条件"指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。所述条件取决于多核苷酸的长度和互补程度。其参数是本领域公知的，并在文献中具体描述(例如，J.Sambrook等，同上)。例如，严格条件可以列举彼此具有80％、90％、95％、97％或99％或更高的高同源性的基因彼此杂交的条件，彼此具有低于其的同源性的基因彼此不杂交的条件，或Southern杂交的一般洗涤条件，即在盐浓度和温度，如60℃、1×SSC、0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更特别是68℃、0.1×SSC、0.1％SDS洗涤一次，特别是洗涤两次到三次的条件。杂交中使用的探针可以是碱基序列的互补序列的一部分。这样的探针可以以含有碱基序列的基因片段为模板，以根据已知序列制备的寡核苷酸为引物，通过PCR来构建。此外，本领域技术人员可以根据需要诸如探针长度的因素，调节洗涤溶液的温度和盐浓度。

本文所用的术语"同源性"指两个多核苷酸或多肽部分之间的相同性百分比。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过已知技术确定。例如，同源性可以通过直接比对两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间的序列信息的参数来确定，例如得分、相同性和相似性等，使用对序列信息分类且容易获得的计算机程序(例如BLAST2.0)进行。此外，多核苷酸之间的同源性可以通过在同源区之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸，然后通过单链特异性核酸酶降解以确定降解片段的大小来确定。

此外，只要蛋白质具有相应于由在本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的阿洛酮糖差向异构酶的活性，可以在SEQ ID NO:1的氨基酸序列之前和之后添加无义序列，或包括天然存在的突变或其沉默突变。包括SEQ ID NO:1的蛋白质也包括在本发明的范围内。

另外，本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可由SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，或与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％同源性的多核苷酸序列编码，但本发明不限于此。此外，明显的是，对于编码本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的多核苷酸，通过密码子简并性，能够翻译成由SEQ ID NO:1氨基酸序列组成的蛋白质或与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸也可包括在本发明的多核苷酸序列范围内。本领域技术人员会理解，使用已知的重组技术，通过取代、添加和/或缺失SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一或多个可以制备编码具有基本相等活性的酶的多核苷酸。

在另一个示例性实施方案中，本发明的阿洛酮糖差向异构酶可衍生自Kaistia属的微生物。具体地，本发明的阿洛酮糖差向异构酶可衍生自Kaistia granuli，更具体而言，可衍生自Kaistia granuli KCTC12575。

在另一个示例性实施方案中，本发明的阿洛酮糖差向异构酶可具有通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量的25kDa至37kDa、27kDa至35kDa或30kDa至35kDa的分子量。

根据本发明的另一个示例性实施方案，提供编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的多核苷酸。

在一个示例性实施方案中，本文提供的多核苷酸可以是由SEQ ID NO:2的碱基序列或与SEQ ID NO:2具有80％、90％、95％、97％或99％或更高的同源性的序列组成的多核苷酸。此外，明显的是，对于本发明提供的多核苷酸，通过密码子简并性，能够翻译成由SEQID NO:1的氨基酸序列组成的蛋白质或与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸也包括在本发明的范围内。

根据本发明的另一个示例性实施方案，提供了一种重组载体，其包括编码本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸。

本发明的重组载体可具有其中使用已知的标准方法将编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸插入到克隆载体或表达载体中的形式。本文所用的术语"克隆载体"涉及能够携带DNA片段进入宿主细胞并使其再生的载体。克隆载体还可以包括聚腺苷酸化信号、转录终止序列和/或多克隆位点。这里，多克隆位点可包括内切核酸酶和限制酶位点中的至少一种。在一个示例性实施方案中，编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸可位于聚腺苷酸化信号和转录终止序列的上游。本文所用的术语"表达载体"涉及所克隆的DNA在合适的宿主中转录和翻译所必需的DNA序列。此外，本文所用的"表达载体"涉及包括与插入物可操作地连接的必需调控元件的基因构建体，使得当插入物存在于受试者细胞中时表达。术语"可操作地连接"是指，一种功能由另一种功能通过多核苷酸上的多核苷酸序列关联调节。使用标准重组DNA技术可以制备和纯化表达载体。表达载体可以包括启动子、起始密码子、编码胞嘧啶差向异构酶的基因和终止密码子中的至少任何一种。

根据本发明的另一个示例性实施方案，提供一种微生物，其中导入了如上所述的重组载体。

在一个示例性实施方案中，导入本发明的重组载体的微生物可以是用包括编码阿洛酮糖差向异构酶的多核苷酸的重组载体或用包括由SEQ ID NO:2的碱基序列组成的多核苷酸的重组载体转化的微生物，所述阿洛酮糖差向异构酶包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

本文所用的术语"转化"是指将基因或包括该基因的重组载体导入宿主细胞，以使该基因能够在宿主细胞中表达。本发明包括任何转化的基因，只要该转化的基因能够在宿主细胞中表达，而不限制其插入宿主细胞的染色体中还是位于宿主细胞的染色体之外。本发明的转化方法包括瞬时转化、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、电注射、化学处理等，但本发明不限于此。能够用重组载体转化的宿主细胞可以包括原核细胞、植物细胞、动物细胞等。可以使用具有高DNA导入效率和导入的DNA的高表达率的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属菌株、棒杆菌属菌株、沙门氏菌属菌株等，例如可以是大肠杆菌如W3110、BL21、JM109、K-12、LE392、RR1和DH5α等。更具体地，本发明的微生物可以是以KCCM11918P保藏的大肠杆菌BL21(DE3)/KGDPE。

根据本发明的另一个示例性实施方案，提供一种用于制备D-阿洛酮糖的组合物，其包括：包括SEQ ID NO:1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物、该微生物的培养物。

在一个示例性实施方案中，本发明的微生物可以是菌株本身、其培养物或微生物的裂解物。本发明的培养物或裂解物可包括本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。另外，本发明的微生物培养物可以包括或不包括所述微生物。另外，本发明的微生物的裂解物可以是通过裂解微生物或其培养物获得的裂解物，或通过离心裂解物获得的上清液。

在另一个示例性实施方案中，本发明的用于制备D-阿洛酮糖的组合物可进一步包括D-果糖作为阿洛酮糖差向异构酶的底物。

在另一个示例性实施方案中，本发明的微生物可以固定在待使用的运载体上。能够用于本发明的运载体的实例包括，但不限于，琼脂、琼脂糖、κ-角叉菜胶、藻酸盐或脱乙酰壳多糖。

此外，本发明的用于制备D-阿洛酮糖的组合物可以进一步包括能够支持阿洛酮糖制备的任何组分。具体地，本发明的用于制备D-阿洛酮糖的组合物可以进一步包括金属。更具体而言，本发明的金属可以是选自锰、钙、镁、铁、锂和钠的至少一种金属。另外，本发明的金属可以是金属离子或金属盐。本发明的金属的浓度可以是0.1mM～10mM、0.1mM～7mM、0.1mM～4mM、0.5mM～10mM、0.5mM～7mM、0.5mM～4mM、1mM～10mM、1mM～7mM、1mM～4mM、2mM～10mM、2mM～7mM、2mM～4mM。更具体而言，本发明的金属盐可以是选自LiCl、Na₂SO₄、MgCl₂、NaCl、FeSO₄、MgSO₄、MnCl₂、MnSO₄和CaCl₂的至少一种金属盐。

根据本发明的另一个示例性实施方案，提供一种制备D-阿洛酮糖的方法，包括：使由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，表达所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物，或该微生物的培养物与D-果糖接触。

在一个示例性实施方案中，所述制备方法可进一步包括在与D-果糖接触之前、之后或同时加入金属。

在另一个示例性实施方案中，该制备方法可以进一步包括，在与D-果糖接触或添加该金属之后，分离和/或纯化包括阿洛酮糖的接触产物。分离和/或纯化可以通过一种或多种已知方法进行，例如透析、沉淀、吸附、电泳、离子交换层析和分级结晶等，但不限于此。

此外，本发明的制备方法可以进一步包括，在分离和/或纯化之前或之后，进行脱色和/或脱盐。通过进行脱色和/或脱盐，可以获得更精制的无杂质阿洛酮糖。

在另一个示例性实施方案中，本发明的制备方法可以进一步包括，在与D-果糖接触，添加该金属，分离和/或纯化，或者进行脱色和/或脱盐之后，对D-阿洛酮糖进行结晶。结晶可以通过使用常规使用的结晶方法进行。例如，可以通过使用冷却结晶方法进行结晶。

在另一个示例性实施方案中，本发明的制备方法可以进一步包括，在结晶之前，浓缩阿洛酮糖。所述浓缩可以提高结晶效率。

在另一个实施方案中，本发明的制备方法可进一步包括，在分离和/或纯化之后，使未反应的D-果糖与阿洛酮糖差向异构酶接触，或可进一步包括，在结晶之后，再使用母液，在分离和/或纯化中从该母液中分离结晶，或其组合。通过额外的步骤，可以以更高的收率获得阿洛酮糖，并且可以减少会被丢弃的D-果糖的量，从而提供经济效益。

在一个示例性实施方案中，本发明的接触可以在pH5.0-9.0、40-90℃进行，和/或进行0.5-48小时。

具体地，本发明的接触可以在pH6.0至8.5、pH6.0至8.0或pH7.0至8.0进行。

此外，本发明的接触可以在40℃-80℃、40℃-75℃、40℃-65℃、50℃-90℃、50℃-80℃、50℃-75℃、50℃-65℃、55℃-90℃、55℃-80℃、55℃-75℃、55℃-65℃、60℃-90℃、60℃-80℃、60℃-75℃、60℃-65℃、65℃-90℃、65℃-80℃或65-75℃的温度下进行。

另外，本发明的接触可以进行0.5小时或更长、1小时或更长、3小时或更长、5小时或更长、或6小时或更长、和/或48小时或更短、36小时或更短、24小时或更短、12小时或更短、9小时或更短。

在本发明的制备D-阿洛酮糖的方法中描述的阿洛酮糖差向异构酶、金属和运载体与上述示例性实施方案中描述的相同。

根据本发明的又一示例性实施方案，提供如本文所述的阿洛酮糖差向异构酶、表达该阿洛酮糖差向异构酶的微生物或该微生物的培养物在阿洛酮糖制备中用于D-果糖转化的用途。

发明效果

本发明的阿洛酮糖差向异构酶的将D-果糖转化为阿洛酮糖的活性是优异的，具有工业上可用的程度的高温稳定性，并且具有快速的转化反应速率。因此，当本发明的阿洛酮糖差向异构酶被用于制备阿洛酮糖时，可以以高效率和高产率制备阿洛酮糖。

附图说明

图1是用于表达阿洛酮糖差向异构酶(KGDPE)的重组载体的示意图，所述阿洛酮糖差向异构酶由本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

图2是关于使用本发明的KGDPE、利用D-果糖作为底物的阿洛酮糖制备的结果的HPLC分析数据。

图3A和3B是显示阿洛酮糖差向异构酶根据温度的相对酶活性的图，其中图3A显示了现有技术中源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(ATPE)的活性，图3B显示了本发明中KGDPE的活性。

图4是显示本发明的KGDPE的根据pH的相对酶活性的图。

图5是显示本发明的KGDPE的加入各种金属的相对酶活性的图。

实施方案详述

以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。然而，本发明不限于下面的实施例，并且应当理解，本领域技术人员可以在本发明的范围和精神内进行各种修改和改变。

在本发明的说明书通篇中，除非另有说明，用于表示特定物质浓度的"％"是指固体/固体(重量/重量)％、固体/液体(重量/体积)％、和液体/液体(体积/体积)％。

实施例

实施例1.制备转化菌株，该转化菌株制备源自Kaistia属的微生物的阿洛酮糖差向异构酶。

选择预期具有阿洛酮糖差向异构酶活性(将D-果糖从Kaistia属微生物转化成阿洛酮糖)的基因，并制备包括该基因的重组表达载体和转化的微生物。

具体地，从Genbank登记的Kaistia属微生物的基因序列中选择预期为阿洛酮糖差向异构酶的Kaistia granuli KCTC12575的基因kgdpe，并基于该基因的氨基酸序列(SEQID NO:1)和核苷酸序列(SEQ ID NO:2)设计和合成正向引物(SEQ ID NO:3)和反向引物(SEQ ID NO:4)。通过使用合成的引物，使用Kaistia granuli KCTC12575的基因组DNA作为模板，通过进行PCR反应(33个循环：包括94℃1分钟、58℃30秒和72℃1分钟的1个循环)扩增基因。使用PCR纯化试剂盒(Quiagen)纯化扩增的基因，并使用限制酶NdeI和NotI将其插入pET24a(+)(Novagen，USA)中以构建重组载体pET24a(+)-KGDPE(图1)。

通过热激转化(Sambrook和Russell：Molecular Cloning，2001)将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后冷冻保存在50％甘油中并使用。转化的菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)/KGDPE，保藏于根据布达佩斯条约的国际保藏中心韩国微生物保藏中心，保藏日期为2016年10月20日，保藏号为KCCM11918P。

实施例2.阿洛酮糖差向异构酶的制备和纯化

为了从实施例1中制备的大肠杆菌BL21(DE3)/KGDPE制备阿洛酮糖差向异构酶，将大肠杆菌BL21(DE3)/KGDPE接种到5ml LB-卡那霉素培养基中，并在37℃、200rpm振荡培养，直至600nm处的吸光度达到1.5。然后，将振荡培养的培养液接种到500ml LB-卡那霉素培养基中，当600nm处的吸光度为0.7时，加入0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，并在16℃和150rpm对细胞进行主培养16小时。

将主培养液以8000rpm离心20分钟，仅回收细胞，用0.85％(w/v)NaCl洗涤细胞2次后，用溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0～300mM NaCl)溶胞，在4℃用声波振动器裂解20分钟。将经裂解的液体在4℃，13,000rpm离心20分钟以回收上清液。然后，将上清液施加至预先用上述溶胞缓冲液平衡的Ni-NTA柱(Ni-NTA Superflow，Qiagen)，并继续使含有250mM咪唑的缓冲液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.0)流过以获得纯化的阿洛酮糖差向异构酶(在下文中，称为KGDPE)。KGDPE的SDS-PAGE证实单体的大小为约32kDa。

实施例3.KGDPE活性的证实

3-1.确认从D-果糖转化成阿洛酮糖的活性的

为了确认KGDPE是否使用D-果糖作为底物制备阿洛酮糖，将实施例2中制备的KGDPE(50mM Tris-HCl，pH7.0)加入到含有50wt％D-果糖和3mM MnSO4的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并在55℃反应6小时。然后，在100℃加热5分钟停止反应，然后通过HPLC分析确认阿洛酮糖的制备。HPLC分析使用装备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的HPLC(Agilent，USA)折射率检测器(Agilent1260RID)进行，其中流动相溶剂是水，温度是80℃，流速是0.6ml/min。

结果，确认了可以使用KGDPE从D-果糖制备阿洛酮糖(图2)。

3-2.确认从D-果糖转化成阿洛酮糖的活性

为了确认KGDPE的制备能力是否优于用于阿洛酮糖制备的常规阿洛酮糖差向异构酶(ATPE，SEQ ID NO:5，韩国专利公开号10-2011-0035805)，确认了从D-果糖到阿洛酮糖的转化速率。

具体地，将用重组表达载体pET24a-ATPE转化的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含卡那霉素(浓度为10μg/ml)的LB培养基中，然后以与实施例2相同的方式对酶进行表达和纯化。将得到的酶加入到含有50wt％D-果糖和3mM MnSO4的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，在55℃反应6小时。然后，在100℃加热5分钟停止反应，然后通过HPLC分析确认阿洛酮糖的制备。在与实施例3-1相同的条件下进行HPLC分析。阿洛酮糖的转化速率计算为每分钟由酶制备的阿洛酮糖的量(mg/min)，并且KGDPE的反应速率显示为相对值，其中ATPE的反应速率值设定为100％。

结果，确认了与使用ATPE时相比，使用KGDPE时每分钟制备的阿洛酮糖的量为117.6％，因此，当使用KGDPE时，从D-果糖到阿洛酮糖的转化速率显著增加(表1)。

[表1]

酶	KGDPE	ATPE
			相对转化速率(％)	117.6	100

实施例4.KGDPE特征的分析

4-1.根据温度分析酶活性

将KGDPE和D-果糖底物在不同温度条件(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃)下反应2小时，并比较根据温度的酶活性。除了温度和反应时间之外，以与实施例3-1中相同的方式进行上述反应，并且以从D-果糖到阿洛酮糖的转化速率测量酶活性。转化速率计算为反应后制备的阿洛酮糖的重量相对于反应前底物(D-果糖)的重量的百分比。

结果，KGDPE在所有测量温度范围内均表现出25％或更高的高转化活性，并且确认了随着温度升高，活性升高，在75℃的最高温度下观察到最大转化速率(表2)。

[表2]

温度(℃)	KGDPE(转化速率，％)
		40	26.7
45	27.8
		50	28.8
55	29.7
		60	30.5
65	31.2
		70	32.1
75	32.8

4-2.酶的热稳定性分析

为了比较KGDPE和传统酶ATPE的热稳定性，在不同温度(55℃，60℃和65℃)热处理各酶，并在每个热处理时间(0.5小时，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时和6小时)对酶促处理溶液进行取样以测定每种酶的残余活性。通过与实施例3-1中相同的方式仅改变反应时间，进行反应30分钟，并且通过从D-果糖到阿洛酮糖的转化速率来测量酶的剩余活性。

结果，KGDPE的半衰期随温度升高的降低显着小于ATPE的半衰期，因此，证实KGDPE具有高的热稳定性(图3A和3B)。

4-3.根据pH分析酶活性

为了根据pH测定酶活性，在各种pH使D-果糖底物与KGDPE反应。此时，除了反应时间和pH值以外，反应以与实施例3-1相同的方式进行。

具体地说，酶反应在55℃进行30分钟，使用50mM磷酸钾，pH5.0、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5和pH8.0，以及使用50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0、pH8.5和pH9.0。然后，以从D-果糖到阿洛酮糖的转化速率测量酶活性。

结果，确认了与最大活性相比，KGDPE在pH6-pH8.5表现出70％或更高的活性，并在pH8.0表现出最高的活性(表3，图4)。

[表3]

4-4.根据金属加入的酶活性分析

为了确认根据金属添加的KGDPE的活性，在与实施例3-1相同的反应条件下，用各种金属盐(LiCl、Na₂SO₄、MgCl₂、NaCl、FeSO₄和CaCl₂)代替MnSO₄，并添加至终浓度为3mM。然后，测量酶活性。对照组不用金属盐处理。

结果，确认了与对照组相比，加入Li、Na、Mg、Fe和Ca以及Mn提高了KGDPE的活性，其中，可以证实Mn最大程度地提高了酶活性(表4和图5)。

[表4]

从以上描述中，本领域技术人员会理解，本发明可以以其它特定形式实现，而不改变其技术思想或基本特征。为此，应当理解，上述实施方案在所有方面都是说明性的而非限制性的。本发明的范围应该被解释为覆盖了从所附权利要求及其等同物的含义和范围衍生的所有修改或变化，而不是详细描述。

序列表

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 一种新型D-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备D-阿洛酮糖的方法

<130> OPA18334

<150> KR 10-2016-0152947

<151> 2016-11-16

<160> 5

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> Amino acid sequences of KGDPE

<400> 1

Met Lys Asn Lys Leu Gly Val His Ala Gln Val Trp Val Gly Gly Trp

1 5 10 15

Ser His Ala Glu Ala Glu Arg Ala Ile Ala Ser Thr Ala Ser Leu Gly

20 25 30

Tyr Asp Tyr Ile Glu Ala Pro Ala Leu Asp Pro Ser Leu Ile Asp Ile

35 40 45

Asp Phe Thr Arg Lys Ala Leu Glu Lys His Gly Leu Gly Ile Thr Thr

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Asp Asp Ser Cys Asp Ile Ser Ser Gly Asp Pro Asp

65 70 75 80

Lys Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Leu Met Lys Val Val Ser Thr Thr

85 90 95

Arg Asp Leu Gly Gly Thr His Ile Thr Gly Ile Leu Tyr Ser Gly Phe

100 105 110

Gln Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Thr Pro Glu Gly Val Ala Gly Ala Val

115 120 125

Glu Val Leu His His Val Ala Glu Glu Ala Ala Lys Ser Asn Ile Thr

130 135 140

Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Thr Asn Val Ile Asn Thr

145 150 155 160

Ala Ala Gln Gly Val Glu Leu Cys Lys Arg Val Gly Met Pro Asn Val

165 170 175

Lys Val His Leu Asp Cys Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Ala Asp Ala

180 185 190

Glu Arg Ala Ile Ile Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Gly Tyr Phe His Thr

195 200 205

Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Ser Ile Asp Phe Thr

210 215 220

Arg Ile Phe Arg Gly Leu Val Lys Ala Asn Tyr Gln Gly Pro Ile Cys

225 230 235 240

Phe Glu Ser Phe Ser Ser Ala Val Ala Gly Glu Pro Leu Ser Gly Ile

245 250 255

Leu Gly Ile Trp Arg Asn Leu Trp Thr Asp Ser Thr Asp Leu Cys Arg

260 265 270

His Ala Met Gln Phe Thr Gln Ala Gln Met Gln Ala Ala Glu Gln Ala

275 280 285

Gln Ser Ile Arg Thr Gly Ala Asp Trp

290 295

<210> 2

<211> 894

<212> DNA

<213> Nucleotide sequences of KGDPE

<400> 2

atgaagaaca agctgggtgt gcacgcacag gtctgggtcg gcggctggag ccatgcggag 60

gcggagcgcg ccatcgccag caccgcctcg ctcggctacg actatatcga ggcgccggcg 120

ctcgacccgt cgctgatcga catcgacttc acccgcaaag cgctggaaaa gcatggtctc 180

ggcatcacga cgtcgctcgg cctcgacgac agctgcgaca tctcctcggg cgatcccgac 240

aagaaggcgc gcggccaggc gcacctgatg aaggtggtct ccaccacccg tgatctcggc 300

ggcacccaca tcaccggtat cctctattcc ggcttccaga aatacttcac gcccgcaacg 360

ccggagggcg tcgccggcgc cgtcgaggta ttgcaccacg tcgccgagga agcggcgaag 420

agcaacatca cgctcggcct cgaggtggtg aaccgctacg agaccaacgt gatcaacacc 480

gccgcccagg gcgtcgagct ctgcaagcgg gtcggcatgc cgaacgtcaa ggtgcacctc 540

gactgctacc acatgaacat cgaggaagcc gacgccgagc gcgccatcat cgataccggc 600

gactatctgg gttatttcca taccggtgaa tcgcatcgcg gctatctcgg caccggctcg 660

atcgacttca cccgcatctt ccgcggcctg gtgaaggcca actaccaggg tccgatctgc 720

ttcgaatcct tctcgtccgc cgtcgccggc gagccgctct ccggcattct cggcatctgg 780

cgcaatctct ggacggattc gaccgatctc tgccgccacg ccatgcagtt cacgcaggca 840

cagatgcagg cggccgagca ggcccagtcg atccgcaccg gcgcggactg gtag 894

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> A forward primer of KGDPE

<400> 3

atgaagaaca agctgggtgt gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> A reverse primer of KGDPE

<400> 4

tcaccagtcc gcgccggtgc 20

<210> 5

<211> 289

<212> PRT

<213> Amino acid sequences of ATPE

<400> 5

Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu

35 40 45

Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala

50 55 60

Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala

65 70 75 80

Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val

85 90 95

Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp

100 105 110

Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg

115 120 125

Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly

130 135 140

Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu

145 150 155 160

Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn

165 170 175

Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp

180 185 190

Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe

195 200 205

His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro

210 215 220

Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp

245 250 255

Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met

260 265 270

Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly

275 280 285

Gly

Claims

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

2.权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其中该D-阿洛酮糖3-差向异构酶由SEQ IDNO:2的多核苷酸序列编码。

3.一种编码权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的多核苷酸。

4.一种重组载体，其包含权利要求3的多核苷酸。

5.一种微生物，其中导入了权利要求4的重组载体。

6.一种用于制备D-阿洛酮糖的组合物，其包含：权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达该D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物或该微生物的培养物。

7.权利要求6的组合物，其还包含：D-果糖。

8.一种制备D-阿洛酮糖的方法，其包括：将权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达该D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物或该微生物的培养物与D-果糖接触。

9.权利要求8的方法，其中所述接触在5.0-9.0的pH、40℃-90℃的温度进行，或进行0.5-48小时。

10.权利要求8的方法，其还包括：在与D-果糖接触之前、之后或同时，使权利要求1的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、表达该D-阿洛酮糖3-差向异构酶的微生物或该微生物的培养物与金属接触。