JP6967599B2

JP6967599B2 - 新規なｄ−プシコース３−エピマー化酵素及びこれを用いたｄ−プシコースの製造方法

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Publication number: JP6967599B2
Application number: JP2019547057A
Authority: JP
Inventors: キム，スジン; イ，ヨンミ; キム，ヤンヒ; キム，ソンボ; パク，スンウォン; チョ，ソンジュン
Original assignee: シージェイチェルジェダンコーポレイション
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2021-11-17
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: UA126473C2; KR101919713B1; CN110462036A; KR20180055736A; TW201823456A; RU2727903C1; AR110093A1; CN110462036B; WO2018093153A1; US20200063117A1; US11174475B2; TWI666323B; EP3543336A1; JP2019535320A; EP3543336A4

Description

本出願は、Ｄ−プシコース３−エピマー化酵素及びこれを用いたＤ−プシコースの製造方法に関する。

Ｄ−プシコース（D-psicose、以下「プシコース」と記載する）は、自然界に極少量存在する希少糖（rare sugar）として知られている単糖類である。砂糖の約７０％の甘みを有しながらも、ほぼゼロカロリーに近く、血糖値の抑制及び脂肪合成の抑制などの機能性により新たな食品原料として多くの関心を受けている。

このような特徴により、プシコースは、砂糖を代替しうる甘味料として様々な食品への使用が考慮されているが、自然界に極少量存在するため、プシコースを効率的に生産しうる方法の必要性が高まっている。

従来知られているプシコースの生産方法は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いたり（非特許文献１）、エタノールとトリエチルアミン（triethylamine）とを一緒に加熱してＤ−フルクトースからプシコースを生産する化学的方法（非特許文献２）とＤ−プシコース３−エピマー化酵素を生産する微生物を用いて、Ｄ−フルクトースからプシコースを生産する生物学的方法（特許文献１）がある。化学的方法によるプシコースの生産は副産物が多く生成されて、複雑な精製過程が必要となり、生物学的な方法も収率が非常に低く、生産コストが高いという問題がある。

このような背景下で、本発明者らはプシコースの生産収率を改善しうる方法を開発するために鋭意研究努力した結果、本出願の新規なＤ−プシコース３−エピマー化酵素（以下、これを「プシコースエピマー化酵素」とする）を用いる場合、Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換速度を高めてプシコースの生産収率を著しく向上させうることを確認することにより、本出願を完成した。

大韓民国特許公開第１０−２０１１−００３５８０５号

Bilik V, Tihlarik K, 1973, Reaction of saccharides catalyzed by molybdate ions. IX. Epimerization of ketohexoses. Chem Zvesti 28:106-109 Doner LW, 1979, Isomerization of d-fructose by base: liqui d-chromatographic evaluation and the isolation of d-psicose. Carbohydr Res. 70:209-216 Diabetes (1990) 39: 1033 Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980； Uhlman Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990

本出願の目的は、新規なプシコースエピマー化酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び前記ベクターが導入された微生物を提供することにある。

本出願の別の目的は、本出願のプシコースエピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を含むＤ−プシコース製造用組成物及び前記酵素を用いたＤ−プシコースの製造方法を提供することにある。

本出願は一様態として、配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピマー化酵素を提供する。

一具現例として、本出願のプシコースエピマー化酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。Ｄ−フルクトースをプシコースに転換する活性を有し、前記相同性を有するアミノ酸配列であれば、前記配列番号１のアミノ酸配列の一部が置換、挿入、変形及び/または欠失された場合が含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、本出願のプシコースエピマー化酵素をコードする塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとして、プシコースエピマー化酵素の活性を有するポリペプチドも制限なく含まれてもよい。

本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、非改質されたまたは改質されたポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを言う。

本出願において、用語、「厳しい条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野によく知られており、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、８０％、９０％、９５％、９７％または９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。前記ハイブリッド化に使用されたプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。これらのプローブは、公知配列に基づいて作成されたオリゴヌクレオチドをプライマーにして、これらの塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲによって作製されてもよい。また、当業者は、温度及び洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さなどの要素に応じて、必要に応じて調節してもよい。

本出願において、用語、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド一部（moiety）間の同一性のパーセントをいう。一つの一部から他の一つの一部までの配列間の相同性は、知られている当該技術によって決定してもよい。例えば、相同性は配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を直接整列して決定してもよい（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖をなす条件下でポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解して、分解された断片の大きさを決定することにより決定してもよい。

また、本出願の配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピマー化酵素と相応する活性を有するタンパク質であれば、配列番号１のアミノ酸配列前後の無意味な配列を追加または自然に発生することができる突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（silent mutation）を除くものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質も本出願の範囲内に属する。

さらに、これに制限されるものではないが、本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素は、配列番号２のポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされるものであってもよい。また、本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドは、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも本出願のポリヌクレオチド配列の範囲に含まれるのは自明である。当業者は、公知の遺伝子組換え技術を用いて、配列番号２の塩基配列の少なくとも一つを置換、付加及び/または欠失して実質的に同等の活性を有する範囲の酵素をエンコードするポリヌクレオチドを製造しうることを理解できる。

他の具現例として、本出願のプシコースエピマー化酵素は、カイスティア属（the genus of Kaistia）微生物から由来したものであってもよい。具体的には、本出願のプシコースエピマー化酵素は、カイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）から由来されたものであってもよく、より具体的には、カイスティア・グラニュリＫＣＴＣ１２５７５から由来したものであってもよい。

他の具現例として、本出願のプシコースエピマー化酵素はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を介して測定された分子量が２５ｋＤａ〜３７ｋＤａ、２７ｋＤａ〜３５ｋＤａまたは３０ｋＤａ〜３５ｋＤａであってもよい。

本出願は別の様態として、配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピマー化酵素をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。

一具現例として、本出願で提供するポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列または配列番号２の塩基配列と８０％、９０％、９５％、９７％または９９％以上の相同性を有する配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、本出願で提供するポリヌクレオチドは、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質に翻訳できるポリヌクレオチドも、本出願の範囲に含まれるのは自明である。

本出願は別の様態として、本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。

本出願の組換えベクターは、プシコースエピマー化酵素をエンコードするポリヌクレオチドを公知の標準方法を用いてクローニングベクターや発現ベクター内に挿入した形態であってもよい。本願で「クローニングベクター」は、宿主細胞内にＤＮＡ断片を運び、これを再生産できるベクターをいう。クローニングベクターは、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、及び/またはマルチクローニングサイトをさらに含んでもよい。このとき、マルチクローニングサイトは、エンドヌクレアーゼ、制限酵素部位のうちの少なくとも一つを含んでもよい。一例として、プシコースエピマー化酵素をエンコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナルと転写終結配列の上流に位置してもよい。本願で「発現ベクター」は、適切な宿主内でクローニングされたＤＮＡの転写と翻訳のために必要なＤＮＡ配列をいう。また、本願で「発現ベクター」は、個体の細胞内に存在する場合、挿入物が発現されるように挿入物に作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。前記「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチド配列の関連性により一つの機能が他のものによって調節されることをいう。発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて製造及び精製されてもよい。発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、プシコースエピマー化酵素をエンコードする遺伝子及び終止コドンのいずれか一つ以上を含んでもよい。

本出願は別の様態として、本出願の組換えベクターが導入された微生物を提供する。

一具現例として、本出願の組換えベクターが導入された微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むプシコースエピマー化酵素をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換されるか、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターによって形質転換されたものであってもよい。

本出願において、用語、「形質転換」は、遺伝子またはこれを含む組換えベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞内で発現できるようにすることを意味し、形質転換された遺伝子は宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内に挿入または染色体外に位置しているものであれ制限せず含まれる。本出願の形質転換方法としては、一時的形質転換、微細注射、形質導入、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介形質感染、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質感染、電気穿孔、電気注入、化学処理などがあるが、これに限定されるものではない。組換えベクターで形質転換されうる宿主細胞としては、原核細胞、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、ＤＮＡの導入効率が良く、導入されたＤＮＡの発現率が高い宿主細胞が用いられる。例えば、宿主細胞は、大腸菌、バチルス属菌株、コリネバクテリア属菌株、サルモネラ属菌株等であってもよく、例えば、Ｗ３１１０、ＢＬ２１、ＪＭ１０９、Ｋ−１２、ＬＥ３９２、ＲＲ１及びＤＨ５aなどの大腸菌であってもよい。より具体的には、本出願の微生物は、ＫＣＣＭ１１９１８Ｐとして寄託されたＥ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥであってもよい。

本出願は別の様態として、配列番号１のアミノ酸配列を含むプシコースエピマー化酵素、前記プシコースエピマー化酵素を発現する微生物、前記微生物の培養物を含むＤ−プシコース製造用組成物を提供する。

一具現例として、本出願の微生物は、菌株自体、その培養物または前記微生物の破砕物であってもよい。本出願の培養物または破砕物は、本出願のＤ−プシコース３−エピマー化酵素を含んでもよい。また、本出願の微生物の培養物は、前記微生物を含んでも、含まなくてもよい。加えて、本出願の微生物の破砕物は、微生物またはその培養物を破砕した破砕物、または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液であってもよい。

他の具現例として、本出願のＤ−プシコース生産用組成物は、プシコースエピマー化酵素の基質となるＤ−フルクトースをさらに含んでもよい。

他の具現例として、本出願の微生物は、担体に固定化させて用いてもよい。本出願で用いられる担体の例としては、アガー（agar）、アガロース（agarose）、ｋ−カラギーナン、アルギン酸またはキトサンがあり、これに限定されるものではない。

また、本出願のＤ−プシコース生産用組成物は、プシコースの生産を補助しうる任意の成分をさらに含んでもよい。具体的には、本出願のＤ−プシコース生産用組成物は金属をさらに含んでもよい。より具体的には、本出願の金属は、マンガン、カルシウム、マグネシウム、鉄、リチウム及びナトリウムからなる群から選択される１つ以上の金属であってもよい。また、本出願の金属は、金属イオンまたは金属塩であってもよい。本出願の金属は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜７ｍＭ、０．１ｍＭ〜４ｍＭ、０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、０．５ｍＭ〜４ｍＭ、１ｍＭ〜１０ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１ｍＭ〜４ｍＭ、２ｍＭ〜１０ｍＭ、２ｍＭ〜７ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭで含んでもよい。より具体的には、本出願の金属塩は、ＬｉＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＦｅＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４及びＣａＣｌ_２からなる群から選択される１種以上の金属塩であってもよい。

本出願は別の様態として、配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピマー化酵素、本出願のプシコースエピマー化酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物とＤ−フルクトースを接触させる段階を含む、Ｄ−プシコースの製造方法を提供する。

一具現例として、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースを接触させる段階の以前、以後または同時に金属を添加する段階をさらに含んでもよい。

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースを接触させる段階、または本出願の金属を添加する段階の後に、プシコースを含む接触結果物を分離及び/または精製する段階をさらに含んでもよい。前記分離及び/または精製は、透析、沈殿、吸着、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及び分別結晶などの公知の方法のいずれか一つ以上の方法を選択して利用してもよいが、これに制限されない。

また、本出願の製造方法は、それぞれ、本出願の分離及び/または精製する段階の以前または以後に脱色及び/または脱塩を行う段階をさらに含んでもよい。前記脱色及び/または脱塩を行うことにより、不純物を含まない、より精製されたプシコースを得ることができる。

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースを接触させる段階、金属を添加する段階、分離及び/または精製する段階、または脱色及び/または脱塩段階の後に、Ｄ−プシコースを結晶化する段階をさらに含んでもよい。前記結晶化は、通常使用する結晶化方法を用いて行ってもよい。例えば、冷却結晶化方法を用いて結晶化を行ってもよい。

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願の結晶化する段階の以前にプシコースを濃縮させる段階をさらに含んでもよい。前記濃縮は結晶化の効率を高めることができる。

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願の分離及び/または精製する段階の後に、未反応とされたＤ−フルクトースをプシコースエピマー化酵素と接触させる段階、本出願の結晶化する段階の後に結晶が分離された母液を前記分離及び/または精製段階で再使用する段階、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。前記追加の段階を介してプシコースをさらに高収率で収得することができ、捨てられるＤ−フルクトースの量を削減することができて経済的利点がある。

一具現例として、本出願の接触は、ｐＨ５．０〜９．０の条件で、４０℃〜９０℃の条件で、及び/または０．５時間〜４８時間行ってもよい。

具体的には、本出願の接触は、ｐＨ６．０〜８．５、ｐＨ６．０〜８．０またはｐＨ７．０〜８．０で行ってもよい。

また、本出願の接触は、４０℃〜８０℃、４０℃〜７５℃、４０℃〜６５℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７５℃、５０℃〜６５℃、５５℃〜９０℃、５５℃〜８０℃、５５℃〜７５℃、５５℃〜６５℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６０℃〜７５℃、６０℃〜６５℃、６５℃〜９０℃、６５℃〜８０℃または６５℃〜７５℃の温度で行ってもよい。

また、本出願の接触は、０．５時間以上、１時間以上、３時間以上、５時間以上、または６時間以上、及び/または４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下、１２時間以下、９時間以下行ってもよい。

本出願のＤ−プシコースの製造方法に記載されたプシコースエピマー化酵素、金属及び担体などは、前述した様態で記載した通りである。

本出願はまた別の様態として、プシコース製造におけるＤ−フルクトースの転換のための、本願に記述されたプシコースエピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物の用途を提供する。

本出願のプシコースエピマー化酵素は、Ｄ−フルクトースからプシコースに転換する活性が優れていて、産業的に利用可能な程度の高温安定性を有し、転換反応速度が速い効果がある。したがって、本出願の酵素を用いてプシコースを製造する場合、高効率及び高収得率でプシコースの生産が可能な利点がある。

本出願の配列番号１のアミノ酸配列からなるプシコースエピマー化酵素（ＫＧＤＰＥ）を発現するための組換えベクターの開裂図である。本出願のＫＧＤＰＥを用いてＤ−フルクトースを基質とし、プシコースを生産した結果のＨＰＬＣ分析データである。プシコースエピマー化酵素の温度による相対的な酵素活性を示したグラフである。図３ａは、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＤ−プシコース３−エピマー化酵素（ＡＴＰＥ）の活性であり、図３ｂは、本出願のＫＧＤＰＥの活性を示す。ｐＨ変化に伴う本出願のＫＧＤＰＥの相対的な酵素活性を示すグラフである。様々な金属添加による本出願のＫＧＤＰＥの相対的な酵素活性を示すグラフである。

以下、本出願の具体的な実施例によって、より詳細に説明する。しかし、本出願が下記の実施例に限定されるものではなく、本出願の趣旨及び内容の範囲内で当業者によって多様な変形または修正が可能であることが認識されるべきである。

本出願の明細書全体にわたり、特定物質の濃度を示すために使用する「％」は、別の記載がない場合、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。

実施例１．カイスティア属微生物由来のプシコースエピマー化酵素を生産する形質転換菌株の製造
カイスティア属微生物からＤ−フルクトースをプシコースに転換するプシコースエピマー化酵素の活性を有すると予想される遺伝子を選抜し、前記遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換微生物を製造した。

具体的には、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されたカイスティア属微生物の遺伝子配列を対象に、プシコースエピマー化酵素と予想されるカイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）ＫＣＴＣ１２５７５の遺伝子ｋｇｄｐｅを選抜して、前記遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）及びヌクレオチド配列（配列番号２）の情報をもとに、前方プライマー（配列番号３）及び逆方プライマー（配列番号４）を考案して合成した。前記合成されたプライマーを用いて、カイスティア・グラニュリＫＣＴＣ１２５７５のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応（９４℃で１分、５８℃で３０秒、７２℃で１分間反応させる条件を一つのサイクルとして３３サイクル）を行って遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子は、ＰＣＲ精製キット（PCR purification kit、Quiagen）を用いて精製し、制限酵素ＮｄｅＩとｎｏｔＩを使用してｐＥＴ２４ａ（＋）（novagen、USA）に挿入して、組換えベクターｐＥＴ２４ａ（＋）−ＫＧＤＰＥを製造した（図１）。

前記組換えベクターを熱ショック（heat shock transformation、Sambrook and Russell：Molecular cloning、2001）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、５０％グリセロールで冷凍保管して使用した。前記形質転換菌株をＥ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture of Microorganisms、KCCM）に２０１６年１０月２０日付で寄託し、受託番号及びＫＣＣＭ１１９１８Ｐを付与された。

実施例２．プシコースエピマー化酵素の生産及び精製
前記実施例１で製造したＥ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥからプシコースエピマー化酵素を生産するために、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥを５ｍｌＬＢカナマイシン（kanamuycin）培地に接種した後、６００ｎｍで測定した吸光度が１．５に達するまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記振とう培養した培養液を５００ｍｌＬＢカナマイシン培地に接種し、６００ｎｍでの吸光度が０．７になったとき、０．５ｍＭＩＰＴＧ（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）を添加した後、１６℃、１５０ｒｐｍの条件で１６時間本培養した。

前記本培養した培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体のみを回収し、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄した後、溶解緩衝液（lysis buffer、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０３００ｍＭＮａＣｌ）に混濁させた後、音波振動器を用いて４℃で２０分間破砕した。前記破砕液を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を回収した後、予め前記溶解緩衝液で平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ni-NTA Superflow、Qiagen）に適用し、２５０ｍＭイミダゾール（imidazole）が含有された緩衝溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を順次流して精製されたプシコースエピマー化酵素（以下、ＫＧＤＰＥと記載）を獲得した。前記ＫＧＤＰＥはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、単量体の大きさが約３２ｋＤａであることを確認した。

実施例３．ＫＧＤＰＥの活性確認
３−１.Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換活性の確認
ＫＧＤＰＥがＤ−フルクトースを基質としてプシコースを生産するかどうかを確認するために、５０ｗｔ％Ｄ−フルクトース及び３ｍＭＭｎＳＯ_４が含まれた５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）に実施例２で生産したＫＧＤＰＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を添加し、５５℃で６時間反応させた。その後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を介してプシコースの生成を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｃカラム（BIO-RAD）が装着されたＨＰＬＣ（Agilent、USA）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘＤｅｔｅｃｔｏｒ（Agilent 1260 RID）を利用し、移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／分で行った。

その結果、ＫＧＤＰＥを用いてＤ−フルクトースからプシコースが生産できることを確認した（図２）。
３−２．Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換速度の確認
ＫＧＤＰＥのプシコース生産能が従来プシコースの生産に用いられているプシコースエピマー化酵素（ＡＴＰＥ、配列番号５、特許文献１）より優れているかどうかを確認するために、Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換速度を確認した。

具体的には、組換え発現ベクターｐＥＴ２４ａ−ＡＴＰＥで形質転換されたＥ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）を、１０μｇ／ｍｌ濃度のカナマイシンを含むＬＢ培地に接種した後、前記実施例２と同様の方法で酵素を発現して精製した。獲得した酵素を５０重量％Ｄ−フルクトース及び３ｍＭＭｎＳＯ_４が含まれた５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）に添加し、５５℃で６時間反応させた。その後、１００℃で５分間加熱して反応を停止させた後、ＨＰＬＣ分析を介してプシコース生成を確認した。ＨＰＬＣ分析は、前記実施例３−１と同じ条件で行った。プシコースへの転換速度は、酵素が分あたりに生成するプシコース量（ｍｇ／分）で計算しており、ＡＴＰＥの反応速度値を１００％としてＫＧＤＰＥの反応速度を相対的な数値で示した。

その結果、ＫＧＤＰＥを用いた場合の分あたりに生成されるプシコースの量は、ＡＴＰＥを用いた場合に比べて１１７．６％であり、ＫＧＤＰＥを用いる場合、Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換速度が著しく増加することを確認した（表１）。

実施例４．ＫＧＤＰＥの特性分析
４−１．温度による酵素の活性の分析
様々な温度条件下（４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃及び７５℃）でＫＧＤＰＥとＤ−フルクトースの基質を２時間反応させて、温度による酵素活性を比較した。前記反応は、温度及び反応時間を除いて、実施例３−１と同様の方法で行い、酵素活性はＤ−フルクトースからプシコースへの転換率で測定した。転換率は反応前の基質（Ｄ−フルクトース）の重量対比反応後に生成されたプシコースの重量の割合で計算した。

その結果、ＫＧＤＰＥはすべての測定温度範囲で２５％以上の高い転換活性を示しており、温度が増加するほど活性も増加し、測定最高温度である７５℃で最大の転換率を示すことが確認された（表２）。

４−２．酵素の熱安定性の分析
ＫＧＤＰＥの熱安定性を従来酵素であるＡＴＰＥと比較するために、前記各酵素の様々な温度（５５℃、６０℃及び６５℃）の熱処理をした後、熱処理時間別（０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間及び６時間）で酵素処理溶液をサンプリングし、それぞれの酵素の残留活性を測定した。前記実施例３−１と同様の方法で反応時間だけを変更して、３０分間反応を行い、Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換率で酵素の残留活性を測定した。

その結果、温度上昇に伴うＫＧＤＰＥの半減期の低下がＡＴＰＥに比べて著しく少ないところ、ＫＧＤＰＥは高い熱安定性を有することを確認した（図３ａ及び３ｂ）。

４−３．ｐＨによる酵素活性の分析
ｐＨによる酵素活性を測定するために、Ｄ−フルクトースの基質をＫＧＤＰＥと様々なｐＨでそれぞれ反応させた。この時、反応は反応時間及びｐＨを除いて、前記実施例３−１と同様の方法で行った。

具体的には、５０ｍＭリン酸カリウム（potassium phosphate）を用いてｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５及びｐＨ８．０の条件下、そして５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液を用いてｐＨ８．０、ｐＨ８．５及びｐＨ９．０の条件下、５５℃で３０分間酵素反応を行った後、Ｄ−フルクトースからプシコースへの転換率で酵素活性を測定した。

その結果、ＫＧＤＰＥはｐＨ６〜ｐＨ８．５で最大活性対比７０％以上の活性を示し、ｐＨ８．０で最も高い活性を示すことを確認した（表３、図４）。

４−４．金属添加による酵素活性の分析
ＫＧＤＰＥの金属添加による活性を確認するために、実施例３−１の反応条件でＭｎＳＯ_４を様々な金属塩（ＬｉＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、ＦｅＳＯ_４及びＣａＣｌ_２）に代替して、それぞれ最終濃度が３ｍＭになるように添加し、酵素活性を測定した。対照群は金属塩を処理していなかった。

その結果、Ｍｎと同様にＬｉ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｆｅ及びＣａ添加時、対照群に比べてＫＧＤＰＥの活性が増加することを確認し、このうちＭｎが酵素活性を最も増加させることが確認できた（表４及び図５）。

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本出願の範囲は前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造するための、配列番号１のアミノ酸配列からなるＤ−プシコース３−エピマー化酵素（D-psicose 3-epimerase）の使用。
前記Ｄ−プシコース３−エピマー化酵素が、配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の使用。
Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造するための、請求項１に記載のＤ−プシコース３−エピマー化酵素をコードする、ポリヌクレオチドの使用。
Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造するための、請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクターの使用。
Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造するための、請求項４に記載のベクターが導入された、微生物の使用。
配列番号１のアミノ酸配列からなるＤ−プシコース３−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を含む、Ｄ−プシコース製造用組成物。
前記組成物が、Ｄ−フルクトースをさらに含む、請求項６に記載のＤ−プシコース製造用組成物。
配列番号１のアミノ酸配列からなるＤ−プシコース３−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物とＤ−フルクトースを接触させる段階を含む、Ｄ−プシコースの製造方法。
前記接触が、ｐＨ７〜８の条件で、４０℃〜７５℃の温度条件で、または２時間以上４８時間以下行うことである、請求項８に記載のＤ−プシコースの製造方法。
前記製造方法が、配列番号１のアミノ酸配列からなるＤ−プシコース３−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物と金属を接触させる段階をさらに含む、請求項８に記載のＤ−プシコースの製造方法。