TWI666323B - D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物 - Google Patents

D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物 Download PDF

Info

Publication number
TWI666323B
TWI666323B TW106139740A TW106139740A TWI666323B TW I666323 B TWI666323 B TW I666323B TW 106139740 A TW106139740 A TW 106139740A TW 106139740 A TW106139740 A TW 106139740A TW I666323 B TWI666323 B TW I666323B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
psicose
fructose
microorganism
present
epimerase
Prior art date
Application number
TW106139740A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201823456A (zh
Inventor
金藪珍
李英美
金良姬
金成俌
朴承源
趙成捘
Original Assignee
南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 filed Critical 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Publication of TW201823456A publication Critical patent/TW201823456A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI666323B publication Critical patent/TWI666323B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明提供新的D-阿洛酮糖3-表異構酶以及使用其製備 D-阿洛酮糖的方法。

Description

D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備D-阿洛酮糖 的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物
以下揭露內容是關於一種D-阿洛酮糖3-表異構酶以及使用其製備D-阿洛酮糖的方法。
D-阿洛酮糖(下文稱作「阿洛酮糖」)為單醣，已知為以極小量存在於自然界的一種罕見的糖。其卡路里約為零，但其甜度約為糖的70%，且由於其諸如抑制血糖以及抑制脂質合成等功能作為新食品配料已受到大量關注。
由於這些特性，考慮在各種食品中將阿洛酮糖用作糖的甜味劑替代物。然而，由於阿洛酮糖以極小量存在於自然界中，因此越來越需要有效製備阿洛酮糖的方法。
一種用於製備阿洛酮糖的已知方法包含利用鉬酸根離子(molybdate ion)的催化的方法(比利克，V.(Bilik,V.)、季赫拉日克，K.(Tihlarik,K.)，1973年，由鉬酸根離子催化之醣類的 反應IX(Reaction of Saccharides Catalyzed by Molybdate Ions.IX)、己酮糖的差向異構化(Epimerization of Ketohexoses)，《化學論文(Chem.Zvesti)》，28：106-109)、用於藉由將乙醇(Ethanol)和三乙胺(Triethylamine)一起加熱自D-果糖製備阿洛酮糖的化學方法(多納，L.W.(Doner,L.W.)，1979年，藉由鹼將D-果糖異構化：D-阿洛酮糖之液相層析評估以及分離(Isomerization of D-Fructose by Base：Liquid-Chromatographic Evaluation and The Isolation of D-Psicose)，《碳水化合物研究(Carbohydr.Res.)》，70：209-216)以及一種使用產生D-阿洛酮糖3-表異構酶的微生物自D-果糖製備阿洛酮糖的生物方法(韓國專利早期公開第10-2011-0035805號)。藉由化學方法製備阿洛酮糖存在產生大量副產物的問題，且因此需要進行複雜的純化。另外，生物方法亦存在產率極低且製備成本較高的問題。
在這些情形下，本發明人已作出許多努力以研發一種用於改良阿洛酮糖的製備產率的方法，且因此已確認當使用本發明的新的D-阿洛酮糖3-表異構酶(下文稱作「阿洛酮糖表異構酶」)時，將D-果糖轉化成阿洛酮糖的比率(下文稱作自D-果糖至阿洛酮糖的轉化率)增加，從而能夠顯著提高阿洛酮糖的製備產率，並且已完成本發明。
[先前技術文獻] (專利文獻)
韓國專利第10-1318422號
韓國專利早期公開第10-2011-0035805號
(非專利文獻)
比利克，V.，季赫拉日克，K.，1973年，由鉬酸根離子催化之醣類的反應IX，己酮糖的差向異構化，《化學論文》，28：106-109
多納，L.W.，1979年，藉由鹼將D-果糖異構化：D-阿洛酮糖之液相層析評估以及分離，《碳水化合物研究》，70：209-216
金，H.J.(Kim,H.J.)、玄，E.K.(Hyun,E.K.)、金，Y.S.(Kim,Y.S.)、李，Y.J.(Lee,Y.J.)、吳，D.K.(Oh,D.K.)，2006年，將D-果糖轉化成D-阿洛酮糖之根癌農桿菌(Agrobacterium Tumefaciens)D-阿洛酮糖3-表異構酶的特性化，《應用與環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)》，72(2)：981-5
本發明之一實施例是針對提供新的阿洛酮糖表異構酶、編碼所述阿洛酮糖表異構酶的聚核苷酸、包含所述聚核苷酸的重組載體以及將所述載體引入其中的微生物。
本發明之另一實施例是針對提供用於製備包含阿洛酮糖表異構酶的D-阿洛酮糖的組成物、表現所述阿洛酮糖表異構酶的微生物或所述微生物的培養物，以及使用所述阿洛酮糖表異構酶製備D-阿洛酮糖的方法。
根據本發明之一例示性實施例，提供一種由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶。
在一例示性實施例中，阿洛酮糖表異構酶可包含具有與SEQ ID NO：1的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的同源性的多肽(polypeptide)。顯而易見的是，具有將D-果糖轉化成阿洛酮糖的活性以及上文所描述的同源性之 胺基酸序列可包含取代、插入、修改及/或缺失SEQ ID NO：1的胺基酸序列的部分的情況。另外，具有阿洛酮糖表異構酶活性的多肽亦可包含(不限於)為由聚核苷酸編碼的多肽，所述聚核苷酸與編碼探針的核苷酸序列之全部或部分的互補序列雜交，所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下由已知基因序列(例如本發明之阿洛酮糖表異構酶)製備。
如本文中所使用之術語「聚核苷酸」是指聚核糖核苷酸(polyribonucleotide)或聚去氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide)，其中核苷酸單體未經修改或經修改成藉由共價鍵在長鏈中延伸的核苷酸聚合物。
如本文中所使用之術語「嚴格條件」意謂允許在聚核苷酸之間進行特異性雜交的條件。所述條件取決於聚核苷酸的長度以及互補程度。其參數為此項技術中所熟知並且在文獻(例如，J.薩姆布魯克(J.Sambrook)等人，同前文獻)中具體描述。舉例而言，所述嚴格條件可列舉使各自具有80%、90%、95%、97%或99%或更多的較高同源性之基因相互雜交的條件、使各自具有低於上述同源性的同源性之基因不相互雜交的條件或印漬雜交(southern hybridization)的一般清洗條件，亦即，在諸如60℃、1×SSC、0.1% SDS，具體言之60℃、0.1×SSC、0.1% SDS，且更具體言之68℃、0.1×SSC、0.1% SDS的鹽濃度以及溫度下清洗一次，具體言之兩次至三次的條件。在雜交中使用的探針可為鹼基序列(base sequence)之互補序列的部分。可藉由利用基於作為引子之已知序列製備的寡核苷酸來使用包含作為模板之鹼基序列的基因片段之PCR來建構此類探針。另外，本領域的技術人員可取決於諸 如探針長度的因素視需要調整清洗溶液的溫度以及鹽濃度。
如本文中所使用之術語「同源性」是指兩個聚核苷酸或兩個多肽部分之間的一致性百分比。可藉由已知技術判定自一個部分至另一部分之序列之間的同源性。舉例而言，可藉由使用將序列資訊分類且可易於獲得的電腦程式(例如，BLAST 2.0)來直接比對兩個聚核苷酸分子或兩個多肽分子之間的序列資訊之參數(諸如分值、一致性以及相似性等)而判定同源性。另外，可藉由在於同源區域之間形成穩定雙鏈的條件下使聚核苷酸雜交，隨後藉由單鏈特異性核酸酶降解以判定所降解片段之大小來判定聚核苷酸之間的同源性。
另外，只要蛋白質具有對應於本發明之由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的阿洛酮糖表異構酶的活性，即有可能在SEQ ID NO：1的胺基酸序列之前及之後增加無義序列，或包含自然發生之突變或其沉默突變。包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的蛋白質亦包含在本發明之範疇內。
另外，本發明之D-阿洛酮糖3-表異構酶可由SEQ ID NO：2的聚核苷酸序列或與其同源性為至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的聚核苷酸序列編碼，但本發明不限於此。另外，顯而易見的是，關於編碼本發明之D-阿洛酮糖3-表異構酶的聚核苷酸，能夠藉由密碼簡併轉譯成由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的蛋白質或與其具有同源性的蛋白質的聚核苷酸亦可包含在本發明的聚核苷酸序列範圍內。本領域的技術人員將理解，有可能使用已知重組技術藉由取代、添加及/或缺失SEQ ID NO：2的核苷酸序列中之一或多者來製備編碼具有實質上等效活性範圍的 酶的聚核苷酸。
在另一例示性實施例中，本發明之阿洛酮糖表異構酶可衍生自凱斯特菌屬(the genus Kaistia)之微生物。具體言之，本發明之阿洛酮糖表異構酶可衍生自細粒凱斯特菌(Kaistia granuli)，且更具體言之可衍生自細粒凱斯特菌KCTC 12575。
在另一例示性實施例中，如經由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)所量測，本發明之阿洛酮糖表異構酶的分子量可為25千道耳頓至37千道耳頓、27千道耳頓至35千道耳頓或30千道耳頓至35千道耳頓。
根據本發明之另一例示性實施例，提供一種編碼由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶之聚核苷酸。
在一例示性實施例中，本發明提供之聚核苷酸可為由SEQ ID NO：2的鹼基序列或與SEQ ID NO：2的鹼基序列的同源性為80%、90%、95%、97%或99%或更多的序列組成。另外，顯而易見的是，關於本發明提供之聚核苷酸，能夠藉由密碼簡併轉譯成由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的蛋白質或與其具有同源性的蛋白質之聚核苷酸亦包含在本發明之範圍內。
根據本發明之另一例示性實施例，提供一種包含編碼本發明之D-阿洛酮糖3-表異構酶之聚核苷酸的重組載體。
本發明之重組載體可具有使用已知標準方法將編碼阿洛酮糖表異構酶之聚核苷酸插入至選殖載體(cloning vector)或表現載體中的形式。如本文中所使用之術語「選殖載體」是指能夠將DNA片段攜載至寄主細胞中並使其再生的載體。選殖載體可 更包含聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列及/或多個選殖位點。此處，多個選殖位點可包含核酸內切酶(endonuclease)以及限制酶位點中之至少一者。在一例示性實施例中，編碼阿洛酮糖表異構酶之聚核苷酸可位於聚腺苷酸化信號以及轉錄終止序列上游。如本文中所使用之術語「表現載體」是指對轉錄及轉譯適合宿主中的選殖DNA而言必要的DNA序列。另外，如本文中所使用之「表現載體」是指包含與插入片段可操作地連接以使得當存在於個體的細胞中時表現插入片段之必需調節元件的基因建構體。術語「可操作地連接」意謂一個功能由另一功能藉由聚核苷酸的聚核苷酸序列相關性來調節。表現載體可使用標準重組DNA技術製備及純化。表現載體可包含啟動子、起始密碼子、編碼胞嘧啶表異構酶的基因以及終止密碼子中之至少任一者。
根據本發明之另一例示性實施例，提供一種將如上文所描述之重組載體引入至其中的微生物。
在一例示性實施例中，將本發明之重組載體引入至其中的微生物可為藉由包含編碼包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的阿洛酮糖表異構酶之聚核苷酸的重組載體或藉由包含由SEQ ID NO：2的鹼基序列組成之聚核苷酸的重組載體轉型的微生物。
如本文中所使用之術語「轉型」意謂將基因或包含所述基因的重組載體引入至寄主細胞中以使得所述基因能夠在所述寄主細胞中表現。本發明包含任何經轉型基因，只要所述經轉型基因能夠在寄主細胞中表現，而不限於將其插入至寄主細胞的染色體中或其位於寄主細胞的染色體外部。本發明之轉型方法包含短暫轉型(transient transformation)、顯微注射、轉導、細胞融合、 磷酸鈣沉澱(calcium phosphate precipitation)、脂質體介導轉染(liposome-mediated transfection)、DEAE聚葡萄糖介導轉染(DEAE dextran mediated transfection)、電穿孔、電注射、化學處理等，但本發明不限於此。能夠藉由重組載體轉型的寄主細胞可包含原核生物細胞、植物細胞、動物細胞等。可使用具有較高DNA引入效率以及較高引入DNA表現率的寄主細胞。舉例而言，寄主細胞可為大腸桿菌(E.coli)、芽孢桿菌屬(the genus Bacillus)的菌株、棒狀桿菌屬(the genus Corynebacterium)的菌株、沙門氏菌屬(the genus Salmonella)的菌株等，並且舉例而言，可為諸如W3110、BL21、JM109、K-12、LE392、RR1以及DH5 α等的大腸桿菌。更具體言之，本發明之微生物可為保藏為KCCM11918P的大腸桿菌BL21(DE3)/KGDPE。
根據本發明之另一例示性實施例，提供一種用於製備D-阿洛酮糖的組成物，包含：SEQ ID NO：1的D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現D-阿洛酮糖3-表異構酶的微生物或所述微生物的培養物。
在一例示性實施例中，本發明之微生物可為菌株自身、其培養物或微生物的破裂物。本發明之培養物或破裂物可包含本發明之D-阿洛酮糖3-表異構酶。另外，本發明之微生物的培養物可包含或可不包含所述微生物。另外，本發明之微生物的破裂物可為藉由使微生物或其培養物破裂而獲得的破裂物或藉由使所述破裂物離心而獲得的上澄液。
在另一例示性實施例中，用於製備本發明之D-阿洛酮糖的組成物可更包含作為阿洛酮糖表異構酶的基質之D-果糖。
在另一例示性實施例中，本發明之微生物可固定於待使 用的載體(carrier)上。能夠用於本發明中之載體的一實例包含(但不限於)瓊脂、瓊脂糖、k-鹿角菜膠、海藻酸鹽或聚葡萄胺糖。
另外，用於製備本發明之D-阿洛酮糖的組成物可更包含能夠支援阿洛酮糖的製備的任何組分。具體言之，用於製備本發明之D-阿洛酮糖的組成物可更包含金屬。更具體言之，本發明之金屬可由以下所構成的族群中選出的至少一種金屬：錳、鈣、鎂、鐵、鋰以及鈉。另外，本發明之金屬可為金屬離子或金屬鹽。本發明之金屬的濃度可為0.1毫莫耳至10毫莫耳、0.1毫莫耳至7毫莫耳、0.1毫莫耳至4毫莫耳、0.5毫莫耳至10毫莫耳、0.5毫莫耳至7毫莫耳、0.5毫莫耳至4毫莫耳、1毫莫耳至10毫莫耳、1毫莫耳至7毫莫耳、1毫莫耳至4毫莫耳、2毫莫耳至10毫莫耳、2毫莫耳至7毫莫耳或2毫莫耳至4毫莫耳。更具體言之，本發明之金屬鹽可為由以下所構成的族群中選出的至少一個金屬鹽：LiCl、Na2SO4、MgCl2、NaCl、FeSO4、MgSO4、MnCl2、MnSO4以及CaCl2。
根據本發明之另一例示性實施例，提供一種用於製備D-阿洛酮糖的方法，包含：使由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現D-阿洛酮糖3-表異構酶的微生物或所述微生物的培養物與D-果糖接觸。
在一例示性實施例中，製備方法可更包含在與D-果糖接觸之前、之後或同時添加金屬。
在另一例示性實施例中，製備方法可更包含在與D-果糖接觸或添加金屬之後分離及/或純化包含阿洛酮糖的接觸產物。分離及/或純化可藉由一或多種已知方法執行，諸如滲析、沉澱、吸附、電泳、離子交換層析法以及分步結晶等，但不限於此。
另外，本發明之製備方法可更包含在分離及/或純化之前或之後進行脫色及/或淡化。藉由進行脫色及/或淡化，有可能獲得不含雜質的更精煉的阿洛酮糖。
在另一例示性實施例中，本發明之製備方法可更包含在與D-果糖接觸、添加金屬、分離及/或純化或進行脫色及/或淡化之後使D-阿洛酮糖結晶。可藉由使用習知使用的結晶方法進行結晶。舉例而言，可藉由使用冷卻結晶方法進行結晶。
在另一例示性實施例中，本發明之製備方法可更包含在結晶之前濃縮阿洛酮糖。濃縮可提高結晶效率。
在另一實施例中，本發明之製備方法可更包含在分離及/或純化之後使未反應的D-果糖與阿洛酮糖表異構酶接觸，或可更包含在結晶之後再使用在分離及/或純化中結晶自其分離的母液，或其組合。經由額外步驟，可以較高產率獲得阿洛酮糖並且可減少待丟棄的D-果糖的量，從而提供經濟效益。
在一例示性實施例中，本發明之接觸可在酸鹼值5.0至9.0下執行，在40℃至90℃下執行，且/或進行0.5小時至48小時。
具體言之，本發明之接觸可在酸鹼值6.0至8.5、在酸鹼值6.0至8.0或在酸鹼值7.0至8.0下進行。
另外，本發明之接觸亦可在以下溫度下進行：40℃至80℃、40℃至75℃、40℃至65℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至75℃、50℃至65℃、55℃至90℃、55℃至80℃、55℃至75℃、55℃至65℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至75℃、60℃至65℃、65℃至90℃、65℃至80℃或65℃至75℃。
另外，本發明之接觸可進行0.5小時或大於0.5小時、1小 時或大於1小時、3小時或大於3小時、5小時或大於5小時、6小時或大於6小時，及/或48小時或小於48小時、36小時或小於36小時、24小時或小於24小時、12小時或小於12小時、9小時或小於9小時。
用於製備本發明之D-阿洛酮糖的方法中所描述之阿洛酮糖表異構酶、金屬以及載體與上文所描述之例示性實施例中所描述的阿洛酮糖表異構酶、金屬以及載體相同。
根據本發明之又一例示性實施例，提供阿洛酮糖表異構酶、表現阿洛酮糖表異構酶之微生物或所述微生物之培養物的用途，如本文中所描述用於在製備阿洛酮糖中轉化D-果糖。
圖1為用於表現本發明之由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的阿洛酮糖表異構酶(KGDPE)之重組載體的圖式。
圖2是使用本發明之KGDPE的將D-果糖用作基質來製備阿洛酮糖的結果的HPLC分析資料。
圖3a及圖3b是展示阿洛酮糖表異構酶根據溫度的相對酶活性的曲線圖，其中圖3a展示衍生自先前技術中的根癌農桿菌之D-阿洛酮糖3-表異構酶(ATPE)之活性，且圖3b展示本發明中的KGDPE之活性。
圖4為展示本發明之KGDPE根據酸鹼值的改變之相對酶活性的圖。
圖5為展示本發明之KGDPE根據各種金屬的添加之相對酶活性的圖。
在下文中，將藉由以下實例更詳細地描述本發明。然而，本發明不限於以下實例，且應理解，本領域的技術人員可在本發明之範疇以及精神內作出各種修改以及改變。
貫穿本發明之說明書，除非另外指出，否則用以指代特定物質的濃度的「%」是指固體/固體(重量/重量)%、固體/液體(重量/體積)%，以及液體/液體(體積/體積)%。
實例
實例1.製備衍生自凱斯特菌屬之微生物的阿洛酮糖表異構酶的經轉型菌株之製備。
選擇預期具有阿洛酮糖表異構酶的活性的基因，所述活性將D-果糖自凱斯特菌屬之微生物轉化成阿洛酮糖，並且製備包含所述基因之重組表現載體以及經轉型微生物。
具體言之，預期為阿洛酮糖表異構酶的細粒凱斯特菌KCTC 12575之基因kgdpe選自在基因庫(Genbank)登記的凱斯特菌屬的微生物之基因序列，並且基於所述基因的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)以及核苷酸序列(SEQ ID NO：2)來設計並合成正向引子(SEQ ID NO：3)以及反向引子(SEQ ID NO：4)。藉由使用所合成之引子，藉由使用細粒凱斯特菌KCTC 12575的基因體DNA作為模板來進行PCR反應(33個循環：1個循環包含94℃持續1分鐘，58℃持續30秒以及72℃持續1分鐘)而將基因擴增。使用PCR純化套組(Quiagen)來純化經擴增之基因，並使用限制酶NdeI以及notI將所述基因插入至pET24a(+)(諾傑公司(novagen)，美國)中以 建構重組載體pET24a(+)-KGDPE(圖1)。
藉由熱衝擊轉型(薩姆布魯克以及拉塞爾(Russell)：分子選殖，2001年)將重組載體轉型為大腸桿菌BL21(DE3)，並且隨後在50%甘油中冷凍貯藏並使用所述重組載體。經轉型菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)/KGDPE，於2016年10月20日保藏在韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms；KCCM)中，其為依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)的國際保藏機構，並授與寄存編號KCCM11918P。
實例2.阿洛酮糖表異構酶之製備以及純化
為了自實例1中所製備之大腸桿菌BL21(DE3)/KGDPE製備阿洛酮糖表異構酶，將大腸桿菌BL21(DE3)/KGDPE接種至5毫升LB-康微素(LB-kanamycin)介質中，並使其在37℃、200轉/分鐘下經受震盪培養，直至在600奈米處量測之吸光度達至1.5為止。隨後，將經震盪培養之培養液接種至500毫升LB-康微素介質中，並且當在600奈米處之吸光度為0.7時添加0.5毫莫耳異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)，且在16℃及150轉/分鐘下將細胞進行主培養16小時。
經主培養之培養液在8000轉/分鐘下離心20分鐘以僅回收細胞，並且用0.85%(重量/體積)NaCl洗滌細胞兩次，且隨後所述細胞在裂解緩衝液(50毫莫耳Tris-HCl、酸鹼值7.0的300毫莫耳NaCl)中裂解，並使用音波振動器在4℃下破裂20分鐘。使所破裂液體在4℃、13,000轉/分鐘下離心20分鐘以回收上澄液。隨後，將上澄液施加至先前與上述裂解緩衝液平衡之Ni-NTA柱(Ni-NTA超流，凱傑(Qiagen))，並且使含有250毫莫耳咪唑(imidazole) 之緩衝溶液(50毫莫耳Tris-HCl，300毫莫耳NaCl，酸鹼值7.0)連續地流動以獲得經純化之阿洛酮糖表異構酶(下文稱作KGDPE)。KGDPE之SDS-PAGE確認單體之大小約為32千道耳頓。
實例3. KGDPE活性的確認
3-1.自D-果糖至阿洛酮糖之轉化活性的確認
為了確認KGDPE是否使用D-果糖作為基質製備阿洛酮糖，將實例2中所製備之KGDPE(50毫莫耳Tris-HCl，酸鹼值7.0)添加到含有50重量%的D-果糖以及3毫莫耳MnSO4之50毫莫耳Tris-HCl緩衝液(酸鹼值8.0)中，並在55℃下反應6小時。隨後，藉由在100℃下加熱5分鐘來停止反應，並且隨後藉由HPLC分析確認阿洛酮糖之製備。使用配備有安美納斯(Aminex)HPX-87C柱(伯瑞(BIO-RAD))的HPLC(安捷倫(Agilent)，美國)折射率偵測器(安捷倫1260 RID)進行HPLC分析，其中流動相溶劑為水，溫度為80℃，且流動速率為0.6毫升/分鐘。
因此，確認可使用KGDPE由D-果糖製備阿洛酮糖(圖2)。
3-2.自D-果糖至阿洛酮糖之轉化活性的確認
為了確認KGDPE之製備能力是否優於用於阿洛酮糖的製備之習知阿洛酮糖表異構酶(ATPE，SEQ ID NO：5，韓國專利早期公開第10-2011-0035805號)之製備能力，確認自D-果糖至阿洛酮糖的轉化率。
具體言之，將藉由重組表現載體pET24a-ATPE轉型的大腸桿菌BL21(DE3)接種至含有濃度為10微克/毫升的康微素之LB介質中，並且隨後表現且以與實例2中相同之方式純化酶。將所獲 得之酶添加到含有50重量%的D-果糖以及3毫莫耳MnSO4的50毫莫耳Tris-HCl緩衝液(酸鹼值8.0)中，並在55℃下反應6小時。隨後，藉由在100℃下加熱5分鐘來停止反應，並且隨後藉由HPLC分析確認阿洛酮糖之製備。在與實例3-1中相同之條件下進行HPLC分析。轉化至阿洛酮糖之轉化率經計算為每分鐘由酶製備阿洛酮糖的量(毫克/分鐘)，並且KGDPE的反應比率展示為相對值，其中ATPE之反應比率值經設定為100%。
因此，確認在使用KGDPE時每分鐘製備阿洛酮糖的量相比於在使用ATPE時為117.6%，且因此自D-果糖轉化至阿洛酮糖之轉化比率在使用KGDPE時顯著提高(表1)。
實例4.KGDPE特性之分析
4-1.根據溫度的酶活性之分析
使KGDPE以及D-果糖基質在各種溫度條件(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃以及75℃)下反應2小時，並且比較根據溫度之酶活性。以除溫度以及反應時間之外與實例3-1中相同之方式進行上述反應，並且將酶活性量測為自D-果糖至阿洛酮糖之轉化比率。轉化比率經計算為在反應之後製備的阿洛酮糖重量相對於在反應之前的基質(D-果糖)重量的百分比。
因此，KGDPE在全部量測溫度範圍內顯現25%或大於25%的高轉化活性，並且確認活性隨著溫度提高而提高，並且在最高溫度75℃下觀測到最大轉化比率(表2)。
[表2]
4-2.酶的熱穩定性之分析
為了將KGDPE的熱穩定性與習知酶ATPE的熱穩定性進行比較，使相應酶在各種溫度(55℃、60℃以及65℃)下經熱處理，並且每個熱處理時間(0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時以及6小時)均取樣酶處理溶液以測定每種酶的殘留活性。藉由以與實例3-1中相同之方式僅改變反應時間來進行反應持續30分鐘，並且藉由自D-果糖至阿洛酮糖的轉化比率來量測酶的殘留活性。
因此，根據溫度升高的KGDPE半衰期的減小明顯小於ATPE半衰期的減小，且因此，確認KGDPE具有較高熱穩定性(圖3a及圖3b)。
4-3.根據酸鹼值的酶活性的分析
為了測定根據酸鹼值的酶活性，使D-果糖基質與KGDPE在各種酸鹼值下反應。此時，以除反應時間以及酸鹼值之外與實例3-1中相同之方式進行反應。
具體言之，藉由使用50毫莫耳磷酸鉀在酸鹼值5.0、酸鹼值6.0、酸鹼值6.5、酸鹼值7.0、酸鹼值7.5以及酸鹼值8.0下，且使用50毫莫耳Tris-HCl緩衝液在酸鹼值8.0、酸鹼值8.5以及酸鹼值9.0下在55℃下進行酶反應持續30分鐘。隨後，酶活性經量測為自D- 果糖轉化至阿洛酮糖之轉化比率。
因此，確認KGDPE在酸鹼值6至酸鹼值8.5下顯現與最大活性相比70%或大於70%的活性，並且在酸鹼值8.0下顯現最高活性(表3，圖4)。
4-4.根據金屬的添加之酶活性分析
為了確認根據金屬添加的KGDPE之活性，在與實例3-1中相同的反應條件下，用各種金屬鹽(LiCl、Na2SO4、MgCl2、NaCl、FeSO4以及CaCl2)替換MnSO4並添加至3毫莫耳的最終濃度。隨後，量測酶活性。對照組未經金屬鹽處理。
因此，確認Li、Na、Mg、Fe和Ca以及Mn的添加相比於對照組提高KGDPE的活性，且其中，可確認Mn提高酶活性最多(表4以及圖5)。
本發明之阿洛酮糖表異構酶的將D-果糖轉化成阿洛酮糖的活性極佳，具有在工業上可用的程度之高溫穩定性，並且具有快速轉化反應速率。因此，當使用本發明之阿洛酮糖表異構酶來製備阿洛酮糖時，有可能以高效率以及高產率製備阿洛酮糖。
根據以上描述，本領域的技術人員將理解，可在不修改本發明之技術理念或其基本特性的情況下以其他特定形式製得本發明。就此而言，應理解，上文所描述的實施例在所有態樣中為說明性而非限制性。本發明之範疇應解釋為涵蓋衍生自所附申請專利範圍之含義以及範疇及其等效物的所有修改或變化而非實施方式。
【生物材料寄存】
[國外寄存資訊]
保藏機構名稱：韓國微生物保藏中心(KCCM)
寄存編號：KCCM11918P
保藏日期：20161020
[國內寄存資訊]
保藏機構名稱：食品工業發展研究所
寄存編號：BCRC940663
保藏日期：20180209
<110> CJ第一製糖
<120> D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備D-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載 體、微生物以及組成物
<130> 74792-PI-479
<150> KR 16/0152947
<151> 2016-11-16
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> KGDPE的胺基酸序列
<400> 1
<210> 2
<211> 894
<212> DNA
<213> KGDPE的核苷酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> KGDPE的正向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> KGDPE的反向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 289
<212> PRT
<213> ATPE的胺基酸序列
<400> 5

Claims (9)

  1. 一種多肽之用途，其係用於由D-果糖生產D-阿洛酮糖，所述多肽為由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述D-阿洛酮糖3-表異構酶由SEQ ID NO：2的聚核苷酸序列編碼。
  3. 一種聚核苷酸之用途，其係用於由D-果糖生產D-阿洛酮糖，所述聚核苷酸編碼如申請專利範圍第1項所述的用途中的所述D-阿洛酮糖3-表異構酶。
  4. 一種重組載體之用途，其係用於由D-果糖生產D-阿洛酮糖，所述重組載體包括如申請專利範圍第3項所述的用途中的所述聚核苷酸。
  5. 一種微生物之用途，其係用於由D-果糖生產D-阿洛酮糖，其中將如申請專利範圍第4項所述的用途中的所述重組載體引入至所述微生物。
  6. 一種用於製備D-阿洛酮糖的組成物，包括：D-果糖以及由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現所述D-阿洛酮糖3-表異構酶的微生物或前述微生物的培養物。
  7. 一種製備D-阿洛酮糖的方法，包括：使由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現所述D-阿洛酮糖3-表異構酶的微生物或前述微生物的培養物與D-果糖接觸。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的製備D-阿洛酮糖的方法，其中所述接觸在酸鹼值5.0至9.0下進行，在40℃至90℃的溫度下進行，或進行持續0.5小時至48小時。
  9. 如申請專利範圍第7項所述的製備D-阿洛酮糖的方法，更包括：在與所述D-果糖接觸之前、之後或同時使由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的所述D-阿洛酮糖3-表異構酶、表現所述D-阿洛酮糖3-表異構酶的所述微生物或前述微生物的所述培養物與金屬接觸。
TW106139740A 2016-11-16 2017-11-16 D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物 TWI666323B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
??10-2016-0152947 2016-11-16
KR20160152947 2016-11-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201823456A TW201823456A (zh) 2018-07-01
TWI666323B true TWI666323B (zh) 2019-07-21

Family

ID=62145632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106139740A TWI666323B (zh) 2016-11-16 2017-11-16 D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11174475B2 (zh)
EP (1) EP3543336A4 (zh)
JP (1) JP6967599B2 (zh)
KR (1) KR101919713B1 (zh)
CN (1) CN110462036B (zh)
AR (1) AR110093A1 (zh)
RU (1) RU2727903C1 (zh)
TW (1) TWI666323B (zh)
UA (1) UA126473C2 (zh)
WO (1) WO2018093153A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101965509B1 (ko) * 2017-11-15 2019-04-03 씨제이제일제당 (주) 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
CN110904132B (zh) * 2019-11-05 2022-08-16 吉林中粮生化有限公司 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用
CN110862980B (zh) * 2019-11-29 2021-05-04 浙江工业大学 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用
CN111019928B (zh) * 2019-12-11 2022-08-16 吉林中粮生化有限公司 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用
KR102254411B1 (ko) * 2019-12-19 2021-05-24 대상 주식회사 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
EP4257689A1 (en) 2021-12-29 2023-10-11 Daesang Corporation Novel promoter variant for constitutive expression and use thereof
CN114262703A (zh) * 2021-12-31 2022-04-01 保龄宝生物股份有限公司 一种利用膜富集d-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014109254A1 (ja) * 2013-01-08 2014-07-17 松谷化学工業株式会社 アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058086A1 (ja) * 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
GB0822937D0 (en) * 2008-12-16 2009-01-21 Terranol As Microorganism
KR20110035805A (ko) 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
KR101203856B1 (ko) * 2011-08-24 2012-11-21 씨제이제일제당 (주) 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 연속적 생산
CN104769125B (zh) * 2012-08-10 2018-10-23 株式会社三养社 阿洛酮糖差向异构酶及使用其的用于转变为阿洛酮糖的组合物
KR101455624B1 (ko) 2013-04-12 2014-10-28 주식회사한국야쿠르트 기능성 희귀당 사이코스의 생산능을 지닌 신규 클로스트리디움 볼티에 유래의 사이코스-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스 생산방법
KR101455759B1 (ko) * 2013-04-23 2014-10-28 씨제이제일제당(주) 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법
US9790481B2 (en) 2013-09-03 2017-10-17 Roquette Frères Variant of D-psicose 3-epimerase and uses thereof
KR101539097B1 (ko) * 2013-12-26 2015-07-23 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
CN103849613A (zh) * 2014-01-03 2014-06-11 江南大学 一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶及其应用
CN103710330B (zh) * 2014-01-03 2015-04-22 江南大学 一种高催化活性的d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的突变体酶及其应用
KR101807507B1 (ko) * 2015-12-23 2017-12-12 씨제이제일제당(주) D-사이코스 3-에피머화 효소 및 염을 포함하는 d-사이코스 제조용 조성물 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
CN105602879B (zh) * 2016-01-26 2019-09-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株高效分泌d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用
CN105802897B (zh) * 2016-05-26 2019-02-12 江南大学 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶生产菌株及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014109254A1 (ja) * 2013-01-08 2014-07-17 松谷化学工業株式会社 アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RefSeq WP_018181373 2013/07/19
RefSeq WP_018181373 2013/07/19 Zhu et al., "Overexpression of D-psicose 3-epimerase from Ruminococcus sp. in Escherichia coli and its potential application in D-psicose production." Biotechnol Lett. 2012, vol. 34, page:1901-1906 *
Zhu et al., "Overexpression of D-psicose 3-epimerase from Ruminococcus sp. in Escherichia coli and its potential application in D-psicose production." Biotechnol Lett. 2012, vol. 34, page:1901-1906

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019535320A (ja) 2019-12-12
TW201823456A (zh) 2018-07-01
UA126473C2 (uk) 2022-10-12
KR101919713B1 (ko) 2018-11-19
US11174475B2 (en) 2021-11-16
AR110093A1 (es) 2019-02-20
CN110462036A (zh) 2019-11-15
EP3543336A4 (en) 2020-06-17
KR20180055736A (ko) 2018-05-25
RU2727903C1 (ru) 2020-07-24
EP3543336A1 (en) 2019-09-25
CN110462036B (zh) 2023-07-14
US20200063117A1 (en) 2020-02-27
JP6967599B2 (ja) 2021-11-17
WO2018093153A1 (ko) 2018-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI666323B (zh) D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物
KR101539096B1 (ko) 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물
TWI700370B (zh) 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法
CA3058589A1 (en) Composition for producing tagatose and method of producing tagatose using the same
TWI704227B (zh) 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法
JP6995410B2 (ja) 新規ケトース３－エピメラーゼ
KR20140080282A (ko) Ｄ-사이코스 3-에피머화 효소를 이용한 과당으로부터 사이코스의 제조방법
US11485963B2 (en) D-Psicose 3-epimerase and method for producing D-Psicose using the same
JP2018537991A (ja) Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ及びその塩を含むｄ−プシコースを製造するための組成物、並びにこれを用いたｄ−プシコースの製造方法
WO2014025235A1 (ko) 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물
EP3845659A1 (en) Novel fructose-4-epimerase and method for preparing tagatose using same
JP7404537B2 (ja) アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びそれを利用したアルロースの製造方法
EP3865574B1 (en) Allulose epimerase variant, method for producing same, and method for producing allulose using same
JP7094449B2 (ja) アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びこれを用いたアルロースの製造方法
CN112867793B (zh) 新型果糖-c4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法
JP6919792B2 (ja) フルクトース−ｃ４−エピメラーゼ及びこれを用いてタガトースを製造するための製造方法
WO2022114207A1 (ja) 新規ｌ－ラムノースイソメラーゼ
JP2023554112A (ja) 熱安定性に優れたアルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法およびこれを用いたアルロースの製造方法
KR101479135B1 (ko) 아스페르기루스 플라버스 유래 솔비톨 탈수소화효소와 ｎａｄｈ 산화효소와의 커플링에 의한 ｌ－자일룰로스의 생산