KR20110035805A

KR20110035805A - 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법

Info

Publication number: KR20110035805A
Application number: KR1020090118465A
Authority: KR
Inventors: 홍영호; 김진하; 김성보; 김정훈; 이영미; 박승원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2011-04-06
Also published as: CN102869783A; EP2470668B1; HRP20161658T1; SI2470668T1; US8735106B2; EP2470668A2; EP2470668A4; CN102869783B; PL2470668T3; HUE031275T2; HK1175207A1; ES2614891T3; BR112012007215A2; JP2013501519A; WO2011040708A2; US20120244580A1; BR112012007215B1; WO2011040708A3; PT2470668T

Abstract

본 발명은 식품안전형으로 발현된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당 또는 포도당으로부터 사이코스를 연속생산하는 방법에 관한 것이다.

사이코스, 사이코스 에피머화 효소, 포도당 이성화 효소, 고정화, 알기네이트.

Description

사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법{Method of producing D-psicose using immobilized D-psicose 3-epimerase}

사이코스는 설탕과 유사한 단맛을 가지나, 초저열량인 단당류로서 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 특히, 사이코스는 천연 물질 내에 거의 존재하지 않거나 또는 소량으로만 존재하기 때문에 "희귀당(rare sugar)"로 알려져 있다.

사이코스는 과당의 에피머로서, 감미의 강도와 종류는 과당과 매우 유사하나, 과당과 달리 체내 흡수시 거의 대사되지 않기 때문에 열량은 제로에 가깝고 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제해서 복부 비만을 감소시키는 기능을 갖기 때문에, 다이어트 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 설탕 대체 감미료로 널리 이용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는 등의 부작용을 일으키는 반면, 사이코스는 부작용이 거의 없다(Matsue, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, and H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., and K. Izumori. 2004. D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127).

이와 같은 이유로 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다.

종래의 사이코스 에피머화 효소를 이용한 사이코스의 생산기술은 재조합 대장균에서 대량 발현된 재조합 효소 또는 이를 포함하는 숙주를 이용한 과당으로부터 사이코스로의 에피머화 공정 개발에 집중되어 있었다. 그러나 이러한 재조합 대장균을 이용한 사이코스의 생물공학적 생산은 식품안전성 측면에서 식품 소재로서의 사이코스 생산에 부적합하다. 식품 소재로서 이용될 수 있는 사이코스를 제조하기 위해서는 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주이면서 산업적으로 대량 생산이 가능한 숙주에서 발현된 사이코스 에피머화 효소 또는 이를 포함한 숙주를 이용한 대량 생산 방법의 개발이 요구된다.

GRAS(Generally Recognized As Safe)는 일반적으로 안전하다고 여겨지는 물질로서 경험과 훈련을 거친 전문가들이 과학적 절차를 통해 물질의 의도된 사용조건 하에서 안전성을 평가하였을 때 안전하다고 판단되는 물질을 말한다. GRAS 제도는 미국만이 가지고 있는 독특한 제도로서 일정한 사용조건 하에서 안전성이 높은 식품 및 식품화학물질에 적용되지만 그 중요성 및 필요성이 미국 뿐 아니라, 국제적으로도 인식되고 있기 때문에 앞으로 추이가 주목되는 제도이다.

한편, 사이코스의 산업적 생산을 위해서는 보다 값싼 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법을 개발하는 것이 요구된다. 현재는 사이코스 에피머화 효소의 높은 기질 특이성 때문에, 가격이 높은 과당만이 사이코스 생산을 위한 기질로 이용되고 있다.

이에 본 발명자들은 식품 소재로 이용될 수 있는 사이코스를 효과적으로 대량생산하는 방법에 대한 연구를 지속하여, 사이코스의 산업적 대량 생산을 위해 효소의 활성을 위한 안정적인 환경을 제공하는 고정화를 이용하고 사이코스 에피머화 효소와 함께 포도당 이성화 효소를 이용하면 과당 또는 포도당으로부터 사이코스를 연속생산할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식품 소재로 이용될 수 있는 사이코스를 제조하기 위한 식품안전형 사이코스 에피머화 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고정화된 식품안전형 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 에피머화 효소를 이용하여 포도당 또는 과당으로부터 사이코스를 연속생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 GRAS 균주에서 발현시킨 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS(generally accepted as safe) 균주의 배양물로부터 사이코스 에피머화 효소를 분리하는 단계, 및

상기 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주는 상기 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "식품안전형"은 식품 소재로 사용될 수 있을 정도로 안전하다는 것을 의미한다. 따라서, "식품안전형으로 발현된"은 대상 유전자가 식품 소재로 사용되어도 유해한 효과를 유발하지 않는 안전한 것으로 인정되는 균주, 예를 들면, GRAS 균주에서 발현되었다는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 재조합 벡터에 의해 GRAS 균주를 형질전환시키는 방법은 전기천공법을 포함하나, 이에 한정되지 않고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 형질전환 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 코리네박테리움 속 박테리아에서 활성을 갖는 프로모터에 작동가능하게 연결된 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 코리네박테리움 속 박테리아에서 tac 프로모터보다 보다 효율적으로 유전자를 발현시키는 것으로 확인된(대한민국 공개특허 제2006-0068505호), 서열번호 2 내지 8 중 하나의 서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 "사이코스 에피머화 효소"는 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 갖는 사이코스-3-에피머화 효소를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖거나 또는 그의 기능성 단편일 수 있다. 상기에서 기능성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열에 일부 아미노산의 치환, 삽입, 또는 결실 등에 의한 변이를 포함하나, 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 갖는 단편을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 속 균주일 수 있다.

코리네박테리움 속 균주는 L-라이신, L-쓰레오닌 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네박테리움 속 균주는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이고, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 가지고 있다. 뿐만 아니라 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있으며, 이로 인하여 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주는 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 11046일 수 있다.

사이코스 에피머화 효소는 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법 (directed evolution) 및 부위 특이적 돌연변이법 (site-directed mutagenesis) 등에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 사이코스 에피머화 효소의 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 일정한 정도 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지며, GRAS 숙주 에서 활성형으로 발현되는 재조합 효소 및 이를 포함하는 숙주세포는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물은 균주의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양조건에서 형질전환 균주를 배양하여 수득될 수 있다. 배양 방법은 당업계에 알려진 임의의 배양 방법, 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양 방법 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따른 사이코스를 제조하는 방법은 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물로부터 사이코스 에피머화 효소를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균주의 배양물로부터 원심분리, 여과 등에 의해 분리된 균체 또는 상기 분리된 균체를 균질화시키고 원심분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액으로부터 분획화, 크로마토그래피 등에 의해 분리 정제된 사이코스 에피머화 효소가 과당을 사이코스로 전환하기 위한 효소로 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 배양물 중의 균체, 또는 균체로부터 분리된 사이코스 에피머화 효소의 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사이코스를 제조하는 단계는 상기 사이코스 에피머화 효소 또는 상기 효소를 발현한 균체를 담체에 고정화시키는 단계를 더 포 함할 수 있다.

효소나 균체를 담체에 고정화시키는 경우, 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경이 제공될 수 있어서 효소나 미생물을 이용한 산업적 생산방법에서 고정화가 이용되고 있다. 고정화에 이용될 있는 담체는 알긴산나트륨과 같은 알기네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화는 알긴산나트륨을 담체로 이용하여 수행될 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누론산(β-D-mannuronic acid)과 글루론산(α-L-gluronic acid)으로 구성되며, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균체나 효소가 안정적으로 고정화될 수 있어 유리하다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화는 1.5% 내지 4.0%의 알긴산나트륨을 담체로 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화는 2%의 알긴산나트륨을 담체로 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화는 알긴산나트륨을 고정화 담체로 이용하여, 효소 또는 균체를 포함하는 시료에 1 내지 2배 부피의 알긴산나트륨 수용액을 첨가하고, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.1 M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드 형태의 균체-알기네이트의 결합체를 생성하는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 담체에 고정화시 키는 단계는 고정화된 효소를 컬럼에 충진시키는 단계 및 상기 충진된 컬럼에 과당 용액을 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.

효소나 균체가 고정화된 담체를 충진시킬 컬럼 및 상기 컬럼에 충진시키는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 사용된 효소나 균체, 또는 고정화 담체에 따라 적합한 것으로 용이하게 선택하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화된 효소를 컬럼에 충진시켜 충진상 컬럼(packed-bed column)을 제조할 수 있다. 충진상 컬럼에 기질인 과당 용액을 공급하는 것에 의해 효소 반응, 즉, 과당의 사이코스로의 전환이 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스 에피머화 효소를 포함하는 균체가 충진된 충진상 컬럼에 과당 용액을 일정 농도로 공급하면, 고정화된 균체에 의해 에피머화 반응이 진행되어 과당이 사이코스로 전환된다. 전환된 사이코스는 분리탑을 이용해 분리 및 정제 후 순수한 사이코스로 이용가능하다.

본 명세서에서 사용된 "고정화 반응기"는 사이코스를 생산하기 위한 반응이 담체에 고정화된 균체 또는 효소에 의해, 또는 담체에 고정화된 균체 또는 효소가 충진된 컬럼을 통해 일어나는 반응기를 의미한다. 즉, 고정화는 생물학적 활성을 제공하는 물질, 이 경우, 사이코스 에피머화 효소나 포도당 에피머화 효소 또는 이들을 포함하는 균체가 담체에 고정화되었다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "운전 안정성"은 사이코스와 같은 목적 산물을 연속적으로 생산하기 위해 생물 반응기를 초기 활성 대비 적합한 수준의 생산성을 유지하면서 운전할 수 있는 것을 의미하며, 보통 운전 기간으로 표시된다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 균체가 고정화된 담체를 충진한 컬럼에 50℃에서 300 g/L의 과당을 0.1 분/ml의 유속으로 공급하여 25일 이상의 운전 안정성을 확보할 수 있다.

본 발명은 또한, 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소를 담체에 고정화시키는 단계를 포함하는, 포도당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 제공한다.

전술된 바와 같이, 사이코스 에피머화 효소의 기질로 이용되는 과당은 값이 비싸기 때문에 산업적 대량 생산을 위해서는 포도당과 같은 값싼 기질로부터 사이코스를 생산하는 것이 요구된다. 포도당 이성화 효소는 포도당을 과당으로 전환시키는 효소이므로, 포도당을 상기 효소에 의해 과당으로 전환시켜 사이코스 에피머화 효소에 대한 기질을 제공할 수 있고, 이에 의해 두 개의 효소를 함께 이용하여 포도당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리된 균체 또는 사이코스 에피머화 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 포도당 이성화 효소는 포도당 이성화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리된 균체 또는 포도당 이성화 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구체에에서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체에에서, 상기 포도당 이성화 효소는 상업적으로 구입된 것일 수 있다. 예를 들면, 덴마크의 Novezymes사에서 판매하는 포도당 이성화 효소 또는 고정화된 포도당 이성화 효소가 이용될 수 있다.

포도당 이성화 효소 (glucose isomerase)는 포도당에서 과당을 전환시키는 대표적 효소로서 현재 프럭토올리고당 생산에 사용되고 있다. 현재 산업적 생산을 위해 이용되고 있는 효소들 가운데서도 그 역가 및 기작이 명확하게 규명된 효소 중 하나이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 GRAS 균주는 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자 및 포도당 이성화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 상기 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터에 의해 동시에 형질전환된 균주일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 속 박테리아일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화용 담체는 알긴산나트륨일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화는 2%의 알긴산나트륨을 담체로 이용 하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자와 포도당 이성화 효소를 코딩하는 유전자는 하나의 GRAS 균주에서 발현되거나 또는 각각 상이한 GRAS 균주에서 발현될 수 있고, 상기 고정화 단계는 배양된 GRAS 균주의 균체, 또는 상기 균체로부터 분리된 두 개의 효소를 혼합하여 담체에 고정화시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물 또는 상기 배양물로부터 분리된 균체 또는 사이코스 에피머화 효소와 포도당 이성화 효소를 각각 담체에 고정화시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 균체 또는 효소가 고정화된 담체를 컬럼에 충진하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 포도당으로부터 사이코스를 제조하는 방법은 고정화된 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소를 컬럼에 충진하는 단계 및 상기 충진된 컬럼에 포도당 용액을 공급하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화된 효소를 컬럼에 충진시켜 충진상 컬 럼을 제조할 수 있다. 충진상 컬럼에 기질인 포도당 용액을 공급하는 것에 의해 효소 반응, 즉, 포도당의 사이코스로의 전환이 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 고정화된 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소는 각각 별개의 컬럼에 충진될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스 에피머화 효소가 고정화된 담체와 포도당 이성화 효소가 고정화된 담체를 각각 별개의 컬럼에 충진시키고, 상기 두 개의 컬럼을 소통될 수 있도록 연결하여, 상기 포도당 이성화 효소가 충진된 컬럼으로부터 상기 사이코스 에피머화 효소가 충진된 컬럼으로 포도당 이성화 반응의 산물인 과당이 공급되어 사이코스로의 전환 반응이 일어나게 할 수 있다. 상기 2개의 소통된 컬럼으로 구성된 고정화 반응기에 포도당 용액을 기질로 공급하면, 포도당 이성화 효소가 충진된 컬럼에서 포도당이 과당으로 전환되고, 상기 과당이 사이코스 에피머화 효소가 충진된 컬럼으로 공급되어 사이코스로 전환되므로, 포도당으로부터 최종 산물인 사이코스를 수득할 수 있다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 사이코스 생산 방법을 이용하여, 식품 재료로 이용될 수 있는 식품안전형 사이코스를 포도당 또는 과당으로부터 대량으로 연속 생산할 수 있다.

사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소의 활성 측정

사이코스 에피머화 효소와 포도당 이성화 효소의 활성은 각각 과당 및 포도당을 기질로 이용하여 측정하였다. 100g/L 기질이 함유된 50 mM PIPES(piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액 pH 8.0 중에 상기 효소 또는 효소를 포함하는 시료를 첨가하고 50℃에서 1시간 반응시킨 후 상기 반응액을 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 중단시켰다. 과당, 포도당 및 사이코스의 농도는 RI(Refractive Index) 검출기가 장착된 HPLC로 측정하였다. HPLC 분석은 80℃로 설정된 컬럼(Supelcogel Pb column)에 시료를 주입한 후 이동상 용매로 증류수를 0.5 ml/min의 속도로 통과시키는 조건에서 수행하였다. 사이코스는 체류 시간(retention time) 32분 경에 분리되었고 사이코스 표준 물질의 정량에 기초하여 전환율 및 생산성을 산출하였다. 효소활성의 비교분석을 위해 효소 1 단위(unit)는 pH 8.0와 50℃에서 분당 1 마이크로몰 (μmole)의 사이코스를 생산하는 양으로 정의하였다.

실시예 1 : 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 재조합 균주

(1) 재조합 균주의 제조

아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) ATCC 33970의 DNA를 주형으로 이용하고 각각 PstI과 XbaI 제한효소 인식부위의 서열이 도입된 서열번호 9와 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하여(95℃에서 30초간 변성 후, 95℃에서의 30초, 55℃에서의 30초 및 68℃에서의 1분으로 구성된 사이클을 26회 수행 후, 68℃에서 10분간 신장시킴) 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 사이코스 에피머화 효소를 대량 발현하기 위하여, 코리네박테리움 속 박테리아에서 유래된 셔틀벡터 pCJ-1 (2004년 11월 6일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁, 수탁번호 KCCM-10611)에 제한효소 PstI과 XbaI으로 절단된 상기 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 재조합 발현 벡터 pCJ-1-ATPE를 제작하였다. 도 1은 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pCJ-1-ATPE를 제조하는 방법을 개략적으로 보여준다.

재조합 발현 벡터 pCJ-1-ATPE를 전기천공을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환에 의해 도입하여 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 재조합 균주를 제조하였다. 상기 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATPE으로 명명하고 부다페스트 조약에 따라 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, KCCM)에 2009년 10월 26일자로 수탁번호 KCCM 11046으로 기탁하였다.

(2) 사이코스 에피머화 효소의 발현

상기 (1)에서 얻어진 재조합 균주를 각각 10㎍/ml 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지(Bacto-trypton 10 g/L, Bacto-yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, Soytone 5 g/L)에 초기농도 O.D. 600 = 0.1로 접종하고, 30℃에서 24시간 배양하여 재조합 사이코스 에피머화 효소의 발현을 유도하였다. 상기에서 수득된 배양액을 10 ㎍/ml 농도의 카나마이신을 함유한 변이배지(포도당 80 g/L, 소이톤(soytone) 20 g/L, (NH₄)₂SO₄ 10 g/L, KH₂PO₄ 1.2 g/L, MgSO₄ 1.4 g/L) 3 L를 담은 5 L 발효기(jar fermenter)에 O.D. 600 = 0.6으로 접종하고 30℃에서 20시간 배양하였다. 발현된 사이코스 에피머화 효소의 활성을 측정하기 위해, 배양액을 8000 x g 에서 10분간 원심분리하여 균체를 수거한 후, 50 mM EPPS 완충용액(pH 8.0)(Sigma-Aldrich)에 재현탁하고, 상기 현탁액에 초음파 처리를 수행하여 세포를 파쇄시켰다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 사이코스 에피머화 효소를 포함하는 상등액을 수득하고 이를 효소로 사용하여 과당의 에피머화 반응을 실시하였다. 에피머화 반응은 전술된 사이코스 에피머화 효소 활성의 측정법을 이용하였다. 도 2b는 에피머화 반응의 HPLC 분석 결과를 보여준다.

실시예 2. 재조합 균주의 고정화 및 사이코스의 제조

(1) 재조합 균주의 고정화

본 실시예에서는 사이코스의 대량 생산을 위해 상기 실시예 1에서 제조된 아 그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATPE(KCCM 11046)를 담체에 고정화시켰다. 재조합 균체의 고정화를 위해 먼저, 실시예 1에서 사용한 코리네박테리움 변이 배지에 재조합 균주를 초기농도 O.D. 600 = 0.6으로 접종하고 30℃에서 20시간 배양하였다. 상기 배양 후, 배양액의 원심분리에 의해 균체를 회수하고, 회수된 세포가 20%가 되도록 50 mM EPPS 완충용액(pH 8.0)에 현탁시켰다. 현탁된 재조합 균주의 균체를 2% (v/v)의 알긴산나트륨 (sodium alginate) 수용액에 첨가하고, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 이용하여 100 mM CaCl₂ 용액에 떨어뜨려 균체가 알긴산나트륨의 비드에 포집된 균체-알기네이트의 결합체를 생성시켰다.

(2) 고정화 재조합 균주를 이용한 사이코스의 제조

상기 (1)에서 알긴산나트륨에 고정화된 재조합 균주를 XK16 충진상 컬럼(packed-bed column)(16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia)에 충진 후 과당의 사이코스로의 전환율을 측정하였다. 고정화 반응기의 최적 반응온도 및 과당 기질 농도를 결정하기 위해 40℃, 45℃ 및 50℃의 온도와 100 g/L, 300 g/L및 500 g/L의 과당 농도의 조합 조건에서 반응을 수행하여 과당의 사이코스로의 전환 반응을 위한 최적 온도 및 기질 농도를 결정하였다. 도 3a 내지 3c에 따르면 50℃의 반응 온도 및 100 g/L에서 가장 우수한 전환율을 보였으나, 300 g/L 및 500 g/L의 기질 농도에서도 높은 전환율을 보였다. 또한, 다른 당전환 반응과 달리, 사이코스 에피머 화 반응은 온도에 대한 의존성은 낮은 것으로 보였다.

(2-1) 과당의 유입 속도에 따른 생산성

상기에 기재된 바와 같이, 고정화된 재조합 균주를 XK16 충진상 컬럼에 충진 후 과당이 투입되는 유속에 따른 생산성을 측정하였다. 이 때, 과당 농도는 상기 (2)에서의 결과를 바탕으로 300 g/L의 농도로 고정하였으며 반응온도는 50℃로 고정하였다. 유속은 공간 속도(space velocity)(1/h)가 0.4, 1, 2, 4, 8 h^-1이 되도록 과당 기질을 조절하며 생산성을 측정하였다. 결과가 하기의 표 1 및 도 4에 표시된다.

표 1. 과당의 유입 속도에 따른 생산성 및 전환율.

유속(ml/분)	과당(g/l)	사이코스(g/l)	생산성(g/l/시)	전환율(%)
3	281.388	3.693	33	1.30
2	289.215	3.309	20	1.13
1	291.268	7.579	23	2.54
0.5	284.639	12.055	18	4.06
0.25	286.463	20.579	15	6.70
0.1	260.096	38.041	11	12.76

(2-2) 운전 안정성(operational stability)

컬럼에 충진된 고정화 재조합 균주의 운전 안정성을 측정하기 위해 XK16 충진상 컬럼에 충진된 고정화 재조합 균주를 50℃ 온도에서 각각 비활성(specific activity)이 50%가 될 때까지 운전을 실시하였다. 이때 과당 기질의 농도는 300 g/L이며 유속은 0.1 min/ml (space velocity 0.4 h^-1)였다. 본 반응 조건 하에서 약 25일 이상 운전 안정성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었다.

도 5는 50℃의 반응 온도에서 고정화 재조합 균주의 운전 안정성을 보여준다.

실시예 3. 고정화 재조합 균주/효소를 이용한 포도당으로부터 사이코스의 제조

(1) 반응온도 및 포도당 농도에 따른 생산성

고정화된 포도당 이성화효소 (Novezymes, Denmark) 10 g 과 상기 실시예 2의 (1)에서 알긴산나트륨에 고정화된 재조합 균주를 각각 XK16 충진상 컬럼(packed-bed column)(16 mm X 20 mm, Amersham pharmacia)에 충진 후 포도당의 사이코스로의 전환율을 측정하였다. 2개 효소의 혼합반응의 최적 조건을 결정하기 위해 40℃, 45℃, 및 50℃의 반응 온도 및 100 g/L, 300 g/L, 및 500 g/L의 포도당 농도 조건에서 반응을 수행하여 최적 온도 및 기질 농도를 결정하였다. 도 6은 반응 온도 및 기질 농도 변화에 따른 사이코스의 전환율을 보여준다. 도 6a 내지 6c에 따르면, 포도당 이성화 반응은 사이코스 에피머화 반응과 달리 온도에 의존적인 반응이다. 즉 온도가 높을수록 포도당에서 과당으로의 전환속도가 빨라져 결국 사이코스 생산성에도 영향을 미치고 있는 것을 볼 수 있었다. 50℃의 반응 온도에서 가장 우수하였으며 기질 농도의 경우 농도가 높아질수록 반응속도에 큰 차이를 보이지 않았다. 이 결과는 고농도의 기질 조건에서 고정화 반응기의 운전이 가능하며 단위 생산성을 증가 시킬 수 있다는 것을 보여준다.

(2) 포도당의 유입 속도에 따른 생산성

고정화된 포도당 이성화효소와 사이코스 에피머화 효소를 포함한 재조합균주를 각각 2개의 충진상 컬럼에 충진 포도당이 투입되는 유속에 따른 생산성을 측정하였다. 반응조건은 위 실시예의 결과를 바탕으로 300 g/L의 포도당 농도와 반응온도는 50℃로 고정하였다. 유속은 공간 속도(1/h)가 0.4, 1, 2, 4, 8 h^-1이 되도록 과당 기질을 조절하며 생산성을 측정하였다. 결과가 하기의 표 2와 도 7에 표시된다.

표 2. 포도당의 유입 속도에 따른 생산성 및 전환율.

유속(ml/분)	포도당(g/l)	과당(g/l)	생산성(g/l/hr)	전환율 (%)
4	281.465	31.136	374	9.96
3	278.849	40.042	360	12.56
2	267.061	50.196	301	15.82
1	238.615	78.854	237	24.84
0.5	207.168	113.081	170	35.31
0.1	172.826	155.850	47	47.42

도 1은 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pCJ-1-ATPE의 제조과정을 개략적으로 보여준다.

도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 활성을 HPLC에 의해 측정한 결과로서, 도 2a는 각 당의 표준 물질, 도 2b는 반응에 의한 전환을 보여준다.

도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 재조합 균주를 이용하여 과당 100g/L (3a), 300g/L (3b), 500g/L (3c), 및 온도 (40℃, 45℃, 50℃)의 조합에 따른 사이코스 전환 반응의 전환율을 보여준다.

도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 기질인 과당의 유속에 따른 사이코스의 생산성을 보여준다.

도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 반응 온도 50℃에서 고정화 반응기의 운전 안정성을 보여준다. 상대적 활성(%)은 운전 개시 시의 활성 대비 활성을 의미한다.

도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 고정화된 포도당 이성화 효소와 고정화된 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 재조합 균주를 이용하여 포도당 100g/L (6a), 300g/L (6b), 500g/L (6c), 및 온도 (40℃, 45℃, 50℃)의 조합에 따른 사이코스 전환 반응의 전환율을 보여준다.

도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에서, 포도당 유속에 따른 사이코스 생산성을 보여준다.

<110> CJ CheilJedang Coroporation <120> Method of producing D-psicose using immobilized D-psicose 3-epimerase <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D-psicose 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 12 16 21 26 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 31 36 41 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 46 51 56 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 61 66 71 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 76 81 86 91 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 96 101 106 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 111 116 121 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 126 131 136 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 141 146 151 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Tyr Leu 156 161 166 171 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 176 181 186 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 191 196 201 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 206 211 216 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 221 226 231 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 236 241 246 251 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 256 261 266 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 271 276 281 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Tyr Leu Gly 286 291 296 Gly <210> 2 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ1 promoter <400> 2 caccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt 60 gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120 caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180 gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240 tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 300 a 301 <210> 3 <211> 285 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ2 promoter <400> 3 aattccacca gacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg 60 atgaatggga gaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag 120 cagagcaatc ggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag 180 atttctacat cgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc 240 aacgtttaaa ttccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca 285 <210> 4 <211> 291 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ3 promoter <400> 4 gctgcctaca tctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa 60 gccggcatgg tctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc 120 gtcaaggcat ccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac 180 caacaggccg tacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc 240 aactaattct ccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c 291 <210> 5 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ4 promoter <400> 5 actgggaggg taggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg 60 ttaccctcct aggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg 120 cgggatgctc aaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt 180 gtaactggca cgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct 240 caagtgccgt gacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca 300 ggaggacata ca 312 <210> 6 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ5 promoter <400> 6 tcggacatat acggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa 60 ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc 120 gcagtgtagg gaacctcggt actatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct 180 ttgaagtaat tctcccaggc aatagctttt gacgtactcc gcttcccaac tttttaggag 240 acaactacc 249 <210> 7 <211> 332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ6 promoter <400> 7 ggcttcatcg tcgtctttga tccgatgcga gtccattaac ccaaactcct taaagcccgt 60 aaaacggggg tattccaaca cggttatcca cagtttaacc gttattcggg ggtaatccta 120 acccaaatca ttacggaaac tccaatctgg ctcacaatat cctccatgat tctagggaca 180 cccaatcagg tgcacccgct tcctgcgaca acgagtcaaa ctcggcaaag ccctcaacct 240 gtcggtctag aatatatata ccgcccggtc tagtgttgtg gtgtacacta acgataaacc 300 aacaaagttg tctattaaga ggaggccatt tc 332 <210> 8 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CJ7 promoter <400> 8 agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60 gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120 catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180 cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240 agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300 caacgaaagg aaacactc 318 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for D-psicose 3-epimerase <400> 9 aaaactgcag atgaaacacg gcatcta 27 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for D-psicose 3-epimerase <400> 10 ctagtctaga tcagccacca agaacgaag 29

Claims

아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS(generally accepted as safe) 균주의 배양물로부터 사이코스 에피머화 효소를 분리하는 단계, 및

상기 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 단계를 포함하는, GRAS 균주에서 발현시킨 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 배양물 중의 균체, 또는 균체로부터 분리된 사이코스 에피머화 효소의 형태인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 속 균주인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 11046인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이코스를 제조하는 단계는 상기 사이코스 에피머화 효소를 담체에 고정화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 담체는 알긴산나트륨인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 고정화된 효소를 컬럼에 충진시키는 단계 및 상기 충진된 컬럼에 과당 용액을 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
사이코스 에피머화 효소, 및 포도당 이성화 효소를 담체에 고정화시키는 단계를 포함하는, 포도당으로부터 사이코스를 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 발현하는 GRAS 균주의 배양물 또는 상기 배양물부터 분리된 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 GRAS 균주는 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 균주인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 속 박테리아인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 GRAS 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 11046인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 아그로박테리움 투머파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 담체는 알긴산나트륨인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 고정화된 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소를 컬럼에 충진하는 단계 및 상기 충진된 컬럼에 포도당 용액을 공급하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 고정화된 사이코스 에피머화 효소 및 포도당 이성화 효소를 각각 별개의 컬럼에 충진하며, 상기 컬럼들은 상호 소통되도록 연결되는 것인 방법.