CN103710329A - 一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于双酶共表达技术领域，具体涉及的是定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达；本发明为了克服现有技术的不足，提供一种对葡萄糖异构酶146位氨基酸定点突变，并与D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的方法，具体为：将定点突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增、纯化、克隆；将克隆得到的双酶核苷酸序列分别与pCDFDuet-1载体进行双酶切，酶切产物纯化连接，构建重组表达质粒，诱导表达得到重组菌，收集重组菌超声破碎得到含有双酶的粗酶液。

Description

一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法

技术领域

本发明属于双酶共表达技术领域，具体涉及的是定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达。

背景技术

木糖异构酶(xylose isomerase，Xiase，EC 5.3.1.5)，又称葡萄糖异构酶(glucose isomerase，GIase)，在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的异构化反应，是食品工业生产上以淀粉为原料制备果葡糖浆的关键酶之一。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，缩写为DPE）是目前能实现D-果糖到D-阿洛酮糖之间生物转化的一种主要酶，属于酮糖3-差向异构酶家族，最适底物为D-阿洛酮糖。因此，应用基因工程技术制备葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组酶，可以有效地将D-葡萄糖转化为D-果糖、再由D-果糖转化为D-阿洛酮糖。

应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其他生物体内含量极微但却具有很高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活跃的研究方向之一。中国科学技术大学生命科学学院独家承担国家科委863项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程”，经十五年科技攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构建表达量极高的基因重组链霉菌工业生产菌株，已具备将基因重组葡萄糖异构酶产业化的成熟的科技条件。一些研究者从菊芋假单胞菌( Pseudomonas cichorii )中分离纯化得到D-塔格糖3-差向异构酶(DTE)，用重组表达的酶固定化制成的生物反应器以60%(w/v)的果糖为底物，转化率达到25%；研究者也将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中D-塔格糖 3-差向异构酶类似蛋白的基因重组表达得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase)；另外，一些研究者从土壤中筛选得到根瘤菌(Sinorhizobium sp.)，其渗透化细胞以70%的D-果糖为底物，15h反应后D-阿洛酮糖浓度达到37mg/mL。目前并没有公开将葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达来同时得到两种酶的文献，也没有对葡萄糖异构酶对146位氨基酸定点突变的公开内容。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种对葡萄糖异构酶146位氨基酸定点突变，并与D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，包括以下步骤：

第一步，获得目的基因

将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸，然后将突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增；将扩增后的所述定点突变的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别纯化后，分别克隆所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列；

第二步，重组表达质粒的构建

将上述得到的定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列及pCDFDuet-1载体分别用Bam HI和Kpn I进行双酶切，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体分别用Bgl II和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T₄连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序；产物再将阳性转化子的质粒转入宿主菌中诱导表达得到重组菌；

第三步，将重组菌经离心收集，并超声破碎，再次离心即得到定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的粗酶液。

所述第一步中定点突变的步骤为：

以pET-28a-GI为模板，设计完全互补配对的上、下游突变引物；按以下程序进行PCR反应：95℃ 3 min；94 ℃ 30s，60℃ 30 s，68℃ 6min，共16个循环；68℃ 10min；PCR产物经DpnI消化后，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取转化子培养并测序，若测序发现未正确突变，则重新挑取单菌落测序或重新突变后测序，直至突变成功；

所述上、下游突变引物为：

F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC

R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。

所述第一步定点突变后的葡萄糖异构酶核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列进行PCR扩增的条件为：

突变葡萄糖异构酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3′

下游引物：5′-GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3′

D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3′

PCR反应体系（50µL）为：10×Taq缓冲溶液5µL，模板DNA1µL，浓度为10µmol•L^-1的引物2µL，浓度为2.5mmol•L^-1 的dNTPs 4µL，TaqDNA聚合酶0.3µL，超纯水35.7µL，混匀；反应条件：95℃ 5min；94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 2min，32个循环；72℃ 10min。

所述第二步中，所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为BamHI和Kpn I；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为Bgl II和Hind III。

所述第二步中诱导表达的条件为：将构建好的重组菌在培养基中培养，于37℃水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30mL培养基的250mL三角瓶中，继续培养至OD₆₀₀为0.6~0.8时，加入IPTG终浓度为1mmol•L^-1，20℃诱导表达。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。

1、芽孢杆菌来源的葡萄糖异构酶146位氨基酸为精氨酸（Arg），在高温下，精氨酸容易发生脱氨反应。Arg位于2个β折叠中间的α转角处，Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小，可能影响GI的热稳定性。经定点突变后146位氨基酸精氨酸（Arg）变为脯氨酸（Pro），Pro属于亚氨基酸，位于芽孢杆菌葡萄糖异构酶β转角的第2个氨基酸，有增强蛋白的热稳定性的作用。

2、离子半径越大，其水合离子半径越小，越有利于它钻入到凹陷的区域。对于Mg²⁺、Co²⁺和Mn²⁺等离子半径小于0.08 nm 的激活离子，当离子和酶结合后，使活性部位（疏水区）外露，以便和底物结合。Ca²⁺等离子半径大于0.08 nm 的抑制剂，水合半径更小，更易钻入活性口袋和酶紧密结合，使疏水区减少，反而有抑制酶活的作用。定点突变后，葡萄糖异构酶146位氨基酸精氨酸（Arg）变为脯氨酸。此氨基酸处于2个β折叠中间的α转角处，Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小。146位氨基酸接近GI的活性中心，GI空间构象发生微小变化，Ca²⁺不易钻入活性口袋，和酶活性中心结合松散，减小了干扰，提高了果糖产率。

3、基因工程技术制备重组酶：自然界存在的葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖3-差向异构酶含量少，活力低，野生菌株培养不易（厌氧）以及酶制备较困难（产酶水平低），大规模生产纯化工艺较为复杂，限制了其扩大应用。因此，通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性葡萄糖苷酶对其实现工业化具有重要意义。

4、菌种的选择：经筛选后，来源于芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的葡萄糖异构酶活力与其它菌种来源相比活力最高；来源于Ruminococcus sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶与来源于其它菌种的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、D-塔格糖 3-差向异构酶相比，热稳定性最好，D-果糖转化生成D-阿洛酮糖的效率最高，更适合D-果糖生成D-阿洛酮糖的工业生产。

5、质粒的选择：本发明需同时表达葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖3-差向异构酶两种酶，选择的pCDFDuet-1为原核共表达质粒，含两个T7启动子，包括两个多基因结合位点，可共表达两个靶蛋白，克服了两个质粒在同一宿主中的不相容性。

6、重组酶的酶学性质：异源表达产物（重组酶）的性质常常因为分子操作和所采用的表达宿主细胞的生理特征而发生改变，本研究结果显示，重组酶葡萄糖异构酶（GI）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）的主要酶学性质与天然酶相比，没有本质上的改变。其中，最适作用温度、最适作用 pH、热稳定性与天然酶相似；在金属离子依赖性方面，两酶共表达时除对 Mg²⁺依赖性有所改变外，无显著改变。

附图说明

图1为含有定点突变的酶葡萄糖异构酶的粗酶液热稳定。

图2为含有定点突变的酶葡萄糖异构酶的粗酶液和未突变酶葡萄糖异构酶粗酶液在80℃时的热稳定性对比图。

图3为密码子优化后的定点突变的酶葡萄糖异构酶（Line1）和未突变的酶葡萄糖异构酶（Line2）的SDS-PAGE对比图。

图4为pCDFDuet-1质粒载体图谱。

图5为蛋白质表达SDS-PAGE分析图。

图6为温度、pH值对阿洛酮糖生成量的影响折线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明采用芽孢杆菌作为葡萄糖异构酶的酶源，大肠杆菌作为重组酶核苷酸序列宿主菌。

本发明前三步采用基因工程技术制备共表达重组酶的具体流程为：

菌种筛选

GI定点突变

载体选择

获得目的基因

重组表达质粒构建

目的蛋白的诱导表达

SDS-PAGE

分析鉴定

酶学性质分析。

一、酶基因来源：

经初筛与复筛、分子鉴定及酶学性质研究筛选出葡萄糖异构酶活性最高的菌株，利用NCBI中的BLAST软件对活性最高菌株进行16SrDNA序列分析发现，该菌株与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）同源性最近。又根据同源序列搜索，并且下载一些相关菌种的16SrDNA序列，利用MEGA4.0软件来构建系统进化树，进一步探索该菌株与芽孢杆菌（Bacillus sp.）的亲缘关系，发现该菌株与Bacillus sp. 进化距离最短，这与BLAST比对的结果一致。

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase)，根据根癌农杆菌的DPE的序列在NCBI上BLAST发现，根据Takara Bio Inc公司提供“保守假定蛋白”（ZP_04858451）的序列合成Ruminococcus sp. DPE基因的全部核苷酸序列。

对葡萄糖异构酶定点突变位点的选择

对不同来源的葡萄糖异构酶进行蛋白质序列比对，并通过DS软件对不同嗜热细菌葡萄糖异构酶三维结构进行分析，发现来源于嗜热细菌葡萄糖异构酶的146位氨基酸为脯氨酸（Pro），而此芽孢杆菌来源的葡萄糖异构酶均为精氨酸（Arg）。在高温下，精氨酸容易发生脱氨反应，此氨基酸处于2个β折叠中间的α转角处，Pro相对于Arg具备一定的刚性结构，形成的转角活动度小，可能影响GI的热稳定性。因此选择位点R146P进行定点诱变。

对葡萄糖异构酶的定点突变

引物：F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC

R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT

载体：pET28a-GI

采用扩增质粒的方法，以pET-28a-GI为模板，设计完全互补配对的上下游突变引物。按以下程序进行PCR反应：95℃ 3min；94 ℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 6min，共16个循环；68℃ 10min。PCR产物经DpnI消化后，转化E.coli DH5α感受态，涂布于含10%卡那霉素的LB（LB-Kana）平板。挑取转化子培养并送至金唯智生物科技有限公司测序。若测序发现未正确突变，则重新挑取单菌落测序或重新突变后测序，直至突变成功。

同时对突变的葡萄糖异构酶进行了热稳定性测定：

突变型粗酶液在缓冲体系于60、70、80、90℃水浴中保温处理，每隔一定时间取样，测定葡萄糖异构酶酶活，残留酶活变化结果见图1。图1结果显示，60℃时，保温24h，还能保留90%的酶活；70℃和80℃在保温24h后分别能保留78%和50%酶活，在90℃超高温下，也能保持4h的稳定性。而在图2中可以看出，野生型粗酶液在80℃保温24h只有35%的酶活，相比突变型菌株来讲，降低了15%。说明突变成Pro后，增强了此葡萄糖异构酶的热稳定性。这一结果暗示葡萄糖异构酶146位的Pro对维持其热稳定性影响起到至关重要的作用。Pro由于其结构熵比其它氨基酸小而更易折叠，且一旦折叠则需要很高的能量才能解折叠，这样在不影响其高级结构的前提下，Pro的替代可以提高整个蛋白质分子的热稳定性。Pro属于亚氨基酸，一般认为，当Pro在α螺旋的N末端或者在2个β折叠中间时，有增强蛋白的热稳定性的作用。将芽孢杆菌葡萄糖异构酶的146位氨基酸突变为Pro，处于β转角的第2个氨基酸，分析认为146位的Pro，对维持其热稳定性有很大的作用。

还对葡萄糖异构酶密码子进行优化以增加在大肠杆菌中的高效表达：将重组型葡萄糖异构酶送去金唯智公司进行密码子优化，此葡萄糖异构酶蛋白含量的测定以野生型葡萄糖异构酶为对照，用凝胶成像仪检测计算得到，野生型菌株以及其经过密码子优化的重组菌株，其葡萄糖异构酶蛋白含量分别约占可溶性蛋白的15%和25%，如图3所示。

二、基因载体的选择：

pCDFDuet-1质粒（如图4所示）含两个开放阅读框，包括两个多基因结合位点，每个位点前都有一个T7lac启动子和一个核糖体结合位点，可共表达两个靶蛋白；也可与pACYCDuet™-1 (Cat.No.71147-3)，pRSFDuet™-1(Cat. No. 71341-3)，pETDuet™-1 (Cat. No. 71146-3)相结合在一个适当的宿主菌株中共表达4~8个靶蛋白。本发明选择pCDFDuet-1质粒对葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖3-差向异构酶两种酶共表达。

三、获得目的基因：

（1）引物设计及目的片段的扩增：

根据GenBank上热芽孢杆菌（Bacillus sp.）葡萄糖异构酶的核苷酸保守设计引物。上游引物：5′-GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3′（下划线部分为Bgl II 酶切位点），下游引物：5′-GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3′（下划线部分为Kpn I酶切位点）。依据NCBI上Ruminococcus sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）的核苷酸保守设计上游引物：5′-CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3′（下划线部分为BamH I酶切位点），下游引物：5′-CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3′（下划线部分为Hind III 酶切位点）。

PCR反应体系（50µL）为：10×Taq缓冲溶液5µL，模板DNA1µL，浓度为10µmol•L^-1的引物2µL，dNTPs（2.5mmol•L^-1）4µL，TaqDNA聚合酶0.3µL，超纯水35.7µL，混匀。反应条件：95℃ 5min；94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 2min，32个循环；72℃ 10min。

（2）基因的克隆及序列分析：

将PCR扩增产物纯化后连接到pCDFDuet-1质粒载体上，转化E.coliDH5α感受态细胞。 筛选获得含dpe和xylA基因阳性克隆，经测序后在NCBI与已有葡萄糖异构酶序列、D-阿洛酮糖3-差向异构酶序列进行比对分析。

四、重组表达质粒的构建

将上述得到的葡萄糖异构酶突变基因及pCDFDuet-1分别用BamHI和Kpn I进行双酶切，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因与pCDFDuet-1分别用Bgl II和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T₄连接酶于16℃连接过夜，转化E.coliDH5α感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序。产物再将阳性转化子的质粒转入表达宿主菌中诱导表达。

五、目的蛋白的诱导表达

将构建好的重组工程菌在培养基中培养，于37℃水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30mL培养基的250mL三角瓶中，继续培养至OD₆₀₀为0.6~0.8时，加入IPTG终浓度为(1mmol•L^-1)，20℃诱导表达。16h后，4000r•min^-1冷冻离心收集菌体，将菌体悬于pH值7.0的磷酸缓冲溶液中，冰浴超声。超声波功率为200W，每超声5s间隔8s，共70次。

六、 SDS-PAGE 分析鉴定

将用超声波破碎后的细胞高温处理后离心，收集上清液，即为粗酶液。分别取上清和全菌体进行SDS-PAGE，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，考马斯亮蓝R-250染色，图5为检测的蛋白质表达情况。

经SDS-PAGE电泳分析，从图5可看出在相对分子质量为43kD处表达一条明显的蛋白条带，与报道的葡萄糖异构酶大小一样。在相对分子质量33kD处有一条明显的蛋白条带，表明RDPE表达成功。在此条件下重组蛋白均以可溶性形式存在。

七、葡萄糖异构酶和 D- 阿洛酮糖 3- 差向异构酶的酶学性质分析

对上述的重组蛋白葡萄糖异构酶（GI）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE）进行酶学性质分析。

（1）温度、pH值以及金属离子对阿洛酮糖生成量的影响以及热稳定性

BGI的葡萄糖异构酶和RDPE的D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性以其异构化果糖为D-阿洛酮糖的速率确定。反应体系为1mL（1mol/L 葡萄糖；100mmol/L PIPES缓冲液，pH7.0；1mmol/L MgCl₂）。异构化反应在65℃下进行 30min。所形成的果糖用分光光度计测定、阿洛酮糖用HPLC测定。异构酶活力定义：在检测条件下每分钟生成1mg果糖所需要的酶量为1个葡萄糖异构酶活力单位；每分钟生成1mg阿洛酮糖所需酶量为一个D-阿洛酮糖3-差向异构酶活力单位。

①研究BGI和RDPE共表达的最适作用温度、最适作用 pH和金属离子依赖性。图6为温度、pH值对阿洛酮糖生成量的影响折线图。

在不同温度下测定BGI和RDPE的酶活，以65℃下测得的酶活作为参照（记为100%），结果如图6所示：BGI和RDPE共表达的最适作用温度为60℃~70℃；在不同 pH 条件下测定BGI和RDPE 的酶活，以pH7.0下测得的酶活作为参照（记为100 %），结果如图6所示：BTGI和RDPE共表达的最适作用pH 为7.0；不同离子下测定BGI和RDPE 的酶活，以10 mmol/L CoCl₂ 存在下测得的酶活作为参照（记为100 %），结果表明BTGI和RDPE共表达的活性依赖Mg²⁺。

综上所述，双酶共表达后最适温度65°C，最适pH值为7.0，加入Mg²⁺对生成阿洛酮糖有很强的促进的作用。

②热稳定性测定在20mmol/L PBS 缓冲液（pH7.0） 1mmol/L MgCl₂中进行；pH稳定性测定在适应的缓冲液（pH5.0~11.0）中进行。

将BGI和RDPE置于pH7.0 缓冲液中，于不同温度下温浴不同时间，然后测定残存酶活，热稳定性实验结果表明，BTGI和RDPE 在70℃，65℃，55℃下的酶活半衰期分别为4h，8h和24h。70°C时，保温4h后几乎没有阿洛酮糖转化能力，65°C时，保温8h后失去阿洛酮糖转化能力，55°C，保温24h以后，还能保持80%的活性。

将BGI和RDPE 在不同pH缓冲液中于65℃下温浴10 min，冰浴中冷却后，测定残存酶活，结果表明BTGI和RDPE 在 pH7.0~8.0之间具有较好的稳定性。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (5)

1.一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，获得目的基因

将葡萄糖异构酶氨基酸序列的146位的精氨酸定点突变为脯氨酸，然后将突变后的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别进行PCR扩增；将扩增后的所述定点突变的葡萄糖异构酶的核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列分别纯化后，分别克隆所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列和D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列；

第二步，重组表达质粒的构建

将上述得到的定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列及pCDFDuet-1载体分别用Bam HI和Kpn I进行双酶切，将D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体分别用Bgl II和Hind III进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T₄连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，链霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序；产物再将阳性转化子的质粒转入宿主菌中诱导表达得到重组菌；

第三步，将重组菌经离心收集，并超声破碎，再次离心即得到定点突变的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶共表达的粗酶液。

2.根据权利要求1所述的一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，其特征在于所述第一步中定点突变的步骤为：

以pET-28a-GI为模板，设计完全互补配对的上、下游突变引物；按以下程序进行PCR反应：95℃ 3 min；94 ℃ 30s，60℃ 30 s，68℃ 6min，共16个循环；68℃ 10min；PCR产物经DpnI消化后，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含10%卡那霉素的LB平板；挑取转化子培养并测序，若测序发现未正确突变，则重新挑取单菌落测序或重新突变后测序，直至突变成功；

所述上、下游突变引物为：

F-AACTTATTTACCCATCCTCGCTTTGTCCATGGC

R-GCCATGGACAAAGCGAGGATGGGTAAATAAGTT。

3.根据权利要求1所述的一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，其特征在于所述第一步定点突变后的葡萄糖异构酶核苷酸序列与D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列进行PCR扩增的条件为：

突变葡萄糖异构酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-GAAGATCTCATGCCTTATTTTGACAACATCAGCA-3′

下游引物：5′-GGGGTACCTTAACGGGCTGCGCAAACTT-3′

D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列引物：

上游引物：5′-CGGGATCCGATGAAATATGGTATTTATTACGCT-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTGACTTCAAATACATGTTTTACA-3′

PCR反应体系（50µL）为：10×Taq缓冲溶液5µL，模板DNA1µL，浓度为10µmol•L^-1的引物2µL，浓度为2.5mmol•L^-1 的dNTPs 4µL，TaqDNA聚合酶0.3µL，超纯水35.7µL，混匀；反应条件：95℃ 5min；94℃ 45s，53℃ 45s，72℃ 2min，32个循环；72℃ 10min。

4.根据权利要求1所述的一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，其特征在于：所述第二步中，所述定点突变的葡萄糖异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为BamHI和Kpn I；所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶核苷酸序列与pCDFDuet-1载体的双酶切用酶为Bgl II和Hind III。

5.根据权利要求1所述的一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法，其特征在于所述第二步中诱导表达的条件为：将构建好的重组菌在培养基中培养，于37℃水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于装有30mL培养基的250mL三角瓶中，继续培养至OD₆₀₀为0.6~0.8时，加入IPTG终浓度为1mmol•L^-1，20℃诱导表达。

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