WO2019144944A1 - 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种生产阿洛酮糖及其衍生物的重组菌株构建方法及应用，通过调控葡萄糖胞内代谢，通过降低果糖6-磷酸激酶的酶活性，增强葡萄糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性、6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶、6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，果糖透过酶和果糖激酶、以及任选地核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶的酶活性，甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性，获得了重组菌株，合成阿洛酮糖、阿洛糖和阿洛糖醇。一种胞外多酶级联法合成阿洛酮糖和阿洛糖的方法，进一步将多酶级联催化法和发酵法相偶联，提高淀粉糖、蔗糖转化合成阿洛酮糖的转化率，该方法转化率高、生产成本低，适合规模化生产阿洛酮糖及其衍生物。

Description

一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株，其构建方法以及将其用于发酵生产阿洛酮糖、阿洛糖和阿洛糖醇中的应用。
背景技术
稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)。近年来，D-阿洛酮糖作为果糖的差向异构体在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，D-阿洛酮糖其甜度为蔗糖的70％，然而能量值仅为0.007kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3％，是一种非常理想的低卡路里甜味剂，可作为蔗糖替代品应用于食品领域；D-阿洛酮糖被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积，在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面也有很高的医疗价值。美国食品及药品管理局(FDA)于2011年正式批准D-阿洛酮糖为GRAS食品，允许应用到食品、医药制剂以及膳食补充剂中，因此，D-阿洛酮糖具有良好的应用前景和开发价值。
D-阿洛糖及阿洛糖醇能抑制多种癌细胞株的增殖，已被证明在癌症治疗方面有成效，作为一种抗氧化剂可以抑制活性氧(ROS)的产生所造成的氧化性损伤，降低了自由基含量并延迟恶化，同时作为一种抗炎剂，可以抑制缺血再灌注损伤，并抑制嗜中性粒细胞的分段生产，还可以发挥细胞冷冻保护剂应用于外科手术和器官移植，因此该稀少糖兼具药物治疗剂和功能食品功效，具有很大的应用潜力。
目前生产D-阿洛酮糖主要通过化学合成和生物转化两种方法，化学合成需要多步保护和脱保护步骤，生产成本高且收率低。生物转化法制备D-阿洛酮糖 以果糖为原料，经D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是目前合成D-阿洛酮糖的主要方式，然而该方法转化率低，目前最高只能达到32％的转化率，需要添加模拟流动床设备实现果糖循环利用，造成产物不易分离，阿洛酮糖生产成本升高。阿洛糖以阿洛酮糖为底物经醛酮异构获得，由于阿洛酮糖的成本已经很高，造成阿洛糖的售价也很高。
发明内容
本发明的第一方面，提供一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株构建方法及所构建的工程菌株和应用，所述生产阿洛酮糖及其衍生物工程菌株的构建方法至少包括以下任一步骤：
(1)增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性，例如通过引入强启动子或者采用质粒表达形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因的表达强度，或者采用染色体整合方式整合其他物种来源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因；
(2)降低果糖6-磷酸激酶的酶活性，例如采用基因敲除或者引入弱启动子方式，降低细胞果糖6-磷酸激酶基因的表达水平；
(3)增强6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，以及任选的核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶的酶活性，例如采用染色体整合或者质粒表达形式，向胞内引入6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，以及任选地核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶基因；
(4)增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性，例如采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，增强果糖透过酶和果糖激酶基因的表达水平；
(5)增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性，例如采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，提高甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶基因的表达水平。
本发明中，所述增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性和降低果糖6-磷酸激酶的酶活性目的在于提高胞内果糖6-磷酸的含量；所述增强6-磷酸阿洛酮糖异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶的酶活性的目的在于将胞内果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖；所述增强核糖-5-磷酸异构酶和6-磷酸阿洛糖磷酸酶的酶活性的目的在于将胞内阿洛酮糖6-磷酸转化为阿洛糖；所述增强核糖醇脱氢酶的酶活性的目的在于将所合成的阿洛酮糖转化为阿洛糖醇；所述增强果糖透过酶和果糖激酶活性的目的在于提高工程菌株利用果糖转化为果糖6-磷酸的能力；所述增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的目的在于提高重组菌株代谢甘油进行细胞生长的能力。
根据本发明，所述工程菌株的构建方法适用于以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等菌株为宿主菌进行遗传改造。所获得工程菌株可用于发酵法合成阿洛酮糖及其衍生物，例如阿洛糖或者阿洛糖醇。
本发明中，所述工程菌株发酵用培养基没有特别限定，可以为本领域常用的细菌发酵培养基，例如BHI培养基、TSB培养基，优选BHI培养基。
根据本发明，所述发酵体系中，可用糖类化合物或者甘油为底物，糖类化合物选自例如淀粉及其衍生物、蔗糖、葡萄糖、果糖；所述底物的初始浓度为1-5％，例如为2％，3％，4％，优选为2％。根据本发明，所述发酵温度为30-37℃，发酵时间为24-48小时。
作为本发明的实施方案，提供一种生产阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，至少包括以下任一步骤：
(1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因(SEQ ID NO:1)和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因(SEQ ID NO:2)，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP转化至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌株Allulose1；
(2)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，降低果糖6-磷酸激酶基因(S EQ ID NO:3)表达水平，得到重组菌株Allulose2；
(3)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP构建至重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose3；
(4)扩增来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶基因(SEQ ID NO:4)和葡萄糖6-磷酸异构酶基因(SEQ ID NO:5)，将其构建在表达载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI转化至重组菌株Allulose3中，得到重组菌株Allulose4；
(5)扩增来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因(SEQ ID NO:6)和来源于大肠杆菌Escherichia coli或者粪肠球菌Enterococcus faecalis的果糖激酶基因(SEQ ID NO:7)，并将其构建至表达载体pEC-P6PE-P6PP中得到重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF，将重组质粒pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF和任选的pXMJ19-GlK-PGI构建至重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose5；
(6)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的甘油透过酶基因(SEQ ID NO:8)、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶基因(SEQ ID NO:9)、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶基因(SEQ ID NO:10)，并将其构建至重组质粒pXMJ19-GlK-PGI中得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时转化至重组菌株Allulose2中得到重组菌株Allulose6。
在本实施方案中，所述步骤(1)中，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus或者大肠杆菌Escherichia coli，其中来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP不仅仅可以催化6-磷酸阿洛酮糖脱磷酸反应为阿洛酮糖，还可以催化6-磷酸阿洛糖脱磷酸反应为阿洛糖。
在本实施方案中，所述步骤(2)中，可通过基因敲除或者替换弱启动子的 方法降低果糖6-磷酸激酶基因表达水平。例如，可根据来源于果糖6-磷酸激酶基因的上游序列和下游序列设计引物，获得扩增的果糖6-磷酸激酶融合基因片段，构建基因敲除载体，导入宿主细胞，获得果糖6-磷酸激酶基因敲除的Allulose2。其中，所述果糖6-磷酸激酶基因可以是来源于谷氨酸棒杆菌，所述上游序列为SEQ ID NO:13，下游序列为SEQ ID NO:14。又例如，替换弱启动子的方法包括通过同源重组方法将细胞染色体上果糖6-磷酸激酶基因的启动子序列替换为弱启动子，进而降低果糖6-磷酸激酶基因的表达水平。
本发明还提供如上所述谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1、Allulose3、Allulose4、Allulose5和Allulose6。本发明还提供如上所述谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1、Allulose3、Allulose4、Allulose5和Allulose6在阿洛酮糖生产中的应用。
作为具体的实施方式，采用重组菌株Allulose1和重组菌株Allulose3发酵葡萄糖合成阿洛酮糖，重组菌株Allulose4和重组菌株Allulose5可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖或者以上三者的混合液如糖蜜生产阿洛酮糖；采用重组菌株Allulose6除了可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖或者以上三者的混合液如糖蜜生产阿洛酮糖外，还可以发酵甘油或者葡萄糖与甘油的混合培养基生产阿洛酮糖。作为本发明的又一实施方案，提供一种生产阿洛糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：在如前所述的生产阿洛酮糖的重组菌株中，进一步引入表达核糖-5-磷酸异构酶基因。
具体地，所述构建方法至少包括以下任一步骤：
(1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因(SEQ ID NO:1)，核糖-5-磷酸异构酶基因(SEQ ID NO:11)和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因(SEQ ID NO:2)，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP转化野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌株Allose1；
(2)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶基因，核糖-5-磷酸异构酶基因，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP构建至如上所 述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose2；
(3)将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose3；
(4)将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和所述的重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose4。
在本发明中，出乎意料的发现，发酵过程中6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶具有催化6-磷酸阿洛糖脱磷酸的活性；当同时导入核糖-5-磷酸异构酶基因和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因的重组菌株用于发酵时，阿洛糖的得率明显高于仅导入核糖-5-磷酸异构酶基因时，说明6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶对于6-磷酸阿洛糖脱磷酸具有催化作用。
本发明还涉及上述方法所构建的谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1，Allose2，Allose3和Allose4。
本发明还提供所述谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1，Allose2，Allose3和Allose4在阿洛糖生产中的应用。作为具体的实施方式，重组菌株Allose1，Allose2和Allose3可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖；重组菌株Allose4不仅仅可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖，也可以发酵甘油与葡萄糖合成阿洛糖。
作为本发明的又一实施方案，提供合成阿洛糖醇谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：在如前所述的生产阿洛酮糖的重组菌株中，进一步引入核糖醇脱氢酶基因。
具体地，所述构建方法至少包括以下任一步骤：
(1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶基因(SEQ ID NO:1)，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因(SEQ ID NO:2)，来源于产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca的核糖醇脱氢酶基因(SEQ ID NO:12)，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH， 将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH构建至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，获得重组菌株Allitol1；
(2)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH构建至所述重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol2；
(3)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和所述重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI共同转化至所述重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol3；
(4)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和所述的重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK共同转化至所述重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol4。
本发明还涉及上述方法所构建的谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3和Allitol4。
本发明还提供所述谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3和Allitol4在阿洛糖醇合成中的应用。重组菌株Allitol1，Allitol2和Allitol3可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖醇。重组菌株Allitol4不仅仅可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖醇，也可以发酵甘油与葡萄糖合成阿洛糖醇。
本发明的第二方面，提供胞外多酶级催化合成阿洛酮糖及其衍生物的方法，包括以淀粉、淀粉衍生物、或蔗糖中至少一种为底物，加入多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖或阿洛糖。
作为本发明的一种实施方案，是胞外多酶级联转化淀粉及衍生物合成阿洛酮糖的方法，以淀粉或其衍生物为底物，加入包含有葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，异淀粉酶，葡聚糖转移酶组成的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
所述淀粉及衍生物包括淀粉衍生物如水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或者多种按照任意比例组成的混合物，优选为麦 芽糊精。
所述反应体系中，淀粉或淀粉衍生物浓度为1-100g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的淀粉或淀粉衍生物浓度为50g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶用量为10U/mL，葡聚糖转移酶用量为10U/mL。
所述酶催化的反应温度为10-80℃，pH为5-9，反应时间为1-120小时；优选反应温度为10-40℃，例如10℃、20℃、30℃、37℃；优选反应pH为6.5，7.0，7.5,8.0；优选反应时间48-96小时，例如48小时、72小时、96小时。
作为本发明的一种实施方案，一种胞外多酶级联转化蔗糖合成阿洛酮糖的方法，以蔗糖为底物，加入包含有蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶组成的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
所述底物蔗糖不仅仅指纯品蔗糖，还可以为富含蔗糖的甘蔗糖蜜、大豆糖蜜等原料中的一种或多种，优选为纯品蔗糖。
所述反应体系中，蔗糖的浓度为1-100g/L,蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的蔗糖的浓度为20g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异 构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL。
所述酶催化的反应温度为10-80℃，pH为5-9，反应时间为1-120小时；优选反应温度为10-40℃，例如10℃、20℃、30℃、37℃；优选反应pH为6.5，7.0，7.5,8.0；优选反应时间48-96小时，例如48小时、72小时、96小时。
作为本发明的一种实施方案，一种胞外多酶级联转化淀粉及衍生物合成阿洛糖的方法，以淀粉或其衍生物为底物，加入包含葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶、6-磷酸阿洛糖磷酸酶，异淀粉酶以及葡聚糖转移酶组成的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛糖。
所述淀粉及衍生物包括淀粉衍生物如水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖中的任意一种或者多种按照任意比例组成的混合物，优选为麦芽糊精。
所述反应体系中，淀粉或淀粉衍生物浓度为1-100g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为0.1-1000U/mL，核糖-5-磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL、6-磷酸阿洛糖磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，异淀粉酶用量为0.1-1000U/mL，葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的淀粉或淀粉衍生物浓度为50g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，核糖-5-磷酸异构酶用量为10U/mL、6-磷酸阿洛糖磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶用量为10U/mL，葡聚糖转移酶用量为10U/mL。
所述酶催化的反应温度为10-80℃，pH为5-9，反应时间为1-120小时；优选反应温度为10-40℃，例如10℃、20℃、30℃、37℃；优选反应pH为6.5，7.0，7.5,8.0；优选反应时间48-96小时，例如48小时、72小时、96小时。
作为本发明的一种实施方案，一种胞外多酶级联转化蔗糖合成阿洛糖的方法，其特征为以蔗糖为底物，加入包含有蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶组成的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
所述底物蔗糖不仅仅指纯品蔗糖，还可以为富含蔗糖的甘蔗糖蜜、大豆糖蜜等原料中的一种或多种，优选为纯品蔗糖。
所述反应体系中，蔗糖的浓度为1-100g/L,蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为0.1-1000U/mL，核糖-5-磷酸异构酶0.1-1000U/mL，6-磷酸阿洛糖磷酸酶0.1-1000U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的蔗糖的浓度为20g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，核糖-5-磷酸异构酶10U/mL，6-磷酸阿洛糖磷酸酶10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL。
所述酶催化的反应温度为10-80℃，pH为5-9，反应时间为1-120小时；优选反应温度为10-40℃，例如10℃、20℃、30℃、37℃；优选反应pH为6.5，7.0，7.5,8.0；优选反应时间48-96小时，例如48小时、72小时、96小时。
根据本发明，所述6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶可选自来源于大肠杆菌Escherichia coli的基因序列SEQ ID NO:1编码的酶(KEGG编号b4085)；具体地，所述酶为EC:5.1.3.-K17195。
根据本发明，所述6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶可选自来源于大肠杆菌Escherichia coli的基因序列SEQ ID NO:2编码的酶(KEGG编号b1727)；具体地，所述酶为EC:3.1.3.23。
本发明的第三方面，提供一种基于酶转化和发酵相偶联的阿洛酮糖或阿洛糖制备方法，所述方法包括：用多酶复合体系对糖类底物进行酶解，然后以酶解液作为碳源制备培养基，采用如本发明第一方面所述重组菌株进行发酵。
根据本发明，所述底物为淀粉、淀粉衍生物或蔗糖。
根据本发明，所述多酶复合体系为本发明第二方面所述任一多酶复合物；重组菌株可以为本发明第一方面所述的任一重组菌株。
根据本发明，所述发酵温度为30-37℃，发酵时间为24-48小时。
根据本发明，所述培养基还含有氮源、氯化钠；优选地，所述氮源为酵母粉或者蛋白胨。
作为本发明的一个实施方案，是一种基于酶转化和发酵相偶联制备阿洛酮糖的方法，首先采用如本发明第二方面所述的多酶反应体系，转化淀粉或其衍生物，例如麦芽糊精合成阿洛酮糖，反应结束后所得反应液，作为碳源制备培养基，经灭菌离心后，采用如前所述的重组菌株Allulose5，对该培养基进行发酵，重组菌株代谢酶反应体系中残余葡萄糖和果糖，合成阿洛酮糖。
所述多酶反应体系中，淀粉或其衍生物和酶的用量与本发明第二方面中用量相同。
所述重组菌株Allulose5发酵培养基包括，多酶转化后反应液作为碳源，酵母粉1-40g/L作为氮源，氯化钠1-10g/L。优选的酵母粉用量为10g/L，氯化钠用量为10g/L，发酵条件为30℃，发酵时间为24-48小时。
作为本发明的一个实施方案，是一种基于酶转化和发酵相偶联的阿洛糖制备方法，首先采用如如本发明第二方面所述所述的多酶反应体系，转化淀粉或其衍生物，例如麦芽糊精合成阿洛糖，反应结束后所得反应液，作为碳源制备培养基，经灭菌离心后，采用如上所述重组菌株Allose3，对该培养基进行发酵，重组菌株代谢酶反应体系中残余葡萄糖和果糖，合成阿洛糖。
所述反应体系中，淀粉或其衍生物和酶的用量与本发明第二方面所述中用量相同，重组菌株Allose3发酵培养基包括：多酶转化后反应液作为碳源，酵母 粉1-40g/L作为氮源，氯化钠1-10g/L。优选的酵母粉用量为10g/L，氯化钠用量为10g/L，发酵条件为30℃，发酵时间为24-48小时。
本发明中，当细胞代谢葡萄糖、果糖等多种碳源时，可以胞内合成果糖6-磷酸，后者可以经阿洛酮糖6-磷酸差向异构酶催化为阿洛酮糖6-磷酸，再经去磷酸化酶合成阿洛酮糖，同时阿洛酮糖6-磷酸也可以经醛酮异构转化为阿洛糖6磷酸，经去磷酸酶合成阿洛糖，所以阿洛酮糖和阿洛糖的合成也可以经该路线实现，该合成路线经过磷酸化和去磷酸化步骤，与传统的差向异构方法相比，具有转化率高的优点，因此本发明提出采用基因工程技术和微生物学方法构建微生物工程菌株，再以廉价的葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖及糖蜜为底物发酵生产阿洛酮糖及其衍生物的新思路。
有益效果
(1)本发明通过微生物糖代谢路径分析，构建了可以高表达发酵生产阿洛酮糖及其衍生物过程中关键酶基因的重组工程菌株，实现了发酵法规模化生产阿洛酮糖及衍生物的新路径。
(2)通过本发明所构建的工程菌株生产阿洛酮糖及其衍生物，代谢过程中所产生的糖类副产物可被微生物作为营养成分利用，可实现反应过程中糖类的循环重复利用，有效提高原料转化率，淀粉、蔗糖和果葡糖浆等原料的转化率可达99％以上。
(3)本发明构建的工程菌株发酵生产阿洛酮糖及其衍生物时，由于微生物的代谢作用以及微生物胞内各种酶的表达水平的调控，有效抑制了最终产物中副产物的残留，可以得到组分单一的阿洛酮糖、阿洛糖和阿洛糖醇，有效解决了传统方法中阿洛糖类产物分离成本高的问题。
(4)本发明的胞外多酶级联法制备阿洛酮糖和阿洛糖可在低温下反应，反应条件温和，减少了美拉德反应的发生，提高了产物质量。
术语定义与说明
术语“D-阿洛酮糖”、“阿洛酮糖”、“Allulose”在本文中可以替换使用，是指D-果糖C3位置所对应的差向异构体，属于六碳稀少酮糖，为如下所示的化合物：
Figure PCTCN2019073256-appb-000001
术语“衍生物”是指化合物中H或其他原子/基团被其他原子或原子团取代所形成的化合物，或者经异构化或者水解所得产物。本文中，术语“阿洛酮糖衍生物”包括但不限于阿洛糖、阿洛糖醇。其中，“阿洛糖”、“D-阿洛糖”、“Allose”在本文中可以替换使用；“阿洛糖醇”、“D-阿洛糖醇”、“蒜糖醇”、“Allitol”在本文中可以替换使用。本文中，术语“淀粉衍生物”是指与淀粉具有相同结构单元的单糖、寡糖或多糖，包括但不限于水解淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖或麦芽糖；术语“淀粉”包括直链淀粉、支链淀粉。
术语“基因”广义上用于指编码多肽或表达的RNA的核酸分子(通常是DNA，但任选地为RNA)的任意片段。因此，基因包括编码表达的RNA(其可以包括多肽编码序列或例如功能性RNA，例如核糖体RNA、tRNA、反义RNA、微小RNA、短发夹RNA、核酶等)的序列。基因可以进一步包含其表达所需要的或影响其表达的调控序列，以及与其天然状态的蛋白质或RNA编码序列相关的序列，例如内含子序列、5′或3′非翻译序列等。在一些实施例中，“基因”可能仅指DNA或RNA分子的蛋白质编码部分，其可能包含或可能不包含内含子。基因的长度优选为大于50个核苷酸，更优选地长度大于100个核苷酸，并且可以是例如长度为50个核苷酸至500,000个核苷酸，例如长度为100个核苷酸至100,000个核苷酸、或长度为约200个核苷酸至约50,000个核苷酸、或长 度为约200个核苷酸至约20,000个核苷酸。基因可以获自多种来源，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成。
术语“野生的”在本文中用于指在宿主中天然存在的核酸序列或氨基酸序列，或者在自然界中天然存在的未经人工基因改造或重组的宿主细胞。术语“非天然的”、“基因重组”在本文中用于指不在宿主中天然存在或不以其在宿主中天然构造的方式构造的核酸序列或氨基酸序列。如本文在提及基因片段或核酸分子时所使用的术语“重组”或“改造的”是指通过人为干预已被改变的核酸分子。作为非限制性实例，cDNA是重组DNA分子，如为通过体外聚合酶反应已经产生的或已经连接了接头或已经整合到载体(例如克隆载体或表达载体)中的任意核酸分子。
当应用于生物体时，本文中可互换使用的术语“转基因的”或“重组的”或“经改造的”或“经遗传改造的”或“工程菌”是指通过将外源或重组核酸序列引入生物体中而被操纵的生物体。通常，异源多核苷酸被稳定地整合到基因组中，使得多核苷酸被传递到后代，但其也可以存在于附加体上，并且可以存在于转基因生物体的合成染色体上。非天然多核苷酸可以单独整合到基因组中或作为重组表达盒的一部分。在另一些实施例中，转基因微生物可以包括可操作地连接至转基因微生物的内源基因的引入的外源调控序列。非限制性实例包括基因敲除、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失或插入，以及将转基因引入生物体中。重组或经遗传改造的生物体也可以是引入了用于基因“敲除”的构建体的生物体。如本文所使用的“重组微生物”或“重组宿主细胞”、“工程菌”包括本发明重组微生物的后代或衍生物。
术语“载体”是指包含可选择的标记基因或允许载体在宿主细胞中复制的复制起点或自主复制序列(ARS)中的至少一个的核酸分子，并且在一些实施例中包括可选择的标记基因和至少一个复制起点或ARS两者。各种实施例中的“载体”、“重组载体”、“重组质粒”包含一个或多个表达序列和/或可以包含用于介导重组的至少一个序列。
本文中所引入的基因可以“来源于”指定的来源，其包括从指定来源分离(全部或部分)核酸区段，例如通过直接克隆、PCR扩增或从指定的多核苷酸来源或基于与指定的多核苷酸来源相关的序列人工合成，其可以是例如生物体种属。来源于特定来源或种属的基因或核酸分子或序列(例如，启动子)也包括相对于源核酸分子具有序列修饰的基因或核酸分子或序列。
如本文所使用的基因片段或序列的“连接”旨在表示两个或更多个序列之间的功能性连接，使得一个序列处或一个序列的活性影响其它序列处或其它序列的活性。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如，启动子)之间的可操作的连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。更进一步的，本文中基因片段的“连接”是指调控区和待转录的编码序列的定位，使得调控区对于调控目标编码序列的转录或翻译是有效的。
附图说明
图1为细胞内合成阿洛酮糖及其衍生物的技术路线。
图2为细胞外酶催化反应合成阿洛酮糖及其衍生物的技术路线。
图3为实施例6中重组菌株Allulose4发酵葡萄糖合成阿洛酮糖的高效液相色谱图分析结果。
图4为实施例7中重组菌株Allulose5发酵果糖合成阿洛酮糖的高效液相色谱图分析结果。
图5为实施例8中重组菌株Allulose6发酵甘油合成阿洛酮糖的高效液相色谱图分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V /V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。所采用的载体pEC-XK99E(Kirchner O and Tauch A.2003,Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum.J.Biotechnol.104:287–299)，pXMJ19(Jakoby,M.；Ngouoto-Nkili,C.-E.；Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnol.Tech.1999,13,437-441)，pK18mobsacB(
Figure PCTCN2019073256-appb-000002
A,Tauch A,Jager W,Kalinowski J,Thierbach G,Puhler A.1994.SmAllulose mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 145:69-73)，为已报道和公开的载体；所采用的葡萄糖，果糖，蔗糖，脑心浸粉，山梨醇，酵母抽提物，蛋白胨，麦芽糊精，卡那霉素，氯霉素等药品均购买于阿拉丁试剂商城；所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成；所采用的阿洛酮糖，阿洛糖，阿洛糖醇标准品购买自Sigma-Aldrich中国试剂商城。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围 下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-P6PP
根据KEGG数据库中来源于大肠杆菌6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因(SEQ ID NO:1)和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因(SEQ ID NO:2)，设计引物1，引物2，引物3和引物4，并通过PCR扩增获得相应序列，用限制性内切酶EcoRI和SmaI同时对基因P6PE和表达载体pEC-XK99E(Kirchner O and Tauch A.2003,Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum.J.Biotechnol.104:287–299)进行酶切，连接得到重组质粒pEC-P6PE；进一步采用限制性内切酶XbaI和PstI同时对基因P6PP和表达载体pEC-P6PE进行酶切、连接得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP。引物序列如下：
引物1 SEQ ID NO:15：taccggaattcatgaaaatctccccctcgttaatg
引物2 SEQ ID NO:16：gatcccccgggttatgctgtttttgcatgaggct
引物3 SEQ ID NO:17：gatggtctagaaaaggaggacaaccatgtcaaccccgcgtcagattct
引物4 SEQ ID NO:18：gacaactgcagttaaccgagaaggtcttttgcggt
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1
将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Allulose1。
具体过程如下：
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞(100μL)，具体包括以下步骤：
(1)从-80℃中取出菌种划线转接谷氨酸棒状杆菌，放于30℃培养。
(2)挑取单菌落到5mL脑心浸粉液体培养液(脑心浸粉51g/L，山梨醇：91g/L)试管中，200rpm 30℃过夜培养。
(3)取1mL上述菌液到装有100mL BHIS培养液的500mL摇瓶中，20 0rpm 30℃培养，测OD值，待OD600为1.3-1.5即可，约2-4h。
(4)无菌条件下下将菌液转移至两个冰预冷的50mL离心管中，配平后6000rpm,20min，倒掉上清液。
(5)用10mL含有10％(v/v)甘油水溶液悬浮，再补甘油水溶液到20mL，配平后6000rpm 20min离心，弃上清，重复步骤(5)三次。
(6)倒置在滤纸上吸去多余液体，加入1mL10％甘油悬浮后转到另一管中。
(7)分装10个无菌管，每管100μL于-80℃下存放。
2.2将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，具体步骤如下，
(1)将2ml脑心浸粉培养液和2mL山梨醇倒在一个大的无菌管中，于46℃水浴加热。
(2)取谷氨酸棒状杆菌感受态于冰上溶化。
(3)将质粒8-12μL加到感受态中(约100μL)，吸打混匀后，吸出全部加到电极杯(之前存放于无水乙醇中，用前放在滤纸上确定晾干)，1800V电压下电击，响声之后快速拿出电极杯，将大枪管调到约800μL，用预热的BHIS吸打混匀后全部吸出加到大的无菌管中，计46℃水浴6min。
(4)将无菌管放30℃摇床中摇床培养45min-60min。
(5)将无菌管放置30℃离心机中4200rpm离心6min。
(6)将菌液涂布于含有卡那抗生素(25ug/mL)的固体脑心浸粉培养基中，放置于30℃培养箱中培养36h。
2.3挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，用引物1和引物4进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1381bp DNA片段的为阳性克隆。
2.4保存经PCR验证正确的菌株，即为含有携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因的重组菌株Allulose1。
实施例2 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose3的构建
1.构建整合载体pK18mobsacB-pfk'
根据KEGG数据库中来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的果糖6-磷酸激酶基因的上游序列(SEQ ID NO:13)和下游序列(SEQ ID NO:14)，设计引物5，引物6，引物7和引物8，引物5和引物6经PCR扩增获得相应pfk'基因上游序列，引物7和引物8经PCR扩增获得相应pfk”基因下游序列；采用融合PCR方法得到由上游和下游序列组成的融合PCR片段pfk'-pfk”，进一步采用限制性内切酶EcoRI和HindIII融合片段pfk'-pfk”和载体pK18mobsacB(
Figure PCTCN2019073256-appb-000003
A,Tauch A,Jager W,Kalinowski J,Thierbach G,Puhler A.1994.SmAllulose mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in the chromosome of Coryneba cterium glutamicum.Gene 145:69-73)进行酶切，连接得到获得重组质粒pK18mobsacB-pfk，具体引物序列如下所示：
引物5 SEQ ID NO:19:accggaattcatgattttggtttccttctgcga
引物6 SEQ ID NO:20:ttcgaatggaacttccttcaagctggctgtgcggacgattcct
引物7 SEQ ID NO:21:aggaatcgtccgcacagccagcttgaaggaagttccattcgaacg
引物8 SEQ ID NO:22:actcaagcttgttaagacgcagctgaccagtg
2.获得果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株Allulose2
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞，将基因敲除载体pK18mobsacB-pfk电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中。
2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是在于通过蔗糖致死性，筛选卡那缺失克隆。
2.3从LB蔗糖平板上挑取若干菌落，用引物5和引物8再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1822DNA片段的为阳性克隆。
2.4保存经PCR验证正确的菌株，即无果糖6-磷酸激酶基因活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为Allulose2。
3.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose3
将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP电转化至重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose3，具体过程参照实施例1电转化过程。
实施例3 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose4的构建
1.构建重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI
根据KEGG数据库中来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶Glk基因(SEQ ID NO:4)和葡萄糖6-磷酸异构酶PGI基因(SEQ ID NO:5)，设计引物9,引物10，引物11和引物12，并以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增葡萄糖激酶基因glk和葡萄糖6-磷酸异构酶的基因pgi，用限制性内切酶HindIII和PstI同时对基因pgi和表达载体pXMJ19(Jakoby,M.；Ngouoto-Nkili,C.-E.；Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.Biotechnol.Tech.1999,13,437-441)进行酶切，并用T4连接酶进行连接，获得表达载体pXMJ19-PGI；进一步采用限制性内切酶PstI和XbaI同时对基因glk和表达载体pXMJ19-PGI进行酶切，获得重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI。具体引物序列如下所示：
引物9 SEQ ID NO:23：cactcaagcttatgggatccatggcggacatttcgaccac
引物10 SEQ ID NO:24：gacaactgcagctacctatttgcgcggtaccact
引物11 SEQ ID NO:25：gacaactgcagaaaggaggacaaccatgccacaaaaaccggccagtt
引物12 SEQ ID NO:26：gatggtctagattagttggcttccactacagagc
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose4
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI电转化至重组菌株Allulose3中，获得重组菌株Allulose4，具体过程参照实施例1电转化过程。
实施例4 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF
根据NCBI数据库中来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子核苷酸序列，来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶Glf基因序列(SEQ ID NO:6)，来源 于粪肠球菌Enterococcus faecalis的果糖激酶Frk基因序列(SEQ ID NO:7)，设计引物13，引物14，引物15，引物16，引物17和引物18，并采用PCR扩增获得tuf启动子，果糖透过酶基因glf和果糖激酶基因frk片段，采用融合PCR策略，以上述三个片段为模板，获得tuf-glf-frk融合片段，并通过酶切连接方式构建至重组表达质粒pEC-P6PE-P6PP中，得到重组表达质粒pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF。
引物13 SEQ ID NO:27：gatggtctagatggccgttaccctgcgaatgt
引物14 SEQ ID NO:28：agtacccagatttttccattcattgtatgtcctcctggacttcgtg
引物15 SEQ ID NO:29：cacgaagtccaggaggacatacaatgaatggaaaaatctgggtact
引物16 SEQ ID NO:30：accctgactactttcagaactcattcacagcgagcgctgaagatcgt
引物17 SEQ ID NO:31：acgatcttcagcgctcgctgtgaaaaggaggacaaccatgagttctgaaagtagtcagggt
引物18 SEQ ID NO:32：ctacttctgggagcgccacatctcct
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5
将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF电转化至果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose5，具体过程参照实施例1电转化过程。
实施例5 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6的构建
1.构建重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK
根据NCBI数据库中来源于大肠杆菌Escherichia coli的甘油透过酶GlpF基因(SEQ ID NO:8)、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶DhaD基因(SEQ ID NO:9)、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶DhaK基因(SEQ ID NO:10)，设计引物19，引物20，引物21，引物22，引物23和引物24，引物21和引物23中RBS位点序列(AAAGGAGGACAACC)，引物19和引物24中含有SmaI和XbaI酶切位点，具体引物序列如下：
引物19 SEQ ID NO:33:gatggtctagaaaaggaggacaaccatgagtcaaacatcaaccttgaaag
引物20 SEQ ID NO:34:gagattgaataacttttagcatatctatatctccttattacagcgaagctttttgt
引物21 SEQ ID NO:35:acaaaaagcttcgctgtaataaggagatatagatatgctaaaagttattcaatctc
引物22 SEQ ID NO:36:tggttaaaaaagaattgagacatggttgtcctcctttttaacgcgccagccactgctgtc
引物23 SEQ ID NO:37:gacagcagtggctggcgcgttaaaaaggaggacaaccatgtctcaattcttttttaacca
引物24 SEQ ID NO:38:tcccccgggtctagattagcccagctcactctccgc
以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，通过引物19和引物20PCR扩增基因甘油透过酶基因，通过引物21和引物22PCR扩增去甘油脱氢酶基因，通过引物23和引物24，PCR扩增二羟丙酮激酶基因，融合PCR方法获得融合片段“glpF-rhaD-yqaB”，用限制性内切酶SmaI和XbaI同时酶切融合基因片段和载体pXMJ19-GlK-PGI，运用T4连接酶将经相同酶酶切的载体pXMJ19-GlK-PGI和融合基因片段进行连接，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-glpF-DhaD-DhaK。
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时电转化至重组菌株Allulose2中得到重组菌株Allulose6，具体过程参照实施例1电转化过程。
实施例6 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1，Allulose3和Allulose4在阿洛酮糖生产中的应用
A1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
选用100mL BHI培养基(脑心浸粉37g/L,卡那霉素25ng/mL)，加入终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1进行培养12-24h，菌株接种量2％，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦 高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器,上样量为10μL。
A2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose3发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose3的培养方法同本实施例A1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
A3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose4发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose6的培养方法同本实施例A1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Allulose1可以发酵葡萄糖合成1.8g/L阿洛酮糖，重组菌株Allulose3可以发酵葡萄糖合成10.6g/L阿洛酮糖，与重组菌株Allulose1相比，阿洛酮糖产量提高近6倍；重组菌株Allulose4可以发酵葡萄糖合成14.8g/L阿洛酮糖，与重组菌株Allulose3相比，阿洛酮糖产量提高近30％。结果如图2((a)表示发酵液0h；(b)表示发酵液48h；(c)表示阿洛酮糖纯品)。
实施例7 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose5的培养方法与实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5发酵果糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose5的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5发酵蔗糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose5的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相 同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，菌株接种量2％，培养培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Allulose5可以发酵葡萄糖合成12.8g/L阿洛酮糖，发酵果糖生成13.6g/L阿洛酮糖，发酵蔗糖生成11.6g/L阿洛酮糖。结果如图3((a)表示发酵液0h；(b)表示发酵液48h；(c)表示阿洛酮糖纯品)。
实施例8谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6在阿洛酮糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6发酵葡萄糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose6的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6发酵果糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose6的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6发酵蔗糖合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose6的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
4、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose6发酵甘油合成阿洛酮糖
重组菌株Allulose6的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的甘油，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Allulose6可以发酵葡萄糖合成12.1g/L阿洛酮糖，发酵果糖生成12.6g/L阿洛酮糖，发酵蔗糖生成10.8g/L阿洛酮糖，发酵甘油生成3.4g/L阿洛酮糖。结果如图4((a)表示发酵液0h；(b)表示发酵液48h；(c)表示阿洛酮糖纯品)。
实施例9谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1，Allose2，Allose3和Allose4的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP
根据KEGG数据库中来源于大肠杆菌6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因(SEQ ID NO:1)，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因(SEQ ID NO:2)和核糖-5-磷酸异构酶RpiB基因(SEQ ID NO:11)设计引物25，引物26，引物27和引物28，引物29和引物30，并通过PCR扩增获得相应序列，采用融合PCR方法得到由P6PE,RpiB,和P6PP组成的融合片段“P6PE-RpiB-P6PP”，用限制性内切酶EcoRI和PstI同时对融合片段和表达载体pEC-XK99E进行酶切，连接得到重组质粒pEC-P6PE-RpiB-P6PP。引物序列如下：
引物25 SEQ ID NO:39：taccggaattcatgaaaatctccccctcgttaatg
引物26 SEQ ID NO:40：gaatctgacgcggggttgacatggttgtcctcctttttatgctgtttttgcatgag
引物27 SEQ ID NO:41：ctcatgcaaaaacagcataaaaaggaggacaaccatgtcaaccccgcgtcagattc
引物28 SEQ ID NO:42：atcacagccaaatgcaatctttttcatggttgtcctcctttttaaccgagaaggtcttttg
引物29 SEQ ID NO:43：caaaagaccttctcggttaaaaaggaggacaaccatgaaaaagattgcatttggctgtgat
引物30 SEQ ID NO:44：gacaactgcagttaaccgagaaggtcttttgcggt
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖-5-磷酸异构酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP电转化至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，获得重组菌株Allose1。
3.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose2
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖-5- 磷酸异构酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP电转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose2。
4.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose3
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖-5-磷酸异构酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和携带有葡萄糖激酶Glk和葡萄糖6-磷酸异构酶PGI基因的表达载体pXMJ19-GlK-PGI共转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose3。
5.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose4
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖-5-磷酸异构酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和携带有葡萄糖激酶Glk，葡萄糖6-磷酸异构酶PGI基因，甘油透过酶GlpF，甘油脱氢酶DhaD和二羟丙酮激酶DhaK的表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK，共转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose4。
实施例10 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1，Allose2，Allose3和Allose4在阿洛糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1发酵葡萄糖合成阿洛糖
重组菌株Allose1的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose2发酵葡萄糖合成阿洛糖
重组菌株Allose2的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose3发酵葡萄糖合成阿洛糖
重组菌株Allose3的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度) 的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose4发酵甘油合成阿洛糖
重组菌株Allose4的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的甘油，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Allose1可以发酵葡萄糖合成1.0g/L阿洛糖，重组菌株Allose2可以发酵葡萄糖合成7.6g/L阿洛糖，与重组菌株Allose1相比，阿洛糖产量提高近7.6倍；重组菌株Allose3发酵葡萄糖合成9.2g/L阿洛糖，与重组菌株Allose2相比，阿洛糖产量提高26.3％；重组菌株Allose4可以发酵甘油合成阿洛糖，阿洛糖产量为2.8g/L。
实施例11 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3和Allitol4的构建
1.构建重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH
根据KEGG数据库中来源于大肠杆菌6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因(SEQ ID NO:1)，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因(SEQ ID NO:2)和核糖醇脱氢酶RDH基因(SEQ ID NO:12)设计引物31，引物32，引物33和引物34，引物35和引物36，并通过PCR扩增获得相应序列，采用融合PCR方法得到由P6PE，P6PP和RDH组成的融合片段“P6PE-P6PP-RDH”，用限制性内切酶EcoRI和PstI同时对融合片段和表达载体pEC-XK99E进行酶切，连接得到重组质粒pEC-P6PE-P6PP-RDH。引物序列如下：
引物31 SEQ ID NO:45：taccggaattcatgaaaatctccccctcgttaatg
引物32 SEQ ID NO:46：gaatctgacgcggggttgacatggttgtcctcctttttatgctgtttttgcatgag
引物33 SEQ ID NO:47：ctcatgcaaaaacagcataaaaaggaggacaaccatgaaaaagattgcatttggctgtgat
引物34 SEQ ID NO:48：caaaagaccttctcggttaaggttgtcctcctttttaaccgagaaggtctttt g
引物35 SEQ ID NO:49：ccaaatgcaatctttttcataaaggaggacaaccatgaaccactctgtctcctctat
引物36 SEQ ID NO:50：gacaactgcagtcagagatccacgctgttcggc
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶RDH基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Allitol1。
3.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol2
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶RDH基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH电转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol2。
4.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol3
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶RDH基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和携带有葡萄糖激酶Glk和葡萄糖6-磷酸异构酶PGI基因的表达载体pXMJ19-GlK-PGI共转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol3。
5.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol4
将携带有6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶RDH基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和携带有葡萄糖激酶Glk，葡萄糖6-磷酸异构酶PGI，甘油透过酶GlpF，甘油脱氢酶DhaD和二羟丙酮激酶DhaK基因的表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK，共转化至如实施例2所述的果糖6-磷酸激酶基因敲除菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol4。
实施例12 谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3和Allitol4在阿洛糖醇生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1发酵葡萄糖合成阿洛糖醇
重组菌株Allitol1的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol2发酵葡萄糖合成阿洛糖醇
重组菌株Allitol2的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol3发酵葡萄糖合成阿洛糖醇
重组菌株Allitol3的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
4、谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol4发酵甘油合成阿洛糖醇
重组菌株Allitol4的培养方法同实施例6中重组菌株Allulose1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的甘油，菌株接种量2％，培养48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Allitol1可以发酵葡萄糖合成0.6g/L阿洛糖醇，重组菌株Allitol2可以发酵葡萄糖合成5.3g/L阿洛糖醇，重组菌株Allitol3发酵葡萄糖合成7.4g/L阿洛糖醇，与重组菌株Allitol2相比，阿洛糖醇产量提高7.4倍；重组菌株Allose4可以发酵甘油合成阿洛糖醇，阿洛糖醇产量为2.1g/L。
实施例13 胞外多酶催化转化麦芽糊精合成阿洛酮糖
建立胞外多酶催化体系转化麦芽糊精为阿洛酮糖。这些关键酶包括：(1)葡聚糖磷酸化酶(EC:2.4.1.1)，该酶催化葡聚糖转化为葡萄糖1-磷酸，(2)葡萄糖磷酸变位酶(EC:5.4.2.2),该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)，该酶催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；(4)6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶(EC:5.1.3.-)，该酶催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸阿洛酮糖；(5)6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，该酶催化6-磷酸阿洛酮糖脱磷酸生成阿 洛酮糖；(6)异淀粉酶AI，该酶催化麦芽糊精为直链聚糖；(7)葡聚糖转移酶GT，该酶催化麦芽二糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖。
在本发明中，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶来源于Clostridium thermocellum，基因在KEGG上的编号为Cthe0217；6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶来源于Escherichia coli，编码基因在KEGG上的编号为b4085(SEQ ID NO:1)；6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶来源于Escherichia coli，编码基因在KEGG上的编号为b1727(SEQ ID NO:2)；异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii,基因在KEGG上的编号为ST0928,葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis,基因在KEGG上的编号为OCC_10078，这些基因组DNA都可以从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这七个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆载体pET21中，获得相应的表达载体pET21-GP，pET21-PGM,pET21-PGI,pET21-P6PE,pET21-P6PP,pET21-AI和pET21-GT。这七个质粒都转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达和纯化，获得含有上述酶的多酶复合物。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，所述麦芽糊精的浓度为50g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶用量为10U/mL，葡聚糖转移酶用量为10U/mL，在37℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得阿洛酮糖25g/L,残余葡萄糖和果糖共计10g/L。
实施例14 胞外多酶催化转化蔗糖合成阿洛酮糖
建立胞外多酶催化体系转化蔗糖为阿洛酮糖。这些关键酶包括：(1)蔗糖磷酸化酶(EC:2.4.1.7)，该酶催化蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸和果糖，(2)葡萄糖 磷酸变位酶(EC:5.4.2.2),该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)，该酶催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；(4)6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶(EC:5.1.3.-)，该酶催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸阿洛酮糖；(5)6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，该酶催化6-磷酸阿洛酮糖脱磷酸生成阿洛酮糖；(6)葡萄糖异构酶(EC:5.3.1.5)，该酶催化果糖转化为葡萄糖；(7)葡萄糖激酶(EC:2.7.1.2),该酶催化葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于Bifidobacterium longum，基因在KEGG上的标号为BL0536，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；葡萄糖磷酸异构酶来源于Clostridium thermocellum，基因在KEGG上的编号为Cthe0217；6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶来源于Escherichia coli，基因在KEGG上的编号为b4085；6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶来源于Escherichia coli，基因在KEGG上的编号为b1727；葡萄糖异构酶来源于Bacillus licheniformis，基因在KEGG上的编号为BL03867；葡萄糖激酶来源于Microlunatus phosphovorus，基因在KEGG上的编号为MLP_2661，这些基因组DNA都可以从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这七个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆到pET21载体中，获得相应的表达载体pET21-SP，pET21-PGM,pET21-PGI,pET21-P6PE,pET21-P6PP,pET21-GI,和pET21-GK。这七个质粒都转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达和纯化。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH7.0)，5mM氯化镁，5mMATP，30mM聚磷酸,所述蔗糖的浓度为20g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶用量为10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，在37℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得阿洛酮糖13.4g/L,剩余蔗糖4.5g/L,同时还有副产物 葡萄糖1.4g/L,果糖0.7g/L。
实施例15 胞外多酶催化转化麦芽糊精合成阿洛糖
建立胞外多酶催化体系转化麦芽糊精为阿洛糖。这些关键酶包括：(1)葡聚糖磷酸化酶(EC:2.4.1.1)，该酶催化葡聚糖转化为葡萄糖1-磷酸，(2)葡萄糖磷酸变位酶(EC:5.4.2.2),该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)，该酶催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；(4)6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶(EC:5.1.3.-)，该酶催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸阿洛酮糖；(5)核糖-5-磷酸异构酶(EC:5.3.1.6)，该酶催化6-磷酸阿洛酮糖转化为6-磷酸阿洛糖；(6)6-磷酸阿洛糖磷酸酶，该酶催化6-磷酸阿洛糖脱磷酸生成阿洛糖；(7)异淀粉酶AI，该酶催化麦芽糊精为直链聚糖；(8)葡聚糖转移酶GT，该酶催化麦芽二糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖。
所采用的葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，异淀粉酶,葡聚糖转移酶与实施例13中相同，所采用核糖-5-磷酸异构酶来源于Escherichia coli，编码基因在KEGGE上的编号为b4090(SEQ ID NO:11)，设计引物从大肠杆菌基因组DNA中通过PCR获取相应基因，并通过酶切连接方法克隆载体pET21中，获得相应的表达载体pET21-RPIB。将上述重组质粒都转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达和纯化。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，所述麦芽糊精的浓度为50g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，核糖-5-磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛糖磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶用量为10U/mL，葡聚糖转移酶用量为10U/mL，在37℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得阿洛糖15g/L,阿洛酮糖10g/L,残余葡萄糖和果糖共计10g/L。
实施例16 胞外多酶催化转化蔗糖合成阿洛糖
建立胞外多酶催化体系转化蔗糖为阿洛酮糖。这些关键酶包括：(1)蔗糖磷酸化酶(EC:2.4.1.7)，该酶催化蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸和果糖，(2)葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2),该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；(3)葡萄糖磷酸异构酶(EC:5.3.1.9)，该酶催化6-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸果糖；(4)6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶(EC:5.1.3.-)，该酶催化6-磷酸果糖转化为6-磷酸阿洛酮糖；(5)核糖-5-磷酸异构酶(EC:5.3.1.6)，该酶催化6-磷酸阿洛酮糖转化为6-磷酸阿洛糖；(6)6-磷酸阿洛糖磷酸酶，该酶催化6-磷酸阿洛糖脱磷酸生成阿洛糖；(7)葡萄糖异构酶(EC:5.3.1.5)，该酶催化果糖转化为葡萄糖；(8)葡萄糖激酶(EC:2.7.1.2)，该酶催化葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸。
所采用的蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛糖磷酸酶与实施例13相同，所采用的葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶与实施例14相同，所采用的核糖-5-磷酸异构酶与实施例15相同，含有上述基因的表达质粒都转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并进行蛋白质表达和纯化。
建立如下反应体系，30mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM氯化镁，5mM ATP，30mM聚磷酸,所述蔗糖的浓度为20g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶用量为10U/mL，核糖-5-磷酸异构酶10U/mL，6-磷酸阿洛糖磷酸酶10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，在37℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得阿洛糖8.4g/L,阿洛酮糖4.5g/L，剩余蔗糖3.5g/L,同时还有副产物葡萄糖2.4g/L,果糖1.2g/L。
实施例17 胞外多酶催化和发酵相偶联转化麦芽糊精合成阿洛酮糖
1、胞外多酶催化转化麦芽糊精合成阿洛酮糖
该胞外多酶催化转化麦芽糊精合成阿洛酮糖方法与实施例13相同。
2、重组菌株Allulose5发酵合成阿洛酮糖
以胞外多酶催化所获得的反应液为碳源，添加10g/L酵母粉，10g/L氯化钠配置培养基，并进行灭菌，按照接种量为2％，接入过夜培养之后的重组菌株Allulose5种子液，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5进行培养24h，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。
发酵结束时，阿洛酮糖产量由25g/L提高至30g/L，而且阿洛酮糖为发酵液中唯一糖分，便于后期产物分离。
实施例18 胞外多酶催化和发酵相偶联转化麦芽糊精合成阿洛糖
1、胞外多酶催化转化麦芽糊精合成阿洛糖
该胞外多酶催化转化蔗糖合成阿洛酮糖方法与实施例15相同。
2、重组菌株Allose3发酵合成阿洛糖
以胞外多酶催化所获得的反应液为碳源，添加10g/L酵母粉，10g/L氯化钠配置培养基，并进行灭菌，按照接种量为2％，接入过夜培养之后的重组菌株Allose3种子液，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose5进行培养24h，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。
发酵结束时，阿洛糖产量由15g/L提高至18g/L，阿洛酮糖含量由10g/L提高至12g/L。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (29)

  1. 一种生产阿洛酮糖及其衍生物工程菌株的构建方法，其特征在于，至少包括以下任一步骤：
    (1)增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性；
    (2)降低果糖6-磷酸激酶的酶活性；
    (3)增强6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，以及任选地核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶的酶活性；
    (4)增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性；
    (5)增强甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶的酶活性。
  2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，至少包括以下任一步骤：
    (1)通过引入强启动子或者采用质粒表达形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因的表达强度，或者采用染色体整合方式整合其他物种来源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因；
    (2)采用分子遗传操作，降低细胞果糖6-磷酸激酶基因的表达水平；
    (3)采用染色体整合或者质粒表达形式，向胞内引入6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，以及任选地核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，核糖醇脱氢酶基因；
    (4)采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，增强果糖透过酶和果糖激酶基因的表达水平；
    (5)采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，提高甘油透过酶、甘油脱氢酶和二羟丙酮激酶基因的表达水平；
    优选地，所述分子遗传操作为基因敲除或者引入弱启动子的操作。
  3. 根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述工程菌株为以谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母中的一种为宿主菌进行遗传改造所得菌株。
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的构建方法,其特征在于，所述阿洛酮糖衍 生物为阿洛糖或者阿洛糖醇。
  5. 生产阿洛酮糖谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，至少包括以下任一步骤：
    (1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP转化至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌株Allulose1；
    (2)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，降低果糖6-磷酸激酶基因表达水平，得到重组菌株Allulose2；
    (3)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-P6PP构建至重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose3；
    (4)扩增来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶基因和葡萄糖6-磷酸异构酶基因，将其构建在表达载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI转化至重组菌株Allulose3中，得到重组菌株Allulose4；
    (5)扩增来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因和来源于大肠杆菌Escherichia coli或者粪肠球菌Enterococcus faecalis的果糖激酶基因，并将其构建至表达载体pEC-P6PE-P6PP中得到重组载体pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF，将重组质粒pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF和pXMJ19-GlK-PGI构建至重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allulose5；
    (6)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的甘油透过酶基因、来源于肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae的甘油脱氢酶基因、来源于弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的二羟丙酮激酶基因，并将其构建至重组质粒pXMJ19-GlK-PGI中得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK和pEC-P6PE-P6PP-FK-GlF同时转化至重组菌株Allulose2中得到重组菌株Allulose6。
  6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus或者大肠杆菌Escherichia coli。
  7. 根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，降低降低果糖6-磷酸激酶基因表达水平的方法为基因敲除或者引入弱启动子的方法。
  8. 如权利要求5-7任一项所述方法所构建的谷氨酸棒杆菌重组菌株Allulose1、Allulose2、Allulose3、Allulose4、Allulose5或Allulose6。
  9. 如权利要求8所述的任一种重组菌株在阿洛酮糖生产中的应用。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，利用所述重组菌株发酵制备阿洛酮糖；优选地，所述重组菌株Allulose1，Allulose3，Allulose4或Allulose5用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛酮糖；所述重组菌株Allulose6用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油中的一种或多种制备阿洛酮糖。
  11. 生产阿洛糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在如权利要求8所述的任一重组菌株中，进一步引入表达核糖-5-磷酸异构酶基因。
  12. 根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述方法至少包括以下任一步骤：
    (1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶P6PE基因，核糖-5-磷酸异构酶基因和6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶P6PP基因，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP，将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP转化野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032，得到重组菌株Allose1；
    (2)将携带6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶基因，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因的重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP构建至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose2；
    (3)将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose3；
    (4)将重组表达载体pEC-P6PE-RpiB-P6PP和所述的重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allose4。
  13. 如权利要求11或12所述方法所构建的谷氨酸棒杆菌重组菌株Allose1，Allose2，Allose3或Allose4。
  14. 如权利要求13所述的任一重组菌株Allose1，Allose2，Allose3或Allose4在阿洛糖生产中的应用。
  15. 根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述重组菌株Allose1，Allose2或Allose3用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖；所述重组菌株Allose4用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油中的一种或多种合成阿洛糖。
  16. 生产阿洛糖醇谷氨酸棒杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在如权利要求8所述的任一重组菌株中，进一步引入核糖醇脱氢酶基因。
  17. 根据权利要求16所述的构建方法，至少包括以下任一步骤：
    (1)扩增来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶基因，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶基因，来源于产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca的核糖醇脱氢酶基因，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH，将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH构建至野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，获得重组菌株Allitol1；
    (2)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH构建至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol2；
    (3)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和所述的重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol3；
    (4)将重组表达载体pEC-P6PE-P6PP-RDH和所述的重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI-GlpF-DhaD-DhaK共同转化至所述的重组菌株Allulose2中，获得重组菌株Allitol4。
  18. 如权利要求16或17所述方法所构建的谷氨酸棒杆菌重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3或Allitol4。
  19. 如权利要求18所述任一重组菌株Allitol1，Allitol2，Allitol3或Allitol4在阿洛糖醇合成中的应用。
  20. 如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述重组菌株Allitol1，Allitol2和Allitol3用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种合成阿洛糖醇；所述菌株Allitol4用于发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油中的一种或者多种合成阿洛糖醇。
  21. 一种胞外多酶级联转化淀粉及衍生物合成阿洛酮糖的方法，其特征在于，以淀粉及衍生物为底物，加入包含有葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
  22. 一种胞外多酶级联转化蔗糖合成阿洛酮糖的方法，其特征在于，以蔗糖为底物，加入包含有蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，6-磷酸阿洛酮糖磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
  23. 一种胞外多酶级联转化淀粉及衍生物合成阿洛糖的方法，其特征在于，以淀粉及衍生物为底物，加入包含葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6-磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶、6-磷酸阿洛糖磷酸酶，异淀粉酶以及葡聚糖转移酶的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛糖。
  24. 一种胞外多酶级联转化蔗糖合成阿洛糖的方法，其特征在于，以蔗糖为底物，加入包含有蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，葡萄糖磷酸异构酶，6 -磷酸阿洛酮糖3-差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶，6-磷酸阿洛糖磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶的多酶复合物，进行酶催化反应，获得阿洛酮糖。
  25. 根据权利要求21-24任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，底物浓度为1-100g/L，各种酶用量为0.1-1000U/mL。
  26. 一种基于酶转化和发酵相偶联的阿洛酮糖或阿洛糖制备方法，所述方法包括：用权利要求21-24任一项所述的多酶复合物对糖类底物进行酶解，然后以酶解液作为碳源制备培养基，采用如权利要求8或13所述任一重组菌株进行发酵。
  27. 一种基于酶转化和发酵相偶联制备阿洛酮糖的方法，其特征在于，首先采用如权利要求21所述的多酶反应体系，转化淀粉或其衍生物合成阿洛酮糖，反应结束后所得反应液，作为碳源制备培养基，经灭菌离心后，采用权利要求8所述重组菌株Allulose5，对该培养基进行发酵，重组菌株代谢酶反应体系中残余葡萄糖和果糖，合成阿洛酮糖。
  28. 一种基于酶转化和发酵相偶联的阿洛糖制备方法，其特征在于，首先采用如所述权利要求23所述的多酶反应体系，转化淀粉或其衍生物合成阿洛糖，反应结束后所得反应液，作为碳源制备培养基，经灭菌离心后，采用权利要求13所述重组菌株Allose3，对该培养基进行发酵，合成阿洛糖。
  29. 根据权利要求27或28所述的方法，其特征在于所述反应体系中，所述重发酵培养基包括：多酶转化后反应液作为碳源，酵母粉1-40g/L作为氮源，氯化钠1-10g/L。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3596212A4 (en) * 2017-03-13 2021-06-02 Bonumose LLC ENZYMATIC PRODUCTION OF HEXOSES
CN114214251A (zh) * 2021-12-31 2022-03-22 保龄宝生物股份有限公司 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN114717276A (zh) * 2022-05-13 2022-07-08 广西大学 联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法
CN115074376A (zh) * 2022-04-28 2022-09-20 福州大学 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
CN115976134A (zh) * 2022-10-21 2023-04-18 福州大学 一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
WO2023097975A1 (zh) * 2021-12-02 2023-06-08 江南大学 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111518853B (zh) * 2020-05-08 2024-04-30 东台市浩瑞生物科技有限公司 一种利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的方法
JP7348457B2 (ja) * 2020-06-03 2023-09-21 ティアンゴン バイオテクノロジー（ティアンジン）カンパニー，リミテッド プシコース３－エピメラーゼミュータント、それを発現するための遺伝子工学菌、その固定化酵素及び固定化方法
CN112080453B (zh) * 2020-08-28 2022-12-23 天津科技大学 一种合成d-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用
CN112501224B (zh) * 2020-11-26 2022-04-19 北京化工大学 一种利用d-葡萄糖生物合成d-阿洛糖的方法
CN112522343B (zh) * 2020-12-29 2022-11-25 青岛龙鼎生物技术有限公司 一种利用nad(p)-依赖型醇脱氢酶催化生产d-阿洛酮糖的方法
CN113229360B (zh) * 2021-05-28 2023-05-02 天津科技大学 苹果透气透氧保鲜剂及其制备方法和应用
EP4151742B1 (en) * 2021-07-30 2024-01-10 Wuhan Bai'anhuiji Biotechnology Co., Ltd Transgenic cell line and genetically engineered bacterium expressing fructosamine deglycase, and use of fructosamine deglycase
CN116240196A (zh) * 2021-12-07 2023-06-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种磷酸酶的突变体及其在果糖和阿洛酮糖制备中的应用
CN114350727B (zh) * 2022-01-18 2023-10-03 湖南成大生物科技有限公司 联合磷酸化与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法
CN114540396A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 天津大学 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法
CN114601745B (zh) * 2022-03-25 2023-06-27 上海龙殷生物科技有限公司 一种护肤品原料、化妆品、制备方法及应用
CN114561417B (zh) * 2022-04-27 2022-08-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 用于制备阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其应用
CN114921392B (zh) * 2022-04-29 2023-10-03 湖南成大生物科技有限公司 一种高效联产葡萄糖酸和蒜糖醇的方法
WO2023242877A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Fertis India Pvt Ltd Enzymatic synthesis of d-allulose and its derivatives from fusion enzymes
CN116042684B (zh) * 2023-01-30 2023-10-27 态创生物科技(广州)有限公司 大肠杆菌及其在催化合成阿洛酮糖中的应用
CN116875626A (zh) * 2023-06-07 2023-10-13 山东福洋生物科技股份有限公司 一种一步法生产d-阿洛酮糖的基因工程菌的构建方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101855357A (zh) * 2007-09-26 2010-10-06 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司 在谷氨酸棒状杆菌中从蔗糖生产氨基酸的方法
CN103333935A (zh) * 2013-05-24 2013-10-02 桐乡晟泰生物科技有限公司 D-阿洛酮糖的生产工艺
CN103397006A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用
CN103468606A (zh) * 2013-08-14 2013-12-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN103710329A (zh) * 2013-12-24 2014-04-09 山西天骄食业有限公司 一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法
CN103805552A (zh) * 2014-02-19 2014-05-21 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物合成稀少糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6993227B2 (ja) * 2015-07-02 2022-01-13 協和発酵バイオ株式会社 希少糖の製造法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101855357A (zh) * 2007-09-26 2010-10-06 阿彻-丹尼尔斯-米德兰公司 在谷氨酸棒状杆菌中从蔗糖生产氨基酸的方法
CN103333935A (zh) * 2013-05-24 2013-10-02 桐乡晟泰生物科技有限公司 D-阿洛酮糖的生产工艺
CN103397006A (zh) * 2013-08-14 2013-11-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用
CN103468606A (zh) * 2013-08-14 2013-12-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN103710329A (zh) * 2013-12-24 2014-04-09 山西天骄食业有限公司 一种基因工程技术制备共表达重组酶的方法
CN103805552A (zh) * 2014-02-19 2014-05-21 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物合成稀少糖的谷氨酸棒杆菌工程菌株及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRANSTROM, T.B. ET AL.: "Izumoring: A Novel and Complete Strategy for Bioproduction of Rare Sugars", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 97, no. 2, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 89 - 94 *
IZUMORI, K.: "Bioproduction Strategies for Rare Hexose Sugars", NATURWISSENSCHAFTEN, vol. 89, 16 February 2002 (2002-02-16), pages 120 - 124, XP055627514 *
IZUMORI, K.: "Izumoring: A Strategy for Bioproduction of all Hexoses", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 124, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 717 - 722, XP024956711, doi:10.1016/j.jbiotec.2006.04.016 *
WEI, MIAO ET AL.: "Effects on Growth and Glycerol Metabolism in E.coli by Coexpression Protein GldA and DhaKLM", CHINESE JOURNAL OF BIOPROCESS ENGINEERING, vol. 9, no. 5, 30 September 2011 (2011-09-30), pages 59 - 64 *
YAO, LIPING: "Metabolic Modification of Glycometabolism for Sucrose to Increase L-Serine Production by Corynobacterium Glutamicum", ENGINEERING SCIENCE & TECHNOLOGY 1, CHINA MASTER S THESES FULL-TEXT DATABASE, 15 February 2017 (2017-02-15), pages B018 - 249 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3596212A4 (en) * 2017-03-13 2021-06-02 Bonumose LLC ENZYMATIC PRODUCTION OF HEXOSES
US11236320B2 (en) 2017-03-13 2022-02-01 Bonumose, Inc. Enzymatic production of hexoses
US11345909B2 (en) 2017-03-13 2022-05-31 Bonumose, Inc. Enzymatic production of hexoses
WO2023097975A1 (zh) * 2021-12-02 2023-06-08 江南大学 一株产d-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株及其应用
US11970723B2 (en) 2021-12-02 2024-04-30 Jiangnan University Strain producing D-allulose 3-epimerase and application thereof
CN114214251A (zh) * 2021-12-31 2022-03-22 保龄宝生物股份有限公司 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN114214251B (zh) * 2021-12-31 2022-12-06 保龄宝生物股份有限公司 一种生产d-阿洛酮糖用枯草芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN115074376A (zh) * 2022-04-28 2022-09-20 福州大学 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
CN115074376B (zh) * 2022-04-28 2023-11-14 福州大学 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法
CN114717276A (zh) * 2022-05-13 2022-07-08 广西大学 联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法
CN115976134A (zh) * 2022-10-21 2023-04-18 福州大学 一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法

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