JP6993227B2 - 希少糖の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた希少糖の効率的な製造法、より詳しくはＤ－プシコースの製造法およびＤ－アロヘプツロースの製造法に関する。

希少糖は国際希少糖学会の定義によれば「自然界に希にしか存在しない糖」と定義されており、自然界における存在量が少ない単糖である。希少糖は、一般に有機化学的合成方法における合成反応においては収量の少ないものが多い。

希少糖の一種であるＤ－プシコースは、砂糖の７割程度の甘味がありながらカロリーはほとんどなく、そのため低カロリー甘味料として用いることが出来る。また血圧上昇の抑制作用および内臓脂肪蓄積の抑制作用なども認められている。

プシコースの製造法としては、アルカリを用いた化学異性化反応および酵素法が知られている。特許文献１には、化学異性化反応を用いたプシコースの製造法が開示されている。また、特許文献２および３並びに非特許文献１～４には、Ｄ－プシコースの生合成に係る酵素が開示されている。また、非特許文献５には、ホウ素を用いて反応効率を上げる方法が開示されている。

また、希少糖の一種であるＤ－アロヘプツロースは、７炭糖の一種であり、黄花九輪桜の根に微量含まれていることが確認されているが（非特許文献６）、その生理機能についての報告はほとんどされていない。Ｄ－アロヘプツロースの製造法としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の酵素を用いた酵素法やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いた発酵法が開示されている（非特許文献７）。

国際公開第２０１０１１３７８５号 日本国特開平６－１２５７７６号公報 日本国特表２０１３－５０１５１９号公報

Journal of fermentation and bioengineering (1995) vol. 80, p. 101-103. Appl. Environ. Microbiol.（2006）vol. 72, p. 981-985 Biotechnology Letters （2009）vol. 31, p. 857-862 World Journal of Microbiology and Biotechnology(2007) vol. 23, p. 559-563 Appl. Environ. Microbiol.（2008）vol. 74, p. 3008-3013 Carbohydrate Research 2.4 (1966): 272-288. Biotechnology and bioengineering 112.1 (2015): 168-180.

化学異性化反応を用いたＤ－プシコースの製造法は、特異的にＤ－プシコースを製造することができないため、Ｄ－プシコース以外の副生糖も大量に生成される他、反応効率が低く、基質となる異性化糖が多く残存する。

また、Ｄ－プシコースの生合成に係る酵素を用いたＤ－プシコースの製造法は、反応効率は良くて３３％程度である。さらに、ホウ素を用いてＤ－プシコースへの反応効率を上げた場合でもその変換率は６０％程度となっている。

このように、これまでの方法はいずれも可逆的な反応を用いたものであり、基質となるグルコースまたはフルクトースの残存が避けられないという問題があった。

したがって、本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を検討した結果、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を利用することにより、効率的にＤ－プシコースを製造できることを見出した。また、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を利用することにより、効率的にＤ－アロヘプツロースを製造できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞（ｉ）酵素源として、親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜２＞親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜３＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、以下の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、＜１＞または＜２＞に記載の製造法。
［４］＜１＞または＜２＞の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５０または５１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
＜４＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物である、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の製造法。
＜５＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の製造法。
＜６＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の製造法。
＜７＞（ｉ）酵素源として、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
＜８＞親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
＜９＞前記微生物が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物である＜７＞または＜８＞に記載の製造法。
＜１０＞前記微生物がＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物である＜７＞～＜９＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１１＞親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物が、以下の［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、＜７＞～＜１０＞のいずれか１に記載の製造法。
［８］配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
＜１２＞Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物が、前記親株に比べ、以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、＜１０＞または＜１１＞に記載の製造法。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜１３＞糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、＜９＞～＜１２＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１４＞糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも１の糖である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１５＞親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の製造法。

本発明により、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法が提供される。本発明のＤ－プシコースの製造法によれば、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、該微生物が有するＤ－アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でＤ－プシコースを製造することができる。

また、本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を用いることにより、該微生物が有するセドヘプツロース－７－リン酸をＤ－アロヘプツロース－７－リン酸へ異性化する活性を効率的に利用することができ、高効率でＤ－アロヘプツロースを製造することができる。

図１（ａ）は、エシェリヒア属に属する微生物が有するＤ－アロースの代謝系の概略図を示す。図１（ｂ）は本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物によるＤ－プシコース製造の具体例の概略図を示す。 図２はエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図を示す。

１．本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（１）～（４）に記載の微生物を挙げることができる。
（１）親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
（２）前記（１）の微生物を親株として、該親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
（３）前記（１）または（２）の微生物を親株として、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
（４）前記（１）～（３）のいずれか１の微生物を親株として、該親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
以下、（１）～（４）について説明する。

（１）親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質

Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性とは、Ｄ－プシコース－６－リン酸を基質として、脱リン酸化する活性をいう。また、「糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物」とは、該微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてＤ－プシコース－６－リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積する微生物をいう。

変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。

相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。

上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。

欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリンＧ群：フェニルアラニン、チロシン

上記の変異蛋白質または相同蛋白質が、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有していることは、後述する方法により該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡでＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を確認することができない微生物、例えばエシェリヒア・コリＷ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるＤ－プシコース－６－リン酸と接触させ、結果として生成するＤ－プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。

親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。

親株は、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。

微生物に、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を人工的に付与する方法としては、（ａ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び（ｅ）野生型株に比べ、Ｄ－プシコース－６－リン酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。

このような親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。

微生物が糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成することのできる微生物であることは、配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで該微生物を形質転換し、形質転換した該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＤ－プシコースを後述のＨＰＬＣを用いて検出することにより確認することができる。

親株の微生物に比べ前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸、好ましくは１～５個のアミノ酸、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。

突然変異処理法としては、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号５０または５１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、１（１）において後述するＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。

相同組換え法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］を挙げることができる。

さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。

親株に比べ、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にＤ－プシコース－６－リン酸とその他の基質を加え、結果として生成するＤ－プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出して比較することで確認することができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。

突然変異処理法は、上記に記載の方法を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、上記の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

また、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株より前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。

そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリで機能するｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターおよびｌｅｔＩプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターも挙げることができる。
親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合は、例えば、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。

親株としてコリネ型細菌を用いる場合は、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］等を挙げることができる。

親株として酵母菌株を用いる場合は、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を挙げることができる。

上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株とそれと比較することにより確認することができる。

（ｂ）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。

前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５０または５１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

前記［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。

アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993）］やＦＡＳＴＡ［Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

上記［６］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。

プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。

また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。

上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。

（ｂ）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。

上記の方法で得られる前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。

前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。

細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

また、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。

親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385］ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Gene, 33, 103 (1985)］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ_ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ_ｌａｃ）、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｐ_ＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。

親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。

親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。

上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。

該組換え体ＤＮＡが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認することができる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認することができる。

上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、および上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号５０で表される塩基配列（ｙｎｉＣ遺伝子）または配列番号５１で表される塩基配列（ｙｂｉＶ遺伝子）に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア・コリ属に属する微生物、より好ましくは、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［PCR Protocols, Academic Press (1990)］により取得することができる。

エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手することができる。

上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。

または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Gene, 77, 51(1989)］によっても、上記［２］のＤＮＡを取得することができる。

すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。

上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］および［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。

取得した上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)］または３７００ ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

前記宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２が挙げられる。

上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)］、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）が挙げられる。

組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)］等が挙げられる。

塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。

更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。

該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製することができる。このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、実施例において後述するＰｔｒｐ－ｙｎｉＣおよびＰｔｒｐ－ｙｂｉＶが挙げられる。

組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)］等の方法が挙げられる。

組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、上記において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、上述の方法により、上記［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡの転写量、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の生産量、または該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。

このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧＣおよびＭＧＶを挙げることができる。

（２）前記（１）の微生物を親株として、該親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性とは、フルクトース－６－リン酸を異性化してＤ－プシコース－６－リン酸とする活性をいう。

親株の微生物に比べアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、
（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するアルロース－６－リン酸
３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸、好ましくは１～８個のアミノ酸、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。

突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記１（１）において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号４２で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）において記載したＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。

親株に比べ、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にフルクトース－６－リン酸とその他の基質を加え、合成されたＤ－プシコース－６－リン酸量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認することができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。

（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。

突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記１（１）に記載の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

また、親株のアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。

そのようなプロモーターとしては、上記１（１）に記載のプロモーターを挙げることができる。

上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。

（ｂ）アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。

アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［３］からなる群より選ばれる１の蛋白質が挙げられる。
［１］配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質、
［３］配列番号５２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質

上記において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。

欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。

配列番号５２で表されるアミノ酸配列において１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。

配列番号５２で表されるアミノ酸配列において１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質が、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質であることは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して、培地で培養し、培養物中のＤ－プシコース－６－リン酸を測定することにより確認することができる。

アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、
［７］配列番号４２で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記１（１）の記載と同じである。上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４２で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。

（ｂ）アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。

上記の方法で得られるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。

前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。

リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。

アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

原核生物を宿主細胞として用いる場合は、前記ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

発現ベクターおよび該発現ベクターを用いる場合のプロモーターは、上記１（１）において記載したものと同様の発現ベクターおよびプロモーターが挙げられる。アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡとしては、例えば、実施例において後述するｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。

また、上記の方法で得られるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記１（１）に記載の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。

上記の方法で取得した微生物が、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（１）に記載の方法を用いて確認することができる。

このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥおよびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。

（３）前記（１）または（２）の微生物を親株として、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼは、Ｄ－アロース－６－リン酸をＤ－プシコース－６－リン酸に異性化する活性を有する蛋白質である。ＲｐｉＲは、リプレッサーとしてアロース資化オペロンのオペレーター部分に結合して、それに連なるオペロンの転写を阻止することにより遺伝子の発現を抑制する活性を有する蛋白質である。

Ｄ－アロース輸送蛋白質は、Ｄ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質である。Ｄ－アロースキナーゼとは、Ｄ－アロースをＤ－アロース－６－リン酸にする活性を有する蛋白質である。

親株に比べＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型の該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。

Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子としては、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５３で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４３で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子

ＲｐｉＲをコードする遺伝子としては、リプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４４で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子

Ｄ－アロース輸送蛋白質をコードする遺伝子としては、Ｄ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５５～５７のいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５５～５７のいずれか１で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４５～４７のいずれか１で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４５～４７のいずれか１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子

Ｄ－アロースキナーゼをコードする遺伝子としては、Ｄ－アロースキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロースキナーゼ活性を細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４８で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロースキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子

Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記１（１）の記載と同じである。

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記１（１）の記載と同じである。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４３～４８のいずれか１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。

親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記１（１）または（２）の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株のＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。

突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内でＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記１（１）の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼをコードする遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号４３～４８で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）に記載のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。

試験管内でＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記１（１）の方法と同じである。

親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロース－６－リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のＤ－プシコース－６－リン酸比を比較することにより確認することができる。

親株に比べ、ＲｐｉＲの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株の図２に示すアロース資化オペロンの転写量と該微生物のそれとをノーザン・ブロッティングにより比較することにより確認することができる。

親株に比べ、Ｄ－アロース輸送蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロースを含む培地で培養し、培養液中のＤ－アロース比を比較することにより確認することができる。

親株に比べ、Ｄ－アロースキナーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロースを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のＤ－アロース－６－リン酸比を比較することにより確認することができる。

親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。

Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、アロース資化オペロンが欠損した微生物が挙げられる。具体的には、例えば、実施例において後述するＭＧ１６５５ Δａｌｓを挙げることができる。

（４）前記（１）～（３）のいずれか１の微生物を親株として、該親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
６－ホスホフルクトキナーゼ活性とは、フルクトース－６－リン酸に作用してフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸とする活性である。

親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下、または喪失した微生物は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型の６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。

６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子としては、６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号３７で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４９で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子

６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記１（１）の記載と同じである。

上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記１（１）の記載と同じである。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４９で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。

親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記１（１）～（３）のいずれか１の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株の６－ホスホフルクトキナーゼ活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。

突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内で６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記１（１）の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。

６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば、配列番号４９で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）に記載のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。

試験管内で６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記１（１）に記載の方法と同じである。

親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をフルクトース－６－リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸比を比較することにより確認することができる。

親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。

６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡを挙げることができる。

２．本発明のＤ－プシコースの製造法
２．１．糖を基質として用いるＤ－プシコースの製造法
本発明のＤ－プシコースの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記１の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物（以下、２．１の微生物という。）の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法について、以下説明する。

２．１の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。

窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が挙げられる。

培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５～４０℃が好ましく、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。

例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該媒体からＤ－プシコースを採取することにより、Ｄ－プシコースを製造することができる。

本明細書において、培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。

これらの中でも、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物が挙げられ、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものが挙げられる。

酵素源の量は、用いる各酵素源について、１～５００ｇ／ｌであることが好ましく、より好ましくは１～３００ｇ／ｌである。

糖の濃度は、０．１ｍＭ～１０Ｍであることが好ましく、より好ましくは１ｍＭ～１Ｍである。糖としては、例えば、グルコース、フルクトースおよびシュクロースが挙げられる。

水性媒体としては、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩およびトリスなどの緩衝液、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、並びにアセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。

Ｄ－プシコースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ－２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２－４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｄ－プシコースの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。

有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１～５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。Ｄ－プシコースの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１～１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。

水性媒体中に生成したＤ－プシコースの定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＤ－プシコースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。

２．２．発酵法によるＤ－プシコースの製造法
本発明のＤ－プシコースの製造法のうち、上記１の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法について、以下説明する。

前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記２．１に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。

上記の培養により、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することにより、Ｄ－プシコースを製造することができる。Ｄ－プシコースの定量方法は、上記２．１に記載の方法を用いることができる。

該培養物中からのＤ－プシコースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＤ－プシコースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｄ－プシコースを採取することができる。

図１（ａ）に、エシェリヒア属に属する微生物が有するＤ－アロースの代謝系の概略図を示す。また、図１（ｂ）に本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物によるＤ－プシコース製造の具体例の概略図を示す。

図１（ｂ）の具体例においては、〔１〕アロース資化オペロンが破壊され、且つ親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼをコードする遺伝子（ａｌｓＥ）の発現が増強され、〔２〕６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ）が破壊され、〔３〕親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物を用いて、発酵法によりＤ－プシコースを製造する場合を説明する。

図２にエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図（J. Bacteriol. 181, 7126-7130, 1999）を示す。図２に示すように、エシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンは、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（ｒｐｉＢ）、リプレッサーをコードする遺伝子（ｒｐｉＲ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（結合蛋白質）をコードする遺伝子（ａｌｓＢ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子（ａｌｓＡ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（膜蛋白質）をコードする遺伝子（ａｌｓＣ）、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性をコードする遺伝子（ａｌｓＥ）およびｙｊｃｔ（ａｌｓＫ）から構成される。

図１（ｂ）の具体例においては、親株における微生物が元来有するアロース資化オペロンが破壊されているので、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ（ＲｐｉＢ）、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質（ＡｌｓＡ、ＡｌｓＢおよびＡｌｓＣ）およびＤ－アロースキナーゼ（ａｌｓＫ）の活性が喪失している。また、該親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼをコードする遺伝子（ａｌｓＥ）の発現が特異的に増強されていることにより、フルクトース－６－リン酸からの異性化でプシコース－６－リン酸が効率的に生産される。

また、図１（ｂ）に示すように、６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ）が破壊されていることにより、フルクトース－６－リン酸が代謝されてフルクトース－６－リン酸に作用してフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸となるのを抑制することができ、基質となるフルクトース－６－リン酸を微生物内に蓄積することができる。

さらに、図１（ｂ）に示す具体例においては、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強されていることにより、Ｄ－プシコース－６－リン酸を脱リン酸化して、Ｄ－プシコースを高効率で生産することができる。

３．本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（２Ａ）～（２Ｃ）に記載の微生物を挙げることができる。
（２Ａ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
（２Ｂ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物
（２Ｃ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物
以下、（２Ａ）、（２Ｂ）および（２Ｃ）について説明する。

（２Ａ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
親株は、上記１（１）に記載の親株を用いることができる。親株の微生物に比べアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、上記１（２）に記載したものと同様の以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物

前記微生物が親株に比べ、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および当該微生物を培養し、培養物を超音波処理した後、該処理物にセドヘプツロース－７－リン酸とその他基質を加え、合成されたＤ－アロヘプツロース－７－リン酸量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認することができる。

また、親株に比べ、アルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（２）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。

親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、例えば、親株よりも以下の［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
［８］配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質

親株に比べ前記［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記１（１）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（１）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。

前記［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物はセドヘプツロース－７－リン酸をＤ－アロヘプツロース－７－リン酸へ異性化する活性を有している。該蛋白質の当該活性は本発明において初めて明らかになったものである。

このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ １６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、を挙げることができる。

（２Ｂ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物
「糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する」とは、微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてセドヘプツロース－７－リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。

親株は、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。

親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物は上記１（２）に記載の方法と同様の方法により取得することができる。

糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物としては、親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物が挙げられる。親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、上記１（４）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（４）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。

親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した上で、さらに６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失することにより、中央代謝へのカーボンの流れが減少し、ペントースリン酸経路への流入が増えることによりＤ－アロヘプツロースの生産性が向上すると考えられる。

このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、を挙げることができる。

（２Ｃ）親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物
「Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物」とは、微生物を培地に培養したときに、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸を出発基質としてＤ－アロヘプツロースを該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。

また、「糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する」とは、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、セドヘプツロース－７－リン酸を異性化して得られたＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を基質としてＤ－アロヘプツロースを生成することをいう。

親株は、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する能力を付与した育種株であってもよい。

Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物としては、例えば、親株よりも以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質

親株に比べ前記［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記１（１）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（１）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。

このような微生物としては、実施例において後述するＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。

４．本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法４．１．糖を基質として用いるＤ－アロヘプツロースの製造法
本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記３．に記載の（２Ａ）～（２Ｃ）の微生物（以下、４．１の微生物という。）の培養物または該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素、並びに（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。

４．１の微生物を培養する方法は、上記２．１に記載の方法を用いることができる。４．１の微生物の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該媒体からＤ－アロヘプツロースを採取することにより、Ｄ－アロヘプツロースを製造することができる。

前記培養物の処理物としては、上記２．１に記載の培養物の処理物と同様に、前記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。

脱リン酸化酵素としては、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸を脱リン酸化する活性を有する脱リン酸化酵素であればいずれでもよいが、例えば、上記１（１）に記載の親株が元来有する脱リン酸化酵素を、好ましくは、ｙｎｉＣ遺伝子がコードする脱リン酸化酵素を挙げることができる。

Ｄ－アロヘプツロースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤および有機溶媒は２．１に記載したものを用いることができる。

水性媒体中に生成したＤ－アロヘプツロースの定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＤ－アロヘプツロースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。

４．２．発酵法によるＤ－アロヘプツロースの製造法
本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法のうち、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。

前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記２．１に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。

上記の培養により、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することにより、Ｄ－アロヘプツロースを製造することができる。Ｄ－アロヘプツロースの定量方法は、上記４．１に記載の方法を用いることができる。

該培養物中からのＤ－アロヘプツロースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＤ－アロヘプツロースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｄ－アロヘプツロースを採取することができる。

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
Ｄ－プシコースの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損および遺伝子置換の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

バチルス・サチルス １６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、ｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。配列番号３８および４０で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＳａｌＩ認識サイトが付与されている。

増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液を鋳型とし、配列番号３９および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

（２）アロース資化オペロンが欠損した微生物の造成
常法により調製したエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

ａｌｓＫ上流１およびａｌｓＫ上流２は、ａｌｓＫ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｒｐｉＢ下流１およびｒｐｉＢ下流２は、ｒｐｉＢ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。

ａｌｓＫ上流１、ｒｐｉＢ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたアロース資化オペロンを含むＤＮＡ（以下、ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

ａｌｓＫ上流２およびｒｐｉＢ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｒｐｉＢ、ｒｉｐＲ、ａｌｓＡ、ａｌｓＢ、ａｌｓＣ、ａｌｓＥ、およびａｌｓＫが欠損したアロース資化オペロン周辺領域を含むＤＮＡ（以下、Δａｌｓという。）断片を得た。

ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を保持するエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（アロース資化オペロンがａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。

Δａｌｓ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔａｌｓに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該微生物をＭＧ１６５５ Δａｌｓと命名した。

（３）アロース資化オペロンおよびｐｆｋＡ遺伝子が欠損した微生物の造成
常法により調製したエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

ｐｆｋＡ上流１およびｐｆｋＡ上流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の開始コドンからその上流約７００ｂｐを含む。ｐｆｋＡ下流１およびｐｆｋＡ下流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の終止コドンからその下流約８００ｂｐを含む。

ｐｆｋＡ上流１、ｐｆｋＡ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号９および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｐｆｋＡ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

ｐｆｋＡ上流２およびｐｆｋＡ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号９および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｐｆｋＡ遺伝子が欠損したｐｆｋＡ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ΔｐｆｋＡという。）断片を得た。

ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢを、ｐＫＤ４６を保持するＭＧ１６５５ Δａｌｓ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ遺伝子がｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。

ΔｐｆｋＡ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｐｆｋＡに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡと命名した。

（４）ｙｎｉＣ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドン上流に、ｔｒｐプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。

ｔｒｐプロモーターについてはｐＴＫ３１（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p. 6378-6385）を鋳型とし、その他の増幅ＤＮＡ断片についてはエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表４の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

ｙｎｉＣ上流１およびｙｎｉＣ上流２は、ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｙｎｉＣ下流１は、ｙｎｉＣ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。ｙｎｉＣ下流２は、ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐを含む。

ｙｎｉＣ上流１、ｙｎｉＣ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７および２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｎｉＣ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

ｔｒｐプロモーター、ｙｎｉＣ上流２、ｙｎｉＣ下流２断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７および２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｙｎｉＣ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターが挿入されたＤＮＡ（以下、Ｐｔｒｐ－ｙｎｉＣという。）断片を得た。

ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、ｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｙｎｉＣ遺伝子がｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。

Ｐｔｒｐ－ｙｎｉＣ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｔｒｐ－ｙｎｉＣに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧＣと命名した。

（５）ｙｂｉＶ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドン上流に、ｔｒｐプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。

ｔｒｐプロモーターについてはｐＴＫ３１を鋳型として、その他の断片についてはエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表５の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。

増幅ＤＮＡ断片のｙｂｉＶ上流１およびｙｂｉＶ上流２は、ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｙｂｉＶ下流１は、ｙｂｉＶ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。ｙｂｉＶ下流２は、ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐを含む。

ｙｂｉＶ上流１、ｙｂｉＶ下流、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｂｉＶ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。

ｔｒｐプロモーター、ｙｂｉＶ上流２、ｙｂｉＶ下流２断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｙｂｉＶ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターが挿入されたＤＮＡ（以下、Ｐｔｒｐ－ｙｂｉＶという。）断片を得た。

ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、ｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリ ＭＧ１６５５株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｙｂｉＶ遺伝子がｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。

Ｐｔｒｐ－ｙｂｉＶ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｔｒｐ－ｙｂｉＶに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧＶと命名した。

同様の方法で、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡのｙｂｉＶ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターを挿入したＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡを造成した。

（６）ａｌｓＥ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５および３６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、制限酵素切断領域を含むａｌｓＥ遺伝子を増幅した。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断した発現ベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。

ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥで、ＭＧＣ、ＭＧＶ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡおよびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡを形質転換し、それぞれ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥおよびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。

また、コントロールとして、ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥでエシェリヒア・コリＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡを形質転換し、それぞれ、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。

［実施例２］
Ｄ－プシコースの製造
実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ２ｇ／Ｌ、カザミノ酸 ５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ２ｇ／Ｌ、クエン酸 １ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 １０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物 ５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物 １０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０４ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥについては３０℃で３２時間、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥについては３０℃で４８時間振盪培養した。

培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量した。結果を表６に示す。

表６に示すように、ｙｎｉＣ遺伝子およびｙｂｉＶ遺伝子が、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有すること、および当該遺伝子を形質転換して得られる、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にＤ－プシコースを製造することができることがわかった。

［実施例３］
微生物の培養物の処理物を用いたＤ－プシコースの製造
実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥをアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養する。

該培養液をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 ５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに１０％接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８時間培養する。該培養液 ４０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得する。

各菌株の培養液各４０ｍｌ分を、反応バッファー（０．１Ｍビシンバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マンガン）で一回洗浄したのち、４ｍｌの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後１８，０００×ｇで５分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。

反応は１２．５ｍＭのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３０℃、３３０ｒｐｍで振とうすることによって行う。反応開始後９０分が経過した時点で１／４量の６．７Ｍリン酸を添加することで反応を終了させる。

反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量する。

［実施例４］
Ｄ－アロへプツロースの製造
実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５、およびＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡをＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。

必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物 ２ｇ／Ｌ、カザミノ酸 ５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム ２ｇ／Ｌ、クエン酸 １ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム １６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 １０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物 ５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物 １０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０４ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して、３０℃で４８時間振盪培養した。

培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量した。結果を表７に示す。

表７に示すように、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－セドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にＤ－アロヘプツロースを製造できることがわかった。

［実施例５］
微生物の培養物の処理物を用いたＤ－アロヘプツロースの製造
実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥをアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養する。

該培養液をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 ５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに１０％接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８時間培養する。該培養液 ４０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得する。

各菌株の培養液各４０ｍｌ分を、反応バッファー（０．１Ｍビシンバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 塩化マンガン）で一回洗浄したのち、４ｍｌの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後１８，０００×ｇで５分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。

反応は１２．５ｍＭのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３０℃、３３０ｒｐｍで振とうすることによって行う。反応開始後９０分が経過した時点で１／４量の６．７Ｍリン酸を添加することで反応を終了させる。

反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量する。

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１５年７月２日付けで出願された日本特許出願（特願２０１５－１３３７０９）および２０１６年３月２５日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－６２３３１）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

本発明のＤ－プシコースの製造法によれば、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、微生物が有するＤ－アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でＤ－プシコースを製造することができる。また、本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を用いることにより、高効率でＤ－アロヘプツロースを製造することができる。

配列番号１－ｙｎｉＣのアミノ酸配列
配列番号２－ｙｂｉＶのアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３７－ｐｆｋＡのアミノ酸配列
配列番号３８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４２－ａｌｓＥの塩基配列
配列番号４３－ｒｐｉＢの塩基配列
配列番号４４－ｒｐｉＲの塩基配列
配列番号４５－ａｌｓＡの塩基配列
配列番号４６－ａｌｓＢの塩基配列
配列番号４７－ａｌｓＣの塩基配列
配列番号４８－ａｌｓＫの塩基配列
配列番号４９－ｐｆｋＡの塩基配列
配列番号５０－ｙｎｉＣの塩基配列
配列番号５１－ｙｂｉＶの塩基配列
配列番号５２－ａｌｓＥのアミノ酸配列
配列番号５３－ｒｐｉＢのアミノ酸配列
配列番号５４－ｒｐｉＲのアミノ酸配列
配列番号５５－ａｌｓＡのアミノ酸配列
配列番号５６－ａｌｓＢのアミノ酸配列
配列番号５７－ａｌｓＣのアミノ酸配列
配列番号５８－ａｌｓＫのアミノ酸配列

Claims (11)

1. （ｉ）酵素源として、親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の発現量が向上した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
   ［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
   ［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
   ［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
2. 親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の発現量が向上した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
   ［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
   ［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
   ［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
3. 糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、以下の［４］、［５］および［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、請求項１または２に記載の製造法。
   ［４］請求項１または２の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
   ［５］配列番号５０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
   ［７］配列番号５０で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
4. 糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼの発現量が向上した微生物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造法。
5. 糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造法。
6. 糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造法。
7. （ｉ）酵素源として、親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼの発現量が向上した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを含む、Ｄ－アロヘプツロースの製造法であって、
   前記微生物がＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物であり、且つ前記親株に比べ、以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の発現量が向上した微生物である、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
   ［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
   ［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
   ［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
8. 親株よりもアルロース－６－リン酸 ３－エピメラーゼの発現量が向上した微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを含む、Ｄ－アロヘプツロースの製造法であって、
   前記微生物がＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物であり、且つ前記親株に比べ、以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の発現量が向上した微生物である、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
   ［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
   ［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
   ［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
9. 糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項７または８に記載の製造法。
10. 糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも１の糖である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造法。
11. 親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造法。

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