WO2022168992A1 - １，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、従来と比して効率的にフコース含有糖質を製造する手段の提供を目的とする。本発明は、［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質、［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質のいずれか１の蛋白質に関する。
Description
本発明は、１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び３－フコシルラクトースなどのフコース含有糖質の製造法に関する。
ヒト母乳中に含まれるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）はプレバイオティクスとしての腸内環境の改善作用や免疫の賦活化、乳幼児の認知機能発達などの健康機能を有することが報告されており、その生理活性から、幼児用調製粉乳への添加剤や成人向け健康機能素材としての活用が期待されている（非特許文献１）。
ＨＭＯとして知られる糖質のうち３－フコシルラクトースなどのフコース含有糖質は、物質量比でＨＭＯ全体の約６０％を占めており（非特許文献２）、ＨＭＯの中でも特に機能性が注目されている。
３－フコシルラクトースの製造法としては、フコース転移酵素を用いる方法がある。フコース転移酵素を用いる３－フコシルラクトースの製造法としては、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼ（非特許文献３）や、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼ（非特許文献４、特許文献１）などを用いる方法が挙げられる。しかし、当該フコース転移酵素の活性が不十分であることが課題となっている。
前記課題を解決するために、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼの改変、具体的には、アミノ酸変異導入による酵素活性改善（特許文献２、非特許文献５）やＣ末端アミノ酸配列の欠損・付加による発現改善（非特許文献６）などによる３－フコシルラクトース生産性の改善効果が確認されている。
Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１９）２３９０２４０：１－８
Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１９）５６：１３０－１３７
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｐｒｏｃ Ｅｎｇ（２０１３）１８：８４３－８４９
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ（２０１６）１１３：１６６６－１６７５
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１８）４８：２６９－２７８
しかしながら、特許文献２、非特許文献５及び非特許文献６等に記載のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼの改変による３－フコシルラクトース生産性の改善効果は不十分であり、さらなる効率的なフコース含有糖質の製造法が求められている。
したがって、本発明は、従来と比して効率的にフコース含有糖質を製造する手段の提供を目的とする。
本発明者は、特定のアミノ酸配列を含む１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を用いることにより、従来の方法と比して、効率的に３－フコシルラクトースを製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．下記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
２．配列番号１又は３で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．前記２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
４．前記３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
５．前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、前記４に記載の形質転換体。
６．前記微生物が大腸菌である、前記５に記載の形質転換体。
７．前記４～６のいずれか１に記載の形質転換体を培地に培養してフコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
８．前記４～６のいずれか１に記載の形質転換体を培地に培養して培養物又は該培養物の処理物を得ること、
該培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させること、および
該水性媒体中から該フコース含有糖質を採取すること、を含む、フコース含有糖質の製造法。
９．前記フコース含有糖質が３－フコシルラクトースである、前記７又は８に記載の製造法。
１．下記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
２．配列番号１又は３で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ。
３．前記２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
４．前記３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
５．前記１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、前記４に記載の形質転換体。
６．前記微生物が大腸菌である、前記５に記載の形質転換体。
７．前記４～６のいずれか１に記載の形質転換体を培地に培養してフコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
８．前記４～６のいずれか１に記載の形質転換体を培地に培養して培養物又は該培養物の処理物を得ること、
該培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させること、および
該水性媒体中から該フコース含有糖質を採取すること、を含む、フコース含有糖質の製造法。
９．前記フコース含有糖質が３－フコシルラクトースである、前記７又は８に記載の製造法。
本発明の蛋白質は特定のアミノ酸配列からなることにより優れたα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有している。したがって、該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、従来と比して、効率的に３－フコシルラクトース等のフコース含有糖質を製造できる。
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
本発明の蛋白質は、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質である。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。
アミノ酸配列の「１～２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加」における「１～２０個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。
「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の挿入」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入されていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
「１～２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加」の具体的な態様としては、１～２０個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などが挙げられる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加などを有するアミノ酸配列としては、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。例えば、対象となるタンパク質が有するアミノ酸配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは以下順に６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていることは、例えば、欠失、置換、挿入又は付加されていることを確認しようとする蛋白質のアミノ酸配列と、元となる蛋白質のアミノ酸配列とをアライメントすることにより確認できる。
アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成できる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸を置換、挿入又は付加する場合、置換、挿入又は付加するアミノ酸残基は、天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニンＢ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸Ｃ群：アスパラギン、グルタミンＤ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリンＦ群：セリン、スレオニン、ホモセリンＧ群：フェニルアラニン、チロシン
α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性とは、ドナー基質であるＧＤＰ－フコースから受容体基質である糖質（「受容体糖質」とも称する）のＮ－アセチルグルコサミン３位水酸基またはグルコース３位水酸基にα１，３－結合でフコースを転移し、フコース含有糖質を生成する活性をいう。
受容体糖質としては、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルラクトサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸、グルコース若しくはラクトースまたはそれらの組合せ、およびそれらを部分構造として含む糖鎖が挙げられる。これらの中でも、ラクトースが好ましい。
得られるフコース含有糖質としては、例えば、３－フコシルラクトース、ラクトジフコテトラオース、ルイスＸ及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩが挙げられ、これらの中でも３－フコシルラクトースが好ましい。
本明細書において、「基質」とは、フコース含有糖質を生じさせるためにα１，３－フコシルトランスフェラーゼが作用し得る物質または該物質の組み合わせをいう。
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸の例としては、前記の天然型アミノ酸が挙げられる。相互に置換可能なアミノ酸の例は前述の通りである。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有するとは、例えば以下の方法により確認できる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ） Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を含む水溶液と接触させ、該水溶液中にフコース含有糖質を生成させる。最後に、後述の糖分析装置を用いて反応液中のフコース含有糖質を検出することにより、変異蛋白質又は相同蛋白質がα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを確認できる。
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとして、具体的には以下の［Ａ１］～［Ａ３］のＤＮＡが挙げられる。
［Ａ１］配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
［Ａ２］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［Ａ３］配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
本発明のＤＮＡは、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとして、具体的には以下の［Ａ１］～［Ａ３］のＤＮＡが挙げられる。
［Ａ１］配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
［Ａ２］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
［Ａ３］配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ。
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
プローブとして用いるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡが挙げられる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡが挙げられる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，１９９７）の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行える。
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）が挙げられる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が挙げられる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２）及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得できる。あるいは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いることでも、本発明のＤＮＡが得られる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ（バクテロイデス・レティキュロターマイティス） ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、以下の（i）または（ii）に示すフュージョンＰＣＲによるキメラ化により取得できる。
（i）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、各染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた下記（ｉ－１）～（ｉ－３）の合計３つのＤＮＡ断片のフュージョンＰＣＲによるキメラ化
（i－１）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、１～３４２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（i－２）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、６０７～９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（i－３）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号６で表されるアミノ酸配列のうち、１２７～２１４番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、大腸菌内で発現させるためにコドン最適化した塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用い、各染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた下記（ii－１）～（ii－３）の合計３つのＤＮＡ断片のフュージョンＰＣＲによるキメラ化
（ii－１）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、１～３４２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii－２）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、６０７～９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii－３）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号６で表されるアミノ酸配列のうち、１２７～２１４番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、大腸菌内で発現させるためにコドン最適化した塩基配列からなるＤＮＡ断片
（i）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、各染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた下記（ｉ－１）～（ｉ－３）の合計３つのＤＮＡ断片のフュージョンＰＣＲによるキメラ化
（i－１）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、１～３４２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（i－２）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、６０７～９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（i－３）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションによって得られた配列番号６で表されるアミノ酸配列のうち、１２７～２１４番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、大腸菌内で発現させるためにコドン最適化した塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用い、各染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた下記（ii－１）～（ii－３）の合計３つのＤＮＡ断片のフュージョンＰＣＲによるキメラ化
（ii－１）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、１～３４２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii－２）微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号３で表される塩基配列のうち、６０７～９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片
（ii－３）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた配列番号６で表されるアミノ酸配列のうち、１２７～２１４番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を、大腸菌内で発現させるためにコドン最適化した塩基配列からなるＤＮＡ断片
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
前記［２］に記載の、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
又は、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法（Ｇｅｎｅ，７７，５１，１９８９）によっても、前記［２］の配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドが得られる。
前記配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により取得できる。具体的には、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１又は３で表わされる塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、前記の配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって、該相同蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、前記１と同様の方法で決定できる。上記の方法で取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３，１９７７）、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
本発明のＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９，１９９０）等が挙げられる。
上記の宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等が挙げられる。
本発明のＤＮＡを組み込んで得られる、組み換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０，１９７２）、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７，１９８８）等が挙げられる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
３．本発明の組換え体ＤＮＡ
本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、前記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、前記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
宿主細胞において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本発明の組換え体ＤＮＡである。組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、前記２の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。また、本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ(いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９，１９８４）、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７，１９８９）、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）、ｐＴｒＳ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８/１２３４３号）、ｐＵＣ１９（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等が挙げられる。
上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、例えば、プロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターが挙げられる。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５，１９８４）等が挙げられる。
上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９，２０００）が挙げられる。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、前記２の方法により調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、前記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製できる。
ここで、本発明のＤＮＡを構成する塩基配列を宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上できる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
４．本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、前記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。本明細書において、「宿主細胞」とは、遺伝子導入による形質転換の対象となる元の細胞をいう。
本発明の形質転換体は、前記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。本明細書において、「宿主細胞」とは、遺伝子導入による形質転換の対象となる元の細胞をいう。
本発明の形質転換体としては、具体的には例えば、上記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物が挙げられる。例えば上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもフコース含有糖質の生産性が増強された微生物が挙げられる。本明細書において、「親株」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株をいう。
前記組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもフコース含有糖質の生産性が増強された微生物としては、例えば、以下のi）～iii）の微生物が挙げられる。
i）上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物
ii）上記［２］の変異蛋白質として、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物
iii）上記［３］の相同蛋白質として、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物
i）上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物
ii）上記［２］の変異蛋白質として、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物
iii）上記［３］の相同蛋白質として、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強された蛋白質を生産することにより、フコース含有糖質の生産性が増強された微生物
上記［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１つに記載のＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認できる。
α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強されたことを確認する方法としては、例えば、変異蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該変異蛋白質を精製し、該蛋白質、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したフコース含有糖質と該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した、フコース含有糖質生成活性を有し、且つ変異が導入されていない蛋白質の比活性と比較することにより確認できる。
このような本発明の形質転換体の例としては、実施例において後述するＴ１６６／ｐＡＴＹ２株及びＴ１６６／ｐＡＴＹ３株が挙げられる。
本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは原核生物又は酵母菌株、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株であり、最も好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ９６３７、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ［例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８］、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ［例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ［Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０］、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ［Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４］若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０）等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
宿主細胞としては、例えば、以下の１）および２）が挙げられる。
１）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力が人工的に付与又は増強された微生物
２）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物
以下、各宿主細胞について説明する。
１）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力が人工的に付与又は増強された微生物
２）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物
以下、各宿主細胞について説明する。
１）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力が人工的に付与又は増強された微生物
宿主細胞としては、好ましくは、α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強された微生物が挙げられる。宿主細胞として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを生成する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
宿主細胞としては、好ましくは、α１，３－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強された微生物が挙げられる。宿主細胞として用いる微生物において、ＧＤＰ－フコースを生成する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
ＧＤＰ－フコースを生産する能力としては、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力が挙げられる。宿主細胞として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（１ａ）～（１ｄ）の方法が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
（１ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（１ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（１ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（１ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（例えば、ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。
糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。
２）宿主細胞として用いる微生物に、フコース転移酵素の反応基質である受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強された微生物
宿主細胞として用いる微生物に、受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（２ａ）～（２ｇ）が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（２ａ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｃ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）受容体糖質を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）受容体糖質から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
宿主細胞として用いる微生物に、受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は増強する方法としては、例えば、以下の（２ａ）～（２ｇ）が挙げられる。これらの方法は単独または組み合わせて用いてもよい。
（２ａ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｂ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｃ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｄ）受容体糖質を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（２ｅ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つについて発現を増強する方法
（２ｆ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（２ｇ）受容体糖質から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びＵＤＰ－ガラクトースを基質としてラクトースを生成するラクトースシンターゼ活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。受容体糖質を分解する機構の具体例としては、例えば、ラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。上記、受容体糖質を供給する能力を付与又は増強する方法の具体例としては、遺伝子操作によりβ－ガラクトシダーゼの活性を低下又は失活させる方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
前記３の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９，１９８４）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３，１９８３）等の方法が挙げられる。
組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５，２０００）が挙げられる。
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
上記の方法で得られた形質転換体が、前記２に記載の本発明のＤＮＡを有していることは、例えば、該形質転換体が糖からＧＤＰ－フコースや受容体糖質を生成する能力を有している宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体の場合、該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積したフコース含有糖質の生成量を、親株のそれと比較することにより確認できる。または、該培養物から本発明の蛋白質を含有する抽出液を調製し、該抽出液、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に蓄積したフコース含有糖質の生成量を、親株のそれと比較することによっても確認できる。
５．本発明のフコース含有糖質の製造法
本発明のフコース含有糖質の製造法は、以下の５－１及び５－２に記載の方法である。
本発明のフコース含有糖質の製造法は、以下の５－１及び５－２に記載の方法である。
５－１．発酵法によるフコース含有糖質の製造法
本発明のフコース含有糖質の製造法としては、上記４の形質転換体を培地に培養してフコース含有糖質を生成させることを含む、発酵法によるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。
本発明のフコース含有糖質の製造法としては、上記４の形質転換体を培地に培養してフコース含有糖質を生成させることを含む、発酵法によるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。
発酵法によるフコース含有糖質の製造法に用いる、本発明の形質転換体としては、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する形質転換体であることが好ましい。
また、発酵によるフコース含有糖質の製造法に用いる本発明の形質転換体として、受容体糖質を生成する能力を有する形質転換体を用いてもよい。
上記４の形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。フコース含有糖質の前駆体としてラクトース等の受容体糖質を、また、ＧＤＰ－フコースの前駆体としてＧＴＰやマンノース等を培地に添加してもよい。
発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する。また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する代わりに、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にＧＤＰ－フコースを供給してもよい。
また、ＧＤＰ－フコースの前駆体であるＧＴＰを供給または増強するために、ＧＴＰを生産する能力を有する微生物を同時に培養してもよい。ＧＴＰを生産する能力を有する微生物としては、例えば、各種遺伝子操作によりＧＴＰの生合成経路に関与する酵素の発現が増強された微生物（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，Ｓｅｐ３：２０１９，２４１２－２４１７）等、公知の微生物が挙げられる。
発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する。
また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する代わりに、糖からラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にラクトース等の受容体糖質を供給してもよい。
培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記の培養により、培養物中にフコース含有糖質を生成させてフコース含有糖質を製造することで、例えば、形質転換体または該培養物中に蓄積したフコース含有糖質を採取することにより、フコース含有糖質を得ることができる。
得られたフコース含有糖質は、糖質イオンクロマトグラフィーなどを用いる通常の方法によって分析できる。上記の培養物又は該培養物の処理物中からのフコース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。菌体内にフコース含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から活性炭やイオン交換樹脂等によって、フコース含有糖質を採取できる。
５－２．ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を基質として用いるフコース含有糖質の製造法
本発明のフコース含有糖質の製造法としては、また、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を前駆体として用いるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。具体的には、上記４の形質転換体を培養して得られる培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させ、必要に応じて該水性媒体中に生成したフコース含有糖質を採取することができる。
本発明のフコース含有糖質の製造法としては、また、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を前駆体として用いるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。具体的には、上記４の形質転換体を培養して得られる培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させ、必要に応じて該水性媒体中に生成したフコース含有糖質を採取することができる。
ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質は、本発明の形質転換体が有する本発明の蛋白質の基質となるものであればその由来は問わないが、ＧＤＰ－フコース又は受容体糖質を生産する能力を有する微生物の培養物又は該培養物の処理物をそのまま、あるいは該培養物又は該培養物の処理物から採取したＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を用いてもよい。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などが挙げられる。
水性媒体としては、例えば、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることもできる。
水性媒体中に生成したフコース含有糖質の分析及び採取方法は５－１と同様である。
［分析例］
実施例において、３－フコシルラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれる３－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：（移動相Ａ）水
（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ 水酸化ナトリウム
（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
（０～１０分）８０：２０：０
（１０～１５分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
（１５～１７分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
（１７～２５分）０：２０：８０
（２５～３５分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
実施例において、３－フコシルラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれる３－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：（移動相Ａ）水
（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ 水酸化ナトリウム
（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸ナトリウム
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比：
（０～１０分）８０：２０：０
（１０～１５分）８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
（１５～１７分）７０：２０：１０から０：２０：８０の勾配
（１７～２５分）０：２０：８０
（２５～３５分）８０：２０：０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
以下に発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］３－フコシルラクトースの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サチルス）１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｐＨＳＧ３９６上のｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約５０ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡ上のｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。
次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを鋳型とし、配列番号８および１１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
（２）β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性及びコラン酸生成活性が喪失した大腸菌の造成
β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドン下流約５０ｂｐから約１０００ｂｐの領域を含む。
ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１３および１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１３および１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５，２０００）を保持するＷ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体 （ｌａｃＺＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ΔｌａｃＺＹと命名した。
同様に、Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンから開始コドンの上流約１０００ｂｐまでの領域を含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐまでの領域を含む。
ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１９および２１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したＷ３１１０ΔｌａｃＺＹ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＴ１６６と命名した。
（３）α１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性（以下、１，３－ＦｕｃＴ活性という。）を有する微生物の造成
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ由来グリコシルトランスフェラーゼ（以下、ＢｒＦｕｃＴという。）をコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ由来グリコシルトランスフェラーゼ（以下、ＢｒＦｕｃＴという。）をコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。また、配列番号２５及び２８、配列番号２９及び３４で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
ｒｃｓＡ、ＢｒＦｕｃＴ、及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６及び３７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
配列番号３８及び３９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．４ｋｂのベクター断片を得た。
このとき、配列番号３６及び３９、配列番号３７及び３８で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
上記で得られたｒｃｓＡ－ＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ＢｒＦｕｃＴ発現プラスミドｐＡＴＹ２を得た。
上記、発現プラスミドｐＡＴＹ２を用いて、実施例１（２）で造成したＴ１６６株を形質転換することで、ＢｒＦｕｃＴを有する大腸菌を造成し、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ２株と命名した。
（４）改変型ＢｒＦｕｃＴを発現する微生物の造成
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる改変型ＢｒＦｕｃＴをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる改変型ＢｒＦｕｃＴをコードする遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を、以下の方法で造成した。
表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表５の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ ＪＣＭ１０５１２株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来α１，３－フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＢｆＦｕｃＴという。）をコードする遺伝子の部分配列を、大腸菌で発現させるためにコドン最適化したＤＮＡである。また、配列番号２５及び２８、配列番号３０及び３１、配列番号３２及び３３、配列番号２９及び３４で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
まず、ｃＢｒＦｕｃＴ上流、ｃＢｒＦｕｃＴ中流及びｃＢｒＦｕｃＴ下流の３断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｃＢｒＦｕｃＴ断片という。）断片を得た。
ｒｃｓＡ、ｃＢｒＦｕｃＴ遺伝子、及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６及び３７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
配列番号３８及び３９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．４ｋｂのベクター断片を得た。
このとき、配列番号３６及び３９、配列番号３７及び３８で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
上記で得られたｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ｃＢｒＦｕｃＴ発現プラスミドｐＡＴＹ３を得た。
上記、発現プラスミドｐＡＴＹ３を用いて、実施例１（２）で造成したＴ１６６株を形質転換することで、ｃＢｒＦｕｃＴを有する大腸菌を造成し、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ３株と命名した。
［比較例］Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＢｆＦｕｃＴという。）の発現が増強された微生物の造成
表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表６の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
表６の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表６の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。また、配列番号２５及び２６、配列番号２７及び３４で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
ｒｃｓＡ、ＢｆＦｕｃＴ遺伝子及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６及び３７で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ＢｆＦｕｃＴ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
配列番号３８及び３９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．４ｋｂのベクター断片を得た。このとき、配列番号３６及び３９、配列番号３７及び３８で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
上記で得られたｒｃｓＡ－ＢｆＦｕｃＴ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、ＢｆＦｕｃＴ発現プラスミドｐＡＴＹ１を得た。
上記、発現プラスミドｐＡＴＹ１を用いて、実施例１（２）で造成したＴ１６６株を形質転換することで、ＢｆＦｕｃＴを有する大腸菌を造成し、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ１株と命名した。
［実施例２］３－フコシルラクトースの製造
実施例１で得られたＴ１６６／ｐＡＴＹ１株、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ２株、及びＴ１６６／ｐＡＴＹ３株を、ＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地４ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２８時間振盪培養した。
実施例１で得られたＴ１６６／ｐＡＴＹ１株、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ２株、及びＴ１６６／ｐＡＴＹ３株を、ＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地４ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物１０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が４ｍＬ入った大型試験管に０．２ｍＬ植菌し、３０℃で２８時間振盪培養した。
培養終了後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清に含まれる３－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００にて分析した。結果を表７に示す。
表７に示すように、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ１株に比べ、Ｔ１６６／ｐＡＴＹ２株、及びＴ１６６／ｐＡＴＹ３株は、顕著に高い３－フコシルラクトース生産性を示し、ＢｒＦｕｃＴ及びｃＢｒＦｕｃＴはいずれも１，３－ＦｕｃＴ活性を有することが分かった。
また、ＢｒＦｕｃＴ及びｃＢｒＦｕｃＴを用いることで、公知のα１，３－ＦｕｃＴであるＢｆＦｕｃＴに比べて３－フコシルラクトースの生産性が大幅に向上することが分かった。
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２１年２月８日付けで出願された日本特許出願（特願２０２１－０１８４８３）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ由来ｂｒｆｕｃＴの塩基配列
配列番号２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ由来ＢｒｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号３：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｉｍｉｓ及びＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｃｂｒｆｕｃＴの塩基配列
配列番号４：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｉｍｉｓ及びＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｃＢｒｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号５：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｂｆｆｕｃＴの塩基配列
配列番号６：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ＢｆｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号７：コドン最適化型ＢｆＦｕｃＴの部分塩基配列
配列番号８、９：ｃａｔ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１０、１１：ｓａｃＢ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１２、１３：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１４、１５：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１６：ｌａｃＺ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１７：ｌａｃＹ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１８、１９：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２０、２１：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２２：ｗｃａＪ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２３：ｗｃａＭ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２４、２５：ｒｃｓＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２６、２７：ｂｆｆｕｃＴ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２８、２９：ｂｒｆｕｃＴ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３０：ｃＢｒＦｕｃＴ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３１、３２：ｃＢｒＦｕｃＴ中流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３３：ｃＢｒＦｕｃＴ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３４、３５：ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３６、３７：ｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３８、３９：ｐＰＥ１６７増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ由来ＢｒｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号３：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｉｍｉｓ及びＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｃｂｒｆｕｃＴの塩基配列
配列番号４：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｉｍｉｓ及びＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｃＢｒｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号５：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ｂｆｆｕｃＴの塩基配列
配列番号６：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来ＢｆｆｕｃＴのアミノ酸配列
配列番号７：コドン最適化型ＢｆＦｕｃＴの部分塩基配列
配列番号８、９：ｃａｔ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１０、１１：ｓａｃＢ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１２、１３：ｌａｃＺ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１４、１５：ｌａｃＹ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１６：ｌａｃＺ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１７：ｌａｃＹ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号１８、１９：ｗｃａＪ上流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２０、２１：ｗｃａＭ下流１増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２２：ｗｃａＪ上流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２３：ｗｃａＭ下流２増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２４、２５：ｒｃｓＡ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２６、２７：ｂｆｆｕｃＴ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号２８、２９：ｂｒｆｕｃＴ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３０：ｃＢｒＦｕｃＴ上流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３１、３２：ｃＢｒＦｕｃＴ中流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３３：ｃＢｒＦｕｃＴ下流増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３４、３５：ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３６、３７：ｒｃｓＡ－ｃＢｒＦｕｃＴ－ｌａｃＹ増幅用プライマーの塩基配列
配列番号３８、３９：ｐＰＥ１６７増幅用プライマーの塩基配列
Claims (9)
- 下記［１］～［３］のいずれか１の蛋白質。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質。 - 配列番号１又は３で表される塩基配列又はその相同配列からなり、かつ請求項１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ。
- 請求項２に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
- 請求項３に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項１に記載の［１］～［３］のいずれか１の蛋白質の活性及びフコース含有糖質の生産性が増強された微生物である、請求項４に記載の形質転換体。
- 前記微生物が大腸菌である、請求項５に記載の形質転換体。
- 請求項４～６のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養してフコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
- 請求項４～６のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養して培養物又は該培養物の処理物を得ること、
該培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させること、を含む、フコース含有糖質の製造法。 - 前記フコース含有糖質が３－フコシルラクトースである、請求項７又は８に記載の製造法。
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