WO2022176994A1 - 改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法 - Google Patents

改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法 Download PDF

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健一郎 田畑
望 鎌田
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協和発酵バイオ株式会社
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a modified ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing a fucose-containing carbohydrate using the protein or a microorganism capable of producing the protein.
  • HMOs Human milk oligosaccharides
  • Non-Patent Document 2 Among carbohydrates known as HMOs, fucose-containing carbohydrates such as 2'-fucosyllactose account for about 60% of the total HMOs, and the functionality of these carbohydrates has attracted attention (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 4 ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Helicobacter pylori is widely used in methods for producing fucose-containing carbohydrates by enzymatic reaction or fermentation production (Non-Patent Documents 2 and 3), but the fucose transfer The problem is that the activity of the enzyme is insufficient (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Bacteroides fragilis
  • Patent Document 1 ⁇ 1,2-fucosyltransferase derived from Helicobacter mustelae
  • the purpose of the present invention is to provide a protein having a modified ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing a fucose-containing carbohydrate using the protein or a microorganism capable of producing the protein.
  • the present invention relates to the following. 1. Amino acid residues corresponding to the 9th, 68th, 75th, 86th and 238th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3] below A protein consisting of an amino acid sequence containing substitutions of one or more amino acid residues selected from the group consisting of groups to other amino acid residues, and A protein having improved ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity compared to the original protein according to any one of [1] to [3] below.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added, and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity
  • a homologous protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity.
  • the protein according to 1 above which consists of an amino acid sequence containing a substitution of a group for another amino acid residue.
  • amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3] above comprises an amino acid sequence containing at least one substitution selected from the following [1a] to [1e]: protein.
  • any one of the above 1 to 3, wherein the amino acid sequence of the protein according to any one of the above [1] to [3] comprises an amino acid sequence containing at least one substitution selected from the following [2a] to [2e] 1.
  • the protein according to 1. [2a] substitution of L-arginine for the amino acid residue corresponding to position 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [2b] replacement of the amino acid residue corresponding to position 68 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • substitution with L-arginine [2c]
  • substitution of the corresponding amino acid residue with L-serine [2e] Substitution of the amino acid residue corresponding to position 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with L-alanine5.
  • an amino acid sequence comprising a substitution of L-arginine for the amino acid residue corresponding to position 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 5.
  • 8. A DNA encoding the protein according to any one of 1 to 7 above.
  • a method for producing a fucose-containing saccharide which comprises culturing a microorganism capable of producing the protein according to any one of 1 to 7 above in a medium to produce the fucose-containing saccharide in the culture. 12.
  • the microorganism having the ability to produce the protein according to any one of 1 to 7 above is cultured in a medium, and the resulting culture or a processed product of the culture is used as an enzyme source, the enzyme source, GDP-fucose and
  • a method for producing a fucose-containing saccharide comprising allowing an acceptor saccharide to exist in an aqueous medium and producing a fucose-containing saccharide in the aqueous medium. 13.
  • a method for producing a fucose-containing carbohydrate using a protein having modified ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and the protein or a microorganism capable of producing the protein is provided.
  • the protein of the present invention is a protein according to any one of (1) to (7) below.
  • (1) Corresponding to the 9th, 68th, 75th, 86th and 238th amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3] below
  • a protein consisting of an amino acid sequence containing substitutions of one or more amino acid residues selected from the group consisting of the amino acid residues that correspond to other amino acid residues, and A protein having improved ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity compared to the original protein according to any one of [1] to [3].
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added, and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity [3] SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 (2) Any of the above [1] to [3], which is a homologous protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity In the amino acid sequence of the protein according to or 1, from the amino acid residues corresponding to the 9th, 68th, 75th, 86th and 238th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 to other amino acid residues
  • amino acid residues to be used are the 9th, 68th, 75th, 86th and 238th amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 when the amino acid sequence of the original protein and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are aligned. Refers to each amino acid residue that aligns to the same position as the amino acid residue.
  • amino acid residues to be used include the following. (i) When the original protein is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the 9th, 68th, 75th, 86th and 86th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2, respectively 238th amino acid residue.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8 there is no amino acid residue corresponding to position 86 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.
  • substitution of one or more amino acid residues selected from the group consisting of groups with other amino acid residues is, for example, the substitution with other amino acid residues [1] It can be confirmed by aligning the amino acid sequence of the protein according to any one of [3] with the amino acid sequence of the original protein.
  • Alignment of amino acid sequences can be created using, for example, the known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22, 4673, (1994)].
  • ClustalW for example, http://www. ebi.ac. Available from uk/clustalw/ (European Bioinformatics Institute). Default values, for example, can be used for parameters when creating an alignment using ClustalW.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • substitution of an amino acid residue with another amino acid residue in the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3] above is , preferably at least one selected from the following [a] to [e], and the other amino acid residue is more preferably an L-form.
  • substitution of an amino acid residue with another amino acid residue in the amino acid sequence of the protein according to any one of [1] to [3] above preferably includes at least one selected from the following [1a] to [1e].
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 9th, 68th Of the one or more amino acid residues selected from the group consisting of the amino acid residues corresponding to the 75th, 86th and 238th amino acids, at least one or more, preferably two or more amino acid residues are preferably substituted.
  • [A ] and [B] are more preferably included.
  • [A] Substitution of the amino acid residue corresponding to the 9th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with another amino acid, preferably the amino acid residues described in the above group D (lysine, arginine, ornithine, 2, 4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid) with 1 selected from, more preferably with L-arginine
  • [C ] is particularly preferred. [C] substitution of the amino acid residue corresponding to position 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 with L-arginine, and amino acid residue corresponding to position 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 to L - substitution to alanine
  • the ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity is the activity of transferring fucose to the galactose residue of the acceptor sugar via an ⁇ 1,2 bond using GDP-fucose and an acceptor sugar as substrates to produce a fucose-containing sugar.
  • Acceptor carbohydrates include carbohydrates containing oligosaccharides having galactose at the non-reducing end, preferably lactose, globotriose, N-acetyllactosamine, lacto-N-tetraose, and lacto-N-neotetraose at the non-reducing end. , Lewis X, or Lewis a structure, more preferably lactose, globotriose, N-acetyllactosamine, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, Lewis X, or Lewis a et al.
  • fucose-containing carbohydrates obtained using the above-mentioned acceptor carbohydrate as a substrate examples include 2′-fucosyllactose, lacto-N-fucopentaose I, lactodifucotetraose, lacto-N-difucohexaose I, and lacto- N-neofucopentaose I and the like can be mentioned.
  • the fact that the protein according to any one of (1) to (7) above has improved ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity compared to the original protein can be confirmed, for example, by the following method.
  • a microorganism that does not have ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity such as a microorganism obtained by transforming Escherichia coli strain W3110, is cultured with the recombinant DNA, and cells containing the protein are obtained from the culture. Prepare the extract.
  • the cell extract containing the protein is brought into contact with an aqueous solution containing GDP-fucose as a substrate and receptor saccharides to produce fucose-containing saccharides in the aqueous solution.
  • the fucose-containing carbohydrates in the reaction solution were detected using a saccharide analyzer described later, and the amounts of the carbohydrates produced were compared to find that the ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity of the protein was higher than that of the original protein. I can confirm that it is improving.
  • Mutant protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or artificially inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • deletion, substitution, insertion or addition of amino acids may be deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids at any position in the same sequence.
  • Amino acids to be substituted, inserted or added may be natural or non-natural.
  • naturally occurring amino acids include the aforementioned naturally occurring amino acids.
  • Homologous proteins refer to a group of proteins derived from proteins of the same evolutionary origin, which are proteins possessed by organisms that exist in nature. Homologous proteins are similar in structure and function to each other.
  • the above mutant protein or homologous protein has ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity can be confirmed, for example, by the following method.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a mutant protein or a homologous protein whose activity is to be confirmed is prepared by the method described below.
  • a microorganism that does not have ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity such as a microorganism obtained by transforming Escherichia coli strain W3110, is cultured with the recombinant DNA, and cells containing the protein are obtained from the culture. Prepare the extract.
  • the cell extract containing the protein is brought into contact with an aqueous solution containing GDP-fucose as a substrate and receptor saccharides to produce fucose-containing saccharides in the aqueous solution.
  • an aqueous solution containing GDP-fucose as a substrate and receptor saccharides to produce fucose-containing saccharides in the aqueous solution.
  • proteins of the present invention include proteins consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID Nos: 51, 52, 53, and 54.
  • DNA of the present invention is DNA encoding the protein described in any one of (1) to (7) above.
  • Specific examples of the DNA of the present invention include any one of the following (8) to (13).
  • L-arginine for the amino acid residue L-proline for the amino acid residue corresponding to the 75th amino acid residue, L-serine for the amino acid residue corresponding to the 86th amino acid residue, or L-alanine for the amino acid residue corresponding to the 238th amino acid residue.
  • a DNA that encodes a protein consisting of an amino acid sequence (10) The DNA according to (8) above, wherein in the amino acid sequence encoded by the amino acid sequence, the amino acid residue corresponding to position 9 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with L-arginine.
  • DNA encoding a protein consisting of (11) The DNA according to (8) above, wherein in the amino acid sequence encoded by the amino acid sequence, the amino acid residue corresponding to position 238 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with L-alanine.
  • DNA encoding a protein consisting of (12) The DNA according to (8) above, wherein in the amino acid sequence encoded by the amino acid sequence, the amino acid residue corresponding to the 9th position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is L-arginine, and the 238th position
  • (13) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, 12, 13 or 14;
  • hybridize means a step in which DNA hybridizes to a DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific nucleotide sequence or the nucleotide sequence of the DNA hybridizing to a part of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. It may be the same DNA.
  • DNAs used as probes include, for example, DNAs of at least 100 bases or more, preferably 200 bases or more, and more preferably 500 bases or more.
  • DNAs used as primers include, for example, DNAs of at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • Commercially available hybridization kits include, for example, a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) in which probes are prepared by the random prime method and hybridized under stringent conditions.
  • the above stringent conditions are, for example, DNA-immobilized filters and probe DNAs mixed with 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6). ), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L of denatured salmon sperm DNA after overnight incubation at 42° C., followed by, for example, 0.2 ⁇ SSC solution at about 65° C. conditions in which the filter is washed.
  • 5 ⁇ SSC 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate
  • 50 mM sodium phosphate pH 7.6
  • 5 ⁇ Denhardt's solution 10% dextran sulfate
  • 20 ⁇ g/L of denatured salmon sperm DNA after overnight incubation at 42° C.
  • 0.2 ⁇ SSC solution at about 65° C. conditions in which the filter is washed.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing blocking reagents used to suppress background in hybridization experiments. Addition of blocking reagents as described above may be accompanied by alteration of the hybridization conditions in order to match the conditions.
  • Examples of the DNA that can hybridize under the above stringent conditions include SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 and 9 when calculated based on the above parameters using programs such as BLAST and FASTA.
  • a DNA consisting of a base sequence having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the indicated base sequence.
  • the DNA of the present invention for example, using a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10, the 9th position of SEQ ID NO: 2 located on the DNA, For example, Molecular Cloning 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) and Current Protocols in Molecular Biology (JOHN WILEY & SONS, INC.). It can be obtained by substituting the encoding base sequence. Alternatively, the DNA of the present invention can also be obtained by using PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a mutein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequence represented by, for example, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 by the same method and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity, the amino acid sequence of the mutant protein and the amino acid represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 as the base thereof
  • a DNA encoding a homologous protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity is used. Then, when the amino acid sequence of the homologous protein and its original amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10 are aligned by the method of 1 above, in the amino acid sequence of the homologous protein, the sequence Mutation in the base sequence of the portion encoding one or more amino acid residues selected from the group consisting of amino acid residues corresponding to the 9th, 68th, 75th, 86th and 238th amino acid residues of number 2 It can also be obtained by installing
  • the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Preferably by Southern hybridization to the chromosomal DNA library of Helicobacter genus, more preferably Helicobacter mustelae ATCC43772 strain, or using a primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using the chromosomal DNA of Helicobacter mustelae ATCC 43772 strain as a template.
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, using a microorganism, preferably Helicobacter.
  • Helicobacter pylori ATCC700392 by Southern hybridization to the chromosomal DNA library of the genus, more preferably Helicobacter pylori ATCC700392 strain, or using a primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 It can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of the strain as a template.
  • Specific examples of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:3.
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, and by using a microorganism, preferably Escherichia. genus, more preferably Escherichia coli O126 strain. It can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of Escherichia coli O126 strain as a template.
  • Specific examples of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6 include DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:5.
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 can be obtained, for example, by using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and by using a microorganism, preferably Bacteroides.
  • Bacteroides fragilis ATCC 25285 by Southern hybridization to the chromosomal DNA library of the genus, more preferably Bacteroides fragilis ATCC 25285 strain, or using primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 It can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of the strain as a template.
  • the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8 specifically includes DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO:7.
  • the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 can be obtained by using a probe that can be designed based on the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and extracting the DNA from a microorganism, preferably Vibrio. genus, more preferably Vibrio cholerae (Vibrio cholerae) O22 strain chromosomal DNA library, or by using a primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 It can be obtained by PCR using the chromosomal DNA of the Vibrio cholerae O22 strain as a template.
  • a specific example of the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:10 is a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO:9.
  • a DNA encoding a mutant protein consisting of a sequence and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity can be obtained, for example, by using a DNA consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9 as a template. can be obtained by subjecting it to error-prone PCR or the like.
  • a partially specific mutagenesis method by PCR using a set of PCR primers each having at their 5' end a nucleotide sequence designed to introduce the desired mutation (deletion, substitution, insertion or addition) [ Gene, 77, 51 (1989)], 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, or A DNA encoding a mutant protein comprising an inserted or added amino acid sequence and having ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity can be obtained.
  • the DNA can also be obtained by following the instructions attached to the commercially available partial-specific mutagenesis kit.
  • a commercially available partial-specific mutagenesis kit for example, PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) that can introduce mutation (deletion, substitution, insertion or addition) at the position where the desired mutation is to be introduced is available. mentioned.
  • a pair of mutagenesis primers having a 15-base overlap on the 5' side is designed. do. At this time, the overlapping portion contains the desired mutation.
  • PCR is performed using a plasmid having a nucleotide sequence to be mutated as a template. By transforming the amplified fragment thus obtained into Escherichia coli, a plasmid having the nucleotide sequence into which the desired mutation has been introduced can be obtained.
  • a DNA encoding a homologous protein having fucosyltransferase activity can be obtained, for example, by the following method.
  • a nucleotide sequence having an identity of 99% or more is searched, and using a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism having the DNA, the above-mentioned
  • a DNA encoding the homologous protein can be obtained by a method similar to the method for obtaining the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10.
  • base sequences and amino acid sequences can be determined by the same method as 1 above.
  • the DNA of the present invention obtained by the above method may be used as it is, or may be cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, incorporated into a vector by a conventional method, and the resulting recombinant DNA introduced into a host cell.
  • Sequence analysis methods such as the dideoxy method [Proc. Nat. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (1977)], or using a base sequence analyzer such as Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer or Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (both manufactured by Thermo Fisher Scientific). can determine the base sequence of the DNA.
  • Vectors that can be used for determining the nucleotide sequence of the DNA of the present invention include, for example, pBluescriptII KS (+), pPCR-Script Amp SK (+) (all manufactured by Agilent Technologies), pT7Blue (Merck Millipore company), pCRII (manufactured by Thermo Fisher Scientific), pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter), and pDIRECT [Nucleic Acids Res. , 18, 6069 (1990)].
  • Any host cell can be used as long as the vector can be introduced and proliferated. Examples include Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli HST08 Premium, Escherichia coli HST02, Escherichia coli HST04 dam ⁇ /dcm ⁇ , and Escherichia coli JM109.
  • any method for introducing DNA into the host cell can be used.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)]
  • protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • full-length DNA can be obtained by Southern hybridization method etc. for the chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using the NTS M series DNA synthesizer manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd., etc.
  • the recombinant DNA of the present invention is a DNA capable of autonomous replication in a host cell, wherein the DNA of the present invention is incorporated into an expression vector containing a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed in 2 above. It is the DNA that exists.
  • a DNA that can be integrated into the chromosome in a host cell and that has the DNA of the present invention is also the recombinant DNA of the present invention.
  • the recombinant DNA is a recombinant DNA that can be integrated into the chromosome, it may not contain a promoter.
  • the recombinant DNA of the present invention is a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention described in 2 above, and a transcription termination sequence. is preferred. Furthermore, a gene controlling a promoter may be included.
  • the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is the ribosome binding sequence, and the initiation codon is preferable to adjust the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is the ribosome binding sequence, and the initiation codon to an appropriate distance, for example, 6 to 18 bases.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • expression vectors include pColdI, pSTV28, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pET21a, pCDF-1b, and pRSF.
  • pKYP200 Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)]
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 82, 4306 (1985)]
  • pTrS30 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)
  • pTrS32 prepared from Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)]
  • pTKNTK31 Irnamplied MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No.
  • Any promoter that functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia can be used when the above expression vector is used.
  • Examples include trp promoter, gapA promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, Promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as the PSE promoter, can be used.
  • Artificially designed and modified promoters such as two trp promoters in series, tac promoter, trc promoter, lacT5 promoter, lacT7 promoter, and let I promoter can also be used.
  • expression vectors include, for example, pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58- 35197), pCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799), pCG11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (both Japanese Patent Laid-Open No. 58-105999 publication), pCE51, pCE52, and pCE53 [all of which are Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter that functions in coryneform bacterium cells may be used as the promoter when using the above expression vector.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, p674-679 (2000)] can be used.
  • expression vectors include, for example, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Any promoter can be used when the expression vector is used, as long as it functions in cells of yeast strains. Examples include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, Promoters such as heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter are included.
  • the recombinant DNA of the present invention can be produced, for example, by treating the DNA fragment prepared by the method 2 above with a restriction enzyme and inserting it downstream of the promoter of the appropriate expression vector.
  • the expression level of the protein encoded by the DNA can be improved.
  • Information on codon usage in host cells is available through public databases.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant DNA containing the DNA of the present invention described in 2 above.
  • Host cells into which the recombinant DNA of the present invention is introduced may be any of prokaryotes, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., preferably prokaryotes or yeast strains, more preferably , Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., or Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon , Siwaniomyces, Pichia, or Candida, most preferably Escherichia coli BL21 codon plus, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue (all manufactured by Agilent Technologies), Escherichia coli BL21(DE3)pLysS( ⁇ ) ⁇ Escherichia coli DH5 ⁇ Escherichia coli HST08 Premium ⁇ Escherichia coli HST02 ⁇ E
  • the above Escherichia coli KY3591 is located at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818). ).
  • the date of receipt (deposit date) is November 18, 2019, and the deposit number is NITE BP-03062.
  • a breeding strain artificially endowed or enhanced with the ability to produce GDP-fucose, which is a reaction substrate of ⁇ 1,2-fucosyltransferase, can be used.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to produce GDP-fucose from sugar to a microorganism used as a host cell include (a) at least one mechanism that controls the biosynthetic pathway for producing GDP-fucose from sugar; (b) a method of enhancing the expression of at least one of the enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugars; (c) a biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugars (d) at least one metabolic pathway branching from a biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar to a metabolite other than the target substance; methods of weakening or blocking, and the like, and the above known methods can be used alone or in combination.
  • Mechanism that controls the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include known mechanisms such as the control mechanism by transcriptional regulatory factors (RcsA, etc.) that are involved in the regulation of the biosynthetic pathway.
  • RcsA transcriptional regulatory factors
  • enzymes involved in the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar include mannose-6-phosphate isomerase, phosphomannommutase, mannose-1-phosphate guanylyltransferase, GDP-mannose- Known enzymes such as 4,6-dehydratase and GDP-L-fucose synthase can be mentioned.
  • metabolic pathway branching from the biosynthetic pathway that produces GDP-fucose from sugar to metabolites other than the target substance include known metabolic pathways such as the metabolic pathway from GDP-fucose to colanic acid. be done.
  • a breeding strain artificially endowed or enhanced with the ability to supply receptor carbohydrates, which are reaction substrates of ⁇ 1,2-fucosyltransferase, can also be used.
  • Methods for artificially imparting or enhancing the ability to supply receptor carbohydrates to microorganisms used as host cells include (a) at least one mechanism that regulates the biosynthetic pathway for producing receptor carbohydrates from sugars; (b) a method of enhancing the expression of at least one enzyme involved in a biosynthetic pathway that produces an acceptor carbohydrate from a sugar; (c) a biosynthesis that produces an acceptor carbohydrate from a sugar (d) reducing or eliminating at least one of the mechanisms that degrade the receptor carbohydrate; (f) a method of increasing the copy number of at least one gene encoding an enzyme involved in cellular uptake of a receptor carbohydrate; (g) methods of weakening or blocking at least one of the metabolic pathways branching from the receptor carbohydrate to metabolites other than the target substance, and the like, and the above known methods can be used alone or in combination.
  • enzymes involved in biosynthetic pathways that produce acceptor carbohydrates from sugars include known enzymes such as enzymes that have lactose synthase activity that produces lactose using glucose and UDP-galactose as substrates.
  • enzymes that have lactose synthase activity that produces lactose using glucose and UDP-galactose as substrates include known enzymes such as ⁇ -galactosidase, which catalyzes the hydrolysis of lactose to produce glucose and galactose.
  • enzymes involved in intracellular uptake of receptor carbohydrates include known enzymes such as lactose permease, which is involved in intracellular uptake of lactose.
  • Specific examples of the method of imparting or enhancing the ability to supply receptor carbohydrates include a method of reducing or inactivating the activity of ⁇ -galactosidase by genetic manipulation (Metabolic Engineering (2017) 41: 23-38). , known methods.
  • Methods for introducing the recombinant DNA of 3 above as an autonomously replicable plasmid in host cells include, for example, the above-mentioned method using calcium ions, the protoplast method, the electroporation method, and the spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 81, 4889 (1984)], the lithium acetate method [J. Bacteriol. , 153, 163 (1983)].
  • Methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of host cells include, for example, homologous recombination.
  • the homologous recombination method includes, for example, a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli for example, a method of introducing recombinant DNA using the homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • a selection method utilizing the sucrose sensitivity of Escherichia coli due to the Bacillus subtilis levansucrase integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, and a method of incorporating a wild-type rpsL gene into Escherichia coli having a streptomycin-resistant mutant rpsL gene.
  • a selection method utilizing the sensitivity of E. coli to streptomycin [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71, 2905 (2007)], etc., to obtain E. coli in which the target region on the chromosomal DNA of the host cell has been replaced with recombinant DNA.
  • the transformant obtained by the above method has the DNA of the present invention described in 2 above is, for example, the ability of the transformant to produce GDP-fucose or an acceptor sugar from sugar.
  • a transformant obtained by transforming a host cell having can be confirmed by Alternatively, an extract containing the protein of the present invention is prepared from the culture, the extract, GDP-fucose and receptor saccharides are allowed to exist in an aqueous medium, and fucose-containing saccharides accumulated in the aqueous medium. can also be confirmed by comparing the production of .
  • transformants of the present invention include the WFL/pAHY2 strain, WFL/pAHY3 strain, WFL/pAHY4 strain and WFL/pAHY5 strain described later in Examples.
  • the method for producing the fucose-containing saccharide of the present invention is the method described in 5-1 and 5-2 below.
  • Method for Producing Fucose-Containing Carbohydrates by Fermentation comprises culturing the transformant of 4 above in a medium to produce fucose-containing saccharides in the culture.
  • a method for producing fucose-containing saccharides by fermentation is mentioned.
  • the transformant of the present invention used in the method for producing fucose-containing carbohydrates by fermentation is preferably a transformant capable of producing GDP-fucose from sugar.
  • a transformant having the ability to produce an acceptor saccharide may also be used as the transformant of the present invention used in the method for producing a fucose-containing saccharide by fermentation.
  • the method for culturing the transformant in 4 above can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • the medium for culturing the transformant should be a medium that contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the transformant and that allows efficient culture of the transformant. , both natural and synthetic media may be used.
  • Any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the transformant.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or starch hydrolysates, and organic sources such as acetic acid or propionic acid.
  • organic sources such as acetic acid or propionic acid.
  • acids include acids, alcohols such as glycerol, ethanol, propanol, and the like.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other inorganic or organic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolysates, soybean meal, soybean meal hydrolysates, various fermented bacteria and their digests, and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Acceptor saccharides such as lactose may be added as fucose-containing saccharide precursors, and GTP, mannose, etc. as GDP-fucose precursors may be added to the medium.
  • GDP-fucose may be supplied to the transformant of the present invention by co-cultivating a microorganism capable of producing GDP-fucose from sugar with the transformant of the present invention.
  • a microorganism capable of producing GTP may be cultured at the same time.
  • microorganisms capable of producing GTP include known microorganisms such as microorganisms in which the expression of enzymes involved in the biosynthetic pathway of GTP is enhanced by various genetic manipulations (Biotechnol Bioeng (2019) Sep 3).
  • the transformant to be used does not have the ability to produce receptor carbohydrates such as lactose
  • the receptor carbohydrates such as lactose are added to the medium during culture. Add to.
  • the transformant to be used does not have the ability to produce receptor carbohydrates such as lactose
  • receptor carbohydrates such as lactose can be added during the culture.
  • the medium by simultaneously culturing a microorganism capable of producing an acceptor carbohydrate such as lactose from sugar with the transformant of the present invention, the transformant of the present invention accepts lactose and the like.
  • Body carbohydrates may be supplied.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as necessary during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a fucose-containing saccharide can be produced by producing and accumulating a fucose-containing saccharide in a culture by the above culture and extracting the fucose-containing saccharide from the culture.
  • the resulting fucose-containing carbohydrates can be analyzed by conventional methods such as carbohydrate ion chromatography.
  • the collection of fucose-containing saccharides from the culture or the treated culture can be carried out by a conventional method using activated charcoal, ion-exchange resin, or the like.
  • activated charcoal ion-exchange resin, or the like.
  • fucose-containing saccharides accumulate in the cells, for example, the microbial cells are disrupted by ultrasonic waves or the like, and the microbial cells are removed by centrifugation. You can pick quality.
  • a culture obtained by culturing the transformant of 4 above or a processed product of the culture is used as an enzyme source, and the enzyme source, GDP-fucose and receptor sugar are present in an aqueous medium. Then, the fucose-containing saccharide is produced and accumulated in the aqueous medium, and the fucose-containing saccharide can be collected from the aqueous medium.
  • GDP-fucose and receptor carbohydrates may be of any origin as long as they serve as substrates for the protein of the present invention possessed by the transformant of the present invention.
  • the GDP-fucose and receptor saccharides collected from the culture of the microorganism or the processed product of the culture may be used as they are, or the GDP-fucose and the receptor carbohydrates collected from the culture or the processed product of the culture may be used.
  • processed cultures include concentrates of cultures, dried cultures, cells obtained by centrifuging cultures, dried cells, lyophilized cells, and Surfactant-treated bacterial cell, ultrasonically treated bacterial cell, mechanical triturated bacterial cell, solvent-treated bacterial cell, enzyme-treated bacterial cell, protein of bacterial cell Fractions, immobilized products of the microbial cells, enzyme preparations obtained by extraction from the microbial cells, and the like can be mentioned.
  • aqueous media examples include water, phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate, buffers such as Tris, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, and acetone. and amides such as acetamide.
  • the culture solution of the microorganism used as the enzyme source can be used as the aqueous medium.
  • the method of analyzing and collecting fucose-containing carbohydrates produced in the aqueous medium is the same as in 5-1.
  • Example 1 Construction of microorganisms used for production of 2'-fucosyllactose (1) Obtaining DNA fragments used as markers for gene deletion As such, PCR was performed using the DNA listed in "Template” in Table 1 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the genomic DNA of 168 strains of Bacillus subtilis was prepared by a standard method.
  • the cat of the amplified DNA fragment includes about 200 bp upstream to about 50 bp downstream of the cat gene on pHSG396.
  • the amplified DNA fragment sacB contains about 300 bp upstream to about 100 bp downstream of the sacB gene on the genomic DNA of Bacillus subtilis strain 168.
  • PCR is performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 15 and 18 as a primer set, and DNA containing the cat gene and the sacB gene (hereinafter referred to as cat -sacB) fragment was obtained.
  • lacZ upstream 1 and lacZ upstream 2 comprise approximately 900 bp upstream from the start codon of the lacZ gene.
  • lacY downstream 1 and lacY downstream 2 comprise approximately 800 bp downstream from the stop codon of the lacY gene.
  • lacZY::cat-sacB A DNA fragment consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequences of the regions surrounding the lacZ and lacY genes was obtained.
  • PCR was performed using a mixture of lacZ upstream 2 and lacY downstream 2 at an equimolar ratio as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 20 and 22 as a primer set. , a DNA fragment consisting of a sequence in which the lacZ upstream and the lacY downstream are directly linked (hereinafter referred to as ⁇ lacZY).
  • lacZY::cat-sacB fragment was transformed into plasmid pKD46 [Datsenko, K. et al. A. , Warner, B.; L. , Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, Vol. 97, 6640-6645 (2000)] was introduced by electroporation into Escherichia coli harboring the lacZ and lacY genes, and a transformant exhibiting chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (lacZ and lacY genes are lacZY::cat -sacB) was obtained.
  • the ⁇ lacZY fragment was introduced into Escherichia coli by electroporation into the transformant, resulting in a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (transformant in which lacZY::cat-sacB was replaced with ⁇ lacZY). got From these, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained.
  • the transformant was named ⁇ lacZY.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Escherichia coli strain KY3591 as a template and DNA consisting of the base sequences shown in "Primer set" in Table 3 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wcaJ upstream 1 and wcaJ upstream 2 comprise approximately 900 bp upstream from the start codon of the wcaJ gene.
  • wcaM downstream 1 and wcaM downstream 2 comprise about 800 bp downstream from the stop codon of the wcaM gene.
  • PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 26 and 28 as a primer set, A DNA fragment (hereinafter referred to as wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the wcaJ-wzxC-wcaKLM operon peripheral region sequence was obtained.
  • a mixture of wcaJ upstream 2 and wcaM downstream 2 at an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 26 and 28 as a primer set to obtain wcaJ-wzxC-wcaKLM.
  • a DNA (hereinafter referred to as ⁇ wcaJ-wzxC-wcaKLM) fragment consisting of a sequence in which the wcaJ upstream and the wcaM downstream are directly linked was obtained.
  • a transformant (wcaJ-wzxC- A transformant in which wcaKLM was replaced with wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wcaJM fragment was introduced into Escherichia coli by electroporation into the transformant, resulting in a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (wcaJ-wzxC-wcaKLM::cat-sacB was ⁇ wcaJ-wzxC- A transformant substituted with wcaKLM) was obtained. Furthermore, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (a transformant lacking pKD46) was obtained. The transformant was named WFL strain.
  • HMFT Helicobacter mustelae-derived ⁇ 1,2-fucosyltransferase
  • Genomic DNA of Escherichia coli strain W3110 was prepared by a conventional method.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 33 and SEQ ID NOs: 34 and 35 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • rcsA-HMFT-lacY A mixture of rcsA, HMFT and lacY fragments at an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 37 and 38 as a primer set to obtain a DNA ligated with the three fragments ( hereinafter referred to as rcsA-HMFT-lacY) fragment.
  • PCR was performed using plasmid pPE167 (Appl. Obtained.
  • nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 37 and 40 and SEQ ID NOs: 38 and 39 contain sequences complementary to their 5' ends.
  • the rcsA-HMFT-lacY fragment obtained above and the vector fragment were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain the expression plasmid pAHY1.
  • a plasmid pAHY2 was prepared by introducing all of the five amino acid mutations onto the amino acid sequence of HMFT using a primer set consisting of a DNA consisting of the base sequence represented by .
  • a plasmid pAHY3 was created in which the 9th amino acid residue on the HMFT amino acid sequence was mutated.
  • a plasmid pAHY4 was prepared by introducing a mutation to the 238th amino acid residue on the HMFT amino acid sequence.
  • a plasmid pAHY5 was prepared by introducing mutations to the 9th and 238th amino acid residues on the HMFT amino acid sequence.
  • the WFL strain constructed in (2) above was transformed, and WFL/pAHY1 strain, WFL/pAHY2 strain, WFL/ A pAHY3 strain, a WFL/pAHY4 strain, and a WFL/pAHY5 strain were obtained.
  • Example 2 Production of 2'-fucosyllactose by fermentation method using microorganism expressing mutant HMFT WFL/pAHY1 strain, WFL/pAHY2 strain, WFL/pAHY3 strain, WFL/pAHY4 obtained in Example 1 and WFL/pAHY5 strains were cultured on LB plates at 30° C. for 24 hours, inoculated into large test tubes containing 5 mL of LB medium containing 100 mg/L kanamycin and shaken at 30° C. for 16 hours. cultured.
  • the resulting culture was then transferred to a production medium containing 100 mg/L kanamycin [glucose 30 g/L, lactose monohydrate 5 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 16 g/L , potassium dihydrogen phosphate 14 g/L, ammonium sulfate 2 g/L, citric acid monohydrate 1 g/L, casamino acid 5 g/L, thiamine hydrochloride 10 mg/L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg/L, Manganese sulfate pentahydrate 10 mg/L (Other than glucose, lactose monohydrate and magnesium sulfate heptahydrate, it was autoclaved after adjusting the pH to 7.2 with an aqueous sodium hydroxide solution) (Glucose, lactose monohydrate An aqueous solution containing the product and magnesium sulfate hept
  • the present invention provides a protein having a modified ⁇ 1,2-fucosyltransferase activity and a method for producing a fucose-containing carbohydrate using the protein or a microorganism capable of producing the protein.

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Abstract

本発明は、改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたフコース含有糖質の製造法の提供を目的とする。本発明によれば、特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換するよう改変された、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いることにより、野生型のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いた場合に比べて、より効率的に２'－フコシルラクトースなどのフコース含有糖質を製造できる。

Description

改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
　本発明は、改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたフコース含有糖質の製造法に関する。
　ヒト母乳に含まれるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、病原性細菌からの感染防御作用やプレバイオティクスとしての機能を有することが報告されており、その生理活性から、幼児用調製粉乳への添加剤としての活用が期待されている（非特許文献１）。
　ＨＭＯとして知られる糖質のうち２’－フコシルラクトースなどのフコース含有糖質は、ＨＭＯ全体の約６０％を占めており、これら糖質の機能性が注目されている（非特許文献２）。
　酵素反応や発酵生産によるフコース含有糖質の製造法には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（ヘリコバクター・ピロリ）由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼが広く利用されている（非特許文献２、３）が、当該フコース転移酵素の活性が不十分であることが課題となっている（非特許文献４）。
　この課題を解決するために、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（バクテロイデス・フラジリス）由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（非特許文献５）や、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ（ヘリコバクター・ムステレ）由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（特許文献１）を用いたフコース含有糖質の製造法が知られているが、さらなる効率的な製造法の開発が求められている。
日本国特許第４０４８１７３号公報
Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１６）２３５：６１－８３ Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１９）５６：１３０－１３７ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８ Ｍｉｃｒｏｂ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔ（２０１３）１２: ４０ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）２５７：１９２－１９８
　本発明は、改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたフコース含有糖質の製造法の提供を目的とする。
　本発明は、以下に関する。
１．下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、
　元となる下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質に比べてα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性が向上した蛋白質。
［１］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、α１、２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、α１、２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質
２．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１に記載の蛋白質。
３．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔１ａ〕～〔１ｅ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１または２に記載の蛋白質。
〔１ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔１ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－スレオニン又はＬ－セリンへの置換
〔１ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン又はＬ－アラニンへの置換
４．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔２ａ〕～〔２ｅ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１～３のいずれか１に記載の蛋白質。
〔２ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔２ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－セリンへの置換
〔２ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換
５．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１～４のいずれか１に記載の蛋白質。
６．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１～４のいずれか１に記載の蛋白質。
７．前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換、および、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記１～４のいずれか１に記載の蛋白質。
８．前記１～７のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
９．前記８に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
１０．前記９に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
１１．前記１～７のいずれか１に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にフコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
１２．前記１～７のいずれか１に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
１３．前記受容体糖質がラクトースである、前記１２に記載のフコース含有糖質の製造法。
１４．前記フコース含有糖質が２’－フコシルラクトースである、前記１１～１３のいずれか１に記載の製造法。
　本発明によれば、改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたフコース含有糖質の製造法が提供される。
１．本発明の蛋白質
　本発明の蛋白質は、以下の（１）～（７）のいずれか１に記載の蛋白質である。
（１）下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、
　元となる［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質に比べてα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性が向上した蛋白質。
［１］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質
（２）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）に記載の蛋白質。
（３）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔１ａ〕～〔１ｄ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）または（２）に記載の蛋白質。
〔１ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔１ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－スレオニン又はＬ－セリンへの置換
〔１ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン又はＬ－アラニンへの置換
（４）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔２ａ〕～〔２ｅ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）～（３）のいずれか１に記載の蛋白質。
〔２ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔２ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－セリンへの置換
〔２ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換
（５）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）～（４）のいずれか１に記載の蛋白質。
（６）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）～（４）のいずれか１に記載の蛋白質。
（７）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換、および配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、前記（１）～（４）のいずれか１に記載の蛋白質。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基とは、当該元となる蛋白質のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とをアライメントした時に、配列番号２のアミノ酸配列における９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目のアミノ酸残基と同じ位置にアライメントされるそれぞれのアミノ酸残基をいう。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の元となる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基とは、例えば、以下のものが挙げられる。
　（ｉ）元となる蛋白質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目のアミノ酸残基。
　（ｉｉ）元となる蛋白質が配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号４で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８４番目及び２４３番目のアミノ酸残基。
　（ｉｉｉ）元となる蛋白質が配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号６で表されるアミノ酸配列の７番目、６６番目、７３番目、８８番目及び２４７番目のアミノ酸残基。
　（ｉｖ）元となる蛋白質が配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号８で表されるアミノ酸配列の７番目、５３番目、６０番目及び２０７番目のアミノ酸残基。配列番号８で表されるアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基は存在しない。
　（ｖ）元となる蛋白質が配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、それぞれ配列番号１０で表されるアミノ酸配列の７番目、６６番目、７３番目、８２番目及び２３８番目のアミノ酸残基。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されていることは、例えば、他のアミノ酸残基に置換されていることを確認しようとする前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列と、元となる蛋白質のアミノ酸配列とをアライメントすることにより確認できる。
　アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成できる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
　前記（１）又は（２）に記載の他のアミノ酸残基は、天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　前記（１）又は（２）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換は、以下の〔ａ〕～〔ｅ〕から選ばれる少なくとも１を含むことが好ましく、該他のアミノ酸残基はＬ体であることがより好ましい。
〔ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基の前記Ｄ群に記載のアミノ酸残基（リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸）から選ばれる１への置換
〔ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基の前記Ｄ群に記載のアミノ酸残基（リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸）から選ばれる１への置換
〔ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基の前記Ｅ群に記載のアミノ酸残基（プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン）から選ばれる１への置換
〔ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基の前記Ｆ群に記載のアミノ酸残基（セリン、スレオニン、ホモセリン）から選ばれる１への置換
〔ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基の前記Ａ群に記載のアミノ酸残基（ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン）から選ばれる１への置換
　前記（１）又は（２）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換として、下記〔１ａ〕～〔１ｅ〕から選ばれる少なくとも１を含むことが好ましい。
〔１ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
〔１ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔１ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－スレオニン又はＬ－セリンへの置換
〔１ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン又はＬ－アラニンへの置換
　前記（１）又は（２）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換として、下記〔２ａ〕～〔２ｅ〕から選ばれる少なくとも１を含むことがより好ましい。
〔２ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
〔２ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
〔２ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－セリンへの置換
〔２ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換
　前記（１）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基のうち、少なくとも１以上、好ましくは２以上のアミノ酸残基が置換されることが好ましい。
　前記（１）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換として、下記〔Ａ〕及び〔Ｂ〕の少なくとも一方を含むことがより好ましい。
〔Ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基から、他のアミノ酸への置換、好ましくは前記Ｄ群に記載のアミノ酸残基（リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸）から選ばれる１への置換、より好ましくはＬ－アルギニンへの置換
〔Ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基から、他のアミノ酸への置換、好ましくは前記Ａ群に記載のアミノ酸残基（ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン）から選ばれる１への置換、より好ましくはＬ－アラニンへの置換
　前記（１）に記載の蛋白質の一態様として、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換として、下記〔Ｃ〕を含むことが特に好ましい。
〔Ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基からＬ－アルギニンへの置換、および配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基からＬ－アラニンへの置換　
　α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性とは、ＧＤＰ－フコースと受容体糖質を基質として、受容体糖質のガラクトース残基にα１，２結合でフコースを転移し、フコース含有糖質を生成する活性をいう。
　受容体糖質としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖を含む糖質、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ－アセチルラクトサミン、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ルイスＸ、又はルイスａ構造等を有するオリゴ糖を含む糖質、より好ましくは、ラクトース、グロボトリオース、Ｎ－アセチルラクトサミン、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ルイスＸ、又はルイスａ等が挙げられる。
　前記受容体糖質を基質として得られるフコース含有糖質は、例えば、２’－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクトジフコテトラオース、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、及びラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ等が挙げられる。
　前記（１）～（７）のいずれか１に記載の蛋白質が、元となる蛋白質に比べてα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性が向上していることは、例えば以下の方法により確認できる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする蛋白質及び元となる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡをそれぞれ作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を含む水溶液と接触させ、該水溶液中にフコース含有糖質を生成させる。最後に、後述の糖分析装置を用いて反応液中のフコース含有糖質を検出し、その生成量を比較することにより、元となる蛋白質に比べて該蛋白質のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性が向上していることを確認できる。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
　置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸の例としては、前記の天然型アミノ酸が挙げられる。
　相互に置換可能なアミノ酸の例は前述の通りである。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
　相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。　
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ　ｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有していることは、例えば以下の方法により確認できる。まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を含む水溶液と接触させ、該水溶液中にフコース含有糖質を生成させる。最後に、後述の糖分析装置を用いて反応液中のフコース含有糖質を検出することにより、変異蛋白質又は相同蛋白質がα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有することを確認できる。
　上記のような本発明の蛋白質の具体例としては、配列番号５１、５２、５３又は５４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。
２．本発明のＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、上記（１）～（７）のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡとして、具体的には以下の（８）～（１３）のいずれか１のＤＮＡが挙げられる。
（８）下記［４］～［６］のいずれか１に記載のＤＮＡでコードされる蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
［４］配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［５］配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［６］配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
（９）上記（８）に記載のＤＮＡであって、そのコードするアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アルギニン、６８番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アルギニン、７５番目に対応するアミノ酸残基がＬ－プロリン、８６番目に対応するアミノ酸残基がＬ－セリン又は２３８番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アラニンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１０）上記（８）に記載のＤＮＡであって、そのコードするアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アルギニンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１１）上記（８）に記載のＤＮＡであって、そのコードするアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アラニンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１２）上記（８）に記載のＤＮＡであって、そのコードするアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アルギニンに、かつ、２３８番目に対応するアミノ酸残基がＬ－アラニンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１３）配列番号１１、１２、１３又は１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ。
　上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
　プローブとして用いるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡが挙げられる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、例えば、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡが挙げられる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得できる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）が挙げられる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が挙げられる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
　本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列をからなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡ上に位置する配列番号２の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２））及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ　ＷＩＬＥＹ　＆　ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより取得できる。あるいは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等を用いることでも、本発明のＤＮＡを得ることができる。
　同様の方法により、例えば配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む変異蛋白質であり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該変異蛋白質のアミノ酸配列とその元となる配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列とを前記１に記載の方法によってアライメントしたときに、該変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することによっても取得できる。
　また、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該相同蛋白質のアミノ酸配列とその元となる配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列とを前記１の方法によってアライメントした時に、該相同蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基のうち１以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することによっても取得できる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはヘリコバクター属、より好ましくはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ　ＡＴＣＣ４３７７２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはヘリコバクター属、より好ましくはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＡＴＣＣ７００３９２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ＡＴＣＣ７００３９２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得できる。配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）　Ｏ１２６株における染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１２６株における染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得できる。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはバクテロイデス属、より好ましくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ２５２８５株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得できる。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはビブリオ属、より好ましくはＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ（ビブリオ・コレラ）　Ｏ２２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｏ２２株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得できる。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、具体的には、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　前記１（１）［２］に記載の、配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、７又は９で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得できる。
　又は、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部分特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、前記１（１）［２］の配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得できる。市販の部分特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入できるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）が挙げられる。
　すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドを得ることができる。
　前記１（１）［３］に記載の、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、以下の方法により取得できる。具体的には、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、７又は９で表わされる塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、前記の配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって、該相同蛋白質をコードするＤＮＡを取得できる。
　塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、前記１と同様の方法で決定できる。
　上記の方法で取得した本発明のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、又はアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定できる。
　本発明のＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等が挙げられる。
　上記の宿主細胞としては、前記ベクターを導入し増殖可能なものであれば何でもよいが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２等が挙げられる。
　本発明のＤＮＡを組み込んで得られる、組み換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得できる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、日本テクノサービス社製ＮＴＳ　ＭシリーズＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
３．本発明の組換え体ＤＮＡ
　本発明の組換え体ＤＮＡは、宿主細胞において自律複製可能なＤＮＡであって、前記２の本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに本発明のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
　宿主細胞において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、本発明の組換え体ＤＮＡである。
　組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、前記２の本発明のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。さらに、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　ここで、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンの間は、適当な距離、例えば６～１８塩基に調節することが好ましい。
　また、本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ (いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ－６０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）、ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等が挙げられる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ　Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞としてコリネ型細菌を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることがきる。
　上記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞として酵母菌株を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
　前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
　本発明の組換え体ＤＮＡは、例えば、前記２の方法により調製したＤＮＡ断片を制限酵素処理する等して、前記の適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによって作製できる。
　ここで、本発明ＤＮＡの塩基配列を宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。宿主細胞におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
４．本発明の形質転換体
　本発明の形質転換体は、前記２に記載の本発明のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。
　本発明の組換え体ＤＮＡを導入する宿主細胞は、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれであってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３５９１（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０６２）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
　上記のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３５９１は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５－８（郵便番号２９２－０８１８）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された。受領日（寄託日）は令和元年（西暦２０１９年）１１月１８日であり、受託番号はＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０６２である。
　宿主細胞としては、好ましくは、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質であるＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は強化した育種株を用いることができる。
　宿主細胞として用いる微生物に、糖からＧＤＰ－フコースを生産する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などが挙げられ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路を制御する機構の具体例としては、例えば、当該生合成経路の制御に関わる転写調節因子（ＲｃｓＡ等）による制御機構等、公知の機構が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、マンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ、ＧＤＰマンノース－４，６－デヒドラターゼ、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　糖からＧＤＰ－フコースを生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の具体例としては、例えば、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への代謝経路等、公知の代謝経路が挙げられる。
　上記、ＧＤＰ－フコースを生成する能力を付与又は強化する方法の具体例としては、各種遺伝子操作による方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　また、宿主細胞として、α１，２－フコシルトランスフェラーゼの反応基質である受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は強化した育種株も用いることができる。
　宿主細胞として用いる微生物に、受容体糖質を供給する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）受容体糖質を分解する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｅ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｆ）受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｇ）受容体糖質から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などが挙げられ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
　糖から受容体糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の具体例としては、例えば、グルコース及びＵＤＰ－ガラクトースを基質としてラクトースを生成するラクトースシンターゼ活性を有する酵素等、公知の酵素が挙げられる。受容体糖質を分解する機構の具体例としては、例えば、ラクトースの加水分解を触媒しグルコース及びガラクトースを生成するβ－ガラクトシダーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　受容体糖質の細胞内取り込みに関与する酵素の具体例としては、例えば、ラクトースの細胞内取り込みに関与するラクトースパーミアーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　上記、受容体糖質を供給する能力を付与又は強化する方法の具体例としては、遺伝子操作によりβ－ガラクトシダーゼの活性を低下又は失活させる方法（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７）４１：２３－３８）等、公知の方法が挙げられる。
　前記３の組換え体ＤＮＡを宿主細胞において自律複製可能なプラスミドとして導入する方法としては、例えば、上述のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、並びに、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを宿主細胞の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、宿主細胞の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された大腸菌を取得できる。
　上記の方法で得られた形質転換体が、前記２に記載の本発明のＤＮＡを有していることは、例えば、該形質転換体が糖からＧＤＰ－フコースや受容体糖質を生成する能力を有している宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体の場合、該形質転換体を培地に培養し、培養物中に蓄積したフコース含有糖質の生成量を、親株のそれと比較することにより確認できる。または、該培養物から本発明の蛋白質を含有する抽出液を調製し、該抽出液、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に蓄積したフコース含有糖質の生成量を、親株のそれと比較することによっても確認できる。
　このような本発明の形質転換体の例としては、実施例において後述するＷＦＬ／ｐＡＨＹ２株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ３株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ４株及びＷＦＬ／ｐＡＨＹ５株が挙げられる。
５．本発明のフコース含有糖質の製造法
　本発明のフコース含有糖質の製造法は、以下の５－１及び５－２に記載の方法である。
５－１．発酵法によるフコース含有糖質の製造法
　本発明のフコース含有糖質の製造法としては、上記４の形質転換体を培地に培養し、培養物中にフコース含有糖質を生成させることを含む、発酵法によるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法に用いる、本発明の形質転換体としては、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する形質転換体であることが好ましい。
　また、発酵によるフコース含有糖質の製造法に用いる本発明の形質転換体として、受容体糖質を生成する能力を有する形質転換体を用いてもよい。
　上記４の形質転換体を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　フコース含有糖質の前駆体としてラクトース等の受容体糖質を、また、ＧＤＰ－フコースの前駆体としてＧＴＰやマンノース等を培地に添加してもよい。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する。
　また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がＧＤＰ－フコースを生成する能力を有していない場合には、培養中に、ＧＤＰ－フコースを培地に添加する代わりに、糖からＧＤＰ－フコースを生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にＧＤＰ－フコースを供給してもよい。
　また、ＧＤＰ－フコースの前駆体であるＧＴＰを供給または強化するために、ＧＴＰを生産する能力を有する微生物を同時に培養してもよい。ＧＴＰを生産する能力を有する微生物としては、例えば、各種遺伝子操作によりＧＴＰの生合成経路に関与する酵素の発現が強化された微生物（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ（２０１９）Ｓｅｐ３）等、公知の微生物が挙げられる。
　発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する。
　また、発酵法によるフコース含有糖質の製造法において、用いる形質転換体がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する代わりに、糖からラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有する微生物を、本発明の形質転換体と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にラクトース等の受容体糖質を供給してもよい。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　上記の培養により、培養物中にフコース含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からフコース含有糖質を採取することにより、フコース含有糖質を製造できる。
　得られたフコース含有糖質は、糖質イオンクロマトグラフィーなどを用いる通常の方法によって分析できる。上記の培養物又は該培養物の処理物中からのフコース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。菌体内にフコース含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から活性炭やイオン交換樹脂等によって、フコース含有糖質を採取できる。
５－２．ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を基質として用いるフコース含有糖質の製造法
　本発明のフコース含有糖質の製造法としては、また、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を前駆体として用いるフコース含有糖質の製造法が挙げられる。
　具体的には、上記４の形質転換体を培養して得られる培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からフコース含有糖質を採取できる。
　ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質は、本発明の形質転換体が有する本発明の蛋白質の基質となるものであればその由来は問わないが、ＧＤＰ－フコース又は受容体糖質を生産する能力を有する微生物の培養物又は該培養物の処理物をそのまま、あるいは該培養物又は該培養物の処理物から採取したＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を用いてもよい。
　培養物の処理物としては、例えば、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などが挙げられる。
　水性媒体としては、例えば、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノールやエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、例えば、酵素源として用いた微生物の培養液が水性媒体として挙げられる。
　水性媒体中に生成したフコース含有糖質の分析及び採取方法は５－１と同様である。
［分析例］
　実施例において、２’－フコシルラクトースの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれる２’－フコシルラクトースを糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：ＣａｒｂｏＰＡＣ　ＰＡ１
カラム温度：２５℃
移動相：　（移動相Ａ）水
　　　　　（移動相Ｂ）５００ｍｍｏｌ／Ｌ　水酸化ナトリウム
　　　　　（移動相Ｃ）３００ｍｍｏｌ／Ｌ　酢酸ナトリウム 
移動相Ａ、移動相Ｂ及び移動相Ｃの混合比： 
　　　（０～１０分）　　８０：２０：０から７０：２０：１０の勾配
　　　（１０～１８分）　７０：２０：１０
　　　（１８～２５分）　８０：２０：０
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ 
検出器：パルスドアンペロメトリー検出器
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］２’－フコシルラクトースの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
　表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サチルス）　１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｐＨＳＧ３９６上のｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約５０ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムＤＮＡ上のｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。
　次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを鋳型とし、配列番号１５および１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
（２）β－ガラクトシダーゼ活性、ラクトースパーミアーゼ活性及びコラン酸生成活性が喪失した大腸菌の造成
　β－ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＺ遺伝子という。）、ラクトースパーミアーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｌａｃＹ遺伝子という。）及びコラン酸生成関連蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ、又はｗｃａＭ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。なお、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ（以下、ｌａｃＺＹという。）、ならびに、ｗｃａＪ、ｗｚｘＣ、ｗｃａＫ、ｗｃａＬ、及びｗｃａＭ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）は大腸菌ゲノム上でそれぞれオペロンを形成している。
　常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＫＹ３５９１株（受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０６２）のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｌａｃＺ上流１およびｌａｃＺ上流２は、ｌａｃＺ遺伝子の開始コドンからその上流約９００ｂｐを含む。ｌａｃＹ下流１およびｌａｃＹ下流２は、ｌａｃＹ遺伝子の終止コドンからその下流約８００ｂｐを含む。
　ｌａｃＺ上流１、ｌａｃＹ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２０および２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｌａｃＺ上流２およびｌａｃＹ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２０および２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＺおよびｌａｃＹを含まず、ｌａｃＺ上流とｌａｃＹ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｌａｃＺＹという。）断片を得た。
　ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｌａｃＺ及びｌａｃＹ遺伝子がｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｌａｃＺＹ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｌａｃＺＹ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｌａｃＺＹに置換した形質転換体）を得た。それらのうちからさらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をΔｌａｃＺＹと命名した。
　同様に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＫＹ３５９１株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｗｃａＪ上流１およびｗｃａＪ上流２は、ｗｃａＪ遺伝子の開始コドンからその上流約９００ｂｐを含む。ｗｃａＭ下流１およびｗｃａＭ下流２は、ｗｃａＭ遺伝子の終止コドンからその下流約８００ｂｐを含む。
　ｗｃａＪ上流１、ｗｃａＭ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２６および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭオペロン周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ上流２およびｗｃａＭ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２６および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭを含まず、ｗｃａＪ上流とｗｃａＭ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭという。）断片を得た。
　ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、上記で造成したΔｌａｃＺＹ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭがｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｃａＪＭ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｃａＪ－ｗｚｘＣ－ｗｃａＫＬＭに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷＦＬ株と命名した。
（３）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼ（ＨＭＦＴ）発現ベクターの調製
　表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表４の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＷ３１１０株のゲノムＤＮＡは常法により調製した。また、配列番号３２及び３３、配列番号３４及び３５で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　ｒｃｓＡ、ＨＭＦＴ及びｌａｃＹ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３７及び３８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、３断片を連結したＤＮＡ（以下、ｒｃｓＡ－ＨＭＦＴ－ｌａｃＹという。）断片を得た。
　配列番号３９及び４０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＰＥ１６７（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７，７３：６３７８－６３８５）を鋳型にＰＣＲを行い、約４．４ｋｂのベクター断片を得た。
　このとき、配列番号３７及び４０、配列番号３８及び３９で表される塩基配列は、それぞれの５’末端に相補的な配列を含む。
　上記で得られたｒｃｓＡ－ＨＭＦＴ－ｌａｃＹ断片とベクター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＡＨＹ１を得た。
（４）変異型ＨＭＦＴを発現する微生物の造成
　上記（３）で得られたプラスミドｐＡＨＹ１を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、表５に記載の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、ＨＭＦＴのアミノ酸配列上に当該５つのアミノ酸変異を全て導入したプラスミドｐＡＨＹ２を作製した。
　同様に、ＨＭＦＴのアミノ酸配列上の９番目のアミノ酸残基に変異を導入したプラスミドｐＡＨＹ３を作製した。
　同様に、ＨＭＦＴのアミノ酸配列上の２３８番目のアミノ酸残基に変異を導入したプラスミドｐＡＨＹ４を作製した。
　同様に、ＨＭＦＴのアミノ酸配列上の９番目及び２３８番目のアミノ酸残基に変異を導入したプラスミドｐＡＨＹ５を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（３）で得られたプラスミドｐＡＨＹ１、並びに上記ｐＡＨＹ２、ｐＡＨＹ３、ｐＡＨＹ４、及びｐＡＨＹ５を用いて、上記（２）で造成したＷＦＬ株を形質転換し、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ１株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ２株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ３株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ４株、及びＷＦＬ／ｐＡＨＹ５株を得た。
［実施例２］変異型ＨＭＦＴを発現する微生物を用いた発酵法による２’－フコシルラクトースの製造
　実施例１で得られたＷＦＬ／ｐＡＨＹ１株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ２株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ３株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ４株、及びＷＦＬ／ｐＡＨＹ５株を、ＬＢプレート上で３０℃にて２４時間培養し、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った大型試験管に植菌して３０℃で１６時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、ラクトース一水和物５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸一水和物１ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした）（グルコース、ラクトース一水和物及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った大型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で３０時間振盪培養した。
　培養終了後、培養液を適宜希釈後に遠心分離し、上清に含まれる２’－フコシルラクトースをＨＰＬＣにて分析した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ１株に比べ、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ２株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ３株、ＷＦＬ／ｐＡＨＹ４株、及びＷＦＬ／ｐＡＨＹ５株は、より高い２’－フコシルラクトース生産性を示した。
　以上より、変異型ＨＭＦＴを有する微生物を用いることで、野生型ＨＭＦＴを有する微生物よりも２’－フコシルラクトースの生産性が向上することが分かった。
　本発明により、改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及び該蛋白質又は該蛋白質を生産する能力を有する微生物を用いたフコース含有糖質の製造法が提供される。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２１年２月１９日付けで出願された日本特許出願（特願２０２１－０２５１７０）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (14)

  1. 　下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれる１以上のアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつ、
    　元となる下記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質に比べてα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性が向上した蛋白質。
    ［１］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［２］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質であり、かつ、α１、２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する変異蛋白質
    ［３］配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相同蛋白質であり、かつ、α１、２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する相同蛋白質
  2. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目、６８番目、７５番目、８６番目及び２３８番目に対応するアミノ酸残基から、他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の蛋白質。
  3. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔１ａ〕～〔１ｅ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載の蛋白質。
    〔１ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
    〔１ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－リジン又はＬ－アルギニンへの置換
    〔１ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
    〔１ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－スレオニン又はＬ－セリンへの置換
    〔１ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン又はＬ－アラニンへの置換
  4. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の〔２ａ〕～〔２ｅ〕から選ばれる少なくとも１の置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載の蛋白質。
    〔２ａ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
    〔２ｂ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の６８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換
    〔２ｃ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の７５番目に対応するアミノ酸残基のＬ－プロリンへの置換
    〔２ｄ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の８６番目に対応するアミノ酸残基のＬ－セリンへの置換
    〔２ｅ〕配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換
  5. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛋白質。
  6. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛋白質。
  7. 　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の９番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アルギニンへの置換、および、配列番号２で表されるアミノ酸配列の２３８番目に対応するアミノ酸残基のＬ－アラニンへの置換を含むアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛋白質。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
  9. 　請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
  10. 　請求項９に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にフコース含有糖質を生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
  12. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＧＤＰ－フコース及び受容体糖質を水性媒体中に存在せしめ、フコース含有糖質を該水性媒体中に生成させることを含む、フコース含有糖質の製造法。
  13. 　前記受容体糖質がラクトースである、請求項１２に記載のフコース含有糖質の製造法。
  14. 　前記フコース含有糖質が２’－フコシルラクトースである、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のフコース含有糖質の製造法。
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