CN117157403A - 经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和含有岩藻糖的糖质的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供经改造的具有α1,2‑岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和使用该蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的微生物的含有岩藻糖的糖质的制造方法。根据本发明，通过使用以特定的氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基的方式改造的、具有α1,2‑岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和具有该蛋白质或生产该蛋白质的能力的微生物，与使用野生型的具有α1,2‑岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和具有该蛋白质或生产该蛋白质的能力的微生物的情况相比，能够更高效地制造2’‑岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质。

Description

经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和含有岩 藻糖的糖质的制造方法

技术领域

本发明涉及经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和使用该蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的微生物的含有岩藻糖的糖质的制造方法。

背景技术

已报道人类母乳中所含的母乳低聚糖(HMO)具有防御来自病原性细菌的感染的作用、作为益生元的功能，由于其生理活性，期待其作为幼儿用配方奶粉中的添加剂的利用(非专利文献1)。

在作为HMO已知的糖质中，2’-岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质占HMO整体的约60％，这些糖质的功能性受到关注(非专利文献2)。

在利用酶反应、发酵生产的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，广泛利用来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的α1,2-岩藻糖基转移酶(非专利文献2、3)，但是，该岩藻糖转移酶的活性不充分已成为课题(非专利文献4)。

为了解决该课题，已知有使用来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的1,2-岩藻糖基转移酶(非专利文献5)、来自鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)的α1,2-岩藻糖基转移酶(专利文献1)的含有岩藻糖的糖质的制造方法，但是要求开发更高效的制造方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4048173号公报

非专利文献

非专利文献1：J Biotechnol(2016)235：61-83

非专利文献2：Curr Opin Biotechnol(2019)56：130-137

非专利文献3：Metabolic Engineering(2017)41：23-38

非专利文献4：Microb Cell Fact(2013)12：40

非专利文献5：Journal of Biotechnology(2017)257：192-198

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和使用具有该蛋白质或生产该蛋白质的能力的微生物的含有岩藻糖的糖质的制造方法。

用于解决问题的方法

本发明涉及以下内容。

1.一种蛋白质，其是由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的一个以上氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质，

并且与作为基础的下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质相比，α1,2-岩藻糖基转移酶活性提高，

[1]由序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

[2]由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白；

[3]由与序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。

2.根据上述1所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成。

3.根据上述1或2所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[1a]～[1e]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[1a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[1d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-苏氨酸或L-丝氨酸的置换；

[1e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-丙氨酸的置换。

4.根据上述1～3中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[2a]～[2e]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[2a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[2d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-丝氨酸的置换；

[2e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换。

5.根据上述1～4中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换的氨基酸序列构成。

6.根据上述1～4中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

7.根据上述1～4中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换和与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

8.一种DNA，其编码上述1～7中任一项所述的蛋白质。

9.一种重组DNA，其含有上述8所述的DNA。

10.一种转化体，其是利用上述9所述的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。

11.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包含如下步骤：在培养基中培养具有生产上述1～7中任一项所述的蛋白质的能力的微生物，在培养物中生成含有岩藻糖的糖质。

12.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包含如下步骤：在培养基中培养具有生产上述1～7中任一项所述的蛋白质的能力的微生物，使用所得到的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源、GDP-岩藻糖和受体糖质存在于水性介质中，在该水性介质中生成含有岩藻糖的糖质。

13.根据上述12所述的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其中，上述受体糖质为乳糖。

14.根据上述11～13中任一项所述的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其中，上述含有岩藻糖的糖质为2’-岩藻糖基乳糖。

发明效果

根据本发明，提供经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和使用该蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的微生物的含有岩藻糖的糖质的制造方法。

具体实施方式

1.本发明的蛋白质

本发明的蛋白质为以下的(1)～(7)中任一项所述的蛋白质。

(1)一种蛋白质，其是由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的一个以上氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质，

并且与作为基础的下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质相比，上述蛋白质的α1,2-岩藻糖基转移酶活性提高，

[1]由序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

[2]由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白；

[3]由与序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。

(2)如上述(1)所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成。

(3)如上述(1)或(2)所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[1a]～[1d]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[1a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[1d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-苏氨酸或L-丝氨酸的置换；

[1e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-丙氨酸的置换。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[2a]～[2e]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[2a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[2d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-丝氨酸的置换；

[2e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换。

(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换的氨基酸序列构成。

(6)如上述(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

(7)如上述(1)～(4)中任一项所述的蛋白质，其由在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换和与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

在上述[1]～[3]中任一项记载的作为基础的蛋白质的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基是指，在对该作为基础的蛋白质的氨基酸序列与序列号2的氨基酸序列进行比对时，被比对为与序列号2的氨基酸序列中的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位的氨基酸残基相同的位置的各个氨基酸残基。

在上述[1]～[3]中任一项记载的作为基础的蛋白质的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基例如可以列举以下的氨基酸残基。

(i)在作为基础的蛋白质为由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，分别为序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位的氨基酸残基。

(ii)在作为基础的蛋白质为由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，分别为序列号4所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第84位和第243位的氨基酸残基。

(iii)在作为基础的蛋白质为由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，分别为序列号6所示的氨基酸序列的第7位、第66位、第73位、第88位和第247位的氨基酸残基。

(iv)在作为基础的蛋白质为由序列号8所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，分别为序列号8所示的氨基酸序列的第7位、第53位，第60位和第207位的氨基酸残基。在序列号8所示的氨基酸序列中，不存在与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基。

(v)在作为基础的蛋白质为由序列号10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的情况下，分别为序列号10所示的氨基酸序列的第7位、第66位、第73位、第82位和第238位的氨基酸残基。

在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中，选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的一个以上氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基，例如可以通过对想要确认被置换为其它氨基酸残基的上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列与作为基础的蛋白质的氨基酸序列进行比对来确认。

氨基酸序列的比对例如可以使用公知的比对程序ClustalW[Nucelic AcidsResearch 22,4673,(1994)]制作。例如，ClustalW可以通过http://www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)来利用。使用ClustalW制作比对时的参数例如可以使用默认值。

上述(1)或(2)中记载的其它氨基酸残基可以是天然型，也可以是非天然型。作为天然型氨基酸，可以列举：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。

以下，示出可以相互置换的氨基酸的例子。同一组中所含的氨基酸可以相互置换。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸

G组：苯丙氨酸、酪氨酸

作为上述(1)或(2)中记载的蛋白质的一个方式，在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换优选包含选自以下的[a]～[e]中的至少一种，该其它氨基酸残基更优选为L体。

[a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向选自上述D组记载的氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸)中的一个的置换

[b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向选自上述D组记载的氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸)中的一个的置换

[c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向选自上述E组记载的氨基酸残基(脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸)中的一个的置换

[d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向选自上述F组记载的氨基酸残基(丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸)中的一个的置换

[e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向选自上述A组记载的氨基酸残基(亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸)中的一个的置换

作为上述(1)或(2)中记载的蛋白质的一个方式，作为上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换，优选包含选自下述[1a]～[1e]中的至少一种。

[1a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[1d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-苏氨酸或L-丝氨酸的置换；

[1e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-丙氨酸的置换。

作为上述(1)或(2)中记载的蛋白质的一个方式，作为上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换，更优选包含选自下述[2a]～[2e]中的至少一种。

[2a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[2d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-丝氨酸的置换；

[2e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换。

作为上述(1)中记载的蛋白质的一个方式，优选在上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中，选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的1个以上氨基酸残基中的至少1个以上、优选2个以上氨基酸残基被置换。

作为上述(1)中记载的蛋白质的一个方式，作为上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换，更优选包含下述[A]和[B]中的至少一者。

[A]从与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向其它氨基酸的置换、优选向选自上述D组记载的氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸)中的一个的置换、更优选向L-精氨酸的置换；

[B]从与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向其它氨基酸的置换、优选向选自上述A组记载的氨基酸残基(亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸)中的一个的置换、更优选向L-丙氨酸的置换。

作为上述(1)中记载的蛋白质的一个方式，作为上述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换，特别优选包含下述[C]。

[C]从与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换和从与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换。

α1,2-岩藻糖基转移酶活性是指将GDP-岩藻糖和受体糖质作为底物，利用α1,2键将岩藻糖转移到受体糖质的半乳糖残基上，生成含有岩藻糖的糖质的活性。

作为受体糖质，可以列举：包含在非还原末端具有半乳糖的寡糖的糖质，优选为包含在非还原末端具有乳糖、红细胞三糖、N-乙酰基乳糖胺、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、路易斯X或路易斯a结构等的寡糖的糖质，更优选为乳糖、红细胞三糖、N-乙酰基乳糖胺、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、路易斯X或路易斯a等。

作为将上述受体糖质作为底物而得到的含有岩藻糖的糖质，例如可以列举：2’-岩藻糖基乳糖、乳-N-岩藻五糖Ⅰ、乳糖基二岩藻四糖、乳-N-二岩藻六糖Ⅰ和乳-N-新岩藻五糖I等。

上述(1)～(7)中任一项所述的蛋白质与作为基础的蛋白质相比α1,2-岩藻糖基转移酶活性提高这一点可以通过例如以下的方法确认。首先，通过后述的方法，分别制作具有编码想要确认上述活性的蛋白质和作为基础的蛋白质的DNA的重组DNA。接着，培养用该重组DNA转化不具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的微生物、例如大肠杆菌W3110株而得到的微生物，从所得到的培养物制备包含该蛋白质的细胞提取液。使包含该蛋白质的细胞提取液与包含作为底物的GDP-岩藻糖和受体糖质的水溶液接触，在该水溶液中生成含有岩藻糖的糖质。最后，通过使用后述的糖分析装置检测反应液中的含有岩藻糖的糖质的糖质，并比较其生成量，由此，能够确认与作为基础的蛋白质相比，该蛋白质的α1,2-岩藻糖基转移酶活性提高。

突变蛋白是指，使作为基础的蛋白质中的氨基酸残基人为地缺失或置换、或者在该蛋白质中人为地插入或添加氨基酸残基而得到的蛋白质。

在突变蛋白中，缺失、置换、插入或添加氨基酸可以是在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸。

被置换、插入或添加的氨基酸可以是天然型，也可以是非天然型。作为天然型氨基酸的例子，可以列举上述的天然型氨基酸。

可以相互置换的氨基酸的例子如上所述。同一组中所含的氨基酸可以相互置换。

同源蛋白是指存在于自然界中的生物所具有的蛋白质，是来自进化上的起源相同的蛋白质的一组蛋白质。同源蛋白的结构和功能彼此类似。

氨基酸序列、碱基序列的一致性使用基于Karlin和Altschul的算法BLAST[Pro.Nat.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]、FASTA[Methods Enz ymol.,183,63(1990)]来确定。基于该算法BLAST，开发了被称为BLASTN、BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。在基于BLAST使用BLASTN对碱基序列进行分析的情况下，参数例如设定为Score＝100、wordlength＝12。另外，在基于BLAST使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下，参数例如设定为score＝50、wordlength＝3。在使用BLAST和Gap ped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。

上述突变蛋白或同源蛋白具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性这一点可以通过例如以下方法确认。首先，通过后述的方法，制作具有编码想要确认上述活性的突变蛋白或同源蛋白的DNA的重组DNA。接着，用该重组DNA培养不具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的微生物、例如转化大肠杆菌W3110株而得到的微生物，从所得到的培养物制备包含该蛋白质的细胞提取液。使包含该蛋白质的细胞提取液与包含作为底物的GDP-岩藻糖和受体糖质的水溶液接触，在该水溶液中生成含有岩藻糖的糖质。最后，通过使用后述的糖分析装置检测反应液中的含有岩藻糖的糖质，能够确认突变蛋白或同源蛋白具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性。

作为如上所述的本发明的蛋白质的具体例，可以列举由序列号51、52、53或54所示的氨基酸序列构成的蛋白质。

2.本发明的DNA

本发明的DNA是编码上述(1)～(7)中任一项所述的蛋白质的DNA。作为本发明的DNA，具体而言，可以列举以下(8)～(13)中的任一DNA。

(8)编码由在由下述[4]～[6]中任一项中记载的DNA编码的蛋白质的氨基酸序列中选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的一个以上氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA。

[4]由序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列构成的DNA；

[5]在严谨条件下与由与序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白的DNA；

[6]由与序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白的DNA。

(9)如上述(8)所述的DNA，其为编码由如下氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，在其编码的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基被置换为L-精氨酸、与第68位对应的氨基酸残基被置换为L-精氨酸、与第75位对应的氨基酸残基被置换为L-脯氨酸、与第86位对应的氨基酸残基被置换为L-丝氨酸或与第238位对应的氨基酸残基被置换为L-丙氨酸。

(10)如上述(8)所述的DNA，其为编码由如下氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，在其编码的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基被置换为L-精氨酸。

(11)如上述(8)所述的DNA，其为编码由如下氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，在其编码的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基被置换为L-丙氨酸。

(12)如上述(8)所述的DNA，其编码由如下氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，在其编码的氨基酸序列中，与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基被置换为L-精氨酸，并且与第238位对应的氨基酸残基被置换为L-丙氨酸。

(13)具有序列号11、12、13或14所示的碱基序列的DNA。

在上述中，杂交是指DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分进行杂交的步骤。因此，该与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分进行杂交的DNA的碱基序列可以是作为Northern或Southern印迹分析的探针有用的长度的DNA，或者可以是能够作为PCR分析的寡核苷酸引物使用的长度的DNA。

作为用作探针的DNA，例如可以列举至少100个碱基以上、优选为200个碱基以上、更优选为500个碱基以上的DNA。作为用作引物的DNA，例如可以列举至少10个碱基以上、优选为15个碱基以上的DNA。

DNA杂交实验的方法是众所周知的，例如可以根据《分子克隆第4版》(Cold SpringHarbor Laboratory Press(2012))、Methods for Gen eral and MolecularBacteriology(ASM Press(1994))、Immunology met hods manual(Academic press(1997))以及多数其它标准教科书来确定杂交的条件并进行实验。

另外，通过按照市售的杂交试剂盒附带的说明书，也能够获得在严谨条件下进行杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒，例如可以列举通过随机引物法制作探针，在严谨条件下进行杂交的随机引物DNA标记试剂盒(罗氏诊断公司制造)。

作为上述严谨条件，例如可以列举如下条件：在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠，75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特溶液、10％的硫酸葡聚糖和20μg/L的变性鲑鱼精DNA的溶液中，在42℃下，将固定有DNA的过滤器和探针DNA孵育一晩，然后在例如约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该过滤器。

上述各种条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的封闭试剂来设定。为了符合条件，上述封闭试剂的添加也可以伴随杂交条件的改变。

作为能够在上述严谨条件下杂交的DNA，例如可以列举由使用上述BLAST、FASTA等程序基于上述参数计算时与序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成的DNA。

本发明的DNA例如可以通过如下方式获得：使用编码由序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，例如通过在《分子克隆第4版》(Cold Spring HarborLaboratory Press(2012))和《分子生物学实验室指南》(JOHN WILEY&SONS,INC.)等中记载的位点特异性突变导入法在位于该DNA上的编码选自由与序列号2的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的1个以上氨基酸残基的部分的碱基序列中导入突变，置换为编码其它氨基酸残基的碱基序列。或者，也可以使用PrimeSTARMutagenesis Basal Kit(宝生物公司制造)等得到本发明的DNA。

通过同样的方法，例如通过如下方式也能够得到本发明的DNA：使用编码由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白的DNA，通过上述1中记载的方法将该突变蛋白的氨基酸序列与作为其基础的序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列进行比对时，在编码该突变蛋白的氨基酸序列中选自由与序列号2的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的1个以上氨基酸残基的部分的碱基序列中导入突变。

另外，通过如下方式也能够获得本发明的DNA：使用编码由与序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白的DNA，在通过上述1的方法对该同源蛋白的氨基酸序列与作为其基础的序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列进行比对时，在编码该同源蛋白的氨基酸序列中选自由与序列号2的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的氨基酸残基中的1个以上氨基酸残基的部分的碱基序列导入突变。

编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA例如可以通过如下方式获得：使用能够基于编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针，通过针对微生物、优选螺杆菌属、更优选鼬鼠螺杆菌ATCC43772株的染色体DNA文库的Southern杂交而获得，或者，通过使用能够基于编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA的、以鼬鼠螺杆菌ATCC43772株的染色体DNA作为模板的PCR[PCRProtocols,Academic Press(1990)]而获得。作为编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，具体而言，可以列举具有由序列号1所示的碱基序列的DNA。

编码序列号4所示的氨基酸序列的DNA例如可以通过如下方式获得：使用能够基于编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针，通过针对微生物、优选螺杆菌属、更优选幽门螺杆菌ATCC700392株的染色体DNA文库的Southern杂交而获得，或者，通过使用能够基于编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA的、以幽门螺杆菌ATCC700392株的染色体DNA作为模板的PCR而获得。作为编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，具体而言，可以列举具有由序列号3所示的碱基序列的DNA。

编码序列号6所示的氨基酸序列的DNA例如可以通过如下方式获得：使用能够基于编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针，通过针对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌(Escherichia coli)O126株中的染色体DNA文库的Southern杂交而获得，或者，通过使用能够基于编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA的、以大肠杆菌O126株中的染色体DNA作为模板的PCR而获得。作为编码由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，具体而言，可以列举具有由序列号5所示的碱基序列的DNA。

编码序列号8所示的氨基酸序列的DNA例如可以通过如下方式获得：使用能够基于编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针，通过针对微生物、优选拟杆菌属、更优选脆弱拟杆菌ATCC25285株的染色体DNA文库的Southern杂交而获得，或者，通过使用能够基于编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA的、以脆弱拟杆菌ATCC25285株的染色体DNA作为模板的PCR而获得。作为编码由序列号8所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，具体而言，可以列举具有序列号7所示的碱基序列的DNA。

编码序列号10所示的氨基酸序列的DNA例如可以通过如下方式获得：使用能够基于编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的碱基序列设计的探针，通过与微生物、优选弧菌属、更优选霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O22株的染色体DNA文库的Southern杂交而获得，或者，通过使用能够基于编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA设计的引物DNA的、以霍乱弧菌O22株的染色体DNA作为模板的PCR而获得。作为编码由序列号10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA，具体而言，可以列举具有序列号9所示的碱基序列的DNA。

编码上述1(1)[2]中记载的、由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白的DNA例如可以通过将由序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列构成的DNA作为模板供于易错PCR等而获得。

或者，利用使用在各自的5’端具有以可导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的1组PCR引物的PCR，通过位点特异性突变导入法[Gene,77,51(1989)]，也能够获得编码上述1(1)[2]的由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白的DNA。

另外，按照市售的位点特异性突变导入试剂盒附带的说明书，也能够获得该DNA。作为市售的位点特异性突变导入试剂盒，例如可以列举能够向想要导入目标突变的位置导入突变(缺失、置换、插入或添加)的PrimeSTAR(注册商标)Mutagenesis Basal Kit(宝生物公司制造)。

即，首先，将具有以可导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的质粒作为模板，设计5’侧15个碱基重叠的一对突变导入用引物。此时，在重叠部分中包含目标突变。接着，使用该突变导入用引物，以具有想要导入目标突变的碱基序列的质粒作为模板进行PCR。将由此得到的扩增片段转化到大肠杆菌中时，能够得到具有导入了目标突变的碱基序列的质粒。

编码上述1(1)[3]中记载的、由与序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白的DNA例如可以通过以下的方法获得。具体而言，例如，针对各种基因序列数据库检索与序列号1、3、5、7或9所示的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列，使用能够基于通过该检索得到的碱基序列或氨基酸序列设计的探针DNA或引物DNA和具有该DNA的微生物，通过与获得编码上述由序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA的方法相同的方法，能够获得编码该同源蛋白的DNA。

碱基序列、氨基酸序列的一致性可以通过与上述1相同的方法确定。

对于通过上述方法获得的本发明的DNA，直接或用适当的限制酶等进行切割，通过常规方法整合到载体中，将所得到的重组DNA导入到宿主细胞中，然后使用通常使用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法[Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,74,5463(1977)]或AppliedBiosystems 3500基因分析仪、Applied Biosystems 3730DNA分析仪(均为赛默飞世尔科技公司制造)等碱基序列分析装置进行分析，由此能够确定该DNA的碱基序列。

作为确定本发明的DNA的碱基序列时可以使用的载体，例如可以列举：pBluescriptII KS(+)、pPCR-Script Amp SK(+)(均为安捷伦科技公司制造)、pT7Blue(默克密理博公司制造)、pCRII(赛默飞世尔科技公司制造)、pCR-TRAP(ジーンハンター公司制造)和pDIRECT[Nucleic Acids Res.,18,6069(1990)]等。

作为上述宿主细胞，只要是能够导入上述载体并增殖的宿主细胞，则可以是任意的宿主细胞，例如可以列举：大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08 Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam^-/dcm^-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制造)、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制造)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522等。

作为将整合本发明的DNA而得到的重组DNA导入到宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入到宿主细胞中的方法则可以使用任一种方法，例如可以列举使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、电穿孔法[Nuclei c Acids Res.,16,6127(1988)]等。

确定碱基序列的结果是，在所获得的DNA为部分长度的情况下，通过对使用该部分长度DNA作为探针的染色体DNA文库的Southern杂交法等，能够获得全长DNA。

进而，通过基于所确定的DNA的碱基序列而使用日本テクノサービス公司制造的NTS M系列DNA合成装置等进行化学合成，也能够制备目标DNA。

3.本发明的重组DNA

本发明的重组DNA是能够在宿主细胞中自主复制的DNA，并且是在能够转录上述2的本发明的DNA的位置含有启动子的表达载体中整合有本发明的DNA的DNA。

在宿主细胞中能够整合到染色体中且具有本发明的DNA的DNA也是本发明的重组DNA。

在重组DNA为能够整合到染色体中的重组DNA的情况下，可以不含有启动子。

在使用细菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，本发明的重组DNA优选为由启动子、核糖体结合序列、上述2的本发明的DNA和转录终止序列构成的重组DNA。此外，还可以包含控制启动子的基因。

在此，优选将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当的距离，例如6～18个碱基。

另外，在本发明的重组DNA中，本发明的DNA的表达未必需要转录终止序列，但是优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。

作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞，在使用属于埃希氏菌属的微生物的情况下，作为表达载体，例如可以列举：pColdI、pSTV28、pUC118(均为宝生物公司制造)、pET21a、pCDF-1b、pRSF-1b(均为默克密理博公司制造)、pMAL-c5x(ニューイングランドバイオラブス公司制造)、pGEX-4T-1、pTrc99A(均为GEヘルスケアバイオサイエンス公司制造)、pTrcHis、pSE280(均为赛默飞世尔科技公司制造)、pGEME X-1(プロメガ公司制造)、pQE-30、pQE-60、pQE80L(均为キアゲン公司制造)、pET-3、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(均为安捷伦科技公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306(1985)]、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制备]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2007,Vol.73,No.20,p6378-6385]、pPE167(Appl.Environ.Microbiol.2007,73：6378-6385)、pPAC31(国际公开第1998/12343号)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)等。

作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要是在属于埃希氏菌属的微生物的细胞中发挥功能的启动子则可以是任何启动子，例如可以使用trp启动子、gapA启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个trp启动子串联而成的启动子、tac启动子、trc启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、letI启动子那样人为设计改造的启动子。

在使用棒杆菌型细菌作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞的情况下，作为表达载体，例如可以列举：pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4(日本特开昭57-183799号公报)、pCG11(日本特开昭57-134500号公报)、pCG116、pCE54、pCB101(均为日本特开昭58-105999号公报)、pCE51、pCE52、pCE53[均为Molecularand General Genetics,196,175(1984)]等。

作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要是在棒杆菌型细菌的细胞中发挥功能的启动子则可以是任何启动子，例如可以使用P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,p674-679(2000)]。

在使用酵母菌株作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞的情况下，作为表达载体，例如可以列举YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。

作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要是在酵母菌株的细胞中发挥功能的启动子则可以是任何启动子，例如可以列举：PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。

本发明的重组DNA例如可以通过将利用上述2的方法制备的DNA片段进行限制酶处理等并插入到上述适当的表达载体的启动子的下游来制作。

在此，通过对本发明DNA的碱基序列以成为最适合于宿主细胞的表达的密码子的方式置换碱基，也能够提高该DNA所编码的蛋白质的表达量。宿主细胞中的密码子使用频率的信息可以通过公共数据库获得。

4.本发明的转化体

本发明的转化体为利用含有上述2中记载的本发明的DNA的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。

导入本发明的重组DNA的宿主细胞可以是原核生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等中的任一种，优选可以列举原核生物或酵母菌株，更优选可以列举：属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属或假单胞菌属等的原核生物或属于酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母菌属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属等的酵母菌株，最优选可以列举：大肠杆菌BL21 codon plus、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制造)、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(默克密理博公司制造)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08 Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam^-/dcm^-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18 mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制造)、大肠杆菌W、大肠杆菌JM101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌AT CC9637、大肠杆菌KY3591(委托编号：NITE BP-03062)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、Brevibacteriumimmariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriu m saccharolyticum)ATCC14066、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoni agenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Micro bacteriumammoniaphilum)ATCC15354或假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110等原核生物或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lact is)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwannio myces alluvius)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或产朊假丝酵母(Candida utilis)等酵母菌株。

上述大肠杆菌KY3591保藏在位于日本千叶县木更津市上总镰足2丁目5-8(邮政编码292-0818)的独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)。接收日(保藏日)为2019年11月18日，委托编号为NITE BP-03062。

作为宿主细胞，优选使用人工赋予或增强了生产作为α1,2-岩藻糖基转移酶的反应底物的GDP-岩藻糖的能力的育种株。

作为对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强由糖生产GDP-岩藻糖的能力的方法，可以列举：(a)使至少一种控制由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的机制缓和或解除的方法；(b)使至少一种参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶表达增强的方法；(c)使至少一种编码参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶的基因的拷贝数增加的方法；(d)将至少一种从由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径分支到该目标物质以外的代谢物的代谢途径弱化或切断的方法等，上述公知的方法可以单独使用或组合使用。

作为控制由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的机制的具体例，例如可以列举利用与该生物合成途径的控制相关的转录调节因子(RcsA等)的控制机制等公知的机制。

作为参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶的具体例，例如可以列举：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、GDP甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶等公知的酶。

作为从由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径分支到该目标物质以外的代谢产物的代谢途径的具体例，例如可以列举从GDP-岩藻糖向胆烷酸的代谢途径等公知的代谢途径。

作为上述赋予或增强生成GDP-岩藻糖的能力的方法的具体例，可以列举通过各种基因操作的方法(Metabolic Engineering(2017)41：23-38)等公知的方法。

另外，作为宿主细胞，也可以使用人工赋予或增强了供给作为α1,2-岩藻糖基转移酶的反应底物的受体糖质的能力的育种株。

作为对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强供给受体糖质的能力的方法，可以列举：(a)使至少一种控制由糖生成受体糖质的生物合成途径的机制缓和或解除的方法；(b)使至少一种参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶表达增强的方法；(c)使至少一种编码参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶的基因的拷贝数增加的方法；(d)使至少一种分解受体糖质的机制缓和或解除的方法；(e)使至少一种参与受体糖质的细胞内摄入的酶表达增强的方法；(f)使至少一种编码参与受体糖质的细胞内摄入的酶的基因的拷贝数增加的方法；(g)将至少一种从受体糖质分支到该目标物质以外的代谢物的代谢途径弱化或切断的方法等，上述公知的方法可以单独使用或组合使用。

作为参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶的具体例，例如可以列举具有以葡萄糖和UDP-半乳糖作为底物而生成乳糖的乳糖合成酶活性的酶等公知的酶。作为分解受体糖质的机制的具体例，例如可以列举催化乳糖的水解而生成葡萄糖和半乳糖的β-半乳糖苷酶等公知的酶。

作为参与受体糖质的细胞内摄入的酶的具体例，例如可以列举参与乳糖的细胞内摄入的乳糖渗透酶等公知的酶。

作为上述赋予或增强供给受体糖质的能力的方法的具体例，可以列举通过基因操作使β-半乳糖苷酶的活性降低或失活的方法(Metabolic Engineering(2017)41：23-38)等公知的方法。

作为将上述3的重组DNA以能够在宿主细胞中自主复制的质粒形式导入的方法，例如可以列举：上述的使用钙离子的方法、原生质体法、电穿孔法和原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984)]、乙酸锂法[J.Bacteriol.,153,163(1983)]等方法。

作为将重组DNA整合到宿主细胞的染色体中的方法，例如可以列举同源重组法。作为同源重组法，例如可以列举使用可以通过与在想要导入的宿主细胞内不能自主复制的具有抗药性基因的质粒DNA连接而制作的同源重组用质粒的方法。作为利用大肠杆菌中频繁使用的同源重组的方法，例如可以列举利用λ噬菌体的同源重组系统导入重组DNA的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)]。

此外，使用利用了通过与重组DNA一起整合到染色体上的枯草杆菌果聚糖蔗糖酶使大肠杆菌变成蔗糖敏感性这一点的选择法、利用了通过在具有链霉素抗性的突变rpsL基因的大肠杆菌中整合野生型rpsL基因而使大肠杆菌变成链霉素敏感性这一点的选择法[Mol.Microbiol.,55,137(2005)，Biosci.Biotechnol.Biochem.,71,2905(2007)]等，能够获得宿主细胞的染色体DNA上的目标区域被置换为重组DNA的大肠杆菌。

关于通过上述方法得到的转化体具有上述2中记载的本发明的DNA这一点，可以通过例如如下方式确认：在该转化体为转化具有由糖生成GDP-岩藻糖或受体糖质的能力的宿主细胞而得到的转化体的情况下，将该转化体在培养基中培养，将培养物中蓄积的含有岩藻糖的糖质的生成量与母株的生成量进行比较。或者，也可以通过如下方式确认：由该培养物制备含有本发明的蛋白质的提取液，使该提取液、GDP-岩藻糖和受体糖质存在于水性介质中，将在该水性介质中蓄积的含有岩藻糖的糖质的生成量与母株的生成量进行比较。

作为这样的本发明的转化体的例子，可以列举在后述实施例中记载的WFL/pAHY2株、WFL/pAHY3株、WFL/pAHY4株和WFL/pAHY5株。

5.本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法

本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法为以下的5-1和5-2中记载的方法。

5-1.利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法

作为本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法，可以列举利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包含如下步骤：在培养基中培养上述4的转化体，在培养物中生成含有岩藻糖的糖质。

作为在利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中使用的本发明的转化体，优选为具有由糖生成GDP-岩藻糖的能力的转化体。

另外，作为在利用发酵的含有岩藻糖的糖质的制造方法中使用的本发明的转化体，也可以使用具有生成受体糖质的能力的转化体。

培养上述4的转化体的方法可以按照微生物的培养中使用的通常的方法进行。

作为培养该转化体的培养基，只要是含有该转化体可同化的碳源、氮源、无机盐类等并能够高效地进行该转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基和合成培养基中的任一种。

作为碳源，只要是转化体可同化的碳源即可，例如可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、乙酸或丙酸等有机酸、或甘油、乙醇或丙醇等醇类等。

作为氮源，例如可以列举：氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵或磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。

作为无机盐，例如可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

作为含有岩藻糖的糖质的前体，可以在培养基中添加乳糖等受体糖质，另外，作为GDP-岩藻糖的前体，可以在培养基中添加GTP、甘露糖等。

在利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，在所使用的转化体不具有生成GDP-岩藻糖的能力的情况下，在培养中，将GDP-岩藻糖添加到培养基中。

另外，在利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，在所使用的转化体不具有生成GDP-岩藻糖的能力的情况下，在培养中，代替将GDP-岩藻糖添加到培养基中，可以通过将具有由糖生成GDP-岩藻糖的能力的微生物与本发明的转化体培养同时培养来向本发明的转化体中供给GDP-岩藻糖。

另外，为了供给或增强作为GDP-岩藻糖的前体的GTP，可以同时培养具有生产GTP的能力的微生物。作为具有生产GTP的能力的微生物，例如可以列举通过各种基因操作而增强了参与GTP的生物合成途径的酶的表达的微生物(Biotechnol Bioeng(2019)Sep3)等公知的微生物。

在利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，在所使用的转化体不具有生成乳糖等受体糖质的能力的情况下，在培养中，将乳糖等受体糖质添加到培养基中。

另外，在利用发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，在所使用的转化体不具有生成乳糖等受体糖质的能力的情况下，在培养中，代替将乳糖等受体糖质添加到培养基中，可以通过将具有由糖生成乳糖等受体糖质的能力的微生物与本发明的转化体同时培养来向本发明的转化体供给乳糖等受体糖质。

培养通常优选在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度通常为15℃～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中的培养液pH通常保持在3.0～9.0。pH的调节使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。

另外，在培养中可以根据需要向培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。在培养利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物时，可以根据需要向培养基中添加诱导剂。例如，在培养利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，在培养利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。

通过上述培养，在培养物中生成含有岩藻糖的糖质并蓄积，从该培养物中采集含有岩藻糖的糖质，由此能够制造含有岩藻糖的糖质。

所得到的含有岩藻糖的糖质可以通过使用糖离子色谱法等的通常的方法进行分析。从上述培养物或该培养物的处理物中采集含有岩藻糖的糖质可以通过使用活性炭、离子交换树脂等的通常的方法进行。在菌体内蓄积含有岩藻糖的糖质的情况下，例如可以利用超声波等将菌体破碎，通过离心分离除去菌体而得到上清液，利用活性炭、离子交换树脂等从上述上清液中采集含有岩藻糖的糖质。

5-2.使用GDP-岩藻糖和受体糖质作为底物的含有岩藻糖的糖质的制造方法

作为本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法，还可以列举使用GDP-岩藻糖和受体糖质作为前体的含有岩藻糖的糖质的制造方法。

具体而言，可以使用培养上述4的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源、GDP-岩藻糖和受体糖质存在于水性介质中，在该水性介质中生成含有岩藻糖的糖质并蓄积，从该水性介质中采集含有岩藻糖的糖质。

GDP-岩藻糖和受体糖质只要是成为本发明的转化体所具有的本发明的蛋白质的底物的GDP-岩藻糖和受体糖质，则其来源不受限制，可以直接使用具有生产GDP-岩藻糖或受体糖质的能力的微生物的培养物或该培养物的处理物，或者使用从该培养物或该培养物的处理物中采集的GDP-岩藻糖和受体糖质。

作为培养物的处理物，例如可以列举：培养物的浓缩物、培养物的干燥物、将培养物离心分离而得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白质分级物、该菌体的固定化物或从该菌体提取得到的酶标品等。

作为水性介质，例如可以列举：水、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液、甲醇、乙醇等醇类、乙酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类等。另外，例如可以列举作为酶源使用的微生物的培养液作为水性介质。

在水性介质中生成的含有岩藻糖的糖质的分析和采集方法与5-1相同。

[分析例]

在实施例中，2’-岩藻糖基乳糖的分析、定量通过以下所示的步骤进行。将培养后的包含微生物的培养液离心分离，回收上清液。利用糖分析装置ICS-5000(赛默飞世尔科技公司制造)对该上清液中所含的2’-岩藻糖基乳糖进行分析。

[分析条件]

柱：CarboPAC PA1

柱温：25℃

流动相：(流动相A)水

(流动相B)500mmol/L氢氧化钠

(流动相C)300mmol/L乙酸钠

流动相A、流动相B与流动相C的混合比：

(0分钟～10分钟)80：20：0～70：20：10的梯度

(10分钟～18分钟)70：20：10

(18分钟～25分钟)80：20：0

流速：0.8mL/分钟

检测器：脉冲安培检测器

实施例

以下，示出本发明的实施例，但是本发明不限于这些实施例。

[实施例1]2’-岩藻糖基乳糖的制造中使用的微生物的制作

(1)基因缺损时作为标记物使用的DNA片段的获取

将由表1的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将在表1的“模板”中记载的DNA作为模板，进行PCR，得到了各扩增DNA片段。

[表1]

枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA通过常规方法制备。扩增DNA片段的cat包含pHSG396上的cat基因的上游约200bp至下游约50bp。扩增DNA片段的sacB包含枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA上的sacB基因的上游约300bp至下游约100bp。

接着，将扩增DNA片段的cat和sacB作为模板，使用由序列号15和18所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了包含cat基因和sacB基因的DNA(以下，称为cat-sacB)片段。

(2)丧失β-半乳糖苷酶活性、乳糖渗透酶活性和胆烷酸生成活性的大肠杆菌的制作

通过以下的方法制作缺失了编码β-半乳糖苷酶的DNA(以下，称为lacZ基因)、编码乳糖渗透酶的DNA(以下，称为lacY基因)和编码胆烷酸生成相关蛋白的DNA(以下，称为wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL或wcaM基因)的大肠杆菌。需要说明的是，lacZ和lacY(以下，称为lacZY)和wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL和wcaM(以下，称为wcaJ-wzxC-wcaKLM)在大肠杆菌基因组上分别形成有操纵子。

将通过常规方法制备的大肠杆菌的KY3591株(委托编号：NITE BP-03062)的基因组DNA作为模板，使用由表2的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，扩增各DNA片段。

[表2]

lacZ上游1和lacZ上游2包含lacZ基因的起始密码子至其上游约900bp。lacY下游1和lacY下游2包含lacY基因的终止密码子至其下游约800bp。

将使lacZ上游1、lacY下游1和cat-sacB片段以等摩尔的比率混合而得到的混合物作为模板，使用由序列号20和22所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了由在lacZ和lacY基因周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下，称为lacZY：：cat-sacB)片段。

将使lacZ上游2和lacY下游2以等摩尔的比率混合而得到的混合物作为模板，使用由序列号20和22所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了由不包含lacZ和lacY且将lacZ上游和lacY下游直接连接而成的序列构成的DNA(以下，称为ΔlacZY)片段。

通过电穿孔法将lacZY：：cat-sacB片段导入到保持有包含编码λ重组酶的基因的质粒pKD46[Datsenko,K.A.,Warner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.97,6640-6645(2000)]的大肠杆菌中，得到了显示氯霉素抗性和蔗糖敏感性的转化体(lacZ和lacY基因被置换为lacZY：：cat-sac B的转化体)。

通过电穿孔法将ΔlacZY片段导入到作为该转化体的大肠杆菌中，得到了显示氯霉素敏感性和蔗糖抗性的转化体(lacZY：：cat-sacB被置换为ΔlacZY的转化体)。从其中进一步得到了显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46脱落的转化体)。将该转化体命名为ΔlacZY。

同样地，将大肠杆菌的KY3591株的基因组DNA作为模板，使用由表3的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了各扩增DNA片段。

[表3]

wcaJ上游1和wcaJ上游2包含wcaJ基因的起始密码子至其上游约900bp。wcaM下游1和wcaM下游2包含wcaM基因的终止密码子至其下游约800bp。

将使wcaJ上游1、wcaM下游1和cat-sacB片段以等摩尔的比率混合而得到的混合物作为模板，使用由序列号26和28所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了由在wcaJ-wzxC-wcaKLM操纵子周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下，称为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB)片段。

将使wcaJ上游2和wcaM下游2以等摩尔的比率混合而得到的混合物作为模板，使用由序列号26和28所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了由不包含wcaJ-wzxC-wcaKLM且将wcaJ上游和wcaM下游直接连接而成的序列构成的DNA(以下，称为ΔwcaJ-wzxC-wcaKLM)片段。

通过电穿孔法将wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB片段导入到上述制作的ΔlacZY株中，得到了显示氯霉素抗性和蔗糖敏感性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM被置换为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB的转化体)。

通过电穿孔法将ΔwcaJM片段导入到作为该转化体的大肠杆菌中，得到了显示氯霉素敏感性和蔗糖抗性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB被置换为ΔwcaJ-wzxC-wcaKLM的转化体)。进而，得到了显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46脱落的转化体)。将该转化体命名为WFL株。

(3)来自鼬鼠螺杆菌的α1,2-岩藻糖基转移酶(HMFT)表达载体的制备

将由表4的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将表4的“模板”中记载的DNA作为模板，进行PCR，得到了各扩增DNA片段。

[表4]

大肠杆菌的W3110株的基因组DNA通过常规方法制备。另外，序列号32和33、序列号34和35所示的碱基序列包含与各自的5’末端互补的序列。

将使rcsA、HMFT和lacY片段以等摩尔的比率混合而得到的混合物作为模板，使用由序列号37和38所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到了3个片段连接而成的DNA(以下，称为rcsA-HMFT-lacY)片段。

将由序列号39和40所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将质粒pPE167(Appl.Environ.Microbiol.2007,73：6378-6385)作为模板，进行PCR，得到了约4.4kb的载体片段。

此时，序列号37和40、序列号38和39所示的碱基序列包含与各自的5’末端互补的序列。

通过使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将上述得到的rcsA-HMFT-lacY片段与载体片段连接，得到了表达质粒pAHY1。

(4)表达突变型HMFT的微生物的制作

将上述(3)中得到的质粒pAHY1作为模板，使用Prime STAR Mutagenesis BasalKit(宝生物公司制造)，将由表5中记载的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，制作了将该5个氨基酸突变全部导入到HMFT的氨基酸序列上而得到的质粒pAHY2。

同样地，制作了将突变导入到HMFT的氨基酸序列上的第9位的氨基酸残基上而得到的质粒pAHY3。

同样地，制作了将突变导入到HMFT的氨基酸序列上的第238位的氨基酸残基上而得到的质粒pAHY4。

同样地，制作了将突变导入到HMFT的氨基酸序列上的第9位和第238位的氨基酸残基上而得到的质粒pAHY5。

[表5]

使用(3)中得到的质粒pAHY1以及上述pAHY2、pAHY3、pAHY4和pAHY5，转化上述(2)中制作的WFL株，得到了WFL/pAHY1株、WFL/pAHY2株、WFL/pAHY3株、WFL/pAHY4株和WFL/pAHY5株。

[实施例2]使用表达突变型HMFT的微生物的利用发酵法的2’-岩藻糖基乳糖的制造

在LB平板上、在30℃下将在实施例1中得到的WFL/pAHY1株、WFL/pAHY2株、WFL/pAHY3株、WFL/pAHY4株和WFL/pAHY5株培养24小时，接种到装有包含100mg/L的卡那霉素的LB培养基5mL的大型试管中，在30℃下振荡培养16小时。然后，将0.1mL的所得到的培养液接种到装有5mL的包含100mg/L的卡那霉素的生产培养基[葡萄糖30g/L、乳糖一水合物5g/L、硫酸镁七水合物2g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸一水合物1g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物以外的物质，利用氢氧化钠水溶液调节为pH7.2，然后进行高压灭菌)(对于含有葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物的水溶液，在另行制备之后进行高压灭菌，分别冷却之后进行混合)]的大型试管中，在30℃下振荡培养30小时。

在培养结束后，将培养液适当地稀释后进行离心分离，利用HPLC分析上清液中所含的2’-岩藻糖基乳糖。将结果示于表6中。

[表6]

如表6所示，与WFL/pAHY1株相比，WFL/pAHY2株、WFL/pAHY3株、WFL/pAHY4株和WFL/pAHY5株显示出更高的2’-岩藻糖基乳糖生产率。

由以上可知，通过使用具有突变型HMFT的微生物，与具有野生型HMFT的微生物相比，2’-岩藻糖基乳糖的生产率提高。

产业上的可利用性

根据本发明，提供经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和使用该蛋白质或具有生产该蛋白质的能力的微生物的含有岩藻糖的糖质的制造方法。

参考特定方式对本发明详细地进行了说明，但可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变更和修正，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。需要说明的是，本申请基于在2021年2月19日提交的日本专利申请(日本特愿2021-025170)，通过引用而援引其全部内容。另外，将在此引用的所有参照作为整体并入本申请中。

序列表

<110> 协和发酵生化株式会社

<120> 经改造的具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质和含有岩藻糖的糖质的制造方法

<130> W532522

<150> JP2021-025170

<151> 2021-02-19

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)

<400> 1

atggatttta agattgtgca agtgcatgga ggacttggaa atcagatgtt tcaatacgct 60

tttgccaaga gtttgcaaac acatctcaat atacccgtgc tacttgatac cacctggttt 120

gattatggca atcgggaatt gggattgcat ctttttccca tcgatttgca atgtgctagt 180

gcacagcaaa ttgctgctgc ccatatgcaa aacctgccaa ggctagtgag aggtgcgctc 240

agacgtatgg gtctaggcag agtcagcaag gaaatcgtgt ttgaatacat gccagagctg 300

tttgagccaa gtcgcattgc ttattttcat ggctatttcc aagatccaag atattttgaa 360

gacatctctc ccctgattaa gcaaacattc accctgcctc accccacaga gcatgcagag 420

caatatagcc gcaaactctc tcagattttg gcggcaaaaa atagcgtatt tgtgcatata 480

aggcgagggg attatatgag acttggctgg caacttgata tcagctacca actacgcgcc 540

attgcatata tggccaagcg cgtgcaaaat ttggagctat ttttattttg cgaggatttg 600

gaatttgtgc agaatcttga tcttggctat ccctttgtgg atatgaccac aagggatggg 660

gcggcgcatt gggatatgat gctgatgcaa tcttgcaagc atggcattat cacaaatagt 720

acctatagtt ggtgggcggc atatttgata aaaaatccag aaaaaatcat tattggacca 780

agccactgga tctatggcaa tgaaaatatc ctttgcaagg attgggtgaa gatagaatcc 840

caatttgaga caaaatcttg a 861

<210> 2

<211> 286

<212> PRT

<213> 鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)

<400> 2

Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val His Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile

50 55 60

Ala Ala Ala His Met Gln Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Gly Ala Leu

65 70 75 80

Arg Arg Met Gly Leu Gly Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr

165 170 175

Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp

210 215 220

Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Thr Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys

260 265 270

Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser

275 280 285

<210> 3

<211> 897

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 3

atggctttta aggtggtgca aatttgcggg gggcttggga atcaaatgtt ccaatacgct 60

ttcgctaaaa gtttgcaaaa acaccttaat acgcccgtgc tattggatat cacttctttt 120

gattggagta ataggaaaat gcaattagaa cttttcccta ttgatttgcc ctatgcgagc 180

gcgaaagaaa tcgctatagc taaaatgcaa cacctcccca agctagtaag agatacgctc 240

aaatgcatgg ggtttgatag ggtgagtcaa gaaatcgttt ttgaatacga gcctggattg 300

ttaaagccaa gccgcttgac ttatttttat ggctattttc aagatccacg atattttgat 360

gctatatccc ctttaatcaa gcaaaccttc accctacccc cccccgaaaa tggaaataat 420

aaaaaaaaag aggaagaata ccaccgcaag cttgctttga ttttagccgc taaaaacagc 480

gtgtttgtgc atgtaagaag aggggattat gtggggattg gctgtcagct tggtattgat 540

tatcaaaaaa aggcgcttga gtatatagca aagcgcgtgc caaacatgga gctttttgtg 600

ttttgcgaag acttaaaatt cacgcaaaat cttgatcttg gctacccttt tatggacatg 660

accactaggg ataaagaaga agaggcgtat tgggacatgc tgctcatgca atcttgcaag 720

catggcatta tcgctaacag cacttatagc tggtgggcgg cctatttgat aaacaatcca 780

gaaaaaatca ttattggccc caaacactgg ctttttgggc atgagaatat cctttgtaag 840

gaatgggtga aaatagaatc ccattttgag gtaaaatcaa aaaaatataa tgcttaa 897

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 4

Met Ala Phe Lys Val Val Gln Ile Cys Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Lys His Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Ser Phe Asp Trp Ser Asn Arg Lys Met Gln

35 40 45

Leu Glu Leu Phe Pro Ile Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Glu Lys Glu Ile

50 55 60

Ala Ile Ala Lys Met Gln His Leu Pro Lys Leu Val Arg Glu Ala Leu

65 70 75 80

Lys Cys Met Gly Phe Asp Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Glu Pro Lys Leu Leu Lys Pro Ser Arg Leu Thr Tyr Phe Tyr Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Asp Ala Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro Pro Pro Glu Asn Asn Lys Lys Lys Glu Glu Glu

130 135 140

Tyr His Arg Lys Leu Ser Leu Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe

145 150 155 160

Val His Ile Arg Arg Gly Asp Tyr Val Gly Ile Gly Cys Gln Leu Gly

165 170 175

Ile Asp Tyr Gln Lys Lys Ala Val Gly Tyr Met Ala Lys Arg Val Pro

180 185 190

Asn Met Glu Leu Phe Val Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Thr Gln Asn

195 200 205

Leu Asp Leu Gly Tyr Pro Phe Met Asp Met Thr Thr Arg Asp Lys Glu

210 215 220

Glu Glu Gly Tyr Trp Asp Met Leu Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly

225 230 235 240

Ile Ile Ala Asn Ser Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Asn

245 250 255

Asn Pro Glu Lys Ile Ile Ile Gly Pro Lys His Trp Leu Phe Gly His

260 265 270

Glu Asn Ile Leu Cys Lys Glu Trp Val Lys Ile Glu Ser His Phe Glu

275 280 285

Val Lys Ser Gln Lys Tyr Asn Ala

290 295

<210> 5

<211> 894

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

atgtctatta taagattaca aggcggactt ggaaatcaac tttttcagtt ctcatttggg 60

tatgcgcttt ccaaaattaa tgggacacca ttatattttg atataagtca ttatgctgaa 120

aatgatgatc atggtggtta caggctaaac aatctacaaa ttccagagga atatttacag 180

tattacacac caaaaattaa taatatttat aaatttttgg ttcgtgggtc aagattatat 240

cctgaaatct ttcttttttt aggtttttgc aatgaatttc atgcctatgg ttatgatttt 300

gaatatatag cgcaaaaatg gaaatccaaa aaatatatag ggtattggca atctgagcac 360

tttttccata aacatatatt agatctaaaa gaatttttta ttccaaagaa tgtgtctgaa 420

caagcaaatt tacttgcagc aaaaattctt gaatctcaat catcactttc tattcatata 480

agaagaggag attatataaa aaacaaaaca gctactttaa ctcatggcgt ttgttcgtta 540

gagtattaca aaaaagcttt aaataaaata cgcgatttgg caatgatacg tgacgtgttt 600

attttcagtg atgatatttt ttggtgtaaa gaaaatatcg aaacattact cagtaaaaaa 660

tataatatat attattcaga agatttatca caagaagaag atttatggtt aatgagctta 720

gctaaccatc atattatagc gaatagtagt tttagttggt ggggggctta tttaggtaca 780

tcagcgtcac agattgttat ttatcctact ccttggtacg atataactcc aaaaaatact 840

tatatcccca tagtcaatca ctggataaac gtggataaac atagctcgtg ttag 894

<210> 6

<211> 297

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

Met Ser Ile Ile Arg Leu Gln Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln

1 5 10 15

Phe Ser Phe Gly Tyr Ala Leu Ser Lys Ile Asn Gly Thr Pro Leu Tyr

20 25 30

Phe Asp Ile Ser His Tyr Ala Glu Asn Asp Asp His Gly Gly Tyr Arg

35 40 45

Leu Asn Asn Leu Gln Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln Tyr Tyr Thr Pro

50 55 60

Lys Ile Asn Asn Ile Tyr Lys Phe Leu Val Arg Gly Ser Arg Leu Tyr

65 70 75 80

Pro Glu Ile Phe Leu Phe Leu Gly Phe Cys Asn Glu Phe His Ala Tyr

85 90 95

Gly Tyr Asp Phe Glu Tyr Ile Ala Gln Lys Trp Lys Ser Lys Lys Tyr

100 105 110

Ile Gly Tyr Trp Gln Ser Glu His Phe Phe His Lys His Ile Leu Asp

115 120 125

Leu Lys Glu Phe Phe Ile Pro Lys Asn Val Ser Glu Gln Ala Asn Leu

130 135 140

Leu Ala Ala Lys Ile Leu Glu Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ile His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Lys Asn Lys Thr Ala Thr Leu Thr His Gly

165 170 175

Val Cys Ser Leu Glu Tyr Tyr Lys Lys Ala Leu Asn Lys Ile Arg Asp

180 185 190

Leu Ala Met Ile Arg Asp Val Phe Ile Phe Ser Asp Asp Ile Phe Trp

195 200 205

Cys Lys Glu Asn Ile Glu Thr Leu Leu Ser Lys Lys Tyr Asn Ile Tyr

210 215 220

Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Gln Glu Glu Asp Leu Trp Leu Met Ser Leu

225 230 235 240

Ala Asn His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala

245 250 255

Tyr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Gln Ile Val Ile Tyr Pro Thr Pro Trp

260 265 270

Tyr Asp Ile Thr Pro Lys Asn Thr Tyr Ile Pro Ile Val Asn His Trp

275 280 285

Ile Asn Val Asp Lys His Ser Ser Cys

290 295

<210> 7

<211> 864

<212> DNA

<213> 脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)

<400> 7

atgttatatg taattttacg tggacgatta ggtaataatc tttttcagat agcaactgcc 60

gcttcgttga ctcagaattt tatattttgt acagtaaata aggaccaaga gagacaggtc 120

cttttgtata aggattcttt ttttaaaaat ataaaagtta tgaagggggt tcctgatggc 180

ataccatatt acaaagaacc attccatgaa tttagcagaa ttccttatga agaaggaaag 240

gatctcatta ttgatggata tttccaatca gaaaagtact ttaaaagaag tgtcgtatta 300

gatctttata gaataactga tgagctaagg aagaaaatat ggaatatttg tggaaatatt 360

ttagaaaagg gagaaactgt gagtattcat gttagaagag gtgattactt gaagctgcca 420

catgcattac cattttgtgg aaagtcatac tataagaatg ctattcaata tattggtgag 480

gataaaatat tcattatttg tagtgatgat atcgattggt gtaaaaaaaa ctttatagga 540

aaaagatatt acttcataga gaacactact cctttactag atttatatat ccaatccttg 600

tgcactcaca atattataag taatagctct tttagttggt ggggagcatg gcttaatgaa 660

aatagtaata aaattgttat tgcacctcaa atgtggtttg gcatttctgt gaagttgggt 720

gttagtgatt tattgcctgt cagttgggtt cgacttccta ataattatac tttaggaaga 780

tattgttttg ctctatataa agtagttgag gactatttat taaatattct gcgattaata 840

tggaaaagaa agaagaatat gtga 864

<210> 8

<211> 288

<212> PRT

<213> 脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)

<400> 8

Met Leu Tyr Val Ile Leu Arg Gly Arg Leu Gly Asn Asn Leu Phe Gln

1 5 10 15

Ile Ala Thr Ala Ala Ser Leu Thr Gln Asn Phe Ile Phe Cys Thr Val

20 25 30

Asn Lys Asp Gln Glu Arg Gln Val Leu Leu Tyr Lys Asp Ser Phe Phe

35 40 45

Lys Asn Ile Lys Val Met Lys Gly Val Pro Asp Gly Ile Pro Tyr Tyr

50 55 60

Lys Glu Pro Phe His Glu Phe Ser Arg Ile Pro Tyr Glu Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asp Leu Ile Ile Asp Gly Tyr Phe Gln Ser Glu Lys Tyr Phe Lys Arg

85 90 95

Ser Val Val Leu Asp Leu Tyr Arg Ile Thr Asp Glu Leu Arg Lys Lys

100 105 110

Ile Trp Asn Ile Cys Gly Asn Ile Leu Glu Lys Gly Glu Thr Val Ser

115 120 125

Ile His Val Arg Arg Gly Asp Tyr Leu Lys Leu Pro His Ala Leu Pro

130 135 140

Phe Cys Gly Lys Ser Tyr Tyr Lys Asn Ala Ile Gln Tyr Ile Gly Glu

145 150 155 160

Asp Lys Ile Phe Ile Ile Cys Ser Asp Asp Ile Asp Trp Cys Lys Lys

165 170 175

Asn Phe Ile Gly Lys Arg Tyr Tyr Phe Ile Glu Asn Thr Thr Pro Leu

180 185 190

Leu Asp Leu Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Thr His Asn Ile Ile Ser Asn

195 200 205

Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala Trp Leu Asn Glu Asn Ser Asn Lys

210 215 220

Ile Val Ile Ala Pro Gln Met Trp Phe Gly Ile Ser Val Lys Leu Gly

225 230 235 240

Val Ser Asp Leu Leu Pro Val Ser Trp Val Arg Leu Pro Asn Asn Tyr

245 250 255

Thr Leu Gly Arg Tyr Cys Phe Ala Leu Tyr Lys Val Val Glu Asp Tyr

260 265 270

Leu Leu Asn Ile Leu Arg Leu Ile Trp Lys Arg Lys Lys Asn Met Gly

275 280 285

<210> 9

<211> 846

<212> DNA

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 9

atgatcgtta tgaaaatatc gggtggctta ggcaatcaat tgtttcagta cgctgtgggt 60

agggcaatag ccattcaata tggtgttcca ttaaaattgg atgttagtgc ttataaaaat 120

tataagctcc ataatggcta ccgattagat cagtttaata ttaatgccga tatagcgaat 180

gaggatgaaa tttttcattt gaaaggttcc agtaatcgtt tgtctagaat tttaagacga 240

ttaggttggt tgaagaaaaa cacgtattac gctgaaaaac aaagaacgat ttatgatgtt 300

agtgttttca tgcaagcacc acgctattta gatggttatt ggcaaaatga gcaatatttt 360

tcacagataa gagcggtatt actgcaagaa ctctggccaa atcaaccttt aagcattaac 420

gcgcaagctc atcagataaa aattcagcag actcatgctg tcagtattca tgttagaaga 480

ggggattatt tgaatcaccc tgaaattgga gttcttgata tagactacta taaacgtgct 540

gttgactata taaaggaaaa aattgaagcg ccagtatttt ttgtgttttc taatgatgta 600

gcatggtgca aagataattt caattttatt gatagcccag tctttattga agacacacaa 660

acagaaattg acgatctaat gctgatgtgc cagtgtcaac ataatattgt tgcaaacagt 720

tcttttagtt ggtgggctgc ttggttaaat agtaatgttg ataagattgt tattgcccct 780

aaaacgtgga tggctgaaaa tccaaaaggc tataaatggg tacctgattc atggcgtgaa 840

atatga 846

<210> 10

<211> 280

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 10

Met Ile Val Met Lys Ile Ser Gly Gly Leu Gly Asn Gln Leu Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Ala Val Gly Arg Ala Ile Ala Ile Gln Tyr Gly Val Pro Leu Lys

20 25 30

Leu Asp Val Ser Ala Tyr Lys Asn Tyr Lys Leu His Asn Gly Tyr Arg

35 40 45

Leu Asp Gln Phe Asn Ile Asn Ala Asp Ile Ala Asn Glu Asp Glu Ile

50 55 60

Phe His Leu Lys Gly Ser Ser Asn Arg Leu Ser Arg Ile Leu Arg Arg

65 70 75 80

Leu Gly Trp Leu Lys Lys Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Lys Gln Arg Thr

85 90 95

Ile Tyr Asp Val Ser Val Phe Met Gln Ala Pro Arg Tyr Leu Asp Gly

100 105 110

Tyr Trp Gln Asn Glu Gln Tyr Phe Ser Gln Ile Arg Ala Val Leu Leu

115 120 125

Gln Glu Leu Trp Pro Asn Gln Pro Leu Ser Ile Asn Ala Gln Ala His

130 135 140

Gln Ile Lys Ile Gln Gln Thr His Ala Val Ser Ile His Val Arg Arg

145 150 155 160

Gly Asp Tyr Leu Asn His Pro Glu Ile Gly Val Leu Asp Ile Asp Tyr

165 170 175

Tyr Lys Arg Ala Val Asp Tyr Ile Lys Glu Lys Ile Glu Ala Pro Val

180 185 190

Phe Phe Val Phe Ser Asn Asp Val Ala Trp Cys Lys Asp Asn Phe Asn

195 200 205

Phe Ile Asp Ser Pro Val Phe Ile Glu Asp Thr Gln Thr Glu Ile Asp

210 215 220

Asp Leu Met Leu Met Cys Gln Cys Gln His Asn Ile Val Ala Asn Ser

225 230 235 240

Ser Phe Ser Trp Trp Ala Ala Trp Leu Asn Ser Asn Val Asp Lys Ile

245 250 255

Val Ile Ala Pro Lys Thr Trp Met Ala Glu Asn Pro Lys Gly Tyr Lys

260 265 270

Trp Val Pro Asp Ser Trp Arg Glu

275 280

<210> 11

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 11

atggatttta agattgtgca agtgcgcgga ggacttggaa atcagatgtt tcaatacgct 60

tttgccaaga gtttgcaaac acatctcaat atacccgtgc tacttgatac cacctggttt 120

gattatggca atcgggaatt gggattgcat ctttttccca tcgatttgca atgtgctagt 180

gcacagcaaa ttgctgctgc ccgcatgcaa aacctgccaa ggcccgtgag aggtgcgctc 240

agacgtatgg gtctaagtag agtcagcaag gaaatcgtgt ttgaatacat gccagagctg 300

tttgagccaa gtcgcattgc ttattttcat ggctatttcc aagatccaag atattttgaa 360

gacatctctc ccctgattaa gcaaacattc accctgcctc accccacaga gcatgcagag 420

caatatagcc gcaaactctc tcagattttg gcggcaaaaa atagcgtatt tgtgcatata 480

aggcgagggg attatatgag acttggctgg caacttgata tcagctacca actacgcgcc 540

attgcatata tggccaagcg cgtgcaaaat ttggagctat ttttattttg cgaggatttg 600

gaatttgtgc agaatcttga tcttggctat ccctttgtgg atatgaccac aagggatggg 660

gcggcgcatt gggatatgat gctgatgcaa tcttgcaagc atggcattat cgctaatagt 720

acctatagtt ggtgggcggc atatttgata aaaaatccag aaaaaatcat tattggacca 780

agccactgga tctatggcaa tgaaaatatc ctttgcaagg attgggtgaa gatagaatcc 840

caatttgaga caaaatcttg a 861

<210> 12

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 12

atggatttta agattgtgca agtgcgcgga ggacttggaa atcagatgtt tcaatacgct 60

tttgccaaga gtttgcaaac acatctcaat atacccgtgc tacttgatac cacctggttt 120

gattatggca atcgggaatt gggattgcat ctttttccca tcgatttgca atgtgctagt 180

gcacagcaaa ttgctgctgc ccatatgcaa aacctgccaa ggctagtgag aggtgcgctc 240

agacgtatgg gtctaggcag agtcagcaag gaaatcgtgt ttgaatacat gccagagctg 300

tttgagccaa gtcgcattgc ttattttcat ggctatttcc aagatccaag atattttgaa 360

gacatctctc ccctgattaa gcaaacattc accctgcctc accccacaga gcatgcagag 420

caatatagcc gcaaactctc tcagattttg gcggcaaaaa atagcgtatt tgtgcatata 480

aggcgagggg attatatgag acttggctgg caacttgata tcagctacca actacgcgcc 540

attgcatata tggccaagcg cgtgcaaaat ttggagctat ttttattttg cgaggatttg 600

gaatttgtgc agaatcttga tcttggctat ccctttgtgg atatgaccac aagggatggg 660

gcggcgcatt gggatatgat gctgatgcaa tcttgcaagc atggcattat cacaaatagt 720

acctatagtt ggtgggcggc atatttgata aaaaatccag aaaaaatcat tattggacca 780

agccactgga tctatggcaa tgaaaatatc ctttgcaagg attgggtgaa gatagaatcc 840

caatttgaga caaaatcttg a 861

<210> 13

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 13

atggatttta agattgtgca agtgcatgga ggacttggaa atcagatgtt tcaatacgct 60

tttgccaaga gtttgcaaac acatctcaat atacccgtgc tacttgatac cacctggttt 120

gattatggca atcgggaatt gggattgcat ctttttccca tcgatttgca atgtgctagt 180

gcacagcaaa ttgctgctgc ccatatgcaa aacctgccaa ggctagtgag aggtgcgctc 240

agacgtatgg gtctaggcag agtcagcaag gaaatcgtgt ttgaatacat gccagagctg 300

tttgagccaa gtcgcattgc ttattttcat ggctatttcc aagatccaag atattttgaa 360

gacatctctc ccctgattaa gcaaacattc accctgcctc accccacaga gcatgcagag 420

caatatagcc gcaaactctc tcagattttg gcggcaaaaa atagcgtatt tgtgcatata 480

aggcgagggg attatatgag acttggctgg caacttgata tcagctacca actacgcgcc 540

attgcatata tggccaagcg cgtgcaaaat ttggagctat ttttattttg cgaggatttg 600

gaatttgtgc agaatcttga tcttggctat ccctttgtgg atatgaccac aagggatggg 660

gcggcgcatt gggatatgat gctgatgcaa tcttgcaagc atggcattat cgctaatagt 720

acctatagtt ggtgggcggc atatttgata aaaaatccag aaaaaatcat tattggacca 780

agccactgga tctatggcaa tgaaaatatc ctttgcaagg attgggtgaa gatagaatcc 840

caatttgaga caaaatcttg a 861

<210> 14

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 14

atggatttta agattgtgca agtgcgcgga ggacttggaa atcagatgtt tcaatacgct 60

tttgccaaga gtttgcaaac acatctcaat atacccgtgc tacttgatac cacctggttt 120

gattatggca atcgggaatt gggattgcat ctttttccca tcgatttgca atgtgctagt 180

gcacagcaaa ttgctgctgc ccatatgcaa aacctgccaa ggctagtgag aggtgcgctc 240

agacgtatgg gtctaggcag agtcagcaag gaaatcgtgt ttgaatacat gccagagctg 300

tttgagccaa gtcgcattgc ttattttcat ggctatttcc aagatccaag atattttgaa 360

gacatctctc ccctgattaa gcaaacattc accctgcctc accccacaga gcatgcagag 420

caatatagcc gcaaactctc tcagattttg gcggcaaaaa atagcgtatt tgtgcatata 480

aggcgagggg attatatgag acttggctgg caacttgata tcagctacca actacgcgcc 540

attgcatata tggccaagcg cgtgcaaaat ttggagctat ttttattttg cgaggatttg 600

gaatttgtgc agaatcttga tcttggctat ccctttgtgg atatgaccac aagggatggg 660

gcggcgcatt gggatatgat gctgatgcaa tcttgcaagc atggcattat cgctaatagt 720

acctatagtt ggtgggcggc atatttgata aaaaatccag aaaaaatcat tattggacca 780

agccactgga tctatggcaa tgaaaatatc ctttgcaagg attgggtgaa gatagaatcc 840

caatttgaga caaaatcttg a 861

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 15

accaggcgtt taagggcacc 20

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 16

gactacgggc ctaaagtcga cagaataaat aaatcctggt gtccc 45

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 17

gtcgacttta ggcccgtagt ctgcaaat 28

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 18

tacggttagc catttgcctg c 21

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 19

ggtgccctta aacgcctggt agctgtttcc tgtgtgaaat tgtt 44

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 20

tcgcgcaacg cgtcagtgg 19

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 21

gcaggcaaat ggctaaccgt aatgaacatg tcgatgacag aaag 44

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 22

tgcgctgtgt gtcgttgggc 20

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 23

ttctgtcatc gacatgttca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 45

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 24

atgaacatgt cgatgacaga aag 23

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 25

ggtgccctta aacgcctggt cgttgttcct gttatttgcc cc 42

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 26

aagctggtga ttaactccgg g 21

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 27

gcaggcaaat ggctaaccgt aatttgcgac cattcctgga aaaa 44

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 28

gcacatagcg accaacggcc 20

<210> 29

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 29

tttttccagg aatggtcgca aatcgttgtt cctgttattt gcccc 45

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 30

atttgcgacc attcctggaa aaa 23

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 31

atgtcaacga ttattatgga tttatg 26

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 32

atccattcta gacctcctta attagcgcat gttgacaaaa atacc 45

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 33

ttaaggaggt ctagaatgga ttttaagatt gtgcaagtg 39

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 34

cataatggat ttcctctcga gtcaagattt tgtctcaaat tggga 45

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 35

ctcgagagga aatccattat gtactattta aaaaacacaa acttt 45

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 36

ttaagcgact tcattcacct gac 23

<210> 37

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 37

gaggagaaat taaccatgtc aacgattatt atggatttat g 41

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 38

agggcatcgg tcgacttaag cgacttcatt cacctgac 38

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 39

gtcgaccgat gcccttgaga g 21

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 40

ggttaatttc tcctctttaa tatcg 25

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 41

caagtgcgcg gaggacttgg aaatcag 27

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 42

tcctccgcgc acttgcacaa tcttaaa 27

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 43

gctgcccgca tgcaaaacct gccaagg 27

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 44

ttgcatgcgg gcagcagcaa tttgctg 27

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 45

ccaaggcccg tgagaggtgc gctcaga 27

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 46

tctcacgggc cttggcaggt tttgcat 27

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 47

ggtctaagta gagtcagcaa ggaaatc 27

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 48

gactctactt agacccatac gtctgag 27

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 49

attatcgcta atagtaccta tagttgg 27

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 50

actattagcg ataatgccat gcttgca 27

<210> 51

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成蛋白质

<400> 51

Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val Arg Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile

50 55 60

Ala Ala Ala Arg Met Gln Asn Leu Pro Arg Pro Val Arg Gly Ala Leu

65 70 75 80

Arg Arg Met Gly Leu Ser Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr

165 170 175

Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp

210 215 220

Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys

260 265 270

Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser

275 280 285

<210> 52

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成蛋白质

<400> 52

Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val Arg Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile

50 55 60

Ala Ala Ala His Met Gln Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Gly Ala Leu

65 70 75 80

Arg Arg Met Gly Leu Gly Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr

165 170 175

Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp

210 215 220

Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Thr Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys

260 265 270

Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser

275 280 285

<210> 53

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成蛋白质

<400> 53

Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val His Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile

50 55 60

Ala Ala Ala His Met Gln Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Gly Ala Leu

65 70 75 80

Arg Arg Met Gly Leu Gly Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr

165 170 175

Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp

210 215 220

Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys

260 265 270

Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser

275 280 285

<210> 54

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成蛋白质

<400> 54

Met Asp Phe Lys Ile Val Gln Val Arg Gly Gly Leu Gly Asn Gln Met

1 5 10 15

Phe Gln Tyr Ala Phe Ala Lys Ser Leu Gln Thr His Leu Asn Ile Pro

20 25 30

Val Leu Leu Asp Thr Thr Trp Phe Asp Tyr Gly Asn Arg Glu Leu Gly

35 40 45

Leu His Leu Phe Pro Ile Asp Leu Gln Cys Ala Ser Ala Gln Gln Ile

50 55 60

Ala Ala Ala His Met Gln Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Gly Ala Leu

65 70 75 80

Arg Arg Met Gly Leu Gly Arg Val Ser Lys Glu Ile Val Phe Glu Tyr

85 90 95

Met Pro Glu Leu Phe Glu Pro Ser Arg Ile Ala Tyr Phe His Gly Tyr

100 105 110

Phe Gln Asp Pro Arg Tyr Phe Glu Asp Ile Ser Pro Leu Ile Lys Gln

115 120 125

Thr Phe Thr Leu Pro His Pro Thr Glu His Ala Glu Gln Tyr Ser Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Gln Ile Leu Ala Ala Lys Asn Ser Val Phe Val His Ile

145 150 155 160

Arg Arg Gly Asp Tyr Met Arg Leu Gly Trp Gln Leu Asp Ile Ser Tyr

165 170 175

Gln Leu Arg Ala Ile Ala Tyr Met Ala Lys Arg Val Gln Asn Leu Glu

180 185 190

Leu Phe Leu Phe Cys Glu Asp Leu Glu Phe Val Gln Asn Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Tyr Pro Phe Val Asp Met Thr Thr Arg Asp Gly Ala Ala His Trp

210 215 220

Asp Met Met Leu Met Gln Ser Cys Lys His Gly Ile Ile Ala Asn Ser

225 230 235 240

Thr Tyr Ser Trp Trp Ala Ala Tyr Leu Ile Lys Asn Pro Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ile Gly Pro Ser His Trp Ile Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Leu Cys

260 265 270

Lys Asp Trp Val Lys Ile Glu Ser Gln Phe Glu Thr Lys Ser

275 280 285

Claims (14)

1.一种蛋白质，其是由在下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从选自由与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基组成的组中的一个以上氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成的蛋白质，

并且与作为基础的下述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质相比，α1,2-岩藻糖基转移酶活性提高，

[1]由序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

[2]由在序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的突变蛋白；

[3]由与序列号2、4、6、8或10所示的氨基酸序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,2-岩藻糖基转移酶活性的同源蛋白。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含从与序列号2所示的氨基酸序列的第9位、第68位、第75位、第86位和第238位对应的氨基酸残基向其它氨基酸残基的置换的氨基酸序列构成。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[1a]～[1e]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[1a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-赖氨酸或L-精氨酸的置换；

[1c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[1d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-苏氨酸或L-丝氨酸的置换；

[1e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-丙氨酸的置换。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含选自以下的[2a]～[2e]中的至少一种置换的氨基酸序列构成：

[2a]与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2b]与序列号2所示的氨基酸序列的第68位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换；

[2c]与序列号2所示的氨基酸序列的第75位对应的氨基酸残基向L-脯氨酸的置换；

[2d]与序列号2所示的氨基酸序列的第86位对应的氨基酸残基向L-丝氨酸的置换；

[2e]与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换的氨基酸序列构成。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

7.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其由在所述[1]～[3]中任一项记载的蛋白质的氨基酸序列中包含与序列号2所示的氨基酸序列的第9位对应的氨基酸残基向L-精氨酸的置换和与序列号2所示的氨基酸序列的第238位对应的氨基酸残基向L-丙氨酸的置换的氨基酸序列构成。

8.一种DNA，其编码权利要求1～7中任一项所述的蛋白质。

9.一种重组DNA，其含有权利要求8所述的DNA。

10.一种转化体，其是利用权利要求9所述的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。

11.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包含如下步骤：在培养基中培养具有生产权利要求1～7中任一项所述的蛋白质的能力的微生物，在培养物中生成含有岩藻糖的糖质。

12.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包含如下步骤：在培养基中培养具有生产权利要求1～7中任一项所述的蛋白质的能力的微生物，使用所得到的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源、GDP-岩藻糖和受体糖质存在于水性介质中，在该水性介质中生成含有岩藻糖的糖质。

13.根据权利要求12所述的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其中，所述受体糖质为乳糖。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其中，所述含有岩藻糖的糖质为2’-岩藻糖基乳糖。