WO2023058772A1 - Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法 - Google Patents

Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法 Download PDF

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neuac
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strain
dna
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PCT/JP2022/037736
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大樹 直江
哲朗 氏原
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協和発酵バイオ株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention provides a microorganism capable of producing N-acetylneuraminic acid (hereinafter also abbreviated as NeuAc) and/or NeuAc-containing saccharide, and efficient production of NeuAc and/or NeuAc-containing saccharide using the microorganism. Regarding the method.
  • NeuAc N-acetylneuraminic acid
  • NeuAc N-Acetylneuraminic acid
  • Non-Patent Document 1 N-Acetylneuraminic acid
  • Non-Patent Document 2 a production method using enzymes and a production method by direct fermentation using microorganisms have been developed.
  • Production methods using enzymes include, for example, a method of producing NeuAc by the reaction of NeuAc aldolase using pyruvate and N-acetylmannosamine (hereinafter referred to as ManNAc) as substrates (Non-Patent Documents 3 and 4); A method for producing NeuAc by reaction of NeuAc aldolase under alkaline conditions using acid and N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as GlcNAc) as substrates (Patent Document 1), using pyruvate and GlcNAc as substrates, NeuAc aldolase and N -Method for producing NeuAc by reaction of acetylglucosamine-2-epimerase (hereinafter referred to as GlcNAc epimerase) (Non-Patent Documents 5 and 6), and phosphoenolpyruvate (hereinafter referred to as PEP) and ManNAc as substrates
  • a method for producing NeuAc
  • Patent Document 4 As a production method by direct fermentation using microorganisms, for example, in Patent Document 4, neuC gene encoding UDP-GlcNAc epimerase and neuB gene encoding sialic acid synthase derived from Campylobacter jejuni are introduced into Escherichia coli, and GlcNAc A method for conversion to NeuAc via ManNAc is disclosed (this pathway is referred to as the NeuC pathway). Moreover, Patent Document 5 describes the production of GlcNAc from glucosamine hexaphosphate by introduction of the GNA1 gene encoding glucosamine acetyltransferase derived from budding yeast, and the cyanobacterium Synechocystis sp. disclosed in Patent Document 3.
  • a method for producing NeuAc from GlcNAc via ManNAc is disclosed by introducing the slr1975 gene encoding PCC6803-derived N-acetylmannosamine epimerase and the neuB gene encoding Rhodobacter-derived sialic acid synthase ( This pathway is called the GNA1 pathway).
  • the GNA1 pathway does not pass through activated sugar nucleotides such as UDP-GlcNAc, so it is considered advantageous for production. and manufacturing costs.
  • E. coli has the wecB gene (also known as yifF gene, nfrC gene or rffE gene) as a gene that encodes UDP-GlcNAc epimerase (WecB) responsible for converting UDP-GlcNAc to UDP-ManNAc (Non-Patent Document 9).
  • WecB UDP-GlcNAc epimerase responsible for converting UDP-GlcNAc to UDP-ManNAc
  • WecB is known to function to biosynthesize an enterobacterial common antigen (hereinafter referred to as ECA) in Escherichia coli (Non-Patent Document 9).
  • ECA enterobacterial common antigen
  • the ECA biosynthetic pathway is known, and it is known that WecA, WecC, etc. are involved in addition to WecB (Non-Patent Documents 9 and 10).
  • An object of the present invention is to provide a microorganism capable of producing NeuAc and/or a NeuAc-containing saccharide, and a method for efficiently producing NeuAc and/or a NeuAc-containing saccharide using the microorganism.
  • the present inventors have found that by using a microorganism capable of producing NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides and having an ECA biosynthetic pathway blocked, NeuAc and/or NeuAc can be produced more efficiently than before.
  • the present invention was completed by discovering that it is possible to produce the contained saccharide.
  • the present invention is as follows. 1. A microorganism capable of producing at least one of N-acetylneuraminic acid and N-acetylneuraminic acid-containing carbohydrates, and having an enterobacterial common antigen (ECA) biosynthetic pathway blocked. 2. 1. The microorganism according to 1 above, which lacks the activity of at least one protein selected from the following [1] to [3].
  • ECA enterobacterial common antigen
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a homologous sequence thereof and having UDP-N-acetylglucosamine-undecaprenyl phosphate N-acetylglucosamine phosphotransferase (WecA) activity
  • SEQ ID NO: 4 Consisting of an amino acid sequence represented by or a homologous sequence thereof, and having UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase (WecB) activity
  • the microorganism according to 1 or 2 above which is Escherichia coli. 4. N-acetylneuraminic acid and N-acetylneuraminic acid and N- A method for producing at least one of acetylneuraminic acid-containing carbohydrates.
  • the microorganism of the present invention exhibits excellent ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides by blocking the ECA biosynthetic pathway in microorganisms capable of producing NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides.
  • By using the microorganism of the present invention it is possible to increase the production of NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides, reduce impurities, and efficiently produce NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides, as compared with conventional methods.
  • the microorganism of the present invention and the method for producing the same has the ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates, and the ECA biosynthetic pathway is blocked, resulting in NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates. is a microorganism with improved production efficiency of
  • Microorganisms of the present invention include, for example, the following (I) and (II) microorganisms.
  • (I) Using a microorganism originally capable of producing NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates as a parent strain, and using a microorganism whose ECA biosynthetic pathway has been blocked
  • (II) A microorganism whose ECA biosynthetic pathway has been blocked as a parent strain , NeuAc and/or microorganisms artificially endowed or enhanced with the ability to produce NeuAc-containing carbohydrates
  • the parent strain refers to the original strain to be subjected to genetic modification, transformation, etc.
  • the original strain to be transformed by gene introduction is also called a host strain.
  • the parent strain can be any microorganism, preferably a prokaryotic or yeast strain, more preferably Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Or prokaryotes belonging to the genus Pseudomonas, etc., or yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, Candida, etc.
  • Microorganisms Capable of Producing NeuAc and/or NeuAc-Containing Carbohydrates As used herein, a microorganism capable of producing NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates means that when the microorganism is cultured in a medium, NeuAc and/or A microorganism capable of biosynthesizing a NeuAc-containing carbohydrate.
  • a breeding strain artificially imparted or enhanced with the ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides can also be suitably used.
  • the production of NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides by microorganisms can be confirmed by, for example, culturing the microorganisms in a medium and analyzing NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides accumulated in the culture by HPLC or a saccharide analyzer described later. It can be confirmed by detecting using
  • Examples of methods for artificially conferring or enhancing the ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates include known methods such as the following (a) to (d), and these methods may be used alone or in combination.
  • can be used (a) a method of enhancing the expression of at least one enzyme involved in a biosynthetic pathway that produces NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates from sugars (b) a biosynthesis that produces NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates from sugars a method of increasing the copy number of at least one of the enzyme genes involved in the pathway; d) A method of weakening or blocking at least one of the metabolic pathways that diverge from the biosynthetic pathway that produces NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates from sugars to metabolites other than the target substance
  • the expression of at least one enzyme involved in assimilation or decomposition of metabolites other than the target substance or compounds derived from medium components is enhanced.
  • a method of artificially imparting or enhancing proteins involved in maltose and isomaltose uptake and/or proteins involved in maltose degradation can be mentioned. be done.
  • the method includes, for example, the method described in International Publication No. 2009/088049.
  • proteins involved in maltose and isomaltose uptake include known proteins such as the PTS maltose transporter subunit IIBC MalP derived from the Bacillus subtilis 168 strain.
  • proteins involved in maltose degradation include known proteins such as maltose-6-phosphate glucosidase MalA derived from Bacillus subtilis 168 strain.
  • the consumption of phosphoenolpyruvate required for NeuAc production may be suppressed.
  • at least one of the proteins involved in the conversion of pyruvate to oxaloacetate may be artificially imparted or enhanced. Specifically, for example, the method described in Vemuri GN et. al. Biotechnol Bioeng 2005, 90: 64-76.
  • proteins involved in the conversion of pyruvate to oxaloacetate include known proteins such as pyruvate carboxylase Pyc derived from Corynebacterium gurmicum ATCC13032 strain.
  • microorganism 1 artificially endowed or enhanced with ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrate>
  • the microorganisms obtained by the above method (a) or (b) are specifically selected from the following [1] to [3]. Examples include microorganisms artificially endowed or enhanced with the ability to produce at least one protein described in the above.
  • NeuAc synthase [2] GlcNAc epimerase [3] N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase
  • microorganisms artificially endowed with or enhanced with the ability to produce NeuAc-containing carbohydrates
  • specific examples of the microorganisms obtained by the method (a) or (b) include the following [1] to [5] ] to which the ability to produce at least one protein selected from ] is artificially imparted or enhanced.
  • [1] NeuAc synthase [2] GlcNAc epimerase [3] N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase [4] CMP-NeuAc synthase [5] sialyltransferase
  • a microorganism that produces the protein can be prepared, for example, by introducing into the parent strain a recombinant DNA in which a DNA fragment encoding the protein is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector. If the recombinant DNA is DNA capable of integration into the chromosomal DNA of the parent strain, it may not contain a promoter.
  • the recombinant DNA is preferably a recombinant DNA composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA containing the target gene, and a transcription termination sequence.
  • a gene controlling a promoter may be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA, but it is preferred to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a suitable nucleic acid molecule for introducing the target DNA into a host, proliferating, and expressing it. may
  • expression vectors include, for example, pColdI, pSTV28, pSTV29, pUC118 (all manufactured by Takara Bio), pMW119 (manufactured by Nippon Gene), pET21a, pCOLADuet-1, pCDFDuet- 1, pCDF-1b, pRSF-1b (manufactured by Merck Millipore), pMAL-c5x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1, pTrc99A (both manufactured by GE Healthcare Bioscience), pTrcHis , pSE280 (both manufactured by Thermo Fisher Scientific), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30, pQE80L (both manufactured by Qiagen), pET-3, pBluescriptII SK (+), pBluescript
  • any promoter can be used as long as it functions in the cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • uspA promoter lac promoter, PL promoter, PR promoter, PSE promoter, and other promoters derived from Escherichia coli, phage, and the like can be used.
  • Artificially designed and modified promoters such as two trp promoters in series, tac promoter, trc promoter, lacT7 promoter, and letI promoter can also be used.
  • expression vectors include, for example, pCG1 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-134500), pCG2 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197), pCG4 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-35197). JP-A-57-183799), pCG11 (JP-A-57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all JP-A-58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 [any and Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter that functions in coryneform bacterium cells may be used as the promoter when using the above expression vector.
  • the P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol. , 53, p674-679 (2000)].
  • expression vectors include, for example, YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15, and the like.
  • Any promoter can be used when using the above expression vector as long as it functions in cells of yeast strains.
  • Examples include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat Examples include promoters such as shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, and CUP1 promoter.
  • the expression level of the protein encoded by the DNA can be improved by substituting bases so that the base sequence of the DNA becomes the optimal codon for expression in the parent strain.
  • Information on the frequency of codon usage in parent strains used in the production method of the present invention can be obtained through public databases.
  • a method for introducing recombinant DNA as an autonomously replicable plasmid in a host strain for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 69, 2110 (1972)], the protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), the electroporation method [Nucleic Acids Res. , 16, 6127 (1988)].
  • Methods for integrating recombinant DNA into the chromosome of the parent strain include, for example, homologous recombination.
  • the homologous recombination method includes, for example, a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • Methods utilizing homologous recombination frequently used in Escherichia coli include, for example, a method of introducing recombinant DNA using the homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • a selection method utilizing the sucrose sensitivity of Escherichia coli due to the Bacillus subtilis levansuclarase integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, and a wild-type rpsL gene integration into Escherichia coli having a streptomycin-resistant mutant rpsL gene.
  • a selection method [Mol. Microbiol. , 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem. , 71, 2905 (2007)] and the like can be used to obtain a microorganism in which the target region on the chromosomal DNA of the parent strain has been replaced with recombinant DNA.
  • the chromosomal region to be introduced is not particularly limited, but non-essential gene regions or non-gene regions upstream of the non-essential gene regions are preferred.
  • the protein-encoding DNAs are present separately in any combination in 1 to 4 types, preferably 1 to 3 types, more preferably 1 or 2 types, and most preferably 1 type of recombinant DNA. may be
  • NeuAc synthase refers to a protein having NeuAc synthase activity.
  • NeuAc synthase activity refers to the activity of generating NeuAc using ManNAc and PEP as substrates.
  • the NeuAc synthase is not particularly limited as long as it has NeuAc synthase activity, and examples thereof include the NeuAc synthase CjneuB of Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain and the protein described in International Publication No. 2015/037698.
  • a protein of interest has NeuAc synthase activity by preparing a recombinant DNA having DNA encoding the protein, and using the recombinant DNA in a microorganism not having NeuAc synthase activity, A microorganism obtained by transforming E. coli strain W3110 is cultured, a cell extract containing the protein is prepared from the resulting culture, the fraction is brought into contact with the substrates ManNAc and PEP, and the resulting NeuAc is produced. can be confirmed by detecting by high performance chromatography or gas chromatography.
  • NeuAc synthase-producing microorganisms include microorganisms with enhanced NeuAc synthase activity compared to the parent strain obtained by transforming the parent strain with recombinant DNA containing DNA encoding NeuAc synthase.
  • the DNA encoding NeuAc synthase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, and most preferably DNA encoding CjneuB derived from Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain (SEQ ID NO: 7).
  • a microorganism with enhanced NeuAc synthase activity compared to the parent strain is the recombinant DNA that is introduced as an autonomously replicable plasmid in the parent strain or integrated into the chromosome of the parent strain.
  • Methods for confirming that the amount of transcription of the DNA or the amount of production of the protein encoded by the DNA is increased include, for example, northern blotting of the amount of transcription of the DNA, or western blotting of the amount of production of the protein. can be confirmed by comparing with that of the parent strain.
  • GlcNAc epimerase refers to a protein having GlcNAc epimerase activity.
  • GlcNAc epimerase activity refers to the activity of producing ManNAc by an epimerization reaction using GlcNAc as a substrate.
  • GlcNAc epimerase-producing microorganisms include, for example, microorganisms belonging to the genus Synechocystis, or GlcNAc epimerase produced by transforming a parent strain with recombinant DNA having DNA encoding GlcNAc epimerase. Microorganisms with enhanced activity are included.
  • Synechocystis sp. PCC6803 strain Pulsteur Culture Collection of Cyanobacteria, Institute Pasteur.
  • the DNA encoding the GlcNAc epimerase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, most preferably Synechocystis sp.
  • Synechocystis sp. DNA encoding GlcNAc epimerase derived from strain PCC6803 can be obtained by the method described in WO 00/47730.
  • a microorganism with enhanced GlcNAc epimerase activity compared to the parent strain By transforming a parent strain with a recombinant DNA containing a DNA encoding GlcNAc epimerase, a microorganism with enhanced GlcNAc epimerase activity compared to the parent strain can be constructed. It is confirmed that the microorganism has enhanced GlcNAc epimerase activity compared to the parent strain by comparing the amount of transcription of the DNA encoding the GlcNAc epimerase and the amount of production of the protein with those of the parent strain by the method described above. can. Examples of such microorganisms include W3110/pRcneuB2.
  • N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase refers to a protein having N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase activity.
  • N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase activity refers to the activity of producing N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate from acetyl CoA and D-glucosamine 6-phosphate.
  • Microorganisms that produce N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase include, for example, microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, or those that encode N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase. Examples include a microorganism having enhanced N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase activity compared to the parent strain, which is obtained by transforming the parent strain with a recombinant DNA having a DNA for
  • microorganisms belonging to the genus Saccharomyces preferably include Saccharomyces cerevisiae strain S288C.
  • the DNA encoding the N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase is preferably derived from a prokaryote such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from yeast, most preferably derived from Saccharomyces cerevisiae strain S288C. - acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase (SEQ ID NO: 9).
  • N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyl Microorganisms with enhanced transferase activity can be constructed.
  • the fact that the microorganism has enhanced N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase activity compared to the parent strain is confirmed by DNA encoding N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase. can be confirmed by comparing the amount of transcription and the amount of production of the protein with those of the parent strain.
  • CMP-NeuAc synthase refers to a protein having CMP-NeuAc synthase activity.
  • CMP-NeuAc synthase activity refers to the activity of producing CMP-NeuAc using CTP and NeuAc as substrates.
  • Microorganisms that produce CMP-NeuAc synthase include, for example, microorganisms belonging to the genus Pasteurella, or the parent strain obtained by transforming the parent strain with recombinant DNA having DNA encoding CMP-NeuAc synthase. and a microorganism with enhanced CMP-NeuAc synthase activity.
  • Microorganisms belonging to the genus Pasteurella preferably include Pasteurella multocida PM70 strain.
  • the DNA encoding CMP-NeuAc synthase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, most preferably DNA encoding CMP-NeuAc synthase derived from Pasteurella multocida PM70 strain ( Japanese Patent Laid-Open No. 2008-5794).
  • DNA encoding CMP-NeuAc synthase derived from Pasteurella multocida PM70 strain can be obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-5794.
  • a microorganism with enhanced CMP-NeuAc synthase activity compared to the parent strain can be created. It can be confirmed by comparing the amount of transcription of DNA encoding CMP-NeuAc synthase and the amount of production of the protein with those of the parent strain that the microorganism has enhanced CMP-NeuAc synthase activity compared to the parent strain.
  • Examples of such microorganisms include Escherichia coli N18-14/pMnK1 (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-5794).
  • a sialyltransferase refers to a protein having sialyltransferase activity.
  • the sialyltransferase activity refers to the activity of producing a NeuAc-containing saccharide using CMP-NeuAc and an acceptor saccharide as substrates.
  • Acceptor carbohydrates that serve as substrates for sialyltransferases include, for example, oligosaccharides, polysaccharides, and glycoconjugates such as glycoproteins and glycolipids.
  • Oligosaccharides or polysaccharides that serve as substrates for sialyltransferase include oligosaccharides or polysaccharides having galactose at the non-reducing end, or oligosaccharides or polysaccharides having NeuAc at the non-reducing end.
  • oligosaccharides or polysaccharides a structure preferably selected from the group consisting of lactose, globotriose, N-acetyllactosamine, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, Lewis a and Lewis X at the non-reducing end or an oligosaccharide having a structure selected from the group consisting of NeuAc ⁇ 2-Gal ⁇ 1-4Glc and NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc at the non-reducing end, more preferably lactose.
  • Complex carbohydrates that serve as substrates for sialyltransferases include, for example, complex carbohydrates in which proteins, lipids, etc. are bound to the aforementioned oligosaccharides and polysaccharides.
  • the NeuAc-containing carbohydrate is, for example, a carbohydrate obtained by adding NeuAc to the receptor carbohydrate, preferably selected from the group consisting of NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4Glc, NeuAc ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4Glc and NeuAc ⁇ 2-8NeuAc at the non-reducing end.
  • carbohydrates containing oligosaccharides having a structure more preferably 3'-sialyllactose (3'SL), 6'-sialyllactose (6'SL), sialyllacto-N-tetraose a (LST-a) , sialyllacto-N-tetraose b (LST-b), sialyllacto-N-tetraose c (LST-c) or disialyllacto-N-tetraose (DSLNT).
  • 3'-sialyllactose 3'SL
  • 6'SL 6'-sialyllactose
  • LST-a sialyllacto-N-tetraose b
  • LST-c sialyllacto-N-tetraose c
  • DSLNT disialyllacto-N-tetraose
  • sialyltransferases include ⁇ 2,3-sialyltransferase that produces 3′-sialyllactose using CMP-NeuAc and lactose as substrates, and ⁇ 2 that produces 6′-sialyllactose using CMP-NeuAc and lactose as substrates. ,6-sialyltransferase and other known enzymes.
  • sialyltransferase-producing microorganisms include microorganisms belonging to the genus Pasteurella, microorganisms belonging to the genus Photobacterium, or parent strains transformed with recombinant DNA having DNA encoding sialyltransferase. and a microorganism having enhanced sialyltransferase activity compared to the parent strain.
  • Microorganisms belonging to the genus Pasteurella preferably include Pasteurella multocida PM70 strain.
  • the microorganism belonging to the genus Photobacterium preferably includes Photobacterium damselae JT0160 strain.
  • the DNA encoding the sialyltransferase is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, most preferably ⁇ -2,3-derived from Pasteurella multocida PM70 strain. Examples thereof include DNA encoding sialyltransferase (International Publication No. 03/27297), and DNA encoding ⁇ -2,6-sialyltransferase derived from Photobacterium damselae JT0160 strain (GenBank Accession No. BAA25316).
  • DNA encoding ⁇ -2,3-sialyltransferase derived from Pasteurella multocida PM70 strain and DNA encoding ⁇ -2,6-sialyltransferase derived from Photobacterium damselae JT0160 strain are described in International Publication No. 03/27297. It can be obtained by the method described in No.
  • a microorganism with enhanced sialyltransferase activity compared to the parent strain can be created.
  • microorganism constructed by the above method has enhanced sialyltransferase activity compared to the parent strain can be confirmed by comparing the amount of transcription of DNA encoding a protein having sialyltransferase activity and the amount of production of the protein with that of the parent strain. can be confirmed by Examples of such microorganisms include Escherichia coli NM522/pYP3 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-5794).
  • microorganism 2 artificially endowed or enhanced with ability to produce NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrate>
  • specific examples of microorganisms obtained by the method (c) or (d) include NeuAc biosynthesis Microorganisms deficient in transcription factors that negatively regulate the activity of genes encoding enzymes involved in , and microorganisms with reduced NeuAc degradation activity are preferred.
  • Transcription factors that negatively regulate the activity of genes encoding enzymes involved in NeuAc biosynthesis include, for example, yhbJ, fruR and cra. Among these, yhbJ is preferred from the viewpoint of specificity for NeuAc production.
  • yhbJ is a transcriptional regulator that negatively regulates the activity of the glmS gene, which encodes L-glutamine-D-fructose 6-phosphate aminotransferase involved in NeuAc biosynthesis.
  • Genetic alterations that impair the function of transcription factors that negatively regulate the activity of genes encoding enzymes involved in NeuAc biosynthesis include modifying the DNA of the host's genomic DNA that encodes the portion corresponding to the protein whose function is to be impaired. Modification includes reducing or completely abolishing the function of the protein encoded by the DNA.
  • the form of modification to be added to the DNA is not particularly limited as long as it reduces or completely terminates the function of the protein encoded by the DNA encoding the portion corresponding to the protein whose function is to be deleted. can be used as appropriate.
  • Forms that reduce or completely terminate the function of the protein encoded by the portion corresponding to the protein whose function is to be deleted include, for example, any one modification selected from the following (i) to (iii). (i) removing all or part of the DNA encoding the portion corresponding to the protein whose function is to be deleted; (ii) one or several substitutions, deletions or additions to the DNA encoding the portion corresponding to the protein whose function is to be deleted; (iii) replacing the DNA encoding the portion corresponding to the protein whose function is to be deleted with a DNA sequence that is less than 80% identical to the DNA sequence prior to modification;
  • the deficient function of yhbJ is, for example, that the activity of yhbJ is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, more preferably 5% or less, compared to an unmodified strain. % or less.
  • the activity of yhbJ can be confirmed by examining the expression level of GlmS by Western blotting or the like [Kalamorz F. et al. , Mol Microbiol. 65(6):1518-33 (2007)].
  • Microorganisms with reduced NeuAc-degrading activity include, for example, microorganisms with reduced NeuAc lyase activity.
  • Microorganisms with reduced NeuAc lyase activity include, for example, Escherichia coli NAN8-71 (FERM BP-7908, International Publication No. 03/72783).
  • Microorganisms in which the intestinal bacterial common antigen (ECA) biosynthetic pathway is blocked are blocked microorganisms.
  • Methods for blocking the ECA biosynthetic pathway include, for example, methods for deactivating proteins involved in the ECA biosynthetic pathway.
  • a method for deficient activity of a protein involved in the ECA biosynthetic pathway the method described above in the section ⁇ Microorganism deficient in a transcription factor that negatively controls the activity of a gene encoding an enzyme involved in NeuAc biosynthesis>>.
  • a method of deficient the function of a specific protein can be mentioned. Specifically, for example, a method of knocking out a specific gene using PCR [Baba T. et al. , Mol systems Biol (2006)], a method using the homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • proteins involved in the ECA biosynthetic pathway include WecA, WecB, WecC, WecD, WecE, WecF and WecG.
  • WecA refers to a protein with UDP-N-acetylglucosamine-undecaprenyl phosphate N-acetylglucosamine phosphotransferase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecA examples include WecA (SEQ ID NO: 2), which is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, and most preferably derived from Escherichia coli BW25113 strain. be done.
  • the WecA-encoding DNA is preferably derived from a prokaryote such as bacteria or yeast, more preferably from a prokaryote, particularly preferably from Escherichia coli, most preferably from Escherichia coli strain BW25113. (SEQ ID NO: 1).
  • WecB refers to a protein with UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecB is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, and most preferably WecB derived from Escherichia coli BW25113 strain (SEQ ID NO: 4). be done.
  • the DNA encoding WecB is preferably derived from a prokaryote such as a bacterium or yeast, more preferably from a prokaryote, particularly preferably from Escherichia coli, most preferably from Escherichia coli strain BW25113. (SEQ ID NO: 3).
  • WecC refers to a protein with UDP-N-acetylmannosamine dehydrogenase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecC is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, and most preferably WecC (SEQ ID NO: 6) derived from Escherichia coli strain BW25113. be done.
  • DNA encoding WecC is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, most preferably DNA encoding WecC derived from Escherichia coli BW25113 strain. (SEQ ID NO: 5).
  • WecD refers to a protein with dTDP-4-amino-4,6-dideoxy-D-galactose acyltransferase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecD is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, and most preferably WecD (SEQ ID NO: 52) derived from Escherichia coli strain BW25113. be done.
  • the DNA encoding WecD is preferably derived from a prokaryote such as bacteria or yeast, more preferably derived from a prokaryote, particularly preferably derived from Escherichia coli, most preferably derived from Escherichia coli strain BW25113. (SEQ ID NO: 51).
  • WecE refers to a protein with dTDP-4-dehydro-6-deoxy-D-glucose transaminase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecE is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, most preferably WecE derived from Escherichia coli BW25113 strain (SEQ ID NO: 54). be done.
  • the WecE-encoding DNA is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably from prokaryotes, particularly preferably from Escherichia coli, most preferably from Escherichia coli strain BW25113. (SEQ ID NO: 53).
  • WecF is a protein with dTDP-N-acetylfucosamine: Lipid II N-acetylfucosaminyltransferase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecF is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, and most preferably WecF derived from Escherichia coli BW25113 strain (SEQ ID NO: 56). be done.
  • DNA encoding WecF is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, most preferably DNA encoding WecF derived from Escherichia coli BW25113 strain. (SEQ ID NO: 55).
  • WecG refers to a protein with UDP-N-acetyl-D-mannosaminouronate transferase activity involved in ECA biosynthesis.
  • WecG is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably derived from prokaryotes, particularly preferably derived from Escherichia coli, most preferably WecG derived from Escherichia coli BW25113 strain (SEQ ID NO: 58). be done.
  • the WecG-encoding DNA is preferably derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, more preferably from prokaryotes, particularly preferably from Escherichia coli, most preferably from Escherichia coli strain BW25113. (SEQ ID NO: 57).
  • a microorganism lacking the activity of at least one protein selected from the following [1] to [3] is preferred.
  • the identity of the nucleotide sequence or amino acid sequence is determined using the algorithm BLAST (Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993) or FASTA (Methods Enzymol., 183, 63, 1990) by Karlin and Altschul. can.
  • BLAST Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993
  • FASTA Method Enzymol., 183, 63, 1990
  • the identity between the target amino acid sequence (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6) and its homologous sequence is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%. % or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more.
  • a method for obtaining a protein consisting of a homologous sequence (hereinafter also referred to as a homologous protein) is not particularly limited, and known methods can be used. Specific examples include the following methods. First, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, most preferably 99% or more identity with the base sequence encoding the target amino acid sequence in various gene sequence databases search for nucleotide sequences having Subsequently, using a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the base sequence or amino acid sequence obtained by the search, and a microorganism having the DNA, using a probe that can be designed based on the base sequence of the DNA, , preferably the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli, still more preferably Escherichia coli BW25113 strain Southern hybridization to the chromosomal DNA library, or primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the protein of interest can be obtained by PCR [
  • a homologous sequence may be an amino acid sequence obtained by artificially deleting or substituting an amino acid residue in the original amino acid sequence, or artificially inserting or adding an amino acid residue into the amino acid sequence.
  • Deletion, substitution, insertion or addition of amino acids in a homologous protein may be deletion, substitution, insertion or addition of 1 to 20 amino acids at any position in the same sequence.
  • Alignment of amino acid sequences can be created using, for example, the known alignment program ClustalW [Nucelic Acids Research 22, 4673 (1994)]. Default values, for example, can be used for parameters when creating an alignment using ClustalW.
  • the amino acid residues to be substituted, inserted, or added may be natural or non-natural.
  • natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, and L-arginine.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenylalanine
  • the activity of proteins involved in the ECA biosynthetic pathway can be confirmed, for example, by examining the expression level of the ECA gene by Northern blotting, Western blotting, or the like. Specifically, for example, the WecA activity, WecB activity, or WecC activity of homologous proteins can be confirmed by the methods described below.
  • a homologous protein consisting of a sequence homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has WecA activity.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed is prepared.
  • a microorganism that does not have WecA activity for example, a microorganism obtained by transforming Escherichia coli BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecA strain described below, is cultured, and the homologous protein is extracted from the resulting culture.
  • a homologous protein consisting of a sequence homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 has WecB activity.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed is prepared.
  • a microorganism that does not have WecB activity for example, a microorganism obtained by transforming the Escherichia coli BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecB strain described below is cultured, and the homologous protein is extracted from the resulting culture.
  • a homologous protein consisting of a sequence homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 has WecC activity.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a protein whose activity is to be confirmed is prepared.
  • a microorganism that does not have WecC activity for example, a microorganism obtained by transforming the Escherichia coli BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecC strain described below is cultured, and the homologous protein is extracted from the resulting culture.
  • the homologous protein has WecC activity by detecting UDP-N-acetyl-D-mannosaminouronate in the reaction solution using an analyzer SPD-20A (manufactured by Shimadzu Corporation) described later. I can confirm.
  • the DNA encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 can be designed based on the base sequence of the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, for example. by Southern hybridization to the chromosomal DNA library of a microorganism, preferably Escherichia genus, more preferably Escherichia coli, more preferably Escherichia coli strain BW25113, or represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 PCR using the chromosomal DNA of a microorganism, preferably Escherichia genus, more preferably Escherichia coli, more preferably Escherichia coli BW25113 strain, as a template, using primer DNA that can be designed based on the DNA encoding the amino acid sequence of It can be obtained from [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Specific examples of the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO:3.
  • Specific examples of the DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:6 include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO:5.
  • the lack of activity of a protein involved in the ECA biosynthetic pathway can be confirmed by, for example, Northern blotting of the expression level of the gene encoding the protein involved in the ECA biosynthetic pathway. It can be confirmed by examining by method, Western blotting method, or the like.
  • the microorganisms created by the above method have improved production efficiency of NeuAc and/or NeuAc-containing carbohydrates compared to the parent strain.
  • the parent strain and the constructed microorganism are cultured in media, respectively.
  • NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides accumulated in the culture were detected using an HPLC or saccharide analyzer described later, and by comparing the production amounts of the parent strain and the created microorganism, it was found that NeuAc and / Or it can be confirmed that the production efficiency of the NeuAc-containing saccharide is improved.
  • the method for producing NeuAc and/or NeuAc-containing saccharides of the present invention comprises culturing the microorganisms described above in a medium, and adding NeuAc and/or NeuAc to the culture. It is characterized by producing carbohydrates.
  • the method of culturing microorganisms can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • natural media and synthetic media can be used as long as they contain carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms, and can efficiently culture the transformants. Any medium may be used.
  • Any carbon source can be used as long as it can be assimilated by the microorganism.
  • Examples include glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, sugars such as starch and starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alternatively, alcohols such as glycerol, ethanol, propanol, and the like are included.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor. , casein hydrolysates, soybean meal, soybean meal hydrolysates, various fermented bacteria and their digests, and the like.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation is usually preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is usually 15 to 40° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH of the culture solution during cultivation is usually maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as necessary during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • the medium When producing a NeuAc-containing saccharide, the medium preferably contains an acceptor saccharide such as lactose.
  • the receptor carbohydrate may be added at the beginning of the culture, or may be added during the culture as needed.
  • the concentration of the receptor saccharide to be added in the medium is preferably 10 to 300 g/l.
  • NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates are produced and accumulated in the culture, and NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates can be produced by collecting NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates from the culture.
  • NeuAc or NeuAc-containing saccharides from the culture can usually be carried out by combining activated charcoal, ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
  • NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates accumulate in the cells, for example, the cells are crushed by ultrasonic waves and the cells are removed by centrifugation. NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates can be harvested.
  • NeuAc or NeuAc-containing carbohydrates can be quantified using a sugar analyzer manufactured by Dionex, a dual-wavelength absorbance detector manufactured by Shimadzu Corporation, etc. [Anal. Biochem. , 189, 151 (1990)].
  • Example 1 Construction of microorganisms used for producing NeuAc (1) Construction of plasmid for NeuAc production NeuAc synthase gene CjneuB (SEQ ID NO: 7) of Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain, N-GluNAc 2 derived from Synechocystis sp PCC 6803 strain - A plasmid expressing epimerase gene slr1975 (SEQ ID NO: 8) and N-acetylglucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase gene GNA1 (SEQ ID NO: 9) of Saccharomyces cerevisiae strain S288C was constructed by the following procedure.
  • Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain, Synechocystis sp PCC strain 6803, or Saccharomyces cerevisiae S288C strain were cultured by a well-known culture method, and the chromosomal DNA of each microorganism was isolated and purified.
  • PCR is performed using the DNA consisting of the base sequence represented by the "primer set” in Table 1 as the primer set and the DNA described in the "template” in Table 1 as the template to obtain each amplified DNA fragment. Obtained.
  • a mixture of the CjneuB fragment, the slr1975 fragment and the GNA1 fragment obtained above at an equimolar ratio was used as a template, and PCR was performed using a primer set consisting of DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 10 and 15 to obtain CjneuB.
  • a DNA fragment of about 2.7 kb (hereinafter referred to as CjneuB-slr1975-GNA1 fragment) was obtained by ligating the slr1975 fragment and the GNA1 fragment.
  • the expression plasmid pTrc99a-CjneuB-slr1975-GNA1 was created by ligating the CjneuB-slr1975-GNA1 fragment and the expression vector pTrc99a (manufactured by GE Healthcare Bioscience) using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio). (hereinafter referred to as pCSG1) was obtained.
  • BW25113 strain (Keio collection (Systematic single-gene knock-out mutants of E. coli K-12)) as a host, by the same method as Baba et al. [Baba T. et al. (2006) Mol systems Biol], A strain BW25113 ⁇ yhbJ was obtained in which the yhbJ gene was completely deleted.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the nucleotide sequences shown in "Primer Set” in Table 2 as a primer set and the DNA described in "Template” in Table 2 as a template to obtain each amplified DNA fragment.
  • the genomic DNA of Bacillus subtilis strain 168 was prepared by a standard method.
  • the amplified DNA fragment cat includes about 200 bp upstream to about 50 bp downstream of the cat (chloramphenicol acetyltransferase) gene on pHSG396.
  • the amplified DNA fragment sacB contains about 300 bp upstream to about 100 bp downstream of the sacB (levansuclarase) gene on the genomic DNA of the Bacillus subtilis strain 168.
  • PCR was performed using a mixture of the amplified DNA fragments cat and sacB at an equimolar ratio as a template, and using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 17 and 20 as a primer set to obtain the cat gene and sacB.
  • a DNA fragment containing the sacB gene (hereinafter referred to as cat-sacB) was obtained.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the base sequences represented by the "primer set" in Table 3 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wecA upstream 1 and wecA upstream 2 comprise approximately 1500 bp upstream from the start codon of the wecA gene.
  • wecA downstream 1 and wecA downstream 2 comprise approximately 1300 bp downstream from the stop codon of the wecA gene.
  • wecA a DNA fragment consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 29 and 30 as a primer set
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as wecA::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the wecA gene peripheral region was obtained.
  • PCR was performed using DNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 29 and 30 as a primer set.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ wecA) consisting of a sequence in which upstream and downstream of wecA are directly linked was obtained.
  • the wecA::cat-sacB fragment was transformed into plasmid pKD46 [Datsenko, K. A., Warner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. -6645 (2000)] was introduced by electroporation into the BW25113 ⁇ yhbJ strain, which exhibited chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (wecA gene was replaced with wecA::cat-sacB transformants) were obtained.
  • the ⁇ wecA fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a chloramphenicol-sensitive and sucrose-resistant transformant (wecA::cat-sacB was replaced with ⁇ wecA). .
  • the transformant was named BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecA strain.
  • Escherichia coli lacking the wecB gene was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the base sequences shown in "primer set" in Table 4 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wecB upstream 1 and wecB upstream 2 include about 1400 bp upstream from the start codon of the wecB gene.
  • wecB downstream 1 and wecB downstream 2 comprise about 1400 bp downstream from the stop codon of the wecB gene.
  • wecB upstream 1, wecB downstream 1, and cat-sacB fragment at an equimolar ratio PCR is performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 39 and 40 as a primer set, A DNA fragment (hereinafter referred to as wecB::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the region surrounding the wecB gene was obtained.
  • PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 39 and 40 as a primer set.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ wecB) consisting of a sequence in which upstream and downstream of wecB were directly linked was obtained.
  • the wecB::cat-sacB fragment was introduced into the BW25113 ⁇ yhbJ strain carrying the plasmid pKD46 containing the gene encoding ⁇ recombinase by electroporation, and the transformant showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity. (a transformant in which the wecB gene was replaced with wecB::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wecB fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (transformant in which wecB::cat-sacB was replaced with ⁇ wecB). .
  • the transformant was named BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecB strain.
  • Escherichia coli lacking the wecC gene was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed using the DNA consisting of the base sequences represented by the "primer set" in Table 5 as a primer set to obtain each amplified DNA fragment.
  • wecC upstream 1 and wecC upstream 2 comprise approximately 1400 bp upstream from the start codon of the wecC gene.
  • wecC downstream 1 and wecC downstream 2 comprise approximately 1400 bp downstream from the stop codon of the wecC gene.
  • wecC upstream 1, wecC downstream 1, and cat-sacB fragment at an equimolar ratio PCR is performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 49 and 50 as a primer set, A DNA fragment (hereinafter referred to as wecC::cat-sacB) consisting of a sequence in which the cat-sacB fragment was inserted into the sequence of the wecC gene peripheral region was obtained.
  • a mixture of wecC upstream 2 and wecC downstream 2 at an equimolar ratio was used as a template, and DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 49 and 50 was used as a primer set to perform PCR.
  • a DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ wecC) consisting of a sequence in which upstream and downstream of wecC are directly linked was obtained.
  • the wecC::cat-sacB fragment was introduced into the BW25113 ⁇ yhbJ strain carrying the plasmid pKD46 containing the gene encoding ⁇ recombinase by electroporation, and the transformant showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity. (a transformant in which the wecC gene was replaced with wecC::cat-sacB) was obtained.
  • the ⁇ wecC fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a chloramphenicol-sensitive and sucrose-resistant transformant (wecC::cat-sacB was replaced with ⁇ wecC). .
  • the transformant was named BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecC strain.
  • strains obtained by transformation were named BW25113 ⁇ yhbJ/pCSG1 strain, BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecA/pCSG1 strain, BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecB/pCSG1 strain and BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecC/pCSG1 strain, respectively.
  • Example 2 Production of NeuAc by fermentation method BW25113 ⁇ yhbJ/pCSG1 strain, BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecA/pCSG1 strain, BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecB/pCSG1 strain, and BW25113 ⁇ yhbJ ⁇ wecC/pCSG1 strain obtained in Example 1 were plated on 30 LB plates containing 100 mg/L of ampicillin. C. overnight, inoculated into a thick test tube containing 5 ml of LB medium containing 100 mg/L ampicillin, and cultured at 30.degree. C. for 16 hours.
  • the culture solution was changed to a production medium containing 100 mg/L of ampicillin [glucose 30 g/L, magnesium sulfate heptahydrate 2.0 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 16 g/L, potassium dihydrogen phosphate 14 g/L, Ammonium sulfate 2.0 g/L, citric acid monohydrate 1.0 g/L, casamino acid (manufactured by Difco) 5.0 g/L, vitamin B1 10 mg/L, iron sulfate heptahydrate 50 mg/L, sulfuric acid Manganese heptahydrate 10 mg/L, autoclaved after adjusting to pH 7.2 with sodium hydroxide aqueous solution] [Glucose and magnesium sulfate heptahydrate aqueous solution were separately prepared, autoclaved, and mixed after cooling] After inoculating 0.3 ml of the culture in a thick test tube, isopropyl- ⁇ -D-thioga
  • the culture solution was diluted appropriately, and the sample after filter sterilization was analyzed by HPLC to quantify the NeuAc concentration contained in the supernatant and the amount of NeuAc produced per cell mass. Table 6 shows the results.
  • Table 7 shows the ratio of NeuAc to all peak compounds detected in this analysis, that is, the HPLC purity of NeuAc.
  • SEQ ID NO: 1 base sequence of wecA SEQ ID NO: 2: amino acid sequence of WecA SEQ ID NO: 3: base sequence of wecB SEQ ID NO: 4: amino acid sequence of WecB SEQ ID NO: 5: base sequence of wecC SEQ ID NO: 6: amino acid sequence of WecC 7: base sequence of CjneuB SEQ ID NO: 8: base sequence of slr1975 SEQ ID NO: 9: base sequence of GNA1 SEQ ID NO: 10: base sequence of CjneuB fragment amplification primer Fw SEQ ID NO: 11: base sequence of CjneuB fragment amplification primer Rv 12: Base sequence of slr1975 fragment amplification primer Fw SEQ ID NO: 13: Base sequence of slr1975 fragment amplification primer Rv SEQ ID NO: 14: Base sequence of GNA1 fragment amplification primer Fw SEQ ID NO: 15: Base sequence of GNA1 fragment amplification primer Rv SEQ ID NO: 16: base sequence of yh

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Abstract

本発明は、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物、及び該微生物により効率的にＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有し、且つ腸内細菌共通抗原（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＥＣＡ）生合成経路が遮断されている微生物及び該微生物を用いたＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造方法に関する。

Description

Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたＮ－アセチルノイラミン酸及び／又はＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法
　本発明は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃとも略す。）及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物および該微生物を用いたＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の効率的な製造方法に関する。
　Ｎ－アセチルノイラミン酸（Ｎ－Ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ。以下、ＮｅｕＡｃという。）はヒトの生体内に含まれるアミノ糖の一種であり、通常シアル酸として糖蛋白質や糖脂質の非還元末端に局在していることが知られている。ＮｅｕＡｃは脳中のガングリオシドや糖脂質中に多く含まれ、脳の発達や認知機能に関与することが示唆されている（非特許文献１）。
　ＮｅｕＡｃの製造法としては、ツバメの巣や卵黄などの天然資源からの抽出法や、ポリマーの加水分解法などが古くから用いられているが、製法の煩雑さや低い収率が課題である（非特許文献２）。
　一方で、より効率的なＮｅｕＡｃの製造法として、酵素を用いた製造法や微生物を用いた直接発酵による製造法が開発されてきた（非特許文献２）。
　酵素を用いる製造法としては、例えば、ピルビン酸及びＮ－アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃという。）を基質とするＮｅｕＡｃアルドラーゼの反応によりＮｅｕＡｃを製造する方法（非特許文献３及び４）、ピルビン酸及びＮ－アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという。）を基質とするアルカリ条件下でのＮｅｕＡｃアルドラーゼの反応によりＮｅｕＡｃを製造する方法（特許文献１）、ピルビン酸及びＧｌｃＮＡｃを基質として、ＮｅｕＡｃアルドラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼという。）の反応によりＮｅｕＡｃを製造する方法（非特許文献５及び６）、並びに、ホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰという。）及びＭａｎＮＡｃを基質とするＮｅｕＡｃシンセターゼの反応によりＮｅｕＡｃを製造する方法（特許文献２及び非特許文献７）などが知られている。しかしながら、上記の酵素を用いたＮｅｕＡｃの製造法は、いずれも操作の煩雑さが課題である。
　微生物を用いた直接発酵による製造法としては、例えば特許文献４には、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするｎｅｕＣ遺伝子及びシアル酸合成酵素をコードするｎｅｕＢ遺伝子を大腸菌に導入し、ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃを経てＮｅｕＡｃへ変換させる方法が開示されている（この経路をＮｅｕＣ経路と呼ぶ）。また、特許文献５には、出芽酵母由来のグルコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードするＧＮＡ１遺伝子の導入によりグルコサミン６リン酸からＧｌｃＮＡｃを生成し、さらに特許文献３に開示されたシアノバクテリアＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のＮ－アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードするｓｌｒ１９７５遺伝子及びＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ由来のシアル酸合成酵素をコードするｎｅｕＢ遺伝子を導入することで、ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃを経てＮｅｕＡｃを生産する方法が開示されている（当該経路をＧＮＡ１経路と呼ぶ）。
　ＧＮＡ１経路は、ＮｅｕＣ経路とは異なりＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃなどの活性化された糖ヌクレオチドを経由しないため、生産には有利と考えられるが、現状では非特許文献８に示されるように、ＮｅｕＡｃの生成効率や製造コスト面で課題がある。
　大腸菌は、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ－ＭａｎＮＡｃへの変換を担うＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＷｅｃＢ）をコードする遺伝子としてｗｅｃＢ遺伝子（別名、ｙｉｆＦ遺伝子、ｎｆｒＣ遺伝子又はｒｆｆＥ遺伝子）を有する（非特許文献９）。上記のとおり、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼはＮｅｕＣ経路において必須の酵素であるが、ＧＮＡ１経路においても、ＷｅｃＢはＮｅｕＡｃ生産において補完的に機能することが示されている（非特許文献８）。
　またＷｅｃＢは、大腸菌において腸内細菌共通抗原（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ。以下、ＥＣＡという。）を生合成するために機能することが知られている（非特許文献９）。ＥＣＡ生合成経路は公知であり、ＷｅｃＢの他に、ＷｅｃＡやＷｅｃＣなどが関わっていることが知られている（非特許文献９及び１０）。
　しかし、ＥＣＡ生合成経路とＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質生産との関連性や、ＷｅｃＢなどのＥＣＡ生合成に関わる蛋白質を欠損させた際のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質生産への影響については知られていない。
米国特許第５６６５５７４号明細書 日本国特開平１０－４９６１号公報 国際公開第２０１５／０３７６９８号 国際公開第２００８／０４０７１７号 国際公開第２０１２／１１２７７７号 国際公開第２００４／００３１７５号 国際公開第２００８／０９７３６６号
Annu. Rev. Nutr. (2009), Vol. 29, p.177-222 Biotechnology Advances (2021), Vol.46, 107678 J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol. 110, p.6481-6486 J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol. 110, p.7159-7163 Angew. Chem. Int. Ed. Eng. (1991), Vol. 30, p.827-828 Carbohydrate Research (1998), Vol. 306, p.575-578 Glycobiology (1997), Vol. 7, p.697-701 Metab. Eng. (2012), Vol. 14, p.623-629 FEMS Microbiol. Rev. (1988), Vol. 54, p.195-222 J Gen Appl Microbiol (2020), Vol. 66, p.169-174
　本発明は、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物、及び該微生物により効率的にＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有するとともに、ＥＣＡ生合成経路が遮断されている微生物を用いることにより、従来と比して、効率的にＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方の生産能を有し、且つ腸内細菌共通抗原（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＥＣＡ）生合成経路が遮断されている微生物。
２．下記［１］～［３］から選ばれる少なくとも１つの蛋白質の活性を欠損している、前記１に記載の微生物。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－ウンデカプレニルリン酸Ｎ－アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ（ＷｅｃＡ）活性を有する蛋白質
［２］配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）活性を有する蛋白質
［３］配列番号６で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンデヒドロゲナーゼ（ＷｅｃＣ）活性を有する蛋白質
３．大腸菌である、前記１又は２に記載の微生物。
４．前記１～３のいずれか１に記載の微生物を培地に培養し、Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方を生成させる、Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方の製造方法。
　本発明の微生物は、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物において、ＥＣＡ生合成経路が遮断されていることにより、優れたＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を示す。本発明の微生物を用いることにより、従来と比して、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産量を高めるとともに不純物を低減でき、効率的にＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造できる。
１．本発明の微生物及びその造成方法
　本発明の微生物は、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有し、且つＥＣＡ生合成経路が遮断されていることにより、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産効率が改善された微生物である。
　本発明の微生物としては、例えば、下記（Ｉ）及び（ＩＩ）の微生物が挙げられる。
（Ｉ）元来ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物を親株として、該親株のＥＣＡ生合成経路が遮断された微生物
（ＩＩ）ＥＣＡ生合成経路が遮断された微生物を親株として、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力が人工的に付与又は強化された微生物
　本発明において、親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
　親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０４　ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１－１８　ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ９６３７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
１－１．ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物
　本明細書において、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物とは、該微生物を培地で培養したときに、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生合成する能力を有する微生物をいう。
　ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有する微生物として、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化した育種株も、好適に用いることができる。
　微生物がＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産していることは、例えば、微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を後述のＨＰＬＣ又は糖分析装置を用いて検出することにより確認できる。
　ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、例えば、下記（ａ）～（ｄ）などの公知の方法が挙げられ、これらの方法は単独または組み合わせて使用できる。
（ａ）糖からＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つの発現を強化する方法
（ｂ）糖からＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法
（ｃ）糖からＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法
（ｄ）糖からＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法
　また、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に強化するために、該目的物質以外の代謝産物又は培地成分に由来する化合物の資化若しくは分解に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化してもよい。例えば、培地成分に由来するマルトース又はイソマルトースの資化を目的として、マルトース及びイソマルトースの取り込みに関わる蛋白質、及び／又は、マルトースの分解に関わる蛋白質を、人工的に付与又は強化する方法が挙げられる。当該方法としては、具体的には例えば、国際公開第２００９／０８８０４９号に記載の方法が挙げられる。
　マルトース及びイソマルトースの取り込みに関わる蛋白質としては、例えば、バチルス・サブチリス　１６８株由来のＰＴＳマルトーストランスポーターサブユニットＩＩＢＣ　ＭａｌＰ等の公知の蛋白質が挙げられる。マルトースの分解に関わる蛋白質としては、例えば、バチルス・サブチリス　１６８株由来のマルトース－６－リン酸グルコシダーゼ　ＭａｌＡ等の公知の蛋白質が挙げられる。
　また、ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に強化するために、ＮｅｕＡｃの生産に必要なホスホエノールピルビン酸の消費を抑制してもよい。例えば、ＮｅｕＡｃの生産に必要なホスホエノールピルビン酸の消費を抑制することを目的として、ピルビン酸からオキサロ酢酸への変換に関わる蛋白質の少なくとも1つを、人工的に付与又は強化してもよい。当該方法としては、具体的には例えば、Ｖｅｍｕｒｉ　ＧＮ　ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ　２００５，９０：６４－７６に記載の方法が挙げられる。
　前記ピルビン酸からオキサロ酢酸への変換に関わる蛋白質としては、例えば、コリネバクテリウム・グルミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株由来のピルビン酸カルボキシラーゼ　Ｐｙｃ等の公知の蛋白質が挙げられる。
＜ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化した微生物１＞
　ＮｅｕＡｃを生産する能力を人工的に付与又は強化した微生物のうち、上記（ａ）又は（ｂ）の方法により得られる微生物としては、具体的には例えば、下記〔１〕～〔３〕から選ばれる少なくとも１の蛋白質を生産する能力が人工的に付与又は強化された微生物が挙げられる。
〔１〕ＮｅｕＡｃシンターゼ
〔２〕ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ
〔３〕Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ
　ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化した微生物のうち、上記（ａ）又は（ｂ）の方法により得られる微生物としては、具体的には例えば、下記〔１〕～〔５〕から選ばれる少なくとも１の蛋白質を生産する能力が人工的に付与又は強化された微生物が挙げられる。
〔１〕ＮｅｕＡｃシンターゼ
〔２〕ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ
〔３〕Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ
〔４］ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ
〔５〕シアリルトランスフェラーゼ
　前記蛋白質を生産する微生物は、例えば、前記蛋白質をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを、親株に導入することにより作製できる。組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、目的遺伝子を含むＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　発現ベクターとしては、目的ＤＮＡを宿主に導入し、増殖、発現させるための適当な核酸分子であれば特に限定されず、プラスミドのみならず、例えば、人工染色体、トランスポゾンを用いたベクター、コスミドを用いてもよい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ　ＡＮＤ　ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１(国際公開第９８／１２３４３号)、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）、ｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７，６６４０－６６４５（２０００）］等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｕｓｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。
　親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４)〕等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］が挙げられる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
　ここで、該ＤＮＡの塩基配列を親株での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手できる。
　組換え体ＤＮＡを宿主株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、例えば相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。また、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］が挙げられる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュクラーゼによって大腸菌がシュクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７(２００５)、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得できる。ここで、導入を起こさせる染色体領域としては、特に制限されないが、必須でない遺伝子領域、若しくは必須でない遺伝子領域上流の非遺伝子領域が好ましい。
　上記〔１〕ＮｅｕＡｃシンターゼ、〔２〕ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、〔３〕Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、〔４〕ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼおよび〔５〕シアリルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、１～４種類の、好ましくは１～３種類の、より好ましくは１又は２種類の、最も好ましくは１種類の組換え体ＤＮＡに、任意の組み合わせで別々に存在していてもよい。
＜＜〔１〕ＮｅｕＡｃシンターゼ＞＞
　ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを基質としてＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
　ＮｅｕＡｃシンターゼとしては、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する限り特に限定されないが、例えば、カンピロバクター　ジェジュニＡＴＣＣ　４３４３８株のＮｅｕＡｃシンターゼＣｊｎｅｕＢ、国際公開第２０１５／０３７６９８号に記載の蛋白質が挙げられる。
　対象となる蛋白質がＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有していることは、該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡでＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有さない微生物、例えばエシェリヒア・コリＷ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰと接触させ、結果として生成するＮｅｕＡｃを高速クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーによって検出することで確認できる。
　ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物としては、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物が挙げられる。
　ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、カンピロバクター　ジェジュニＡＴＣＣ　４３４３８株由来のＣｊｎｅｕＢをコードするＤＮＡ（配列番号７）が挙げられる
　親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物をいう。
　前記ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認できる。
＜＜〔２〕ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ＞＞
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼとは、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性とは、ＧｌｃＮＡｃを基質として、エピメリ化反応により、ＭａｎＮＡｃを生成する活性をいう。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物としては、例えば、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）に属する微生物、又は、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物が挙げられる。
　シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）に属する微生物としては、好ましくは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ　ＰＡＳＴＥＵＲ）が挙げられる。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株由来の、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号８）が挙げられる。
　例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．ＰＣＣ６８０３株由来のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡは、国際公開第００／４７７３０号に記載された方法で取得できる。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物を造成できる。該微生物が、親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量を、親株のそれと比較することにより確認できる。このような微生物としては、例えば、Ｗ３１１０／ｐＲｃｎｅｕＢ２が挙げられる。
＜＜〔３〕Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ＞＞
　Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼとは、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ活性とは、アセチルＣｏＡとＤ－グルコサミン６－リン酸からＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン６－リン酸を生成する活性をいう。
　Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼを生産する微生物としては、例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物、又は、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物が挙げられる。
　サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物としては、好ましくは、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ２８８Ｃ株が挙げられる。
　Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは酵母由来の、最も好ましくは、サッカロマイセス　セレビシエ　Ｓ２８８Ｃ株由来のＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（配列番号９）が挙げられる。
　Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、該親株よりもＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物を造成できる。該微生物が、親株よりもＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物であることは、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量を、親株のそれと比較することにより確認できる。
＜＜〔４〕ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ＞＞
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＣＴＰ及びＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物としては、例えば、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）に属する微生物、又は、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物が挙げられる。
　パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　ＰＭ７０株が挙げられる。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ　ＰＭ７０株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（日本国特開２００８－５７９４号公報）が挙げられる。
　例えば、パスツレラ・マルトシダ　ＰＭ７０株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、日本国特開２００８－５７９４号公報に記載の方法で取得できる。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物を造成できる。該微生物が、親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であることは、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量を、親株のそれと比較することにより確認できる。このような微生物としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎ１８－１４／ｐＭｎＫ１（日本国特開２００８－５７９４号公報）が挙げられる。
＜＜〔５〕シアリルトランスフェラーゼ＞＞
　シアリルトランスフェラーゼとは、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。シアリルトランスフェラーゼ活性とは、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び受容体糖質を基質として、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する活性をいう。
　シアリルトランスフェラーゼの基質となる受容体糖質としては、例えば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質が挙げられる。シアリルトランスフェラーゼの基質となるオリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖若しくは多糖、または非還元末端にＮｅｕＡｃを有するオリゴ糖若しくは多糖が挙げられる。
　前記オリゴ糖または多糖の中でも、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ－アセチルラクトサミン、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ルイスａおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にＮｅｕＡｃα２－Ｇａｌβ１－４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースが挙げられる。
　シアリルトランスフェラーゼの基質となる複合糖質としては、例えば、前記オリゴ糖及び多糖に蛋白質又は脂質等が結合した複合糖質が挙げられる。
　ＮｅｕＡｃ含有糖質としては、例えば、前記受容体糖質にＮｅｕＡｃが付加した糖質、好ましくは、非還元末端にＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２－８ＮｅｕＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質が挙げられ、より好ましくは３’－シアリルラクトース（３’ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’ＳＬ）、シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ－ａ）、シアリルラクト－Ｎ‐テトラオースｂ（ＬＳＴ－ｂ）、シアリルラクト－Ｎ‐テトラオースｃ（ＬＳＴ－ｃ）またはジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。
　シアリルトランスフェラーゼとしては、具体的には、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及びラクトースを基質として３’－シアリルラクトースを生成するα２，３－シアリルトランスフェラーゼ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及びラクトースを基質として６’－シアリルラクトースを生成するα２，６－シアリルトランスフェラーゼ等、公知の酵素が挙げられる。
　シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物としては、例えば、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）に属する微生物、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物、又は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物が挙げられる。
　パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　ＰＭ７０株が挙げられる。フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物としては、好ましくは、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄａｍｓｅｌａｅ　ＪＴ０１６０株が挙げられる。
　シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　ＰＭ７０株由来のα－２，３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするＤＮＡ（国際公開第０３／２７２９７号）、又はＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄａｍｓｅｌａｅ　ＪＴ０１６０株由来のα－２，６－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．ＢＡＡ２５３１６）をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
　例えば、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）　ＰＭ７０株由来のα－２，３－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするＤＮＡ及びＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄａｍｓｅｌａｅ　ＪＴ０１６０株由来のα－２，６－ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするＤＮＡは、国際公開第０３／２７２９７号に記載された方法で取得できる。
　シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物を造成できる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物であることは、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量を、親株のそれと比較することにより確認できる。このような微生物としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／ｐＹＰ３（日本国特開２００８－５７９４号公報）が挙げられる。
＜ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化した微生物２＞
　ＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生産する能力を人工的に付与又は強化した微生物のうち、上記（ｃ）又は（ｄ）の方法により得られる微生物としては、具体的には例えば、ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子が欠損した微生物、ＮｅｕＡｃの分解活性が低下した微生物が好ましく挙げられる。
＜＜ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子が欠損した微生物＞＞
　ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子としては、例えば、ｙｈｂＪ、ｆｒｕＲおよびｃｒａが挙げられる。ＮｅｕＡｃ生産に対する特異性の観点から、これらの中でも、ｙｈｂＪが好ましい。
　ｙｈｂＪは、ＮｅｕＡｃ生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子である。
　ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主のゲノムＤＮＡのうち、機能を欠損させる蛋白質に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の機能を低減または完全に停止させることが挙げられる。
　前記したＤＮＡに加える改変の形態は、機能を欠損させる蛋白質に相当する部分をコードするＤＮＡがコードする蛋白質の機能を低減または完全に停止させるような形態であれば特に限定されず、公知の方法を適宜使用できる。
　機能を欠損させる蛋白質に相当する部分がコードする蛋白質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態としては、例えば、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）から選ばれるいずれか１の改変が挙げられる。
（ｉ）機能を欠損させる蛋白質に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｉｉ）機能を欠損させる蛋白質に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｉｉｉ）機能を欠損させる蛋白質に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
　機能を欠損させる蛋白質がｙｈｂJである場合、ｙｈｂＪの機能の欠損としては、例えば、非改変株と比較して、ｙｈｂＪの活性が好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが挙げられる。
　ｙｈｂJの活性は、GｌｍＳの発現量をウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる［Ｋａｌａｍｏｒｚ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（６）：１５１８－３３（２００７）］。
＜＜ＮｅｕＡｃの分解活性が低下した微生物＞＞
　ＮｅｕＡｃの分解活性が低下した微生物としては、例えば、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性が低下した微生物が挙げられる。ＮｅｕＡｃリアーゼ活性が低下した微生物としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＡＮ８－７１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７９０８、国際公開第０３／７２７８３号）が挙げられる。
１－２．腸内細菌共通抗原（ＥＣＡ）生合成経路が遮断されている微生物
　本発明の微生物は、Ｎ－アセチルノイラミン酸又はＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有するとともに、ＥＣＡ生合成経路が遮断されている微生物である。ＥＣＡ生合成経路を遮断する方法としては、例えば、ＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質の活性を欠損させる方法が挙げられる。
　ＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質の活性を欠損させる方法としては、＜＜ＮｅｕＡｃ生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の活性を負に制御する転写因子が欠損した微生物＞＞の項において上述した方法と同様にして、例えば、特定蛋白質の機能を欠損させる方法が挙げられる。具体的には、例えば、ＰＣＲを利用して特定の遺伝子をノックアウトする方法［Ｂａｂａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｌ（２００６）］、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］、特定の遺伝子の発現をＲＮＡｉにより阻害する方法、ニトロソグアニジン、紫外線などの変異剤を用いて特定の遺伝子およびそのプロモーター領域に変異を導入する方法が挙げられる。
　ＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質としては、例えば、ＷｅｃＡ、ＷｅｃＢ、ＷｅｃＣ、ＷｅｃＤ、ＷｅｃＥ、ＷｅｃＦおよびＷｅｃＧが挙げられる。
　ＷｅｃＡとは、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－ウンデカプレニルリン酸Ｎ－アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。
　ＷｅｃＡとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＡ（配列番号２）が挙げられる。
　ＷｅｃＡをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＡをコードするＤＮＡ（配列番号１）が挙げられる。
　ＷｅｃＢとは、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＢとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＢ（配列番号４）が挙げられる。
　ＷｅｃＢをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＢをコードするＤＮＡ（配列番号３）が挙げられる。
　ＷｅｃＣとは、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＣとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＣ（配列番号６）が挙げられる。
　ＷｅｃＣをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＣをコードするＤＮＡ（配列番号５）が挙げられる。
　ＷｅｃＤとは、ＥＣＡの生合成に関与するｄＴＤＰ－４－アミノ－４，６－ジデオキシ－Ｄ－ガラクトースアシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＤとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＤ（配列番号５２）が挙げられる。
　ＷｅｃＤをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＤをコードするＤＮＡ（配列番号５１）が挙げられる。
　ＷｅｃＥとは、ＥＣＡの生合成に関与するｄＴＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－グルコーストランスアミナーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＥとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＥ（配列番号５４）が挙げられる。
　ＷｅｃＥをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＥをコードするＤＮＡ（配列番号５３）が挙げられる。
　ＷｅｃＦとは、ＥＣＡの生合成に関与するｄＴＤＰ－Ｎ－アセチルフコサミン：Ｌｉｐｉｄ　ＩＩ　Ｎ－アセチルフコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＦとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＦ（配列番号５６）が挙げられる。
　ＷｅｃＦをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＦをコードするＤＮＡ（配列番号５５）が挙げられる。
　ＷｅｃＧとは、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミノウロナートトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。ＷｅｃＧとしては、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＧ（配列番号５８）が挙げられる。
　ＷｅｃＧをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株由来のＷｅｃＧをコードするＤＮＡ（配列番号５７）が挙げられる。
　ＥＣＡ生合成経路が遮断されている微生物として、具体的には、下記［１］～［３］から選ばれる少なくとも１つの蛋白質の活性を欠損している微生物が好ましい。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＷｅｃＡ活性を有する蛋白質
［２］配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＷｅｃＢ活性を有する蛋白質
［３］配列番号６で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＷｅｃＣ活性を有する蛋白質
　塩基配列又はアミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定できる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ　ｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　対象となるアミノ酸配列（配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列）とその相同配列との同一性は、８０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
　相同配列からなる蛋白質（以下、相同蛋白質とも称する）を取得する方法としては、特に制限されず、公知の方法を使用できる。具体的には例えば、次の方法が挙げられる。まず、各種の遺伝子配列データベースに対して対象となるアミノ酸配列をコードする塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索する。続いて、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計できるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、当該ＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は対象となる蛋白質をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。
　相同配列は、元となるアミノ酸配列中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該アミノ酸配列中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られるアミノ酸配列であってもよい。相同蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
　アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２，４６７３（１９９４）］を用いて作成できる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
　対象となるアミノ酸配列にアミノ酸を置換、挿入又は付加する場合、置換、挿入又は付加するアミノ酸残基は、天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　ＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質の活性は、例えば、ＥＣＡ遺伝子の発現量をノーザンブロット法、ウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる。具体的には例えば、相同蛋白質のＷｅｃＡ活性、ＷｅｃＢ活性又はＷｅｃＣ活性は下記に示す方法で確認できる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列の相同配列からなる相同蛋白質が、ＷｅｃＡ活性を有することは、例えば次の方法により確認できる。まず、該活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、ＷｅｃＡ活性を有さない微生物、例えば後述のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＡ株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該相同蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該相同蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるウンデカプレニル－１リン酸及びＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを含む水溶液と接触させ、該水溶液中にＬｉｐｉｄ　Ｉを生成させる。最後に、後述の分析装置ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所製）を用いて反応液中のＬｉｐｉｄ　Ｉを検出することにより、相同蛋白質がＷｅｃＡ活性を有することを確認できる。
　配列番号４で表されるアミノ酸配列の相同配列からなる相同蛋白質が、ＷｅｃＢ活性を有することは、例えば次の方法により確認できる。まず、該活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、ＷｅｃＢ活性を有さない微生物、例えば後述のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＢ株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該相同蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該相同蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンを含む水溶液と接触させ、該水溶液中にＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンを生成させる。最後に、後述の分析装置ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所製）を用いて反応液中のＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンを検出することにより、相同蛋白質がＷｅｃＢ活性を有することを確認できる。　　　
　配列番号６で表されるアミノ酸配列の相同配列からなる相同蛋白質が、ＷｅｃＣ活性を有することは、例えば次の方法により確認できる。まず、該活性を確認しようとする蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、ＷｅｃＣ活性を有さない微生物、例えば後述のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＣ株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該相同蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。該相同蛋白質を含む細胞抽出液を、基質であるＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンを含む水溶液と接触させ、該水溶液中にＵＤＰ－ＭａｎＮＡｃＡを生成させる。最後に、後述の分析装置ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所製）を用いて反応液中のＵＤＰ－Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミノウロナートを検出することにより、相同蛋白質がＷｅｃＣ活性を有することを確認できる。
　配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計できるプローブを用い、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、又は配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに基づき設計できるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ）、さらに好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得できる。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、具体的には、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、具体的には、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
　上述の方法により得られた微生物において、ＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質の活性が欠損していることは、例えば、上述のＥＣＡ生合成経路に関与する蛋白質をコードする遺伝子の発現量をノーザンブロット法、ウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる。
　上述の方法で造成した微生物が、親株に比べＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産効率が改善されていることは、例えば以下の方法により確認できる。まず、親株と造成した微生物をそれぞれ培地に培養する。続いて培養物中に蓄積したＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を後述のＨＰＬＣ又は糖分析装置を用いて検出し、親株と造成した微生物との生産量を比較することで、親株よりもＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産効率が改善されていることを確認できる。
２．微生物を用いたＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造方法
　本発明のＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造方法は、上記した微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ及び／又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成させることを特徴とする。
　微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が挙げられる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造する場合は、培地にラクトース等の受容体糖質を含むことが好ましい。受容体糖質は、培養の最初に添加してもよく、培養の途中から必要に応じて添加してもよい。添加する受容体糖質の培地中の濃度は、１０～３００ｇ／ｌとすることが好ましい。
　また、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造において、用いる微生物がラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有していない場合には、培養中に、ラクトース等の受容体糖質を培地に添加する代わりに、糖からラクトース等の受容体糖質を生成する能力を有する微生物を、本発明の微生物と同時に培養することにより、本発明の形質転換体にラクトース等の受容体糖質を供給してもよい。
　上記の培養により、培養物中にＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造できる。
　前記培養物中からのＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の採取は、通常活性炭やイオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質を採取できる。
　ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質は、Ｄｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置、島津製作所製の二波長吸光度検出器などを用いて定量できる［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）］。
［分析例］
　実施例において、ＮｅｕＡｃの分析、定量は以下に示す手順で行った。培養後の微生物を含む培養液を遠心分離し、上清を回収した。該上清に含まれるＮｅｕＡｃを分析装置ＳＰＤ－２０Ａ（島津製作所製）にて分析した。
［分析条件］
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＲＳｐａｋ　ＫＣ－８１１
カラム温度：４０℃
溶離液組成：１％リン酸水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＳＰＤ－２０Ａ
［実施例１］ＮｅｕＡｃの製造に用いる微生物の造成
（１）ＮｅｕＡｃ生産用プラスミドの造成
　カンピロバクター　ジェジュニＡＴＣＣ　４３４３８株のＮｅｕＡｃ合成酵素遺伝子ＣｊｎｅｕＢ（配列番号７）、シネコシスティス　エスピー　ＰＣＣ　６８０３株由来のＮ－ＧｌｕＮＡｃ　２－エピメラーゼ遺伝子ｓｌｒ１９７５（配列番号８）及びサッカロマイセス　セレビシエＳ２８８Ｃ株のＮ－アセチルグルコサミン－６－リン酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子ＧＮＡ１（配列番号９）を発現させるプラスミドを、以下の手順で作製した。
　カンピロバクター　ジェジュニＡＴＣＣ　４３４３８株、シネコシスティス　エスピー　ＰＣＣ　６８０３株又はサッカロマイセス　セレビシエＳ２８８Ｃ株を周知の培養方法により培養し、各微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。調製したＤＮＡを用い、表１の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記で得られたＣｊｎｅｕＢ断片、ｓｌｒ１９７５断片及びＧＮＡ１断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１０及び１５で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを実施し、ＣｊｎｅｕＢ断片、ｓｌｒ１９７５断片及びＧＮＡ１断片を連結させた約２．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＣｊｎｅｕＢ－ｓｌｒ１９７５－ＧＮＡ１断片という。）を得た。
　ＣｊｎｅｕＢ－ｓｌｒ１９７５－ＧＮＡ１断片と発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９ａ－ＣｊｎｅｕＢ－ｓｌｒ１９７５－ＧＮＡ１（以下、ｐＣＳＧ１という。）を得た。
（２）ＮｅｕＡｃ生産用宿主の造成
＜ｙｈｂＪ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　ＮｅｕＡｃ生合成に関わるＬ－グルタミン－Ｄ－フルクトース６リン酸アミノトランスフェラーゼをコードするｇｌｍＳ遺伝子の活性を負に制御する転写制御因子ｙｈｂＪ遺伝子（配列番号１６）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。
　ＢＷ２５１１３株（Ｋｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２））を宿主として用い、Ｂａｂａら［Baba T. et al. (2006) Mol systems Biol］と同様の方法により、ｙｈｂＪ遺伝子を完全に欠失させた株ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を得た。
＜遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得＞
　表２の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表２の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｐＨＳＧ３９６上のｃａｔ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素）遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約５０ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、バチルス・サブチリス　１６８株のゲノムＤＮＡ上のｓａｃＢ（レバンシュクラーゼ）遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。
　次に、増幅ＤＮＡ断片のｃａｔ及びｓａｃＢを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７及び２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
＜ｗｅｃＡ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　上記で造成したＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を親株として、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－ウンデカプレニルリン酸Ｎ－アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼをコードするｗｅｃＡ遺伝子（配列番号１）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。
　常法により調製したＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｗｅｃＡ上流１及びｗｅｃＡ上流２は、ｗｅｃＡ遺伝子の開始コドンからその上流約１５００ｂｐを含む。ｗｅｃＡ下流１及びｗｅｃＡ下流２は、ｗｅｃＡ遺伝子の終始コドンからその下流約１３００ｂｐを含む。
　ｗｅｃＡ上流１、ｗｅｃＡ下流１、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９及び３０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＡ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ断片（以下、ｗｅｃＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
　ｗｅｃＡ上流２及びｗｅｃＡ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９及び３０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＡを含まず、ｗｅｃＡ上流とｗｅｃＡ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ断片（以下、ΔｗｅｃＡという。）を得た。
　ｗｅｃＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Datsenko, K. A., Warner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol.97, 6640-6645 (2000)］を保持するＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｅｃＡ遺伝子がｗｅｃＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｅｃＡ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｅｃＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｅｃＡに置換した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＡ株と命名した。
＜ｗｅｃＢ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を親株として、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼをコードするｗｅｃＢ遺伝子（配列番号３）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した。
　常法により調製したＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として表４の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ｗｅｃＢ上流１及びｗｅｃＢ上流２は、ｗｅｃＢ遺伝子の開始コドンからその上流約１４００ｂｐを含む。ｗｅｃＢ下流１及びｗｅｃＢ下流２は、ｗｅｃＢ遺伝子の終始コドンからその下流約１４００ｂｐを含む。
　ｗｅｃＢ上流１、ｗｅｃＢ下流１、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３９及び４０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＢ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ断片（以下、ｗｅｃＢ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
　ｗｅｃＢ上流２及びｗｅｃＢ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３９及び４０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＢを含まず、ｗｅｃＢ上流とｗｅｃＢ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ断片（以下、ΔｗｅｃＢという。）を得た。
　ｗｅｃＢ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｅｃＢ遺伝子がｗｅｃＢ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｅｃＢ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体 (ｗｅｃＢ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｅｃＢに置換した形質転換体) を得た。当該形質転換体をＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＢ株と命名した。
＜ｗｅｃＣ遺伝子を欠損した大腸菌＞
　ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株を親株として、ＥＣＡの生合成に関与するＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンデヒドロゲナーゼをコードするｗｅｃＣ遺伝子（配列番号５）を破壊した大腸菌を、以下の手順で作製した
　常法により調製したＢＷ２５１１３株の染色体ＤＮＡを鋳型として表５の「プライマーセット」で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各増幅ＤＮＡ断片を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ｗｅｃＣ上流１及びｗｅｃＣ上流２は、ｗｅｃＣ遺伝子の開始コドンからその上流約１４００ｂｐを含む。ｗｅｃＣ下流１及びｗｅｃＣ下流２は、ｗｅｃＣ遺伝子の終始コドンからその下流約１４００ｂｐを含む。
　ｗｅｃＣ上流１、ｗｅｃＣ下流１、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４９及び５０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＣ遺伝子周辺領域の配列にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ断片（以下、ｗｅｃＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）を得た。
　ｗｅｃＣ上流２及びｗｅｃＣ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４９及び５０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｗｅｃＣを含まず、ｗｅｃＣ上流とｗｅｃＣ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ断片（以下、ΔｗｅｃＣという。）を得た。
　ｗｅｃＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｗｅｃＣ遺伝子がｗｅｃＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｗｅｃＣ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ｗｅｃＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｗｅｃＣに置換した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＣ株と命名した。
（３）ＮｅｕＡｃ生産用プラスミドを有する微生物の造成
　上記（１）で得られたプラスミドｐＣＳＧ１を、上記（２）で造成したＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＡ株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＢ株及びＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＣ株へそれぞれ形質転換した。形質転換にあたっては、定法に従い、アンピシリンナトリウム１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地で選抜した。形質転換により取得した株をそれぞれＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＣＳＧ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＡ／ｐＣＳＧ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＢ／ｐＣＳＧ１株及びＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＣ／ｐＣＳＧ１株と命名した。
［実施例２］発酵法によるＮｅｕＡｃの製造
　実施例１で得られたＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪ／ｐＣＳＧ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＡ／ｐＣＳＧ１株、ＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＢ／ｐＣＳＧ１株及びＢＷ２５１１３ΔｙｈｂＪΔｗｅｃＣ／ｐＣＳＧ１株を、アンピシリン１００ｍｇ／Lを含むＬＢプレート上で３０℃にて終夜培養し、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍｌが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１６時間培養した。
　その後、該培養液をアンピシリン１００ｍｇ／Lを含む生産培地［グルコース　３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物　２．０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム　１６ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム　１４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム　２．０ｇ／Ｌ、クエン酸１水和物１．０　ｇ／Ｌ、カザミノ酸（ディフコ社製）　５．０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１　１０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物　５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン７水和物　１０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブした］［グルコース及び硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途調製してオートクレーブし、冷却後に混合した］が３ｍｌ入った太型試験管に０．３ｍｌ植菌後、０．１２５ｍＭとなるようにイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で３０時間振とう培養した。
　培養終了後、培養液を適宜希釈し、フィルター滅菌後のサンプルをＨＰＬＣ分析し、上清に含まれるＮｅｕＡｃ濃度および菌体量当たりのＮｅｕＡｃ生産量を定量した。結果を表６に示す。
　また、本分析中で検出された全ピーク化合物に対するＮｅｕＡｃの割合、すなわちＮｅｕＡｃのＨＰＬＣ純度について表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６及び表７に示すように、ＥＣＡの生合成に関与するｗｅｃＡ遺伝子、ｗｅｃＢ遺伝子又はｗｅｃＣ遺伝子のいずれかを破壊することで、親株よりも高いＮｅｕＡｃ生産能を示すことが明らかとなった。また、培養液に含まれる全産物中に対しＮｅｕＡｃが占める割合が向上していることから、不純物の低減にも効果があることが示された。これらの結果から、ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の生産能を有し、且つＥＣＡ生合成経路が遮断されている微生物を用いることで、従来と比して効率的にＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質を製造できることがわかった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２１年１０月８日付けで出願された日本特許出願（特願２０２１－１６６４７６）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号１：ｗｅｃＡの塩基配列
配列番号２：ＷｅｃＡのアミノ酸配列
配列番号３：ｗｅｃＢの塩基配列
配列番号４：ＷｅｃＢのアミノ酸配列
配列番号５：ｗｅｃＣの塩基配列
配列番号６：ＷｅｃＣのアミノ酸配列
配列番号７：ＣｊｎｅｕＢの塩基配列
配列番号８：ｓｌｒ１９７５の塩基配列
配列番号９：ＧＮＡ１の塩基配列
配列番号１０：ＣｊｎｅｕＢ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１１：ＣｊｎｅｕＢ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１２：ｓｌｒ１９７５断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１３：ｓｌｒ１９７５断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１４：ＧＮＡ１断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１５：ＧＮＡ１断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１６：ｙｈｂＪの塩基配列
配列番号１７：ｃａｔ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号１８：ｃａｔ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号１９：ｓａｃＢ断片増幅用プライマーＦｗの塩基配列
配列番号２０：ｓａｃＢ断片増幅用プライマーＲｖの塩基配列
配列番号２１：ｗｅｃＡ上流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号２２：ｗｅｃＡ上流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号２３：ｗｅｃＡ下流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号２４：ｗｅｃＡ下流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号２５：ｗｅｃＡ上流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号２６：ｗｅｃＡ上流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号２７：ｗｅｃＡ下流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号２８：ｗｅｃＡ下流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号２９：ｗｅｃＡ破壊用断片作成用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号３０：ｗｅｃＡ破壊用断片作成用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号３１：ｗｅｃＢ上流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号３２：ｗｅｃＢ上流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号３３：ｗｅｃＢ下流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号３４：ｗｅｃＢ下流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号３５：ｗｅｃＢ上流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号３６：ｗｅｃＢ上流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号３７：ｗｅｃＢ下流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号３８：ｗｅｃＢ下流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号３９：ｗｅｃＢ破壊用断片作成用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号４０：ｗｅｃＢ破壊用断片作成用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号４１：ｗｅｃＣ上流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号４２：ｗｅｃＣ上流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号４３：ｗｅｃＣ下流１断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号４４：ｗｅｃＣ下流１断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号４５：ｗｅｃＣ上流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号４６：ｗｅｃＣ上流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号４７：ｗｅｃＣ下流２断片増幅用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号４８：ｗｅｃＣ下流２断片増幅用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号４９：ｗｅｃＣ破壊用断片作成用プライマー＿Ｆｗの塩基配列
配列番号５０：ｗｅｃＣ破壊用断片作成用プライマー＿Ｒｖの塩基配列
配列番号５１：ｗｅｃＤの塩基配列
配列番号５２：ＷｅｃＤのアミノ酸配列
配列番号５３：ｗｅｃＥの塩基配列
配列番号５４：ＷｅｃＥのアミノ酸配列
配列番号５５：ｗｅｃＦの塩基配列
配列番号５６：ＷｅｃＦのアミノ酸配列
配列番号５７：ｗｅｃＧの塩基配列
配列番号５８：ＷｅｃＧのアミノ酸配列

Claims (4)

  1. 　Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方の生産能を有し、且つ腸内細菌共通抗原（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＥＣＡ）生合成経路が遮断されている微生物。
  2. 　下記［１］～［３］から選ばれる少なくとも１つの蛋白質の活性を欠損している、請求項１に記載の微生物。
    ［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－ウンデカプレニルリン酸Ｎ－アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ（ＷｅｃＡ）活性を有する蛋白質
    ［２］配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン２－エピメラーゼ（ＷｅｃＢ）活性を有する蛋白質
    ［３］配列番号６で表されるアミノ酸配列またはその相同配列からなり、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミンデヒドロゲナーゼ（ＷｅｃＣ）活性を有する蛋白質
  3. 　大腸菌である、請求項１又は２に記載の微生物。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方を生成させる、Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の少なくとも一方の製造方法。
PCT/JP2022/037736 2021-10-08 2022-10-07 Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法 WO2023058772A1 (ja)

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