CN118103494A - 具有生产n-乙酰神经氨酸和/或含n-乙酰神经氨酸的糖质的能力的微生物以及使用该微生物的n-乙酰神经氨酸和/或含n-乙酰神经氨酸的糖质的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于,提供具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物、以及利用该微生物高效地制造NeuAc和/或含NeuAc的糖质的方法。本发明涉及具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力且肠道杆菌共同抗原(enterobacterial common antigen、ECA)生物合成途径被阻断的微生物、以及使用该微生物制造NeuAc和/或含NeuAc的糖质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有N-乙酰神经氨酸(以下也简称为NeuAc)和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物、以及使用该微生物的NeuAc和/或含NeuAc的糖质的高效制造方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid。以下称为NeuAc)为存在于人体内的一种氨基糖,已知通常以唾液酸形式局部存在于糖蛋白、糖脂的非还原末端。NeuAc在脑中的神经节苷脂、糖脂中含量较多,暗示了其参与脑的发育、认知功能(非专利文献1)。
作为NeuAc的制造方法,一直以来使用从燕窝、蛋黄等天然资源中提取的方法、聚合物的水解法等,但制法的繁杂性、低收率成为课题(非专利文献2)。
另一方面,作为更高效的NeuAc的制造方法,开发了使用酶的制造方法、使用微生物的基于直接发酵的制造方法(非专利文献2)。
作为使用酶的制造方法,已知例如以丙酮酸和N-乙酰基甘露糖胺(以下称为ManNAc)为底物通过NeuAc缩醛酶的反应来制造NeuAc的方法(非专利文献3和4)、以丙酮酸和N-乙酰基葡糖胺(以下称为GlcNAc)为底物在碱条件下通过NeuAc缩醛酶的反应来制造NeuAc的方法(专利文献1)、以丙酮酸和GlcNAc为底物通过NeuAc缩醛酶和N-乙酰基葡糖胺-2-差向异构酶(以下称为GlcNAc差向异构酶)的反应来制造NeuAc的方法(非专利文献5和6)、以及以磷酸烯醇丙酮酸(以下称为PEP)和ManNAc为底物通过NeuAc合成酶的反应来制造NeuAc的方法(专利文献2和非专利文献7)等。但是,上述使用酶的NeuAc的制造方法中,操作的繁杂性均成为课题。
作为使用微生物的基于直接发酵的制造方法,例如专利文献4公开了如下方法:将来自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的编码UDP-GlcNAc差向异构酶的neuC基因和编码唾液酸合成酶的neuB基因导入大肠杆菌,从GlcNAc起经由ManNAc向NeuAc转化(将该途径称为NeuC途径)。另外,专利文献5公开了如下方法:通过导入来自出芽酵母的编码葡糖胺乙酰转移酶的GNA1基因,由葡糖胺6磷酸生成GlcNAc,进而导入专利文献3公开的来自蓝藻中的集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803的编码N-乙酰基甘露糖胺差向异构酶的slr1975基因和来自红细菌(Rhodobacter)的编码唾液酸合成酶的neuB基因,从而由GlcNAc经由ManNAc生产NeuAc(将该途径称为GNA1途径)。
与NeuC途径不同,GNA1途径不经由UDP-GlcNAc等活化的糖核苷酸,因此认为对生产有利,但现状是,如非专利文献8所示在NeuAc生成效率、制造成本方面存在课题。
大肠杆菌中,作为编码负责从UDP-GlcNAc向UDP-ManNAc的转化的UDP-GlcNAc差向异构酶(WecB)的基因,具有wecB基因(别名yifF基因、nfrC基因或rffE基因)(非专利文献9)。如上所述,表明UDP-GlcNAc差向异构酶为NeuC途径中所必需的酶,但在GNA1途径中,WecB在NeuAc生产中也辅助性地发挥功能(非专利文献8)。
另外,已知WecB用于在大肠杆菌中生物合成肠道杆菌共同抗原(enterobacterialcommon antigen。以下记作ECA)而发挥作用(非专利文献9)。ECA生物合成途径是公知的,已知除了WecB以外,WecA、WecC等也参与其中(非专利文献9和10)。
但是,ECA生物合成途径与NeuAc或含NeuAc的糖质生产的关联性、WecB等参与ECA生物合成的蛋白质缺损时对NeuAc或含NeuAc的糖质生产的影响尚属未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第5665574号说明书
专利文献2:日本特开平10-4961号公报
专利文献3:国际公开第2015/037698号
专利文献4:国际公开第2008/040717号
专利文献5:国际公开第2012/112777号
专利文献6:国际公开第2004/003175号
专利文献7:国际公开第2008/097366号
非专利文献
非专利文献1:Annu.Rev.Nutr.(2009),Vol.29,p.177-222
非专利文献2:Biotechnology Advances(2021),Vol.46,107678
非专利文献3:J.Am.Chem.Soc.(1988),Vol.110,p.6481-6486
非专利文献4:J.Am.Chem.Soc.(1988),Vol.110,p.7159-7163
非专利文献5:Angew.Chem.Int.Ed.Eng.(1991),Vol.30,p.827-828
非专利文献6:Carbohydrate Research(1998),Vol.306,p.575-578非专利文献7:Glycobiology(1997),Vol.7,p.697-701
非专利文献8:Metab.Eng.(2012),Vol.14,p.623-629
非专利文献9:FEMS Microbiol.Rev.(1988),Vol.54,p.195-222
非专利文献10:J Gen Appl Microbiol(2020),Vol.66,p.169-174
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于,提供具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物、以及利用该微生物高效制造NeuAc和/或含NeuAc的糖质的方法。
用于解决问题的方法
本发明人发现,通过使用具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力且ECA生物合成途径被阻断的微生物,与以往相比能够高效地制造NeuAc和/或含NeuAc的糖质,从而完成了本发明。
即,本发明如下所述。
1.一种微生物,其具有N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者的生产能力,并且肠道杆菌共同抗原(enterobacterial common antigen、ECA)生物合成途径被阻断。
2.根据上述1所述的微生物,其缺损了选自下述[1]~[3]中的至少1种蛋白质的活性。
[1]由序列号2所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基葡糖胺-十一碳二烯磷酸酯N-乙酰基葡糖胺磷酸转移酶(WecA)活性的蛋白质
[2]由序列号4所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基葡糖胺2-差向异构酶(WecB)活性的蛋白质
[3]由序列号6所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基甘露糖胺脱氢酶(WecC)活性的蛋白质
3.根据上述1或2所述的微生物,其为大肠杆菌。
4.一种制造N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者的方法,其中,在培养基中培养上述1~3中任一项所述的微生物,生成N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者。
发明效果
本发明的微生物通过在具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物中使ECA生物合成途径被阻断而显示优良的NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力。通过使用本发明的微生物,与以往相比,能够提高NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产量并且减少杂质,能够高效地制造NeuAc和/或含NeuAc的糖质。
具体实施方式
1.本发明的微生物和其制作方法
本发明的微生物是具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力且ECA生物合成途径被阻断、从而使NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产效率得到改善的微生物。
作为本发明的微生物,可列举例如下述(I)和(II)的微生物。
(I)以本来具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物为母株,该母株的ECA生物合成途径被阻断的微生物
(II)以ECA生物合成途径被阻断的微生物为母株,人工赋予或增强了生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的微生物
本发明中,母株是指成为基因改造和转化等的对象的原始株。成为通过基因导入而进行转化的对象的原始株也称为宿主株。
母株可以为任意微生物,优选列举原核生物或酵母菌株,更优选列举属于埃希氏属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属或假单胞菌属等的原核生物、或者属于酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属等的酵母菌株,最优选列举大肠杆菌BL21 codon plus、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制)、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(默克密理博公司制)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18 mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制)、大肠杆菌W、大肠杆菌JM101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ATCC9637、大肠杆菌BW25113、、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354或假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110等原核生物、或者酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或产朊假丝酵母(Candida utilis)等酵母菌株。
1-1.具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物
本说明书中,具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物是指:在培养基中培养该微生物时,具有生物合成NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的微生物。
作为具有NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产能力的微生物,也可以优选使用人工赋予或增强了生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的育种株。
微生物生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质这一点例如可以如下确认:在培养基中培养微生物,使用后述的HPLC或糖分析装置检测培养物中蓄积的NeuAc和/或含NeuAc的糖质。
作为人工赋予或增强生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的方法,可列举例如下述(a)~(d)等公知的方法,这些方法可以单独使用或组合使用。
(a)使参与由糖生成NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生物合成途径的至少一种酶的表达增强的方法
(b)使参与由糖生成NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生物合成途径的至少一个酶基因的拷贝数增加的方法
(c)使控制由糖生成NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生物合成途径的至少一种机制减弱或解除的方法
(d)使至少一条从由糖生成NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生物合成途径分支到该目标物质以外的代谢产物的代谢途径弱化或阻断的方法
另外,为了人工增强生产含NeuAc的糖质的能力,可以增强参与该目标物质以外的代谢产物或来自培养基成分的化合物的同化或分解的至少一种酶的表达。可列举例如下述方法:为了同化来自培养基成分的麦芽糖或异麦芽糖,人工赋予或增强麦芽糖和异麦芽糖摄取相关蛋白质和/或麦芽糖分解相关蛋白质。作为该方法,具体而言,可列举例如国际公开第2009/088049号中记载的方法。
作为麦芽糖和异麦芽糖摄取相关蛋白质,可列举例如来自枯草芽孢杆菌168株的PTS麦芽糖转运体亚基IIBC MalP等公知的蛋白质。作为麦芽糖分解相关蛋白质,可列举例如来自枯草芽孢杆菌168株的麦芽糖-6-磷酸糖苷酶MalA等公知的蛋白质。
另外,为了人工增强生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力,也可以抑制NeuAc的生产所必需的磷酸烯醇丙酮酸的消耗。例如,为了抑制NeuAc的生产所必需的磷酸烯醇丙酮酸的消耗,可以人工赋予或增强至少一种丙酮酸向草酰乙酸转化的相关蛋白质。作为该方法,具体而言,可列举例如Vemuri GN et.al.Biotechnol Bioeng 2005,90:64-76中记载的方法。
作为上述丙酮酸向草酰乙酸转化的相关蛋白质,可列举例如来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032株的丙酮酸羧化酶Pyc等公知的蛋白质。
<人工赋予或增强了生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的微生物1>
人工赋予或增强了生产NeuAc的能力的微生物中,作为通过上述(a)或(b)的方法得到的微生物,具体而言,可列举例如人工赋予或增强了生产选自下述[1]~[3]中的至少1种蛋白质的能力的微生物。
[1]NeuAc合酶
[2]GlcNAc差向异构酶
[3]N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶
人工赋予或增强了生产含NeuAc的糖质的能力的微生物中,作为通过上述(a)或(b)的方法得到的微生物,具体而言,可列举例如人工赋予或增强了生产选自下述[1]~[5]中的至少1种蛋白质的能力的微生物。
[1]NeuAc合酶
[2]GlcNAc差向异构酶
[3]N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶
[4]CMP-NeuAc合酶
[5]唾液酸转移酶
生产上述蛋白质的微生物例如可以如下制作:将编码上述蛋白质的DNA片段插入到合适的表达载体的启动子下游,将所得重组体DNA导入到母株中而制作。重组体DNA为可整合于母株的染色体DNA的DNA时,也可以不含启动子。
使用细菌等原核生物作为母株时,重组体DNA优选为由启动子、核糖体结合序列、含有目标基因的DNA和转录终止序列构成的重组体DNA。也可以含有控制启动子的基因。
优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调整为合适距离(例如6~18个碱基)的质粒。该重组体DNA中,转录终止序列对于该DNA的表达而言并非必需,但是也优选在结构基因的紧下游配置转录终止序列。
作为表达载体,只要是用于将目标DNA导入到宿主中并进行增殖、表达的适当的核酸分子则没有特别限定,不仅可使用质粒,还可使用例如人工染色体、使用转座子的载体、柯斯质粒。
使用属于埃希氏菌属的微生物作为母株时,作为表达载体,可列举例如pColdI、pSTV28、pSTV29、pUC118(均为宝生物公司制)、pMW119(ニッポンジーン公司制)、pET21a、pCOLADuet-1、pCDFDuet-1、pCDF-1b、pRSF-1b(均为默克密理博公司制)、pMAL-c5x(ニューイングランドバイオラブス公司制)、pGEX-4T-1、pTrc99A(均GE医疗生命科学公司制)、pTrcHis、pSE280(均为赛默飞世尔科技公司制)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制)、pQE-30、pQE80L(均为凯杰公司制)、pET-3、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(均为安捷伦科技公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,82,4306(1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)(ストラタジーン公司制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,2007,Vol.73,No.20,p6378-6385]、pPAC31(国际公开第98/12343号)、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)、pKD46[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,97,6640-6645(2000)]等。
作为使用上述表达载体时的启动子,只要在属于埃希氏菌属的微生物的细胞中起作用则可以为任意启动子,可以使用例如trp启动子、ilv启动子等参与氨基酸生物合成的基因的启动子、uspA启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外,也可以使用将2个trp启动子串联而成的启动子、tac启动子、trc启动子、lacT7启动子、letI启动子之类人为进行了设计改造的启动子。
使用棒杆菌型细菌作为母株时,作为表达载体,可列举就例如pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4(日本特开昭57-183799号公报)、pCG11(日本特开昭57-134500号公报)、pCG116、pCE54、pCB101(均参见日本特开昭58-105999号公报)、pCE51、pCE52、pCE53[均参见Molecular and General Genetics,196,175(1984)]等。
作为使用上述表达载体时的启动子,只要在棒杆菌型细菌的细胞内起作用则可以为任意启动子,可列举例如P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,p674-679(2000)]。
使用酵母菌株作为母株时,作为表达载体,可列举例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为使用上述表达载体时的启动子,只要在酵母菌株的细胞中发挥作用则可以为任意启动子,可列举例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
在此,还可以通过以成为最适合在母株中表达的密码子的方式对该DNA的碱基序列的碱基进行置换,来提高该DNA所编码的蛋白质的表达量。本发明的制造方法中使用的母株的密码子使用频率信息可以通过公共数据库获得。
作为以能够在宿主株中自主复制的质粒形式导入重组体DNA的方法,可列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.,16,6127(1988)]等方法。
作为使重组体DNA整合到母株的染色体中的方法,可列举例如同源重组法。作为同源重组法,可列举例如使用同源重组用质粒的方法,所述同源重组用质粒可以通过与在想要导入的宿主细胞内不能自主复制的具有抗药基因的质粒DNA连接而制作。另外,作为利用大肠杆菌中频繁使用的同源重组的方法,可列举例如利用λ噬菌体的同源重组系统导入重组DNA的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)]。
进而,使用利用了通过与重组DNA一起整合到染色体上的枯草杆菌果聚糖蔗糖酶使大肠杆菌变成蔗糖敏感性这一点的选择法、利用了通过在具有链霉素抗性的突变rpsL基因的大肠杆菌中整合野生型rpsL基因而使大肠杆菌变成链霉素敏感性这一点的选择法[Mol.Microbiol.,55,137(2005)、Biosci.Biotechnol.Biochem.,71,2905(2007)]等,可以获得母株的染色体DNA上的目标区域被置换为重组DNA的微生物。在此,作为引起导入的染色体区域,没有特别限制,优选为非必需基因区域或非必需基因区域上游的非基因区域。
编码选自由上述[1]NeuAc合酶、[2]GlcNAc差向异构酶、[3]N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶、[4]CMP-NeuAc合酶和[5]唾液酸转移酶组成的组中的蛋白质的DNA可以以任意的组合分别存在于1~4种、优选1~3种、更优选1或2种、最优选1种重组体DNA中。
<<[1]NeuAc合酶>>
NeuAc合酶是指具有NeuAc合酶活性的蛋白质。NeuAc合酶活性是指以ManNAc和PEP为底物生成NeuAc的活性。
作为NeuAc合酶,只要具有NeuAc合酶活性则没有特别限定,可列举例如空肠弯曲菌ATCC 43438株的NeuAc合酶CjneuB、国际公开第2015/037698号中记载的蛋白质。
成为对象的蛋白质具有NeuAc合酶活性这一点可以如下确认:制作具有编码该蛋白质的DNA的重组体DNA,用该重组体DNA转化不具有NeuAc合酶活性的微生物、例如大肠杆菌W3110株并对所得到的微生物进行培养,由得到的培养物制备含有该蛋白质的细胞提取液,使该级分与作为底物的ManNAc和PEP接触,对于作为结果生成的NeuAc,利用高效液相色谱或气相色谱进行检测,由此进行确认。
作为生产NeuAc合酶的微生物,可列举用含有编码NeuAc合酶的DNA的重组体DNA转化母株而得到的、与该母株相比NeuAc合酶活性得到增强的微生物。
作为编码NeuAc合酶的DNA,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、特别优选来自原核生物、最优选来自空肠弯曲菌ATCC 43438株的编码CjneuB的DNA(序列号7)。
与母株相比NeuAc合酶活性得到增强的微生物是指:通过将该重组体DNA以能够在母株中自主复制的质粒形式导入或使其整合到母株的染色体中,从而该DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的生产量增大的微生物。
作为确认上述DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的生产量增大的方法,例如可以通过利用Northern印迹与母株比较该DNA的转录量、或通过蛋白质印迹与母株比较该蛋白质的生产量来进行确认。
<<[2]GlcNAc差向异构酶>>
GlcNAc差向异构酶是指具有GlcNAc差向异构酶活性的蛋白质。GlcNAc差向异构酶活性是指以GlcNAc为底物通过差向异构化反应生成ManNAc的活性。
作为生产GlcNAc差向异构酶的微生物,可列举例如属于集胞藻属(Synechocystis)的微生物、或用具有编码GlcNAc差向异构酶的DNA的重组体DNA转化母株而得到的、与该母株相比GlcNAc差向异构酶活性得到增强的微生物。
作为属于集胞藻属(Synechocystis)的微生物,优选列举集胞藻PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria,INSTITUTE PASTEUR)。
作为编码GlcNAc差向异构酶的DNA,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、特别优选来自原核生物、最优选来自集胞藻PCC6803株的编码GlcNAc差向异构酶的DNA(序列号8)。
例如,来自集胞藻PCC6803株的编码GlcNAc差向异构酶的DNA可以通过国际公开第00/47730号中记载的方法获得。
通过用具有编码GlcNAc差向异构酶的DNA的重组体DNA转化母株,从而可以制作与该母株相比GlcNAc差向异构酶活性得到增强的微生物。该微生物为与母株相比GlcNAc差向异构酶活性得到增强的微生物这一点可以通过利用上述方法与母株比较编码GlcNAc差向异构酶的DNA的转录量、该蛋白质的生产量来确认。作为这样的微生物,可列举例如W3110/pRcneuB2。
<<[3]N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶>>
N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶是指具有N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶活性的蛋白质。N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶活性是指由乙酰基CoA和D-葡糖胺6-磷酸生成N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸的活性。
作为生产N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的微生物,可列举例如属于酵母属(Saccharomyces)的微生物、或用具有编码N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的DNA的重组体DNA转化母株而得到的、与母株相比N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶活性得到增强的微生物。
作为属于酵母属(Saccharomyces)的微生物,优选列举酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C株。
编码N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、特别优选来自酵母、最优选来自酿酒酵母S288C株的编码N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的DNA(序列号9)。
通过用具有编码N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的DNA的重组体DNA转化母株,由此可以制作与该母株相比N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶活性得到增强的微生物。该微生物为与母株相比N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶活性得到增强的微生物这一点可以通过与母株比较编码N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的DNA的转录量、该蛋白质的生产量来进行确认。
<<[4]CMP-NeuAc合酶>>
CMP-NeuAc合酶是指具有CMP-NeuAc合酶活性的蛋白质。CMP-NeuAc合酶活性是指以CTP和NeuAc为底物生成CMP-NeuAc的活性。
作为生产CMP-NeuAc合酶的微生物,可列举例如属于巴氏杆菌属(Pasteurella)的微生物、或用具有编码CMP-NeuAc合酶的DNA的重组体DNA转化母株而得到的、与母株相比CMP-NeuAc合酶活性得到增强的微生物。
作为属于巴氏杆菌属(Pasteurella)的微生物,优选列举多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PM70株。
编码CMP-NeuAc合酶的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、特别优选来自原核生物、最优选来自多杀性巴氏杆菌PM70株的编码CMP-NeuAc合酶的DNA(日本特开2008-5794号公报)。
例如,来自多杀性巴氏杆菌PM70株的编码CMP-NeuAc合酶的DNA可以通过日本特开2008-5794号公报中记载的方法来获得。
通过用具有编码CMP-NeuAc合酶的DNA的重组体DNA转化母株,可以制作与该母株相比CMP-NeuAc合酶活性得到增强的微生物。该微生物为与母株相比CMP-NeuAc合酶活性得到增强的微生物这一点可以通过与母株比较编码CMP-NeuAc合酶的DNA的转录量、该蛋白质的生产量来进行确认。作为这样的微生物,可列举例如大肠杆菌N18-14/pMnK1(日本特开2008-5794号公报)。
<<[5]唾液酸转移酶>>
唾液酸转移酶是指具有唾液酸转移酶活性的蛋白质。唾液酸转移酶活性是指以CMP-NeuAc和受体糖质为底物生成含NeuAc的糖质的活性。
作为成为唾液酸转移酶的底物的受体糖质,可列举例如寡糖、多糖、以及糖蛋白和糖脂等复合糖质。作为成为唾液酸转移酶的底物的寡糖或多糖,可列举在非还原末端具有半乳糖的寡糖或多糖、或在非还原末端具有NeuAc的寡糖或多糖。
上述寡糖或多糖中,优选列举在非还原末端具有选自由乳糖、红细胞三糖、N-乙酰基乳糖胺、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、路易斯a和路易斯X组成的组中的结构的寡糖或在非还原末端具有选自由NeuAcα2-Galβ1-4Glc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc组成的组中的结构的寡糖,更优选列举乳糖。
作为成为唾液酸转移酶的底物的复合糖质,可列举例如上述寡糖和多糖上结合有蛋白质或脂质等的复合糖质。
作为含NeuAc的糖质,可列举例如上述受体糖质上附加有NeuAc的糖质,优选列举含有在非还原末端具有选自由NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc和NeuAcα2-8NeuAc组成的组中的结构的寡糖的糖质,更优选列举3’-唾液酸乳糖(3’SL)、6’-唾液酸乳糖(6’SL)、唾液酸乳-N-四糖a(LST-a)、唾液酸乳-N-四糖b(LST-b)、唾液酸乳-N-四糖c(LST-c)或二唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)。
作为唾液酸转移酶,具体而言,可列举以CMP-NeuAc和乳糖为底物生成3’-唾液酸乳糖的α2,3-唾液酸转移酶、以CMP-NeuAc和乳糖为底物生成6’-唾液酸乳糖的α2,6-唾液酸转移酶等公知的酶。
作为生产唾液酸转移酶的微生物,可列举例如属于巴氏杆菌属(Pasteurella)的微生物、属于发光杆菌属(Photobacterium)的微生物、或用具有编码唾液酸转移酶的DNA的重组体DNA转化母株而得到的、与母株相比唾液酸转移酶活性得到增强的微生物。
作为属于巴氏杆菌属(Pasteurella)的微生物,优选列举多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PM70株。作为属于发光杆菌属(Photobacterium)的微生物,优选列举美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)JT0160株。
作为编码唾液酸转移酶的DNA,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、特别优选来自原核生物、最优选来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PM70株的编码α-2,3-唾液酸转移酶的DNA(国际公开第03/27297号)、或来自美人鱼发光杆菌JT0160株的编码α-2,6-唾液酸转移酶(GenBank ACCESSION No.BAA25316)的DNA等。
例如,来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PM70株的编码α-2,3-唾液酸转移酶的DNA和来自美人鱼发光杆菌JT0160株的编码α-2,6-唾液酸转移酶的DNA可以通过国际公开第03/27297号中记载的方法获得。
通过用具有编码唾液酸转移酶的DNA的重组体DNA转化母株,可以制作与该母株相比唾液酸转移酶活性得到增强的微生物。
通过上述方法制作的微生物为与母株相比唾液酸转移酶活性得到增强的微生物这一点,可以通过与母株比较编码具有唾液酸转移酶活性的蛋白质的DNA的转录量、该蛋白质的生产量来进行确认。作为这样的微生物,可列举例如大肠杆菌NM522/pYP3(日本特开2008-5794号公报)。
<人工赋予或增强了生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的微生物2>
人工赋予或增强了生产NeuAc和/或含NeuAc的糖质的能力的微生物中,作为通过上述(c)或(d)的方法得到的微生物,具体而言,可优选列举例如负调控编码NeuAc生物合成相关酶的基因的活性的转录因子缺损的微生物、NeuAc分解活性下降的微生物。
<<负调控编码NeuAc生物合成相关酶的基因的活性的转录因子缺损的微生物>>
作为负调控编码NeuAc生物合成相关酶的基因的活性的转录因子,可列举例如yhbJ、fruR和cra。从对NeuAc生产的特异性的观点出发,这些中优选yhbJ。
yhbJ为负调控编码与NeuAc生物合成相关的L-谷氨酰胺-D-果糖6磷酸氨基转移酶的glmS基因的活性的转录控制因子。
作为使负调控编码NeuAc生物合成相关酶的基因的活性的转录因子的功能缺损的基因改造,可列举通过对宿主的基因组DNA中的、编码与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分的DNA施加改造而使该DNA所编码的蛋白质的功能降低或完全停止。
上述对DNA施加的改造的方式只要是使编码与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分的DNA所编码的蛋白质的功能降低或完全停止的方式,则没有特别限定,可以适当使用公知的方法。
作为使与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分所编码的蛋白质的功能降低或完全停止的方式,可列举例如选自下述(i)~(iii)中的任意一种改造。
(i)将编码与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分的DNA的全部或一部分除去。
(ii)对编码与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分的DNA进行1或多个置换、缺失或添加。
(iii)将编码与要使其功能缺损的蛋白质相当的部分的DNA置换为与改造前的DNA序列的一致性小于80%的DNA序列。
要使其功能缺损的蛋白质为yhbJ时,作为yhbJ的功能的缺损,可列举例如与非改造株相比yhbJ的活性为优选20%以下、更优选10%以下、进一步优选5%以下。
yhbJ的活性可以通过用蛋白质印迹法等调查GlmS的表达量来进行确认[KalamorzF.et al.,Mol Microbiol.65(6):1518-33(2007)]。
<<NeuAc的分解活性下降的微生物>>
作为NeuAc的分解活性下降的微生物,可列举例如NeuAc裂解酶活性下降的微生物。作为NeuAc裂解酶活性下降的微生物,可列举例如大肠杆菌NAN8-71(FERM BP-7908、国际公开第03/72783号)。
1-2.肠道杆菌共同抗原(ECA)生物合成途径被阻断的微生物
本发明的微生物为具有N-乙酰神经氨酸或含N-乙酰神经氨酸的糖质的生产能力且ECA生物合成途径被阻断的微生物。作为阻断ECA生物合成途径的方法,可列举例如使参与ECA生物合成途径的蛋白质的活性缺损的方法。
作为使参与ECA生物合成途径的蛋白质的活性缺损的方法,与<<负调控编码NeuAc生物合成相关酶的基因的活性的转录因子缺损的微生物>>这一项中所述的方法同样地,可列举例如使特定蛋白质的功能缺损的方法。具体而言,可列举例如:利用PCR敲除特定基因的方法[Baba T.et al.,Mol systems Biol(2006)];利用λ噬菌体的同源重组系统的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)];通过RNAi抑制特定基因的表达的方法;使用亚硝基胍、紫外线等诱变剂向特定基因和其启动子区域导入突变的方法。
作为参与ECA生物合成途径的蛋白质,可列举例如WecA、WecB、WecC、WecD、WecE、WecF和WecG。
WecA是指具有参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基葡糖胺-十一碳二烯磷酸酯N-乙酰基葡糖胺磷酸转移酶(UDP-N-アセチルグルコサミン-ウンデカプレニルリン酸N-アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ)活性的蛋白质。
作为WecA,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecA(序列号2)。
编码WecA的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecA的DNA(序列号1)。
WecB是指具有参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基葡糖胺2-差向异构酶活性的蛋白质。作为WecB,可列举优选来自来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecB(序列号4)。
编码WecB的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecB的DNA(序列号3)。
WecC是指具有参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基甘露糖胺脱氢酶活性的蛋白质。作为WecC,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecC(序列号6)。
编码WecC的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecC的DNA(序列号5)。
WecD是指具有参与ECA生物合成的dTDP-4-氨基-4,6-二脱氧-D-半乳糖酰基转移酶活性的蛋白质。作为WecD,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecD(序列号52)。
编码WecD的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecD的DNA(序列号51)。
WecE是指具有参与ECA生物合成的dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖转氨酶活性的蛋白质。作为WecE,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecE(序列号54)。
编码WecE的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecE的DNA(序列号53)。
WecF是指具有参与ECA生物合成的dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺:Lipid II N-乙酰基岩藻糖胺基转移酶活性的蛋白质。作为WecF,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecF(序列号56)。
编码WecF的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecF的DNA(序列号55)。
WecG是指具有参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基-D-甘露糖胺醛酸酯转移酶(UDP-N-アセチル-D-マンノサミノウロナートトランスフェラーゼ)活性的蛋白质。作为WecG,可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的WecG(序列号58)。
编码WecG的DNA可列举优选来自细菌等原核生物或酵母、更优选来自原核生物、特别优选来自大肠杆菌、最优选来自大肠杆菌BW25113株的编码WecG的DNA(序列号57)。
作为ECA生物合成途径被阻断的微生物,具体而言,优选为缺损了选自下述[1]~[3]中的至少1种蛋白质的活性的微生物。
[1]由序列号2所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有WecA活性的蛋白质
[2]由序列号4所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有WecB活性的蛋白质
[3]由序列号6所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有WecC活性的蛋白质
碱基序列或氨基酸序列的一致性使用基于Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Nat.Acad.Sci.USA,90,5873,1993)、FASTA(Methods Enzymol.,183,63,1990)来确定。基于该算法BLAST,开发了被称为BLASTN、BLASTX的程序(J.Mol.Biol.,215,403,1990)。在基于BLAST使用BLASTN对碱基序列进行分析的情况下,参数例如设定为Score=100、wordlength=12。另外,在基于BLAST使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下,参数例如设定为score=50、wordlength=3。在使用BLAST和Gap ped BLAST程序的情况下,使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。
成为对象的氨基酸序列(序列号2、4或6所示的氨基酸序列)与其同源序列的一致性优选为80%以上,更优选为90%以上,进一步优选为95%以上,特别优选为98%以上,最优选为99%以上。
作为获得由同源序列构成的蛋白质(以下也称为同源蛋白)的方法,没有特别限制,可以使用公知的方法。具体而言,可列举例如下述方法。首先,对于各种基因序列数据库,检索与编码成为对象的氨基酸序列的碱基序列具有优选80%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选99%以上的一致性的碱基序列。接着,可以使用可基于通过该检索得到的碱基序列或氨基酸序列设计的探针DNA或引物DNA以及具有该DNA的微生物,使用可基于该DNA的碱基序列设计的探针,通过针对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌(Escherichia coli)、进一步优选大肠杆菌BW25113株的染色体DNA文库的Southern杂交来获得,或者使用可基于编码成为对象的蛋白质的DNA设计的引物DNA且以微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌(Escherichia coli)、进一步优选大肠杆菌BW25113株的染色体DNA为模板通过PCR[PCR Protocols,Academic press(1990)]来获得。
同源序列可以为人为地使成为基础的氨基酸序列中的氨基酸残基发生缺失或进行置换、或者人为地在该氨基酸序列中插入或添加氨基酸残基而得到的氨基酸序列。同源蛋白中,缺失、置换、插入或添加氨基酸可以在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加1~20个氨基酸。
氨基酸序列的比对例如可以使用公知的比对程序ClustalW[Nucelic AcidsResearch 22,4673(1994)]来制作。使用ClustalW制作比对时的参数例如可以使用默认值。
向成为对象的氨基酸序列中置换、插入或添加氨基酸时,置换、插入或添加的氨基酸残基为天然型或非天然型均可。作为天然型氨基酸,可列举L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下,示出可以相互置换的氨基酸的例子。同一组中所含的氨基酸可以相互置换。
A组:亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组:天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组:天冬酰胺、谷氨酰胺
D组:赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组:脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组:丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组:苯丙氨酸、酪氨酸
参与ECA生物合成途径的蛋白质的活性例如可以通过利用Northern印迹法、蛋白质印迹法等调查ECA基因的表达量来进行确认。具体而言,例如,可以通过下述所示的方法对同源蛋白的WecA活性、WecB活性或WecC活性进行确认。
由序列号2所示的氨基酸序列的同源序列构成的同源蛋白具有WecA活性这一点例如可以通过下述方法来进行确认。首先,制作具有编码想要确认该活性的蛋白质的DNA的重组体DNA。然后,利用该重组体DNA转化不具有WecA活性的微生物、例如后述的大肠杆菌BW25113ΔyhbJΔwecA株,对得到的微生物进行培养,由得到的培养物制备含有该同源蛋白的细胞提取液。使含有该同源蛋白的细胞提取液与含有作为底物的十一碳二烯基-1磷酸酯(ウンデカプレニル-1リン酸)和UDP-N-乙酰基葡糖胺的水溶液接触,在该水溶液中生成Lipid I。最后,使用后述的分析装置SPD-20A(岛津制作所制)检测反应液中的Lipid I,由此可以确认同源蛋白具有WecA活性。
由序列号4所示的氨基酸序列的同源序列构成的同源蛋白具有WecB活性这一点例如可以通过下述方法来进行确认。首先,制作具有编码想要确认该活性的蛋白质的DNA的重组体DNA。然后,利用该重组体DNA转化不具有WecB活性的微生物、例如后述的大肠杆菌BW25113ΔyhbJΔwecB株,对得到的微生物进行培养,由得到的培养物制备含有该同源蛋白的细胞提取液。使含有该同源蛋白的细胞提取液与含有作为底物的UDP-N-乙酰基葡糖胺的水溶液接触,在该水溶液中生成UDP-N-乙酰基甘露糖胺。最后,使用后述的分析装置SPD-20A(岛津制作所制)检测反应液中的UDP-N-乙酰基甘露糖胺,由此可以确认同源蛋白具有WecB活性。
由序列号6所示的氨基酸序列的同源序列构成的同源蛋白具有WecC活性这一点例如可以通过下述方法来进行确认。首先,制作具有编码想要确认该活性的蛋白质的DNA的重组体DNA。然后,利用该重组体DNA转化不具有WecC活性的微生物、例如后述的大肠杆菌BW25113ΔyhbJΔwecC株,对得到的微生物进行培养,由得到的培养物制备含有该同源蛋白的细胞提取液。使含有该同源蛋白的细胞提取液与含有作为底物的UDP-N-乙酰基甘露糖胺的水溶液接触,在该水溶液中生成UDP-ManNAcA。最后,使用后述的分析装置SPD-20A(岛津制作所制)检测反应液中的UDP-N-乙酰基-D-甘露糖胺醛酸酯,由此可以确认同源蛋白具有WecC活性。
编码由序列号2、4或6所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA例如可以如下获得:使用可基于编码序列号2、4或6所示的氨基酸序列的DNA的碱基序列设计的探针,通过针对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌、进一步优选大肠杆菌BW25113株的染色体DNA文库的Southern杂交来获得;或者,使用可以基于编码序列号2、4或6所示的氨基酸序列的DNA设计的引物DNA并且以微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌、进一步优选大肠杆菌BW25113株的染色体DNA为模板通过PCR[PCR Protocols,Academic press(1990)]来获得。
作为编码序列号2所示的氨基酸序列的DNA,具体而言,可列举具有序列号1所示的碱基序列的DNA。作为编码序列号4所示的氨基酸序列的DNA,具体而言,可列举具有序列号3所示的碱基序列的DNA。作为编码序列号6所示的氨基酸序列的DNA,具体而言,可列举具有序列号5所示的碱基序列的DNA。
通过上述方法得到的微生物中参与ECA生物合成途径的蛋白质的活性缺损这一点例如可以通过利用Northern印迹法、蛋白质印迹法等调查编码上述参与ECA生物合成途径的蛋白质的基因的表达量来进行确认。
通过上述方法制作的微生物与母株相比NeuAc和/或含NeuAc的糖质生产效率得到改善这一点例如可以通过以下方法进行确认。首先,分别在培养基中培养母株和所制作的微生物。接着,使用后述的HPLC或糖分析装置检测培养物中蓄积的NeuAc和/或含NeuAc的糖质,对母株与所制作的微生物的生产量进行比较,从而可以确认与母株相比NeuAc和/或含NeuAc的糖质的生产效率得到改善。
2.使用微生物的NeuAc和/或含NeuAc的糖质的制造方法
本发明的NeuAc和/或含NeuAc的糖质的制造方法的特征在于,在上述培养基中培养微生物,在培养物中生成NeuAc和/或含NeuAc的糖质。
培养微生物的方法可以按照用于微生物培养的常规方法来进行。
作为培养微生物的培养基,只要是含有该微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等且能够高效地进行该转化体的培养的培养基,则可以使用天然培养基和合成培养基中的任一种。
作为碳源,只要是该微生物可同化的碳源即可,可列举例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、醋酸或丙酸等有机酸或者甘油、乙醇或丙醇等醇类等。
作为氮源,可列举例如氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵或磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐,可列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常优选在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度通常为15~40℃,培养时间通常为5小时~7天。培养中的培养液pH通常保持在3.0~9.0。pH的调节可以使用无机或有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
另外,培养中可以根据需要向培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。在培养利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化的微生物时,可以根据需要向培养基中添加诱导剂。例如,在培养利用使用lac启动子的表达载体转化的微生物时,可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等,在培养利用使用trp启动子的表达载体转化的微生物时,可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
制造含NeuAc的糖质时,优选使培养基含有乳糖等受体糖质。受体糖质可以在培养最初添加,也可以在培养过程中根据需要添加。添加的受体糖质在培养基中的浓度优选设为10~300g/l。
另外,制造含NeuAc的糖质时使用的微生物不具有生成乳糖等受体糖质的能力的情况下,培养中,代替向培养基中添加乳糖等受体糖质,可以与本发明的微生物同时培养具有由糖生成乳糖等受体糖质的能力的微生物而向本发明的转化体供给乳糖等受体糖质。
通过上述培养,在培养物中生成、蓄积NeuAc或含NeuAc的糖质,通过从该培养物中采集NeuAc或含NeuAc的糖质,从而可以制造NeuAc或含NeuAc的糖质。
从上述培养物中采集NeuAc或含NeuAc的糖质的操作通常可以通过将活性炭、离子交换树脂法、沉淀法之类的公知方法组合来实施。需要说明的是,在菌体内蓄积NeuAc或含NeuAc的糖质时,例如可以将菌体用超声波等破碎,通过离心分离除去菌体,从得到的上清中利用离子交换树脂法等采集NeuAc或含NeuAc的糖质。
NeuAc或含NeuAc的糖质可以使用Dionex公司制造的糖分析装置、岛津制作所制造的双波长吸光度检测器等来进行定量[Anal.Biochem.,189,151(1990)]。
实施例
[分析例]
在实施例中,NeuAc的分析、定量按照以下所示的步骤来进行。对含有培养后的微生物的培养液进行离心分离,回收上清。利用分析装置SPD-20A(岛津制作所制)对该上清中所含的NeuAc进行分析。
[分析条件]
柱:Shodex RSpak KC-811
柱温:40℃
洗脱液组成:1%磷酸水溶液
流速:0.5ml/分钟
检测器:SPD-20A
[实施例1]NeuAc的制造中使用的微生物的制作
(1)NeuAc生产用质粒的制作
按照以下步骤制作表达空肠弯曲菌ATCC 43438株的NeuAc合成酶基因CjneuB(序列号7)、来自集胞藻PCC 6803株的N-GluNAc 2-差向异构酶基因slr1975(序列号8)和酿酒酵母S288C株的N-乙酰基葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶基因GNA1(序列号9)的质粒。
利用周知的培养方法培养空肠弯曲菌ATCC 43438株、集胞藻PCC 6803株或酿酒酵母S288C株,分离纯化各微生物的染色体DNA。使用所制备的DNA,以由表1的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA为引物组,以表1的“模板”所记载的DNA为模板,进行PCR,得到各扩增DNA片段。
[表1]
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将上述所得到的CjneuB片段、slr1975片段和GNA1片段以等摩尔的比率混合,将其作为模板,以由序列号10和15所示的碱基序列构成的DNA为引物组,实施PCR,得到CjneuB片段、slr1975片段和GNA1片段连接而成的约2.7kb的DNA片段(以下称为CjneuB-slr1975-GNA1片段)。
将CjneuB-slr1975-GNA1片段和表达载体pTrc99a(GE医疗生命科学公司制)用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制)连接,由此得到表达质粒pTrc99a-CjneuB-slr1975-GNA1(以下称为pCSG1)。
(2)NeuAc生产用宿主的制作
<缺损了yhbJ基因的大肠杆菌>
按照以下步骤制作破坏了负调控编码与NeuAc生物合成相关的L-谷氨酰胺-D-果糖6磷酸氨基转移酶的glmS基因的活性的转录控制因子yhbJ基因(序列号16)的大肠杆菌。
使用BW25113株(Keio collection(Systematic single-gene knock-outmutants of E.coli K-12))作为宿主,通过与Baba等[Baba T.et al.(2006)Mol systemsBiol]相同的方法得到yhbJ基因完全缺失的株BW25113ΔyhbJ株。
<基因缺损时作为标志物使用的DNA片段的获得>
以由表2的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA为引物组,以表2的“模板”所记载的DNA为模板,进行PCR,得到各扩增DNA片段。
[表2]
引物组(序列号) | 模板 | 扩增DNA片段 |
17和18 | pHSG396(宝生物公司制造) | cat |
19和20 | 枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA | sacB |
通过常规方法制备枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA。扩增DNA片段的cat含有pHSG396上的cat(氯霉素乙酰基转移酶)基因的上游约200bp至下游约50bp。扩增DNA片段的sacB含有枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA上的sacB(果聚糖蔗糖酶)基因的上游约300bp至下游约100bp。
然后,将扩增DNA片段的cat和sacB以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号17和20所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到含有cat基因和sacB基因的DNA片段(以下称为cat-sacB)。
<缺损了wecA基因的大肠杆菌>
以上述所制作的BW25113ΔyhbJ株为母株,按照以下步骤制作破坏了编码参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基葡糖胺-十一碳二烯磷酸酯N-乙酰基葡糖胺磷酸转移酶的wecA基因(序列号1)的大肠杆菌。
以按照常规方法制备的BW25113株的染色体DNA为模板,使用由表3的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到各扩增DNA片段。
[表3]
wecA上游1和wecA上游2含有wecA基因的起始密码子至其上游约1500bp。wecA下游1和wecA下游2含有wecA基因的终止密码子至其下游约1300bp。
将wecA上游1、wecA下游1和cat-sacB片段以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号29和30所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由在wecA基因周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA片段(以下称为wecA::cat-sacB)。
将wecA上游2和wecA下游2以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号29和30所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由不含wecA、wecA上游与wecA下游直接连接而成的序列构成的DNA片段(以下称为ΔwecA)。
利用电穿孔法将wecA::cat-sacB片段导入到保有含有编码λ重组酶的基因的质粒pKD46[Datsenko,K.A.,Warner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.97,6640-6645(2000)]的BW25113ΔyhbJ株中,得到显示氯霉素抗性且显示蔗糖敏感性的转化体(wecA基因被置换为wecA::cat-sacB的转化体)。
利用电穿孔法将ΔwecA片段导入到该转化体中,得到显示氯霉素敏感性和蔗糖抗性的转化体(wecA::cat-sacB被置换为ΔwecA的转化体)。将该转化体命名为BW25113ΔyhbJΔwecA株。
<缺损了wecB基因的大肠杆菌>
以BW25113ΔyhbJ株为母株,按照以下步骤制作破坏了编码参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基葡糖胺-2-差向异构酶的wecB基因(序列号3)的大肠杆菌。
以按照常规方法制备的BW25113株的染色体DNA为模板,使用由表4的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到各扩增DNA片段。
[表4]
wecB上游1和wecB上游2含有wecB基因的起始密码子至其上游约1400bp。wecB下游1和wecB下游2含有wecB基因的终止密码子至其下游约1400bp。
将wecB上游1、wecB下游1、和cat-sacB片段以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号39和40所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由在wecB基因周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA片段(以下称为wecB::cat-sacB)。
将wecB上游2和wecB下游2以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号39和40所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由不含wecB、wecB上游与wecB下游直接连接而成的序列构成的DNA片段(以下称为ΔwecB)。
利用电穿孔法将wecB::cat-sacB片段导入到保有含有编码λ重组酶的基因的质粒pKD46的BW25113ΔyhbJ株中,得到显示氯霉素抗性且显示蔗糖敏感性的转化体(wecB基因被置换为wecB::cat-sacB的转化体)。
利用电穿孔法将ΔwecB片段导入到该转化体中,得到显示氯霉素敏感性且显示蔗糖抗性的转化体(wecB::cat-sacB被置换为ΔwecB的转化体)。将该转化体命名为BW25113ΔyhbJΔwecB株。
<缺损了wecC基因的大肠杆菌>
以BW25113ΔyhbJ株为母株,按照以下步骤制作破坏了编码参与ECA生物合成的UDP-N-乙酰基甘露糖胺脱氢酶的wecC基因(序列号5)的大肠杆菌。
以按照常规方法制备的BW25113株的染色体DNA为模板,使用由表5的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到各扩增DNA片段。
[表5]
wecC上游1和wecC上游2含有wecC基因的起始密码子至其上游约1400bp。wecC下游1和wecC下游2含有wecC基因的终止密码子至其下游约1400bp。
将wecC上游1、wecC下游1、和cat-sacB片段以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号49和50所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由在wecC基因周边区域的序列中插入了cat-sacB片段的序列构成的DNA片段(以下称为wecC::cat-sacB)。
将wecC上游2和wecC下游2以等摩尔的比率混合,将其作为模板,使用由序列号49和50所示的碱基序列构成的DNA作为引物组,进行PCR,得到由不含wecC、wecC上游与wecC下游直接连接而成的序列构成的DNA片段(以下称为ΔwecC)。
利用电穿孔法将wecC::cat-sacB片段导入到保有含有编码λ重组酶的基因的质粒pKD46的BW25113ΔyhbJ株中,得到显示氯霉素抗性且显示蔗糖敏感性的转化体(wecC基因被置换为wecC::cat-sacB的转化体)。
利用电穿孔法将ΔwecC片段导入到该转化体中,得到显示氯霉素敏感性且显示蔗糖抗性的转化体(wecC::cat-sacB被置换为ΔwecC的转化体)。将该转化体命名为BW25113ΔyhbJΔwecC株。
(3)具有NeuAc生产用质粒的微生物的制作
将上述(1)中得到的质粒pCSG1分别转化到上述(2)中制作的BW25113ΔyhbJ株、BW25113ΔyhbJΔwecA株、BW25113ΔyhbJΔwecB株和BW25113ΔyhbJΔwecC株中。转化时,按照常规方法用含有氨苄青霉素钠100mg/L的LB琼脂培养基进行筛选。将通过转化而获得的株分别命名为BW25113ΔyhbJ/pCSG1株、BW25113ΔyhbJΔwecA/pCSG1株、BW25113ΔyhbJΔwecB/pCSG1株和BW25113ΔyhbJΔwecC/pCSG1株。
[实施例2]利用发酵法的NeuAc的制造
将实施例1中得到的BW25113ΔyhbJ/pCSG1株、BW25113ΔyhbJΔwecA/pCSG1株、BW25113ΔyhbJΔwecB/pCSG1株和BW25113ΔyhbJΔwecC/pCSG1株在含有氨苄青霉素100mg/L的LB平板上在30℃下培养过夜,接种到装有5ml含有氨苄青霉素100mg/L的LB培养基的粗试管中,在30℃下培养16小时。
此后,将该培养液0.3ml接种到装有3ml含有氨苄青霉素100mg/L的生产培养基[葡萄糖30g/L、硫酸镁七水合物2.0g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵2.0g/L、柠檬酸一水合物1.0g/L、酪蛋白氨基酸(ディフコ公司制)5.0g/L、维生素B1 10mg/L、硫酸铁七水合物50mg/L、硫酸锰七水合物10mg/L,利用氢氧化钠水溶液调节到pH7.2后进行高压灭菌][葡萄糖和硫酸镁七水合物水溶液另行制备并进行高压灭菌,冷却后混合]的粗试管中,然后以达到0.125mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG),在30℃下振荡培养30小时。
培养结束后,将培养液适当稀释并过滤器灭菌后,对所得样品进行HPLC分析,对上清中所含的NeuAc浓度和每单位菌体量的NeuAc生产量进行定量。将结果示于表6。
另外,关于本分析中检测到的NeuAc相对于全部峰化合物的比例、即NeuAc的HPLC纯度,示于表7中。
[表6]
[表7]
如表6和表7所示,可知通过破坏参与ECA生物合成的wecA基因、wecB基因或wecC基因中的任一者,从而显示出高于母株的NeuAc生产能力。另外,NeuAc相对于培养液中所含的全部产物所占的比例提高,因此在减少杂质方面也显示出有效。由这些结果可知,通过使用具有NeuAc或含NeuAc的糖质的生产能力且ECA生物合成途径被阻断的微生物,与以往相比可以高效地制造NeuAc或含NeuAc的糖质。
参照特定方式对本发明进行了详细说明,但可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变更和修正,这对于本领域技术人员而言是显而易见的。需要说明的是,本申请基于2021年10月8日提出的日本专利申请(日本特愿2021-166476),通过引用而援引其整体。另外,在此引用的全部参照作为整体被并入。
序列表自由文本
序列号1:wecA的碱基序列
序列号2:WecA的氨基酸序列
序列号3:wecB的碱基序列
序列号4:WecB的氨基酸序列
序列号5:wecC的碱基序列
序列号6:WecC的氨基酸序列
序列号7:CjneuB的碱基序列
序列号8:slr1975的碱基序列
序列号9:GNA1的碱基序列
序列号10:CjneuB片段扩增用引物Fw的碱基序列
序列号11:CjneuB片段扩增用引物Rv的碱基序列
序列号12:slr1975片段扩增用引物Fw的碱基序列
序列号13:slr1975片段扩增用引物Rv的碱基序列
序列号14:GNA1片段扩增用引物Fw的碱基序列
序列号15:GNA1片段扩增用引物Rv的碱基序列
序列号16:yhbJ的碱基序列
序列号17:cat片段扩增用引物Fw的碱基序列
序列号18:cat片段扩增用引物Rv的碱基序列
序列号19:sacB片段扩增用引物Fw的碱基序列
序列号20:sacB片段扩增用引物Rv的碱基序列
序列号21:wecA上游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号22:wecA上游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号23:wecA下游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号24:wecA下游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号25:wecA上游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号26:wecA上游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号27:wecA下游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号28:wecA下游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号29:wecA破坏用片段制作用引物_Fw的碱基序列
序列号30:wecA破坏用片段制作用引物_Rv的碱基序列
序列号31:wecB上游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号32:wecB上游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号33:wecB下游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号34:wecB下游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号35:wecB上游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号36:wecB上游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号37:wecB下游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号38:wecB下游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号39:wecB破坏用片段制作用引物_Fw的碱基序列
序列号40:wecB破坏用片段制作用引物_Rv的碱基序列
序列号41:wecC上游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号42:wecC上游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号43:wecC下游1片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号44:wecC下游1片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号45:wecC上游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号46:wecC上游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号47:wecC下游2片段扩增用引物_Fw的碱基序列
序列号48:wecC下游2片段扩增用引物_Rv的碱基序列
序列号49:wecC破坏用片段制作用引物_Fw的碱基序列
序列号50:wecC破坏用片段制作用引物_Rv的碱基序列
序列号51:wecD的碱基序列
序列号52:WecD的氨基酸序列
序列号53:wecE的碱基序列
序列号54:WecE的氨基酸序列
序列号55:wecF的碱基序列
序列号56:WecF的氨基酸序列
序列号57:wecG的碱基序列
序列号58:WecG的氨基酸序列
Claims (4)
1.一种微生物,其具有N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者的生产能力,并且肠道杆菌共同抗原(ECA)生物合成途径被阻断。
2.根据权利要求1所述的微生物,其缺损了选自下述[1]~[3]中的至少1种蛋白质的活性:
[1]由序列号2所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基葡糖胺-十一碳二烯磷酸酯N-乙酰基葡糖胺磷酸转移酶(WecA)活性的蛋白质;
[2]由序列号4所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基葡糖胺2-差向异构酶(WecB)活性的蛋白质;
[3]由序列号6所示的氨基酸序列或其同源序列构成且具有UDP-N-乙酰基甘露糖胺脱氢酶(WecC)活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的微生物,其为大肠杆菌。
4.一种N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者的制造方法,其中,在培养基中培养权利要求1~3中任一项所述的微生物,生成N-乙酰神经氨酸和含N-乙酰神经氨酸的糖质中的至少一者。
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