WO2015037698A1 - Ｎ－アセチルノイラミン酸及びｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 - Google Patents

Ｎ－アセチルノイラミン酸及びｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015037698A1
WO2015037698A1 PCT/JP2014/074181 JP2014074181W WO2015037698A1 WO 2015037698 A1 WO2015037698 A1 WO 2015037698A1 JP 2014074181 W JP2014074181 W JP 2014074181W WO 2015037698 A1 WO2015037698 A1 WO 2015037698A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
neuac
microorganism
culture
dna
pep
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/074181
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
哲朗 氏原
秀明 山本
田畑　和彦
Original Assignee
協和発酵バイオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和発酵バイオ株式会社 filed Critical 協和発酵バイオ株式会社
Priority to JP2015536641A priority Critical patent/JP6441806B2/ja
Publication of WO2015037698A1 publication Critical patent/WO2015037698A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for producing N-acetylneuraminic acid (hereinafter referred to as NeuAc) and NeuAc-containing carbohydrate using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture.
  • NeuAc N-acetylneuraminic acid
  • Non-patent Documents 1 and 2 As a method for producing NeuAc using an enzyme, a production method using NeuAc aldolase as an enzyme and pyruvic acid and N-acetylmannosamine (hereinafter referred to as ManNAc) as substrates (Non-patent Documents 1 and 2), under alkaline conditions A production method using NeuAc acid aldolase as an enzyme and pyruvic acid and N-acetylglucosamine (hereinafter referred to as GlcNAc) as a substrate (Patent Document 1), NeuAc acid aldolase and N-acetylglucosamine-2-epimerase (hereinafter referred to as “Pirate”).
  • Non-patent Documents 3 and 4 pyruvate and GlcNAc as a substrate
  • PEP NeuAc synthetase
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • ManNAc ManNAc
  • An efficient method for producing NeuAc includes a production method using microorganisms. Examples of such methods include the use of E. coli expressing GlcNAc epimerase and NeuAc synthetase derived from pathogenic E. coli K1 strain.
  • Patent Document 3 A method for producing NeuAc from GlcNAc via ManNAc (Patent Document 3), and GlcNAc6-phosphate epimerase, and Escherichia coli expressing NeuAc synthase derived from Campylobacter jejuni that is a causative microorganism of food poisoning, A method for producing NeuAc using glycerol as a carbon source is known (Patent Document 4).
  • a method for producing a NeuAc-containing carbohydrate using a microorganism includes cytidine-5′-monophosphate-N-acetylneuraminic acid synthase (hereinafter referred to as CMP-NeuAc synthase), sialyltransferase, and Campylobacter jejuni.
  • CMP-NeuAc synthase cytidine-5′-monophosphate-N-acetylneuraminic acid synthase
  • sialyltransferase sialyltransferase
  • Campylobacter jejuni A method for producing sialyl lactose from glucose and lactose using E. coli in which NeuAc synthetase derived from ( Campylobacterjejuni ) is expressed is known (Patent Document 5).
  • the NeuAc synthase in addition to enzymes from the above pathogenic microorganisms, B streptococci Streptococcus agalactiae (Streptococcus agalactiae) derived enzymes, meningococcal Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis) from the enzyme In fact, it has been confirmed to have NeuAc synthase activity. These NeuAc synthases are all derived from pathogenic microorganisms.
  • NeuAc is a sugar that mammals have, and since the microorganisms produce NeuAc as a defense mechanism from the immune system of mammals, all of the NeuAc acid synthase that has been confirmed to be actually active has been used in mammals, etc. It can be understood that it is derived from a pathogenic microorganism having an infectious ability. The existence of NeuAc synthase derived from a non-pathogenic microorganism is suggested from the information of the genome sequence, but it is not known whether it has NeuAc synthase activity.
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing NeuAc and NeuAc-containing carbohydrate using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture.
  • the present invention relates to the following (1) to (14).
  • Protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 [2] In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, 1 to 20 amino acids have been deleted, substituted, inserted or added Mutant protein consisting of an amino acid sequence and having NeuAc synthase activity [3] A homologue consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and having NeuAc synthase activity Protein (2) PEP uses any one or more of the microorganisms or PEP cultures described in (1) above, or a culture of the microorganisms, or a processed product of the cultures as an enzyme source, The production method according to the above (1), which is a PEP obtained by allowing an energy donor to be present in an aqueous medium and producing and accumulating PEP in the aqueous medium.
  • PEP uses any one or more microorganisms or PEP cultures described in (3) above, or a culture of microorganisms, or a processed product of the culture, as an enzyme source, and the enzyme source and energy
  • the production method according to the above (3) which is a PEP obtained by allowing a donor to be present in an aqueous medium and producing and accumulating PEP in the aqueous medium.
  • CTP uses a culture of microorganisms that produce and accumulate CTP from any one or more microorganisms or CTP precursors described in (3) above, or a processed product of the culture as an enzyme source,
  • the production method according to the above (3) or (4) which is a CTP obtained by allowing an enzyme source, a CTP precursor, and an energy donor to be present in an aqueous medium, and generating and accumulating CTP in the aqueous medium.
  • DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] in (1) above [5] DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and encodes a homologous protein having NeuAc synthase activity (9)
  • a microorganism producing CMP-NeuAc synthase obtained by transforming a parent strain with a recombinant DNA having a DNA encoding CMP-NeuAc synthase has enhanced CMP-NeuAc synthase activity than the parent strain.
  • a method for producing a NeuAc-containing carbohydrate which comprises culturing in a medium containing the product, producing and accumulating a NeuAc-containing carbohydrate in the culture, and collecting the NeuAc-containing carbohydrate from the culture.
  • the present invention provides an efficient method for producing NeuAc and NeuAc-containing carbohydrates using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture.
  • the production method of the present invention uses NeuAc synthase derived from non-pathogenic microorganisms, it is more convenient for consumers than the conventional production method of NeuAc and NeuAc-containing carbohydrates using NeuAc synthase derived from pathogenic microorganisms. The anxiety given can be reduced.
  • Microorganisms used in the method for producing NeuAc of the present invention 1.1 Microorganism that produces the protein according to any one of [1] to [3] below and a method for producing the microorganism
  • the method for producing NeuAc or NeuAc-containing carbohydrate of the present invention includes a microorganism that produces NeuAc synthase.
  • NeuAc synthase refers to a protein having NeuAc synthase activity.
  • NeuAc synthase activity refers to the activity of producing NeuAc using ManNAc and PEP as substrates.
  • a mutated protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • a homologous protein is a protein whose structure and function are similar to the original protein, so that the gene encoding the protein has the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein. It refers to the protein of living organisms.
  • an amino acid is deleted, substituted, inserted or added is that 1 to 20 amino acids are deleted, substituted, inserted or added at any position in the same sequence. Also good.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 20, preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenyl, threonine
  • the above-mentioned mutant protein or homologous protein has NeuAc synthase activity because a recombinant DNA having a DNA encoding the protein is prepared by the method described later, and NeuAc synthase activity is produced using the recombinant DNA.
  • a microorganism not obtained for example, a microorganism obtained by transforming Escherichia coli W3110 strain, is cultured, a cell extract containing the protein is prepared from the obtained culture, and the fraction is mixed with ManNAc and PEP as substrates. It can confirm by making it contact and detecting NeuAc produced as a result by a high-speed chromatography or a gas chromatography.
  • microorganisms belonging to the genus Rhodobacter examples include microorganisms belonging to the genus Rhodobacter, microorganisms belonging to the genus Flavobacterium, and the following [4] [1] to [1] to DNA encoding the protein according to any one of [3], [5] DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, [6] DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and encodes a homologous protein having NeuAc synthase activity, or [ 7] a nucleotide sequence having at least 95%, preferably 97%, more preferably 98%, most preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Rhodobacter include Rhodobacter capsulatus NBRC16581 strain.
  • a preferred example of the microorganism belonging to the genus Flavobacterium is Flavobacterium psychorophilum NBRC 100250 strain.
  • hybridizing is a process in which DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Accordingly, the DNA having the specific base sequence or a part of the base sequence of the DNA is useful as a probe for Northern or Southern blot analysis, or DNA of a length that can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis. May be.
  • Examples of DNA used as a probe include at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • DNA used as a primer is at least 10 bases, preferably 15 bases or more. Can give you DNA.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) that prepares a probe by a random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above stringent conditions include, for example, a filter on which DNA is immobilized and a probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 ⁇ mM sodium chloride, 75 ⁇ mM sodium citrate), 50 ⁇ mM sodium phosphate ( After incubation overnight at 42 ° C. in a solution containing pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, for example 0.2 ⁇ SSC at about 65 ° C. Conditions for washing the filter in a solution can be given.
  • the various conditions described above can also be set by adding or changing a blocking reagent used to suppress the background of hybridization experiments.
  • the addition of the blocking reagent described above may be accompanied by a change in hybridization conditions in order to adapt the conditions.
  • the DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 when calculated based on the above parameters using a program such as the above BLAST and FASTA. And DNA having a nucleotide sequence having at least 95%, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • the expression level of the protein encoded by the DNA can be improved by substituting the base so that the base sequence of the portion encoding the protein becomes an optimal codon for host expression.
  • Information on codon usage in the parent strain used in the production method of the present invention can be obtained through a public database.
  • the recombinant DNA having the DNA according to any one of [4] to [7] above is capable of autonomously replicating in the parent strain or integrating into the chromosome, and can transcribe the DNA.
  • the parent strain refers to the original strain that is the target of genetic modification and transformation.
  • the original strain to be transformed by gene transfer is also called a host strain.
  • the parent strain may be any microorganism, but is preferably a prokaryotic or yeast strain, more preferably, Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium.
  • a prokaryote belonging to the genus Pseudomonas or a yeast strain belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, Candida, etc., most preferably Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2- Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21 codon plus (Stratagene), Serratia ficari a, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratiamarcescen
  • the parent strain is preferably a microbial cell having a reduced NeuAc degradation activity.
  • microorganisms include microorganisms with reduced NeuAc lyase activity, and specifically, Escherichia coli NAN8-71 (FERMBP-7908, WO03 / 72783).
  • FERMBP-7908, WO03 / 72783 Escherichia coli NAN8-71
  • 1.5 or 1.6 microorganisms described later can also be used as parent strains of microorganisms used in the production method of the present invention.
  • the recombinant DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any of [4] to [7] above, and a transcription termination sequence.
  • Recombinant DNA is preferred.
  • a gene that controls the promoter may also be included. It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA, but a transcription termination sequence is preferably arranged immediately below the structural gene.
  • examples of expression vectors include pColdI (Takara Bio), pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Novagen), pMAL-c2x (New England Biolabs) PGEX-4T-1 (manufactured by GE Healthcare Bioscience), pTrcHis (manufactured by Invitrogen), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Qiagen) , PET-3 (manufactured by Novagen), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • pPAC31 (WO98 / 12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Bio Inc.), pUC118 (Takara) Bio,) and pPA1 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-233798).
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • trp promoter P trp
  • lac promoter P lac
  • P L promoter P L promoter
  • P R promoter P SE promoter
  • an artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
  • examples of expression vectors include pCG1 (JP 57-134500), pCG2 (JP 58-35197), pCG4 (JP 57-183799), pCG11 (special). Kaisho 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all of which is JP-A-58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 [all of which are Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)].
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of coryneform bacteria.
  • P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 ( 2000)] can be used.
  • examples of the expression vector include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • the promoter in the case of using the above expression vector may be any promoter as long as it functions in cells of yeast strains.
  • promoters such as heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP 1 promoter, and the like.
  • a microorganism obtained by transforming a parent strain with the recombinant DNA and having an enhanced NeuAc synthase activity than the parent strain means that the recombinant DNA is introduced as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain. Or a microorganism in which the transcription amount of the DNA or the production amount of the protein encoded by the DNA is increased by being incorporated into the chromosome of the parent strain. Further, the microorganism may be a microorganism in which the specific activity of NeuAc synthase is enhanced by producing the mutant protein of [2] above.
  • the transcription amount of the DNA As a method for confirming that the transcription amount of the DNA according to any of the above [4] to [7] or the production amount of the protein encoded by the DNA has increased, for example, the transcription amount of the DNA It can be confirmed by blotting or by comparing the production amount of the protein with that of the parent strain by Western blotting.
  • the mutant protein is purified from a transformant obtained by transforming a parent strain with DNA encoding the mutant protein, and the protein, ManNAc and By making PEP present in an aqueous medium, measuring the specific activity from the amount of NeuAc produced and accumulated in the aqueous medium and the protein, and comparing it with the specific activity of NeuAc synthase into which no mutation was measured. Can be confirmed.
  • a microorganism obtained by transforming a parent strain with a recombinant DNA having the DNA according to any one of [4] to [7] above and having enhanced NeuAc synthase activity compared to the parent strain is obtained by the following method. Can be created.
  • the DNA encoding the protein of [1] and the DNA of [5] can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, for example.
  • microorganisms preferably Rhodobacter Shokumata the microorganisms belonging to the genus Flavobacterium, more preferably, Rhodobacter Kapusuratasu (Rhodobacter capsulatus) NBRC16581 strain or Flavobacterium cyclophilin ram (Flavobacteriumpsychrophilum) NBRC 100250 strain chromosomal DNA of It can be obtained by Southern hybridization to a library or PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using a primer DNA that can be designed based on the nucleotide sequence and using the chromosomal DNA of the microorganism as a template. .
  • Rhodobacter capslatus NBRC16581 and Flavobacterium cyclophilum NBRC 100250 can be obtained from the NITE Biological Resource Center.
  • the DNA encoding the homologous protein of [3] and the DNAs of [6] and [7] are represented by SEQ ID NO: 1 or 3 with respect to various gene sequence databases, for example.
  • An amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by No. 2 or 4 is obtained and obtained by the search.
  • a probe DNA or primer DNA that can be designed based on the base sequence or amino acid sequence, and a microorganism having the DNA, the above-mentioned It can be obtained by a method similar to the method for obtaining the NA.
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] is obtained, for example, by subjecting the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 to error-prone PCR or the like as a template. be able to.
  • PCR Gene, 77, 51 (1989) using a pair of PCR primers each having a base sequence designed to introduce a target mutation (deletion, substitution, insertion or addition) at the 5 ′ end thereof. )] can also obtain the DNA of [2] above.
  • a sense primer corresponding to the 5 ′ end of the DNA and an antisense primer corresponding to the sequence immediately before the mutation introduction site (5 ′ side) having a sequence complementary to the mutation sequence at the 5 ′ end PCR is performed using the DNA as a template, and a fragment A (mutation is introduced at the 3 ′ end) from the 5 ′ end to the mutation introduction site of the DNA is amplified.
  • the obtained DNA described in any of [4] to [7] above is cut as it is or with an appropriate restriction enzyme and incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant DNA is introduced into a host cell.
  • base sequence analysis methods such as dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems) etc. By analyzing with an apparatus, the base sequence of the DNA can be determined.
  • Examples of the host cell e.g., Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49 Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522 and the like.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000
  • Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101
  • the above vectors include pBluescriptIIKS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (Stratagene), pT7Blue (Novagen) PCR II (manufactured by Invitrogen) and pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter).
  • a method for introducing recombinant DNA any method for introducing DNA into a host cell can be used. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • the full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can be prepared by chemical synthesis using a 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • a recombinant DNA possessed by the microorganism used in the production method of the present invention can be produced.
  • examples of such recombinant DNA include pRcneuB and pFpneuB described later.
  • methods for introducing recombinant DNA as a plasmid capable of autonomous replication in a parent strain include methods using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (special (Kai Sho 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • a homologous recombination method can be mentioned as a method for incorporating the recombinant DNA into the chromosome of the parent strain.
  • a homologous recombination method a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligation with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot be autonomously replicated in the host cell to be introduced can be used, and is frequently used in Escherichia coli.
  • a method using homologous recombination a method of introducing recombinant DNA using a lambda phage homologous recombination system [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000 )].
  • a selection method that makes Escherichia coli susceptible to sucrose by Bacillus subtilis levansucklease integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, or the wild-type rpsL gene is incorporated into Escherichia coli having a mutant rpsL gene resistant to streptomycin.
  • Using the selection method using the fact that Escherichia coli becomes streptomycin sensitive [Mol. Microbiol., 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)], etc. Microorganisms in which the above target region has been replaced with recombinant DNA can be obtained.
  • the microorganism produced by the above method is a microorganism having an enhanced NeuAc synthase activity as compared to the parent strain.
  • the amount of DNA transferred according to any one of the above [4] to [7], The production amount of the protein encoded by DNA or the specific activity of the protein can be confirmed by comparing it with that of the parent strain.
  • Examples of such microorganisms include W3110 / pRcneuB and W3110 / pFpneuB described later.
  • CMP-NeuAc synthase refers to a protein having CMP-NeuAc synthase activity.
  • the CMP-NeuAc synthase activity refers to an activity for producing CMP-NeuAc using CTP and NeuAc as substrates.
  • microorganisms producing CMP-NeuAc synthase include those obtained by transforming a parent strain with a microorganism belonging to the genus Pasteurella or a recombinant DNA having a DNA encoding CMP-NeuAc synthase. And microorganisms with enhanced CMP-NeuAc synthase activity.
  • Pasteurella multocida ( Pasteurella multocida) (70) strain can be mentioned preferably.
  • the DNA encoding CMP-NeuAc synthase is preferably a DNA encoding CMP-NeuAc synthase from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably from prokaryotes, most preferably from Pasteurella multocida strain PM70 ( Japanese Patent Application No. 2008-5794).
  • DNA encoding CMP-NeuAc synthase derived from Pasteurella multocida strain PM70 can be obtained by the method described in Japanese Patent Application No. 2008-5794.
  • Recombinant DNA having the DNA can be prepared according to the method described in 1.1 above.
  • a microorganism obtained by transforming a parent strain with the recombinant DNA and having enhanced CMP-NeuAc synthase activity than the parent strain can be constructed according to the method described in 1.1 above.
  • the microorganism produced by the above method is a microorganism having enhanced CMP-NeuAc synthase activity as compared with the parent strain.
  • the amount of transcription of the DNA encoding CMP-NeuAc synthase, the amount of production of the protein, Alternatively, the specific activity of the protein can be confirmed by comparing it with that of the parent strain.
  • Examples of such microorganisms include Escherichiacoli N18-14 / pMnK1 (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-5794).
  • the DNA encoding NeuAc synthase and the DNA encoding CMP-NeuAc synthase may be present in the same recombinant DNA, or may be present in separate recombinant DNAs.
  • Microorganism producing sialyltransferase and method for producing the microorganism The method for producing a NeuAc-containing carbohydrate of the present invention uses a microorganism producing sialyltransferase.
  • Sialyltransferase refers to a protein having sialyltransferase activity.
  • Sialyltransferase activity refers to the activity of producing NeuAc-containing carbohydrates using CMP-NeuAc and acceptor carbohydrates as substrates.
  • the acceptor carbohydrate used as a substrate may be any of oligosaccharides, polysaccharides, and complex carbohydrates such as glycoproteins and glycolipids as long as they can serve as sialyltransferase substrates.
  • oligosaccharides or polysaccharides that serve as sialyltransferase substrates include oligosaccharides or polysaccharides having galactose at the non-reducing end, or oligosaccharides or polysaccharides having NeuAc at the non-reducing end, preferably lactose at the non-reducing end.
  • Oligosaccharide having a structure selected from the group consisting of globotriose, N-acetyllactosamine, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, Lewis a and Lewis X, or NeuAc ⁇ 2-Gal ⁇ 1-4Glc at the non-reducing end
  • an oligosaccharide having a structure selected from the group consisting of NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc, more preferably lactose.
  • complex carbohydrates include complex carbohydrates in which proteins or lipids are bound to the above-mentioned oligosaccharides and polysaccharides.
  • the NeuAc-containing carbohydrate is a carbohydrate obtained by adding NeuAc to the above-described receptor carbohydrate, preferably a structure selected from the group consisting of NeuAc ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-4Glc, NeuAc ⁇ 2-6Gal ⁇ 1-4Glc and NeuAc ⁇ 2-8NeAc at the non-reducing end
  • Carbohydrates containing oligosaccharides having the above can be mentioned, more preferably 3'-sialyl lactose or 6'-sialyl lactose.
  • microorganisms that produce sialyltransferases include microorganisms belonging to the genus Pasteurella , microorganisms belonging to the genus Photobacterium , or recombinant DNA having a DNA encoding sialyltransferase. And a microorganism having a sialyltransferase activity enhanced as compared with the parent strain.
  • microorganisms belonging to the Pasteurella preferably, mention may be made of Pasteurella multocida (Pasteurellamultocida) PM70 shares.
  • Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Photobacterium include Photobacterium damselae JT0160 strain.
  • DNA encoding the sialyltransferase preferably a prokaryotic or yeast such as bacteria, particularly preferably from prokaryotic organisms, and most preferably, the ⁇ -2,3-sialyltransferase derived from Pasteurella multocida (Pasteurellamultocida) PM70 strain Examples include DNA encoding (WO03 / 27297) or DNA encoding ⁇ -2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316) derived from Photobacterium damselae JT0160.
  • DNA encoding ⁇ -2,3-sialyltransferase derived from Pasteurella multocida PM70 strain and DNA encoding ⁇ -2,6-sialyltransferase derived from Photobacterium damselae JT0160 strain are described in WO03 / 27297. Can be obtained by any method. Recombinant DNA having the DNA can be prepared according to the method described in 1.1 above.
  • a microorganism obtained by transforming a parent strain with the recombinant DNA and having enhanced sialyltransferase activity as compared to the parent strain can be constructed according to the method described in 1.1 above.
  • the microorganism produced by the above method is a microorganism having enhanced sialyltransferase activity as compared to the parent strain, the amount of transcription of DNA encoding a protein having sialyltransferase activity, the production amount of the protein, Alternatively, the specific activity of the protein can be confirmed by comparing it with that of the parent strain.
  • microorganisms examples include Escherichiacoli NM522 / pYP3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-5794). Further, from a parent strain obtained by transforming the microorganism with a DNA according to any one of [4] to [7] of 1.1 above or a recombinant DNA having a DNA encoding CMP-NeuAc synthase Alternatively, the microorganism may have enhanced NeuAc synthase activity or CMP-NeuAc synthase activity.
  • the DNA encoding a protein selected from the group consisting of sialyltransferase, NeuAc synthase, and CMP-NeuAc synthase is 1 to 3, preferably 1 to 2, most preferably 1 type of recombinant.
  • the DNAs may exist separately in any combination.
  • Microorganism producing GlcNAc epimerase and method for producing the microorganism The method for producing NeuAc or NeuAc-containing carbohydrate of the present invention includes GlcNAc when the production of NeuAc or NeuAc-containing carbohydrate is carried out using GlcNAc as a substrate. A microorganism that produces epimerase is used.
  • GlcNAc epimerase refers to a protein having GlcNAc epimerase activity.
  • GlcNAc epimerase activity refers to the activity of producing ManNAc by epimerization reaction using GlcNAc as a substrate.
  • microorganisms that produce GlcNAc epimerase include microorganisms belonging to the genus Synechocystis , or a GlcNAc epimerase obtained by transforming a parent strain with a recombinant DNA having a DNA encoding GlcNAc epimerase. Mention may be made of microorganisms with enhanced activity.
  • Preferred examples of the microorganism belonging to the genus Synechocystis include Synechocystis sp. PCC6803 strain (Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR).
  • the DNA encoding GlcNAc epimerase is preferably a DNA encoding GlcNAc epimerase derived from prokaryotes such as bacteria or yeast, particularly preferably derived from prokaryotes, most preferably derived from Synechocystis sp. PCC6803 strain. it can.
  • DNA encoding GlcNAc epimerase derived from Synechocystis sp. PCC6803 can be obtained by the method described in WO00 / 47730.
  • Recombinant DNA having the DNA can be prepared according to the method described in 1.1 above.
  • a microorganism obtained by transforming a parent strain with the recombinant DNA and having enhanced GlcNAc epimerase activity than the parent strain can be constructed according to the method described in 1.1 above.
  • the microorganism produced by the above method is a microorganism having enhanced GlcNAc epimerase activity as compared with the parent strain.
  • the amount of transcription of the DNA encoding GlcNAc epimerase, the production amount of the protein, or the amount of the protein Specific activity can be confirmed by comparison with that of the parent strain.
  • Examples of such microorganisms include W3110 / pRcneuB2, which will be described later.
  • the microorganism further has a DNA selected from the group consisting of the DNA according to any one of [4] to [7] of 1.1 above, a DNA encoding CMP-NeuAc synthase, and a DNA encoding sialyltransferase. It may be a microorganism in which the activity of a protein selected from the group consisting of NeuAc synthase, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase is enhanced than the parent strain obtained by transformation with recombinant DNA.
  • DNA encoding a protein selected from the group consisting of GlcNAc epimerase, NeuAc synthase, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase is 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 It may be present separately in any combination in one kind, most preferably one kind of recombinant DNA.
  • Microorganism producing and accumulating PEP and method for producing the microorganism In the method for producing NeuAc or NeuAc-containing carbohydrate of the present invention, the substrate PEP may be supplied by the microorganism producing and accumulating PEP.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism that generates and accumulates PEP from an energy donor such as sugar, but preferably a prokaryotic organism belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium, or a yeast strain belonging to the genus Saccharomyces Most preferably, Escherichia coli, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Saccharomyces cerevisiae and the like can be mentioned. Examples of the Saccharomyces cerevisiae include the strains described in JP-A-6-197778.
  • mutation method or the gene recombination method can also be used.
  • Microorganism that produces and accumulates CTP from CTP precursor and method for producing the microorganism In the method for producing a NeuAc-containing carbohydrate of the present invention, CTP as a substrate is supplied by a microorganism that produces and accumulates CTP from CTP precursor. May be.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism that generates and accumulates CTP from a CTP precursor, but preferably a prokaryotic organism belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium, or a yeast strain belonging to the genus Saccharomyces, Preferably, Escherichia coli, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Saccharomyces cerevisiae, etc., most preferably Escherichia coli or Corynebacterium ammoniagenes. Can be mentioned.
  • generates CTP from a CTP precursor by a mutation method or a gene recombination method can also be used.
  • the CTP precursor may be any substance that can be metabolized by microorganisms and converted to CTP, and preferably includes orotic acid, uracil, orotidine, uridine, cytosine, cytidine, CMP, UTP and UMP. Preferred are orotic acid and CMP, and more preferred is orotic acid.
  • a microorganism that produces the protein according to any one of [1] to [3] of 1.1 and generates ManNAc from sugar is used.
  • the microorganism that produces ManNAc from sugar refers to a microorganism that produces and accumulates ManNAc in cells of the microorganism using the sugar as a starting substrate when the microorganism is cultured in a medium by the method of 2.3 described later.
  • Such a microorganism is not limited as long as it is a microorganism that produces ManNAc using sugar as a starting substrate. For example, it is described in Example 4 of Patent Document 4, which is known to produce NeuAc.
  • microorganism that produces the protein according to any one of [1] to [3] of 1.1 above and generates ManNAc from a saccharide is, for example, the pBS-neuBC plasmid described in Example 4 of Patent Document 4.
  • a microorganism hereinafter referred to as microorganism A in which the DNA encoding NeuAc synthase (neuB) possessed by the pBS-neuBC plasmid is replaced with the DNA described in any one of [4] to [7] of 1.1 above.
  • Microorganism that produces the protein, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase according to any one of [1] to [3] of 1.1 above, and produces ManNAc from sugar, and a method for producing the microorganism. Fermentation of the present invention In the method for producing a NeuAc-containing carbohydrate by the method, the protein according to any one of [1] to [3] of 1.1 above, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase are produced, and ManNAc is produced from the sugar. Use microorganisms.
  • microorganism that produces ManNAc from sugar is the same as in 1.7 above.
  • microorganisms that produce the protein according to any of [1] to [3] of 1.1 above, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase, and that produce ManNAc from sugar include, for example, the method described in 1.1 above.
  • the NeuAc synthase contained in the plasmid is encoded.
  • microorganism C A microorganism (hereinafter referred to as microorganism C) in which the DNA (neuB) to be replaced with the DNA described in any one of [4] to [7] in 1.1 above, or any one of [4] to [7] in 1.1 above DNA encoding GlcNAc epimerase of 1.4, CMP-NeuAc of 1.2 GlcNAc described in Example 14 of International Publication No. WO2004 / 003175, comprising 1 to 4 types of recombinant DNAs having DNAs encoding tase and DNAs encoding sialyltransferases of 1.4 described above in any combination.
  • microorganism D Transformation of production strains 7107-607 (2), 7107-660 (1), 7107-660 (4), 7107-661 (1), 7107-661 (2) or 7107-661 (3), etc.
  • the method for culturing microorganisms described in 2.1 can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism any of a natural medium and a synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, and can efficiently culture the microorganism. May be.
  • Any carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, ethanol, Alcohols such as propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digests thereof, and the like can be used.
  • the inorganic salt monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the enzyme source, ManNAc and PEP are present in an aqueous medium, and NeuAc is produced and accumulated in the aqueous medium.
  • NeuAc can be produced.
  • the processed product of the culture includes the concentrate of the culture, the dried product of the culture, the cells obtained by centrifuging or filtering the culture, and the drying of the cells.
  • a lyophilized product of the microbial cell a surfactant-treated product of the microbial cell, a solvent-treated product of the microbial cell, an enzyme-treated product of the microbial cell, and an immobilized product of the microbial cell.
  • the purified enzyme obtained from the treated cells preferably the culture concentrate, the dried product of the culture, the cells obtained by centrifuging or filtering the culture, Dried product of cells, freeze-dried product of cells, surfactant-treated product of cells, solvent-treated product of cells, enzyme of cell A substance containing live cells having the same function as the culture as an enzyme source, such as a physical product and an immobilized product of the cells, and a sonicated product of the cells, a mechanical of the cells
  • the ground product is most preferably a concentrate of the above culture, a dried product of the culture, a cell obtained by centrifuging or filtering the culture, a dried product of the cell, Same as the culture as an enzyme source, such as a lyophilized product of a cell, a surfactant-treated product of the cell, a solvent-treated
  • the amount of the enzyme source is 1 to 500 g / l, preferably 1 to 300 g / l, for each enzyme source used.
  • the concentration of ManNAc and PEP is 0.1 mM to 10M, preferably 1 mM to 1M.
  • aqueous media include buffers such as water, phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate, and tris, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, and ketones such as acetone. And amides such as acetamide.
  • the culture solution of the microorganism used as an enzyme source can be used as an aqueous medium.
  • a chelating agent such as phytic acid, a surfactant, or an organic solvent may be added as necessary.
  • Surfactants include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (eg, Nimine S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium bromide and alkyldimethyl benzylammonium chloride (eg, cationic F2-40E).
  • NeuAc's cationic surfactants anionic surfactants such as lauroyl sarcosinate, tertiary amines such as alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, manufactured by Nippon Oil & Fats), etc. Any one may be used as long as it promotes production, and one kind or a mixture of several kinds may be used.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / l.
  • the organic solvent examples include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate and the like, which are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml / l.
  • the NeuAc production reaction is carried out in an aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, and 20 to 50 ° C. for 1 to 96 hours.
  • adenine, adenosine-5'-monophosphate (AMP), adenosine-5'-triphosphate (ATP), magnesium sulfate, magnesium chloride and the like can be added.
  • Adenine, AMP and ATP are usually used at a concentration of 0.01 to 100 mmol / l.
  • the substrate PEP used in the above NeuAc production method is not particularly limited, and a commercially available PEP may be used.
  • the microorganism of 2.1 or the culture of the microorganism of 1.5 or the treated product of the culture may be used as an enzyme source.
  • PEP obtained by allowing the enzyme source and energy donor to be present in an aqueous medium, generating and accumulating PEP in the aqueous medium, and collecting the PEP from the medium may be used. Furthermore, by simultaneously performing the reaction for producing NeuAc and the reaction for producing PEP in the same aqueous medium, it is possible to produce PEP in the same aqueous medium and produce NeuAc.
  • the energy donor may be any substance that can be metabolized by the microorganism and can produce an energy substance such as adenosine-5'-triphosphate (hereinafter abbreviated as ATP).
  • the concentration of the energy donor is usually 10 to 300 g / l.
  • NeuAc produced in an aqueous medium can be quantified using a sugar analyzer manufactured by Dionex [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].
  • NeuAc produced in the reaction solution can be collected by a normal method using activated carbon, ion exchange resin, or the like.
  • the method for culturing microorganisms in 2.2 can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism the medium described in 2.1 above can be used.
  • the enzyme source, GlcNAc and PEP are present in an aqueous medium, and NeuAc is produced and accumulated in the aqueous medium.
  • NeuAc can be produced.
  • the microorganism of 2.2 may be a separate microorganism constructed from different parent strains as described in 1.4 above. As described in 1.4 above, one microorganism may be one of the above 1.1 [4] to [7]. You may have DNA which codes the protein in any one, and DNA which codes GlcNAc epimerase. When the microorganisms in 2.2 are composed of two types, the microorganisms can be cultured, and then the respective cultures or treated products of the cultures can be mixed to obtain the above enzyme source.
  • the amount of enzyme source is the same as described in 2.1 above.
  • the concentration of GlcNAc is 0.1 mM to 10M, preferably 1 mM to 1M.
  • the aqueous medium the aqueous medium described in 2.1 above can be used.
  • the substrate PEP used in the above NeuAc production method is not particularly limited, and a commercially available PEP may be used.
  • the microorganism of 2.2 or the culture of 1.5 or the treated product of the culture may be used as an enzyme source.
  • PEP obtained by allowing the enzyme source and energy donor to be present in an aqueous medium, generating and accumulating PEP in the aqueous medium, and collecting the PEP from the medium may be used. Furthermore, by simultaneously performing the reaction for producing NeuAc and the reaction for producing PEP in the same aqueous medium, it is possible to produce PEP in the same aqueous medium and produce NeuAc.
  • the energy donor the energy donor described in 2.1 above can be used.
  • the concentration of the energy donor is the same as described in 2.1 above.
  • a method for quantifying and collecting NeuAc the method described in 2.1 above can be used.
  • 2.3 Method for producing NeuAc by fermentation method a microorganism producing the protein according to any one of [1] to [3] of 1.1 above and producing ManNAc from sugar is used as a medium.
  • a method for producing NeuAc characterized in that NeuAc is produced and accumulated in the culture and NeuAc is collected from the culture is described below.
  • the method for culturing the microorganism can be carried out according to a conventional method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism the medium described in 2.1 above can be used.
  • NeuAc can be produced by producing and accumulating NeuAc in the culture and collecting NeuAc from the culture by the above culture.
  • NeuAc can be collected from the culture by combining an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • NeuAc accumulates in the microbial cells, for example, NeuAc is collected from the supernatant obtained by crushing the microbial cells with ultrasonic waves and removing the microbial cells by centrifugation, etc., by the ion exchange resin method or the like. Can do.
  • the method for culturing microorganisms described in 3.1 can be performed according to a usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism the medium described in 2.1 above can be used.
  • the enzyme source, ManNAc, PEP, receptor carbohydrate, and CTP are present in an aqueous medium, and the aqueous medium
  • a NeuAc-containing saccharide can be produced by generating and accumulating a NeuAc-containing saccharide therein and collecting the NeuAc-containing saccharide from the medium.
  • the microorganism of 3.1 may be a separate microorganism constructed from different parent strains as described in 1.2 and 1.3 above, and as described in 1.2 and 1.3 above, one microorganism may be [3] A DNA selected from the group consisting of a DNA encoding the protein according to any one of the above, a DNA encoding CMP-NeuAc synthase, and a DNA encoding sialyltransferase may be included.
  • the microorganism of 3.1 is a microorganism composed of two or more types, after culturing each microorganism, the respective cultures or treated products of the culture can be mixed to obtain the enzyme source.
  • the amount of enzyme source is the same as described in 2.1 above.
  • the concentration of ManNAc is the same as described in 2.1 above.
  • the concentration of the receptor carbohydrate is 1 mM to 3M, preferably 50 mM to 1M.
  • the aqueous medium the aqueous medium described in 2.1 above can be used.
  • the substrate PEP used in the above-mentioned method for producing a NeuAc-containing carbohydrate is not particularly limited, and a commercially available PEP may be used, a microorganism of 3.1 or a culture of the microorganism of 1.5 or a processed product of the culture May be used as an enzyme source, PEP obtained by allowing the enzyme source and energy donor to exist in an aqueous medium, generating and accumulating PEP in the aqueous medium, and collecting the PEP from the medium may be used. . Furthermore, by simultaneously performing the reaction for producing NeuAc-containing carbohydrate and the reaction for producing PEP in the same aqueous medium, it is possible to produce PEP in the same aqueous medium and produce NeuAc-containing carbohydrate.
  • the CTP of the substrate used in the above method for producing a NeuAc-containing carbohydrate is not particularly limited, and a commercially available CTP may be used, a culture of 3.1 microorganism or a culture of 1.6 microorganism, or a processed product of the culture CTP obtained by allowing the enzyme source, CTP precursor, and energy donor to be present in an aqueous medium, generating and accumulating CTP in the aqueous medium, and collecting from the medium May be used.
  • the concentration of CTP precursor is 1 mM to 1M.
  • the energy donor the energy donor described in 2.1 above can be used.
  • the concentration of the energy donor is the same as described in 2.1 above.
  • the quantification of NeuAc-containing carbohydrates produced in an aqueous medium can be performed using a sugar analyzer manufactured by Dionex [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].
  • the NeuAc-containing saccharide produced in the reaction solution can be collected by an ordinary method using activated carbon, ion exchange resin, or the like.
  • the method for culturing microorganisms described in 3.2 can be carried out according to the usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism the medium described in 2.1 above can be used.
  • the enzyme source, GlcNAc, PEP, receptor carbohydrate, and CTP are present in an aqueous medium, and the aqueous medium
  • a NeuAc-containing saccharide can be produced by generating and accumulating a NeuAc-containing saccharide therein and collecting the NeuAc-containing saccharide from the medium.
  • the microorganism of 3.2 may be a separate microorganism constructed from different parent strains as described in the above 1.2, 1.3 and 1.4, and as described in 1.2, 1.3 and 1.4 above, one microorganism may be DNA selected from the group consisting of DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3], DNA encoding CMP-NeuAc synthase, DNA encoding sialyltransferase, and DNA encoding GlcNAc epimerase You may have.
  • the microorganism of 3.2 is a microorganism composed of two or more types, after culturing each microorganism, the respective cultures or treated products of the culture can be mixed to obtain the enzyme source.
  • the amount of enzyme source is the same as described in 2.1 above.
  • the concentration of GlcNAc is the same as described in 2.2 above.
  • the concentration of the receptor carbohydrate is the same as described in 3.1 above.
  • As the aqueous medium the aqueous medium described in 2.1 above can be used.
  • the substrate PEP used in the above-mentioned method for producing a NeuAc-containing carbohydrate is not particularly limited, and a commercially available PEP may be used.
  • a microorganism of 3.2 or a culture of the microorganism of 1.5 or a processed product of the culture May be used as an enzyme source, PEP obtained by allowing the enzyme source and energy donor to exist in an aqueous medium, generating and accumulating PEP in the aqueous medium, and collecting the PEP from the medium may be used. . Furthermore, by simultaneously performing the reaction for producing NeuAc-containing carbohydrate and the reaction for producing PEP in the same aqueous medium, it is possible to produce PEP in the same aqueous medium and produce NeuAc-containing carbohydrate.
  • the CTP of the substrate used in the above-mentioned method for producing a NeuAc-containing carbohydrate is not particularly limited, and commercially available CTP may be used, and the microorganism of 3.2 or the culture of the microorganism of 1.6 or the processed product of the culture CTP obtained by allowing the enzyme source, CTP precursor, and energy donor to be present in an aqueous medium, generating and accumulating CTP in the aqueous medium, and collecting from the medium May be used.
  • the concentration of CTP precursor is the same as described in 3.1 above.
  • the energy donor the energy donor described in 2.1 above can be used.
  • the concentration of the energy donor is the same as described in 2.1 above.
  • a method for quantifying and collecting NeuAc-containing carbohydrate the method described in 3.1 above can be used.
  • 3.3 Method for Producing NeuAc-Containing Carbohydrate by Fermentation Method the protein, CMP-NeuAc synthase, and sialyltransferase described in any one of [1] to [3] of 1.1 above
  • culturing a microorganism that produces ManNAc from sugar in a medium containing a receptor sugar producing and accumulating a NeuAc-containing carbohydrate in the culture, and adding NeuAc-containing carbohydrate from the culture.
  • a method for producing a NeuAc-containing carbohydrate, which is characterized by sampling, will be described below.
  • the method for culturing the microorganism can be carried out according to a conventional method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism a medium containing a receptor sugar in the medium described in 2.1 above can be used.
  • the receptor carbohydrate may be added at the beginning of the culture or may be added as needed from the middle of the culture.
  • the concentration of the receptor carbohydrate to be added is 10 to 300 g / l.
  • a NeuAc-containing saccharide can be produced by producing and accumulating a NeuAc-containing saccharide in the culture by collecting the NeuAc-containing saccharide from the culture.
  • a method for quantifying the NeuAc-containing carbohydrate the method described in 3.1 above can be used.
  • the collection of NeuAc-containing saccharides from the culture can be usually carried out by combining ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
  • NeuAc-containing carbohydrate accumulates in the microbial cells, for example, the NeuAc-containing saccharides are obtained from the supernatant obtained by crushing the microbial cells with ultrasonic waves or the like and removing the microbial cells by centrifugation, for example, by an ion exchange resin method.
  • Carbohydrates can be collected.
  • Escherichia coli W3110 strain was cultured by a known method, and the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified. PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 as a primer set and the chromosomal DNA as a template. The amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes KpnI and BamHI, and an approximately 0.4 kb DNA fragment (hereinafter referred to as Ptrp fragment) containing the tryptophan promoter of E. coli W3110 strain was purified.
  • Ptrp fragment an approximately 0.4 kb DNA fragment
  • the expression vector pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] was cleaved with restriction enzymes HindIII and BamHI to purify a 2.7 kb DNA fragment (hereinafter referred to as pUC18HindIIIBamHI fragment).
  • the above three types of DNA fragments were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed using the ligation reaction solution to construct W3110 / pRcneuB.
  • Flavobacterium cyclophilum NBRC 100250 strain is a known method
  • the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified. PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 10 as a primer set and the chromosomal DNA as a template.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes KpnI and HindIII, and a DNA fragment of about 1 kb containing DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 was purified.
  • the DNA fragment, Ptrp fragment and pUC18HindIIIBamHI fragment were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed with the ligation reaction solution to construct W3110 / pFpneuB.
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • the mixture was centrifuged at 18,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the membrane fraction, and the supernatant was collected.
  • the supernatant was quantified for protein using the Bradford method and used for the reaction.
  • For the reaction add the above-mentioned supernatant protein solution to a reaction buffer containing 12.5 mM ManNAc and PEP (both manufactured by Sigma-Aldrich) to a final concentration of 0.25 mg / ml, and shake at 30 ° C. and 330 rpm. Was done by.
  • a 1/4 amount of 6.7M phosphoric acid was added to terminate the reaction.
  • NeuAc was analyzed using the analyzer DX-500 manufactured by Dionex under the following conditions.
  • the NeuAc production method of the present invention reduces the anxiety given to consumers as compared to the NeuAc production method using NeuAc synthase derived from a conventional pathogenic microorganism. can do.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzyme HindIII, and a DNA fragment of about 1 kb containing DNA encoding GlcNAc epimerase (hereinafter referred to as GlcNAc epimerase fragment) was purified.
  • Plasmid pRcneuB extracted from W3110 / pRcneuB constructed in Example 1 (1) by a conventional method was cleaved with HindIII, and a DNA fragment of about 4.1 kb was purified.
  • the above two kinds of DNA fragments were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed using the ligation reaction solution.
  • a transformant in which DNA encoding GlcNAc epimerase was expressed by the control of the tryptophan promoter was selected using PCR, and W3110 / pRcneuB2 was constructed.
  • Campylobacter jejuni ATCC 43438 strain was cultured by a known method, and the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified.
  • PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 13 and 14 as a primer set and the chromosomal DNA as a template.
  • the amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes KpnI and HindIII, and a DNA fragment of about 1 kb containing DNA encoding NeuAc synthase was purified.
  • the DNA fragment, Ptrp fragment and pUC18HindIIIBamHI fragment were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed using the ligation reaction solution to construct W3110 / pCjneuB.
  • Plasmid pCjneuB extracted from W3110 / pCjneuB by a conventional method was cleaved with HindIII, and a DNA fragment of about 4.1 kb was purified.
  • the approximately 4.1 kb DNA fragment and GlcNAc epimerase fragment were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110-W3110 strain was transformed with the ligation reaction solution.
  • a transformant in which DNA encoding GlcNAc epimerase was expressed by the control of the tryptophan promoter was selected using PCR, and W3110 / pCjneuB2 was constructed.
  • Escherichia coli K235 ATCC 13027 strain was cultured by a known method, and the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified. PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 as a primer set and the chromosomal DNA as a template. The amplified DNA fragment was cleaved with restriction enzymes KpnI and Sse8387I, and a DNA fragment of about 1 kb containing DNA encoding NeuAc synthase was purified.
  • the DNA fragment of about 1 kb and the Ptrp fragment and the pUC18 fragment previously cleaved with PstI and BamHI were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed with the ligation reaction solution to thereby obtain W3110 / pEcneuB.
  • Plasmid pEcneuB extracted from W3110 / pEcneuB by a conventional method was cleaved with Sse8387I, and a DNA fragment of about 4.1 kb was purified.
  • Synecocystis sp. PCC680 strain was cultured by a known method, and the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified. PCR was performed using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 17 and 18 as a primer set and the chromosomal DNA as a template. The amplified DNA fragment was cleaved with a restriction enzyme Sse8387I, and a DNA fragment of about 1 kb containing DNA encoding GlcNAc epimerase was purified.
  • the about 4.1 kb DNA fragment cleaved with Sse8387I and the about 1 kb DNA fragment cleaved with Sse8387I were ligated using a ligation kit, and Escherichia coli W3110 strain was transformed using the ligation reaction solution.
  • a transformant in which DNA encoding GlcNAc epimerase was expressed by the control of the tryptophan promoter was selected using the PCR method to construct W3110 / pEcneuB2.
  • 30 ml of the culture solution was 5 g / l glucose, 5 g / l yeast extract (Oriental), 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 6 g / l disodium hydrogen phosphate, 1 g / l ammonium chloride, manganese sulfate pentahydrate 10 mg / L, uracil 30 mg / L, iron sulfate heptahydrate 0.2 g / L, thiamine 8 mg / L, magnesium sulfate heptahydrate 2.4 g / L, ampicillin 50 ⁇ g / ml, liquid medium (pH 7.
  • a reaction solution composed of 700 ml of a culture solution adjusted to 50 OD with water, 50 g / l of glucose, 140 g / l of GlcNAc and 5 ml / l of xylene is placed in a 2.5 L culture tank, and the reaction solution is stirred (500 rpm).
  • the reaction was conducted at 32 ° C. for 44 hours.
  • the pH of the reaction solution was maintained at 7.2 using 10N NaOH.
  • the host E. coli can supply PEP in the presence of glucose as an energy donor, the reaction for producing NeuAc and the reaction for producing PEP are carried out simultaneously in the same aqueous medium. As a result, PEP was produced in the same aqueous medium, and NeuAc could be produced.
  • W3110 / pRcneuB2 was able to produce 10.4 g / L NeuAc that is more than 4 times W3110 / pCjneuB2 and more than 3 times W3110 / pEcneuB2.
  • a method for producing NeuAc using a microorganism obtained by transforming a parent strain with a recombinant DNA having a DNA encoding NeuAc synthase derived from Rhodobacter capsulatus is known as NeuAc synthase derived from a known pathogenic microorganism.
  • Microorganism A and microorganism B described in 1.7 above are each cultured overnight at 30 ° C. on an LB plate, inoculated into a large test tube containing 5 mL of LB medium, and 30 ° C. Incubate with shaking for 12 hours.
  • Test tube production medium [glucose 30 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / L, yeast extract 2 g / L, ammonium sulfate 20 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, sodium chloride 0.6 g / L, Thiamine hydrochloride 100 mg / L, Ferrous sulfate heptahydrate 20 mg / L, Manganese sulfate pentahydrate 20 mg / L, After adjusting to pH 7.5 with sodium hydroxide solution, Calcium carbonate 30 g / L, Glucose and magnesium sulfate heptahydrate aqueous solution are separately autoclaved, cooled and mixed with 0.5 mL in a large test tube containing 5 mL, and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution After completion of the culture, the culture solution is appropriately diluted and then centrifuged, and the NeuAc concentration of the supernatant is quantified by HPLC.
  • Test tube production medium [glucose 30 g / L, lactose 30 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g / L, yeast extract 2 g / L, ammonium sulfate 20 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, sodium chloride 0.6 g / L, thiamine hydrochloride 100 mg / L, ferrous sulfate heptahydrate 20 mg / L, manganese sulfate pentahydrate 20 mg / L, adjusted to pH 7.5 with sodium hydroxide solution, calcium carbonate 30 g / L, glucose and magnesium sulfate heptahydrate aqueous solution are autoclaved separately, inoculated 0.5 mL into a large test tube containing 5 mL of [mixed after cooling], and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours.
  • the culture solution After completion of the culture, the culture solution is appropriately diluted and then centrifuged, and the sialyl lactose concentration in the supernatant is quantified by HPLC.
  • NeuAc and NeuAc-containing carbohydrate can be efficiently produced. Moreover, the anxiety given to consumers can be reduced.
  • ⁇ represents W3110 / pRcneuB2
  • ⁇ represents W3110 / pCjneuB2
  • ⁇ represents W3110 / pEcneuB2.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明によれば、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、又は、該微生物の培養物若しくは該微生物の処理物を酵素源として用いることにより、また、該微生物を用いた発酵法により、効率的にＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。

Description

Ｎ－アセチルノイラミン酸及びＮ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
　本発明は、微生物、微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いたＮ－アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃという。）及びＮｅｕＡｃ含有糖質の効率的な製造法に関する。
　酵素を用いたＮｅｕＡｃ製造法としては、ＮｅｕＡｃアルドラーゼを酵素として、ピルビン酸及びＮ－アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃという。）を基質として用いる製造法（非特許文献１及び２）、アルカリ条件下で、ＮｅｕＡｃ酸アルドラーゼを酵素として、ピルビン酸及びＮ－アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという。）を基質として用いる製造法（特許文献１）、ＮｅｕＡｃ酸アルドラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼという。）を酵素として、ピルビン酸及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いる製造法（非特許文献３及び４）、並びにＮｅｕＡｃシンセターゼを酵素として、ホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰという。）及びＭａｎＮＡｃを基質として用いる製造法(特許文献２及び非特許文献５)が知られている。
　しかしながら、上記の酵素を用いたＮｅｕＡｃの製造法はいずれも、操作が煩雑である。
　効率的なＮｅｕＡｃの製造法としては、微生物を用いた製造法を挙げることができ、そのような例としては、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、及び病原性大腸菌Ｋ１株由来のＮｅｕＡｃシンセターゼを発現させた大腸菌を用いて、ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃを経てＮｅｕＡｃを製造する方法（特許文献３）、並びにＧｌｃＮＡｃ６リン酸エピメラーゼ、及び食中毒の原因微生物であるカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来のＮｅｕＡｃシンターゼを発現させた大腸菌を用いて、グリセロールを炭素源としてＮｅｕＡｃを製造する方法 (特許文献４)が知られている。
　また、微生物を用いたＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法としては、シチジン－５’－一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼという。）、シアリルトランスフェラーゼ、及びカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacterjejuni)由来のＮｅｕＡｃシンセターゼを発現させた大腸菌を用いた、グルコース及びラクトースからシアリルラクトースを製造する方法（特許文献５）が知られている。
　ＮｅｕＡｃシンターゼとしては、上記の病原性微生物由来の酵素以外にも、Ｂ群レンサ球菌ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来の酵素、髄膜炎菌ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)由来の酵素が実際にＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有することが確認されている。これらのＮｅｕＡｃシンターゼは、いずれも病原性微生物由来である。
　そもそも、ＮｅｕＡｃは哺乳類が有する糖であり、微生物が哺乳類の免疫系からの防御機構としてＮｅｕＡｃを生成することからも、これまで実際に活性を有することが確認されたＮｅｕＡｃ酸シンターゼが、全て哺乳類等に感染能をもつ病原性微生物由来であることは理解できる。
　非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼとしては、ゲノム配列の情報からその存在が示唆されているが、実際にＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有するかは知られていない。たとえ、これらの非病原性微生物が活性を有するＮｅｕＡｃシンターゼを有していたとしても、当該微生物は哺乳類の免疫系からの防御機構としてＮｅｕＡｃを生成する必要がないので、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性は弱いものと予測することができることから、微生物を用いたＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法において、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用する動機付けはなかった。
米国特許第５，６６５，５７４号公報 特開平１０－４９６１号公報 特開２００１－１３６９８２号公報 国際公開第ＷＯ２００８／０４０７１７号パンフレット 国際公開第ＷＯ２０１２／１１２７７７号パンフレット
J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol.110, p.6481-6486 J. Am. Chem. Soc. (1988), Vol.110, p.7159-7163 Angew. Chem. Int. Ed. Eng. (1991), Vol.30, p.827-828 Carbohydrate Research (1998), Vol.306, p.575-578 Glycobiology (1997), Vol. 7, p.697-701
　本発明の課題は、微生物、微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いた効率的なＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法を提供することにある。
　本発明は、以下の（１）～（１４）に関する。
（１）次の(ｉ）～（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、以下の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
（２）ＰＥＰが、上記（１）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、上記（１）に記載の製造法。
（３）次の(ｉ）～（ｉｉｉ）、
（ｉ）酵素源として、上記（１）の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の培養物、又はそれらの培養物の処理物、
（ｉｉ）基質として、シチジン－５’－三リン酸（以下、ＣＴＰという。）、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
（４）ＰＥＰが、上記（３）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、上記（３）に記載の製造法。
（５）ＣＴＰが、上記（３）に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させて得られるＣＴＰである、上記（３）又は（４）に記載の製造法。
（６）ＰＥＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（２）、（４）、又は（５）のいずれか１つに記載の製造法。
（７）ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（５）に記載の製造法。
（８）上記（１）の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物が、以下の［４］～［６］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の製造法。
［４］上記（１）の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
（９）ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物が、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物である、上記（１）～（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１０）ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物が、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、上記（３）～（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１１）シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物が、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物である、上記（３）～（７）のいずれか１つに記載の製造法。
（１２）上記（１）の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
（１３）上記（１）の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
（１４）親株が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、上記（８）～（１３）のいずれか１つに記載の製造法。
　本発明により、微生物、該微生物の培養物、又は該培養物の処理物を用いた効率的なＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法が提供される。
　また、本発明の製造法は、非病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用することから、従来の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用するＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法よりも、消費者に与える不安を軽減することができる。
微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造において、反応時間（横軸、単位は時間を表す）に対するＮｅｕＡｃの生成量（縦軸、単位はg/Lを表す）を示す図である。
1 本発明のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる微生物
1.1 以下の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物として、以下の
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質、又は
［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物を用いる。
　ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。
　ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを基質としてＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどがあげられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有していることは、後述する方法により該蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAでＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有さない微生物、例えばエシェリヒア・コリＷ3110株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰと接触させ、結果として生成するＮｅｕＡｃを高速クロマトグラフィー又はガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
　上記の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の例としては、ロドバクター属に属する微生物、フラボバクテリウム属に属する微生物、及び以下の
［４］上記［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
［７］配列番号１又は３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
　ロドバクター属に属する微生物としては、好ましくは、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）NBRC16581株を挙げることができる。フラボバクテリウム属に属する微生物としては、好ましくは、フラボバクテリウム・サイクロフィラム(Flavobacteriumpsychrophilum) NBRC 100250株を挙げることができる。
　上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのDNAであってもよい。プローブとして用いるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
　DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第2版、第3版（2001年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、例えばDNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50％ホルムアミド、5×SSC（750 ｍMの塩化ナトリウム、75 mMのクエン酸ナトリウム）、50 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20 μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42 ℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65 ℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができる。
　上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTおよびFASTA等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１または３で表される塩基配列と少なくとも95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAをあげることができる。
　また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることができる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
　上記の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
　親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは、原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21 codon plus（ストラタジーン社製）、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratiamarcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、若しくはPseudomonas sp. D-0110等の原核生物、又はSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、若しくはCandida utilis等の酵母菌株を挙げることができる。
　該親株は、ＮｅｕＡｃの分解活性が低下した微生物細胞を用いるのが好ましい。そのような微生物としては、例えばＮｅｕＡｃリアーゼ活性が低下した微生物をあげることができ、具体的には、Escherichia coli NAN8-71 (FERMBP-7908, WO03/72783)をあげることができる。
　また、後述する1.5又は1.6の微生物も、本発明の製造法に用いられる微生物の親株として用いることができる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385] pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、P54-6プロモーター［Appl.　Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
　親株を、該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物をいう。
　また、該微生物は、上記［２］の変異蛋白質を生産することにより、ＮｅｕＡｃシンターゼの比活性が増強した微生物であってもよい。
　上記［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　ＮｅｕＡｃシンターゼの比活性が増強したことを確認する方法としては、例えば、該変異蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該変異蛋白質を精製し、該蛋白質、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したＮｅｕＡｃと該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した変異が導入されていないＮｅｕＡｃシンターゼの比活性と比較することにより確認することができる。
　親株を、上記［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物は、以下の方法で造成することができる。
　上記［４］のＤＮＡのうち上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号１または３で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、ロドバクター属又はフラボバクテリウム属に属する微生物、より好ましくは、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）NBRC16581株又はフラボバクテリウム・サイクロフィラム (Flavobacteriumpsychrophilum) NBRC 100250株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ [PCR Protocols, Academic Press (1990)] により取得することができる。
　ロドバクター・カプスラタスNBRC16581株及びフラボバクテリウム・サイクロフィラムNBRC 100250株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（NITE Biological Resource Center）から入手することができる。
　上記［４］のＤＮＡのうち上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］及び［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１又は３で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
　上記［４］のＤＮＡのうち上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの5'端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Gene, 77, 51 (1989)］によっても、上記の［２］のＤＮＡを取得することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの5'端に対応するセンスプライマーと、5'端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（5'側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの5'端から変異導入部位までの断片Ａ（3'端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、5'端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（3'側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの3'端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、5'端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から3'端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
　取得した上記の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
　上記の宿主細胞としては、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347、Escherichia coli NM522等を挙げることができる。
　上記のベクターとしては、pBluescriptIIKS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT　[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
　このような組換え体ＤＮＡの例としては、後述するpRcneuB及びpFpneuBを挙げることができる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等の方法を挙げることができる。
　組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、相同組換え法を挙げえることができる。例えば、相同組換え法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、上記［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡの転写量、該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　このような微生物の例としては、後述するW3110/pRcneuB及びW3110/pFpneuBを挙げることができる。
1.2 ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物を用いる。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼとは、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する蛋白質をいう。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性とは、ＣＴＰ及びＮｅｕＡｃを基質として、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃを生成する活性をいう。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物の例としては、パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物、又は、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
　パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株を挙げることができる。
　ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ　PM70株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（特願2008-5794)を挙げることができる。
　例えば、パスツレラ・マルトシダ　PM70株由来のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、特願2008-5794に記載された方法で取得することができる。
　該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
　該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　このような微生物の例としては、Escherichiacoli N18-14/pMnK1（特開2008-5794）を挙げることができる。
　また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であってもよい。
　このとき、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及びＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡは、同一の組換え体ＤＮＡに存在していてもよく、別々の組み換え体ＤＮＡに存在していてもよい。
1.3 シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物を用いる。
　シアリルトランスフェラーゼとは、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をいう。
　シアリルトランスフェラーゼ活性とは、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ及び受容体糖質を基質として、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する活性をいう。
　本発明の製造法において、基質として用いられる受容体糖質としては、シアリルトランスフェラーゼの基質になるものであれば、オリゴ糖、多糖、ならびに糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質などいずれでもよい。
　シアリルトランスフェラーゼの基質となるオリゴ糖または多糖としては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖または多糖、あるいは非還元末端にＮｅｕＡｃを有するオリゴ糖または多糖をあげることができ、好ましくは非還元末端にラクトース、グロボトリオース、Ｎ‐アセチルラクトサミン、ラクト‐Ｎ‐テトラオース、ラクト‐Ｎ‐ネオテトラオース、ルイスaおよびルイスＸからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、または非還元末端にNeuAcα2-Galβ1-4GlcおよびNeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖、より好ましくはラクトースをあげることができる。
　複合糖質としては、上記したオリゴ糖及び多糖に蛋白質又は脂質等が結合した複合糖質をあげることができる。
　ＮｅｕＡｃ含有糖質としては、上記した受容体糖質にＮｅｕＡｃが付加した糖質、好ましくは、非還元末端にＮｅｕＡｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、ＮｅｕＡｃα２－６Ｇａｌβ１－４ＧｌｃおよびＮｅｕＡｃα２－８ＮｅｕＡｃからなる群より選ばれる構造を有するオリゴ糖を含む糖質をあげることができ、より好ましくは３´‐シアリルラクトースまたは６´‐シアリルラクトースをあげることができる。
　シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の例としては、パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物、フォトバクテリウム属（Photobacterium）に属する微生物、又は、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
　パスツレラ属（Pasteurella）に属する微生物としては、好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株を挙げることができる。フォトバクテリウム属（Photobacterium）に属する微生物としては、好ましくは、Photobacterium damselae JT0160株を挙げることができる。
　シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurellamultocida） PM70株由来のα-2,3-sialyltransferaseをコードするＤＮＡ （WO03/27297）、又はPhotobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferase (GenBank ACCESSION No. BAA25316)をコードするＤＮＡなどを挙げることができる。
　例えば、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida） PM70株由来のα-2,3-sialyltransferaseをコードするＤＮＡ及びPhotobacterium damselae JT0160株由来のα-2,6-sialyltransferaseをコードするＤＮＡは、WO03/27297に記載された方法で取得することができる。
　該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
　該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、シアリルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　このような微生物の例としては、Escherichiacoli NM522/pYP3（特開2008-5794）を挙げることができる。
　また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、又はＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりも、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性又はＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物であってもよい。
　このとき、シアリルトランスフェラーゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、１～３種類の、好ましくは１～２種類の、最も好ましくは１種類の組換え体ＤＮＡに、任意の組み合わせで別々に存在していてもよい。
1.4　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、ＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造が、ＧｌｃＮＡｃを基質として行われる場合には、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物を用いる。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼとは、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する蛋白質をいう。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性とは、ＧｌｃＮＡｃを基質として、エピメリ化反応により、ＭａｎＮＡｃを生成する活性をいう。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の例としては、シネコシスティス属（Synechocystis）に属する微生物、又は、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
　シネコシスティス属（Synechocystis）に属する微生物としては、好ましくは、Synechocystis sp. PCC6803株(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, INSTITUTE PASTEUR)を挙げることができる。
　ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物または酵母由来の、特に好ましくは原核生物由来の、最も好ましくは、Synechocystis sp. PCC6803株由来の、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを挙げることができる。
　例えば、Synechocystis sp. PCC6803株由来のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡは、WO00/47730に記載された方法で取得することができる。
　該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記1.1に記載の方法に従って作成することができる。
　親株を、該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物は、上記1.1に記載の方法に従って造成することができる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　このような微生物の例としては、後述するW3110/pRcneuB2を挙げることができる。
　また、該微生物を、さらに上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、及びシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、親株よりも、ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる蛋白質の活性が増強された微生物であってもよい。
　このとき、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、ＮｅｕＡｃシンターゼ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、１～４種類の、好ましくは１～３種類の、より好ましくは１又は２種類の、最も好ましくは１種類の組換え体ＤＮＡに、任意の組み合わせで別々に存在していてもよい。
1.5 ＰＥＰを生成、蓄積する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ又はＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法では、基質であるＰＥＰは、ＰＥＰを生成、蓄積する微生物によって供給されてもよい。
　該微生物としては、糖等のエネルギー供与体からＰＥＰを生成、蓄積する微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、エシェリヒア属若しくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、又はサッカロマイセス属に属する酵母菌株を、最も好ましくは、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエ等を挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、特開平6-197778に記載の株をあげることができる。
　また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、糖等のエネルギー供与体からＰＥＰを生成する活性を増強した微生物を用いることもできる。
1.6 ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物及び該微生物を造成する方法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法では、基質であるＣＴＰは、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物によって供給されてもよい。
　該微生物としては、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物であれば特に制限はないが、好ましくは、エシェリヒア属若しくはコリネバクテリウム属に属する原核生物、又はサッカロマイセス属に属する酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、サッカロマイセス・セレビシエ等を、最も好ましくは、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを挙げることができる。
　また、変異手法あるいは遺伝子組換え手法により、ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成する活性を増強した微生物を用いることもできる。
　ＣＴＰ前駆物質としては、微生物が代謝してＣＴＰに変換できる物質であればいずれでもよく、好ましくはオロット酸、ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジン、ＣＭＰ、ＵＴＰおよびＵＭＰをあげることができ、より好ましくはオロット酸およびＣＭＰ、さらに好ましくはオロット酸を挙げることができる。
1.7 上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物及び該微生物の造成法
　本発明のＮｅｕＡｃの発酵法による製造法には、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を用いる。
　糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物とは、後述の2.3の方法で該微生物を培地に培養したときに、該糖を出発基質として、ＭａｎＮＡｃを該微生物の細胞中に生成、蓄積する微生物をいう。
　そのような微生物としては、糖を出発基質としてＭａｎＮＡｃを生成する微生物である限りにおいて制限はないが、例えば、ＮｅｕＡｃを生産することが知られている、特許文献４の実施例４に記載されたSI2株を、又は、国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を親株として、上記1.1の方法により、上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物を挙げることができる。
　上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物は、例えば、特許文献４の実施例４に記載されたpBS-neuBCプラスミドを有する株SI2において、pBS-neuBCプラスミドが有するＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（neuB）を上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載されたＤＮＡに置き換えた微生物（以下、微生物Ａという。）、又は上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載されたＤＮＡ及び上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を形質転換した微生物を挙げることができる（7107-607(2)株を親株として造成された微生物を、微生物Ｂという。）。
1.8 上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物及び該微生物の造成法
　本発明の発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法には、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を用いる。
　糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物については、上記1.7と同じである。
　上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物としては、例えば、上記1.1の方法によって造成される特許文献５の実施例７に記載されたneuABC、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びバクテリアタイプのα(2,3)シアリルトランスフェラーゼを発現するプラスミドを有するE547株において、当該プラスミドが有するＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ（neuB）を上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡに置き換えた微生物（以下、微生物Ｃという。）、又は上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載されたＤＮＡ、上記1.4のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡ、上記1.2のＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及び上記1.4のシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを任意の組み合わせですべて有する１乃至４種類の組換え体ＤＮＡで、国際公開第ＷＯ２００４／００３１７５号パンフレットの実施例１４に記載されたＧｌｃＮＡｃ生産株である7107-607(2)、7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)又は7107-661(3)株等を形質転換した微生物を挙げることができる（7107-607(2)株を親株として造成された微生物を、微生物Ｄという。）。
2　本発明のＮｅｕＡｃの製造法
2.1　ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造法
　本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物（以下、2.1の微生物という。）の培養物、又は該培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
　2.1の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
　窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
　無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
　培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15～40℃がよく、培養時間は、通常5時間～7日間である。培養中pHは3.0～9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
　本明細書において、培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素を、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物を、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものをあげることができる。
　酵素源の量は、用いる各酵素源について、１～５００ｇ／ｌであり、好ましくは１～３００ｇ／ｌである。
　ＭａｎＮＡｃ及びＰＥＰの濃度は、0.1ｍＭ～10Ｍであり、好ましくは1ｍＭ～1Ｍである。
　水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
　ＮｅｕＡｃの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ＮｅｕＡｃの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
　有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１～５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。ＮｅｕＡｃの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１～１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
　上記のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、2.1の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
　2.1の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、2.1の微生物がＮｅｕＡｃの製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
　エネルギー供与体としては、該微生物が代謝することができ、かつアデノシン‐５´‐三リン酸（以下ＡＴＰと略す）などのエネルギー物質を生産させることができる物質であればいずれでもよく、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ‐アセチルノイラミン酸等の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解物等をあげることができる。
　エネルギー供与体の濃度は、通常１０～３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
　水性媒体中に生成したＮｅｕＡｃの定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＮｅｕＡｃの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
2.2　ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造法
　本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、2.2の微生物という。）の培養物、又は該培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
　2.2の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
　上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＧｌｃＮＡｃ及びＰＥＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
　2.2の微生物は、上記1.4に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.4に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［４］～［７］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有していてもよい。2.2の微生物が２種類からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
　酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
　ＧｌｃＮＡｃの濃度は、0.1ｍＭ～10Ｍであり、好ましくは1ｍＭ～1Ｍである。
　水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
　上記のＮｅｕＡｃの製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、2.2の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産することもできる。
　2.2の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、2.2の微生物がＮｅｕＡｃの製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
　エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
　エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
　ＮｅｕＡｃの定量方法及び採取方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。
2.3　発酵法によるＮｅｕＡｃの製造法
　本発明のＮｅｕＡｃの製造法のうち、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法について、以下説明する。
　該微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
　上記の培養により、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することにより、ＮｅｕＡｃを製造することができる。
　ＮｅｕＡｃの定量方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。
　該培養物中からのＮｅｕＡｃの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＮｅｕＡｃが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＮｅｕＡｃを採取することができる。
3 本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
3.1　ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ、及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、3.1の微生物という。）の培養物、又はそれらの培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
　3.1の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
　上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＭａｎＮＡｃ、ＰＥＰ、受容体糖質、及びＣＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
　3.1の微生物は、上記1.2及び1.3に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.2及び1.3に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、及びシアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有していてもよい。3.1の微生物が２種類以上からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
　酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
　ＭａｎＮＡｃの濃度は、上記2.1の記載と同じである。
　受容体糖質の濃度は、１ｍＭ～３Ｍであり、好ましくは５０ｍＭ～１Ｍである。
　水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
　上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、3.1の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
　3.1の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、3.1の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
　上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＣＴＰは、特に制限はなく、市販のＣＴＰを用いてもよいし、3.1の微生物若しくは上記1.6の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＣＴＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＣＴＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
　ＣＴＰ前駆物質の濃度は、１ｍＭ～１Ｍである。
　3.1の微生物の親株に上記1.6の微生物を用いた場合や、3.1の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＣＴＰを供給できる場合は、上記1.6の微生物を用いることを要しない。
　エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
　エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
　水性媒体中に生成したＮｅｕＡｃ含有糖質の定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＮｅｕＡｃ含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
3.2　ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ、及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物、シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物（これらの微生物を以下、3.2の微生物という。）の培養物、又はそれらの培養物の処理物、（ｉｉ）基質として、ＣＴＰ、受容体糖質、ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃ、を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
　3.2の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地を用いることができる。
　上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、ＧｌｃＮＡｃ、ＰＥＰ、受容体糖質、及びＣＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
　3.2の微生物は、上記1.2、1.3及び1.4に記載のとおり、異なる親株から造成された別個の微生物であってもよく、上記1.2、1.3及び1.4に記載のとおり、一の微生物が、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡからなる群より選ばれるＤＮＡを有していてもよい。3.2の微生物が２種類以上からなる微生物であるときは、それぞれの微生物を培養した後、それぞれの培養物又は該培養物の処理物を混合して上記の酵素源とすることができる。
　酵素源の量は、上記2.1の記載と同じである。
　ＧｌｃＮＡｃの濃度は、上記2.2の記載と同じである。
　受容体糖質の濃度は、上記3.1の記載と同じである。
　水性媒体としては、上記2.1に記載の水性媒体を用いることができる。
　上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＰＥＰは、特に制限はなく、市販のＰＥＰを用いてもよいし、3.2の微生物若しくは上記1.5の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＰＥＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
　3.2の微生物の親株に上記1.5の微生物を用いた場合や、3.2の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＰＥＰを供給できる場合は、上記1.5の微生物を用いることを要しない。
　上記のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法に用いられる基質のＣＴＰは、特に制限はなく、市販のＣＴＰを用いてもよいし、3.2の微生物若しくは上記1.6の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させ、該媒体中から採取することによって得られたＣＴＰを用いてもよい。さらにＮｅｕＡｃ含有糖質を生成する反応とＣＴＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＣＴＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃ含有糖質を生産することもできる。
　ＣＴＰ前駆物質の濃度は、上記3.1の記載と同じである。
　3.2の微生物の親株に上記1.6の微生物を用いた場合や、3.2の微生物がＮｅｕＡｃ含有糖質の製造に十分なＣＴＰを供給できる場合は、上記1.6の微生物を用いることを要しない。
　エネルギー供与体としては、上記2.1に記載のエネルギー供与体を用いることができる。
　エネルギー供与体の濃度は、上記2.1の記載と同じである。
　ＮｅｕＡｃ含有糖質の定量方法及び採取方法は、上記3.1に記載の方法を用いることができる。
3.3　発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法
　本発明のＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法のうち、上記1.1の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法について、以下説明する。
　該微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　該微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
　受容体糖質は、培養の最初に添加してもよく、培養の途中から必要に応じて添加してもよい。添加する受容体糖質の濃度は、１０～３００ｇ／ｌの濃度で用いられる。
　上記の培養により、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することにより、ＮｅｕＡｃ含有糖質を製造することができる。
　ＮｅｕＡｃ含有糖質の定量方法は、上記3.1に記載の方法を用いることができる。
　該培養物中からのＮｅｕＡｃ含有糖質の採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＮｅｕＡｃ含有糖質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、ＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することができる。
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
(1) ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
　ロドバクター・カプスラタスNBRC16581株を公知の方法[Arch Microbiol105, 207-216. 1975]により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号５及び６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　大腸菌W3110株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号７及び８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、大腸菌W3110株のトリプトファンプロモーターを含む約0.4ｋｂのＤＮＡ断片（以下、Ptrp断片という。）を精製した。
　発現ベクターであるpUC18〔Gene, 33, 103 (1985)〕を制限酵素HindIII及びBamHIで切断し、2.7ｋｂのＤＮＡ断片（以下、pUC18HindIIIBamHI断片という）を精製した。
　上記の3種類のＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pRcneuBを造成した。
(2) フラボバクテリウム・サイクロフィラム由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
　フラボバクテリウム・サイクロフィラム NBRC 100250株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　当該ＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びpUC18HindIIIBamHI断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pFpneuBを造成した。
(3) ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
　W3110/pRcneuB及びW3110/pFpneuBをアンピシリン50 mg/mlを含むＬＢ培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）10 g/l、酵母エキス（ディフコ社製）5 g/l、塩化ナトリウム5 g/l]　5 mlの入った太型試験管に接種し、30℃で16 時間培養した。該培養液をアンピシリン50 mg/mlを含むＬＢ培地 50 ml の入ったバッフル付三角フラスコに10％接種し、30℃、220rpmで8時間培養した。該培養液 40ml分を遠心分離し湿菌体を取得した。
　各菌株の培養液各40 ml分を、反応バッファー(0.1Mビシンバッファー（pH 8.0）、10mM塩化マンガン)で一回洗浄したのち、4mlの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行った。 破砕後 18,000×gで5分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取した。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いた。
　反応は12.5mMのＭａｎＮＡｃ、ＰＥＰ (共にシグマ・アルドリッチ社製)を含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度0.25 mg/mlになるように添加して、30℃、330rpmで振とうすることによって行った。反応開始後90分が経過した時点で1/4量の6.7Mリン酸を添加することで反応を終了させた。
　ＮｅｕＡｃの分析は、ダイオネックス社製の分析装置 DX-500を用いて以下の条件で行った。(カラム：Cabopac PA-10、分析温度：30℃、流速：0.8ml/min、溶離液A組成：500mM NaOH、溶離液B組成：100mM NaOH/500mM NaOAc、溶離液C組成： 脱イオン水　溶離グラジエント条件：分析開始0分から10分まで A:B:C = 1 : 1 : 98 → A:B:C = 4 : 4 : 92、分析開始10分から15分まで A:B:C = 20:16:64 → 35:35:30、分析開始15分から22分まで A:B:C = 50:50:0　検出器：パルスドアンペロメトリー検出器)
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果より、ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物、又はフラボバクテリウム・サイクロフィラム由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物が、ＮｅｕＡｃの製造に利用できることが示された。
　上記のＮｅｕＡｃシンターゼは非病原性微生物由来であることから、本発明のＮｅｕＡｃ製造法は、従来の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼを利用するＮｅｕＡｃ製造法と比較して、消費者に与える不安を軽減することができる。
ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
(1) ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡ及びシアノバクテリア由来のＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物の造成
　シネコシスティス・エスピーPCC680株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIで切断し、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ断片という。）を精製した。
　実施例１(1)で造成したW3110/pRcneuBから定法によって抽出したプラスミドpRcneuBをHindIIIで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　上記の２種類のＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pRcneuB2を造成した。
(2) 本発明の製造法に用いる微生物を評価するための微生物の造成
　本発明の製造法に用いる微生物を評価するため、既知の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を造成した。
　カンピロバクター・ジェジュニATCC 43438株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びHindIIIで切断し、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　当該ＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びpUC18HindIIIBamHI断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pCjneuBを造成した。
　W3110/pCjneuBから定法によって抽出したプラスミドpCjneuBをHindIIIで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　当該約4.1ｋｂのＤＮＡ断片及びＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110 W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pCjneuB2を造成した。
　大腸菌K235 ATCC 13027株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素KpnI及びSse8387Iで切断し、ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　当該約１ｋｂのＤＮＡ断片並びにPtrp断片及びあらかじめPstI及びBamHIで切断したpUC18断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換することにより、W3110/pEcneuBを造成した。
　W3110/pEcneuBから定法によって抽出したプラスミドpEcneuBをSse8387Iで切断し、約4.1ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　シネコシスティス・エスピーPCC680株を公知の方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素Sse8387Iで切断し、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
　上記のSse8387Iで切断した約4.1ｋｂのＤＮＡ断片及びSse8387Iで切断した約1ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションキットを用いて連結し、該連結反応液を用いてEscherichia coli W3110株を形質転換した。該形質転換体のうち、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡがトリプトファンプロモーターの制御により発現する形質転換体をＰＣＲ法を用いて選択し、W3110/pEcneuB2を造成した。
(3) ＰＥＰ及びＧｌｃＮＡｃを基質として用いるＮｅｕＡｃの製造
　W3110/pRcneuB2、W3110/pCjneuB2、及びW3110/pEcneuB2をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地 50ｍｌの入った300mＬ容バッフル付き三角フラスコに接種し、30℃で２２０ｒｐｍの条件で１6時間培養した。該培養液30ｍｌをグルコース 5ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル社製）５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム ３ｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム 6ｇ／ｌ、塩化アンモニウム 1g/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、ウラシル 30mg/L、硫酸鉄七水和物0.2g/L、チアミン 8mg/L、硫酸マグネシウム七水和物 2.4 g/L、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ7.0）０．８Ｌの入った２．５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で培養した。攪拌は６００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分の条件で培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを添加した。培養開始後十分時間が経ち、OD 660nmが50を超えた段階で該培養液を用いて反応を行った。
　水でODを50に調整した培養液700ml、グルコース50ｇ／ｌ、ＧｌｃＮＡｃ １４０ｇ／ｌ、キシレン５ｍｌ／ｌの組成からなる反応液を２．５Ｌ容培養槽に入れ、該反応液を攪拌（500ｒｐｍ）し、３２℃で44時間反応を行った。反応中、10Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持した。
　なお、本反応においては、宿主の大腸菌がエネルギー供与体であるグルコースの存在下によりＰＥＰを供給することができるので、ＮｅｕＡｃを生成する反応とＰＥＰを生産する反応を同一の水性媒体中で同時に行うことにより、同一の水性媒体中でＰＥＰを生成させるとともに、ＮｅｕＡｃを生産させることができた。
　結果を表２及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　W3110/pRcneuB2ではW3110/pCjneuB2の４倍以上、W3110/pEcneuB2の３倍以上である10.4ｇ/LのＮｅｕＡｃを生産することができた。
　以上の結果から、ロドバクター・カプスラタス由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造法は、既知の病原性微生物由来のＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物を用いたＮｅｕＡｃの製造法と比較して、消費者の不安を軽減することができるだけではなく、より効率的にＮｅｕＡｃを製造できることが示された。
発酵法によるＮｅｕＡｃの製造
　上記1.7に記載の微生物Ａ及び微生物Ｂを、それぞれLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養する。試験管生産培地［グルコース　30g/L、硫酸マグネシウム７水和物　0.5 g/L、イーストエキストラクト 2g/L、硫酸アンモニウム　20g/L、リン酸二水素カリウム 2 g/L、塩化ナトリウム0.6 g/L、チアミン塩酸塩 100mg/L、硫酸第一鉄七水和物　20 mg/L、硫酸マンガン五水和物　20 mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.5に調整後、炭酸カルシウム 30 g/L、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.5mL植菌し、30℃で48時間、振盪培養する。
　培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のＮｅｕＡｃ濃度をHPLCにて定量する。
発酵法によるＮｅｕＡｃ含有糖質の製造
　上記1.7に記載の微生物Ｃを、それぞれLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養する。試験管生産培地［グルコース　30g/L、ラクトース　30g/L、硫酸マグネシウム７水和物　0.5 g/L、イーストエキストラクト 2g/L、硫酸アンモニウム　20g/L、リン酸二水素カリウム 2 g/L、塩化ナトリウム0.6 g/L、チアミン塩酸塩 100mg/L、硫酸第一鉄七水和物　20 mg/L、硫酸マンガン五水和物　20 mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.5に調整後、炭酸カルシウム 30 g/L、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.5mL植菌し、30℃で48時間、振盪培養する。
　培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のシアリルラクトース濃度をHPLCにて定量する。
　本発明により、ＮｅｕＡｃ及びＮｅｕＡｃ含有糖質を効率的に製造することができる。また、消費者に与える不安を軽減することができる。
　図１において、●はW3110/pRcneuB2を、■はW3110/pCjneuB2を、▲はW3110/pEcneuB2を示す。
配列番号５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７－人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８－人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (14)

  1. 次の(ｉ）～（ｉｉｉ）、
    （ｉ）酵素源として、以下の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
    （ｉｉ）基質として、ホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰという。）及びＮ－アセチルマンノサミン（以下、ＭａｎＮＡｃという。）又はＮ－アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃという。）、並びに
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＮ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ（以下、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼという。）を生産する微生物の培養物又は該培養物の処理物、
    を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮ－アセチルノイラミン酸（以下、ＮｅｕＡｃという。）を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
    ［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
    ［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する変異蛋白質
    ［３］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質
  2. ＰＥＰが、請求項１に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、請求項１に記載の製造法。
  3. 次の(ｉ）～（ｉｉｉ）、
    （ｉ）酵素源として、請求項１の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物、シチジン－５’－一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸シンターゼ（以下、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼという。）を生産する微生物、及びシアリルトランスフェラーゼを生産する微生物の培養物、又はそれらの培養物の処理物、
    （ｉｉ）基質として、シチジン－５’－三リン酸（以下、ＣＴＰという。）、受容体糖質、ＰＥＰ及びＭａｎＮＡｃ又はＧｌｃＮＡｃ、並びに
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）において、ＧｌｃＮＡｃを基質として用いる場合は、さらに酵素源としてＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物の培養物、又は該培養物の処理物、
    を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該水性媒体からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
  4. ＰＥＰが、請求項３に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＰＥＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＰＥＰを生成、蓄積させて得られるＰＥＰである、請求項３に記載の製造法。
  5. ＣＴＰが、請求項３に記載のいずれか１種以上の微生物若しくはＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物の培養物、又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、ＣＴＰ前駆物質、及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＣＴＰを生成、蓄積させて得られるＣＴＰである、請求項３又は４に記載の製造法。
  6. ＰＥＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項２、４、又は５のいずれか１項に記載の製造法。
  7. ＣＴＰ前駆物質からＣＴＰを生成、蓄積する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項５に記載の製造法。
  8. 請求項１の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産する微生物が、以下の［４］～［６］のいずれかに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造法。
    ［４］請求項１の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［５］配列番号１又は３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
    ［６］配列番号１又は３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＮｅｕＡｃシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
  9. ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを生産する微生物が、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性が増強された微生物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造法。
  10. ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼを生産する微生物が、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ活性が増強された微生物である、請求項３～７のいずれか１項に記載の製造法。
  11. シアリルトランスフェラーゼを生産する微生物が、シアリルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもシアリルトランスフェラーゼ活性が増強された微生物である、請求項３～７のいずれか１項に記載の製造法。
  12. 請求項１の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質を生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃを生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃを採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃの製造法。
  13. 請求項１の［１］～［３］のいずれかに記載の蛋白質、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃシンターゼ、及びシアリルトランスフェラーゼを生産し、かつ、糖からＭａｎＮＡｃを生成する微生物を受容体糖質を含有する培地に培養し、培養物中にＮｅｕＡｃ含有糖質を生成、蓄積させ、該培養物中からＮｅｕＡｃ含有糖質を採取することを特徴とする、ＮｅｕＡｃ含有糖質の製造法。
  14. 親株が、エシェリヒア属に属する微生物又はコリネ型細菌である、請求項８～１３のいずれか１項に記載の製造法。
PCT/JP2014/074181 2013-09-12 2014-09-12 Ｎ－アセチルノイラミン酸及びｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 WO2015037698A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015536641A JP6441806B2 (ja) 2013-09-12 2014-09-12 Ｎ−アセチルノイラミン酸及びｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-189331 2013-09-12
JP2013189331 2013-09-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015037698A1 true WO2015037698A1 (ja) 2015-03-19

Family

ID=52665796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/074181 WO2015037698A1 (ja) 2013-09-12 2014-09-12 Ｎ－アセチルノイラミン酸及びｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6441806B2 (ja)
WO (1) WO2015037698A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022219187A1 (en) * 2021-04-16 2022-10-20 Inbiose N.V. Cellular production of bioproducts
WO2023058772A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 協和発酵バイオ株式会社 Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH104961A (ja) * 1996-06-18 1998-01-13 Marukin Shoyu Kk Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びこれを用いるｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法
JP2001136982A (ja) * 1999-08-30 2001-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
WO2003072783A1 (fr) * 2002-02-28 2003-09-04 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique
JP2008005794A (ja) * 2006-06-30 2008-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
WO2012112777A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH104961A (ja) * 1996-06-18 1998-01-13 Marukin Shoyu Kk Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びこれを用いるｎ−アセチルノイラミン酸の製造方法
JP2001136982A (ja) * 1999-08-30 2001-05-22 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
WO2003072783A1 (fr) * 2002-02-28 2003-09-04 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique
JP2008005794A (ja) * 2006-06-30 2008-01-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
WO2012112777A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUCHAUD E. ET AL.: "Complete genome sequence of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum", NAT. BIOTECHNOL., vol. 25, no. 7, 2007, pages 763 - 9 *
STRNAD H. ET AL.: "Complete genome sequence of the photosynthetic purple nonsulfur bacterium Rhodobacter capsulatus SB 1003", J. BACTERIOL., vol. 192, no. 13, 2010, pages 3545 - 6 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022219187A1 (en) * 2021-04-16 2022-10-20 Inbiose N.V. Cellular production of bioproducts
WO2023058772A1 (ja) 2021-10-08 2023-04-13 協和発酵バイオ株式会社 Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015037698A1 (ja) 2017-03-02
JP6441806B2 (ja) 2018-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7244613B2 (ja) 希少糖の製造法
JP7035024B2 (ja) テアニンの製造方法
JP3946423B2 (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
WO2022168992A1 (ja) １，３－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
WO2023238843A1 (ja) ３'－シアリルラクトースの生産性が向上した微生物および３'－シアリルラクトースの製造方法
JP6441806B2 (ja) Ｎ−アセチルノイラミン酸及びｎ−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
JPWO2002050267A1 (ja) Ｕｄｐ−ｎ−アセチルガラクトサミンおよびｎ−アセチルガラクトサミン含有糖質の製造法
WO2023120615A1 (ja) コア３糖としてラクト－ｎ－トリオースｉｉを含む糖質の製造方法および該糖質の結晶の製造方法
JP5079272B2 (ja) シチジン‐５´‐一リン酸‐ｎ‐アセチルノイラミン酸およびｎ‐アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法
WO2022168991A1 (ja) フコース含有糖質の輸送活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
EP4400588A1 (en) Recombinant microorganism used for producing cdp-choline, and method for producing cdp-choline using said recombinant microorganism
WO2023182528A1 (ja) α１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰＩ）の製造方法
WO2023153461A1 (ja) ルイスｘ骨格を有するオリゴ糖の製造法
WO2023182527A1 (ja) ラクトジフコテトラオース（ｌｄｆｔ）の製造法
WO2023058772A1 (ja) Ｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたｎ－アセチルノイラミン酸及び／又はｎ－アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法
WO2022176994A1 (ja) 改変されたα１，２－フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質及びフコース含有糖質の製造法
US20240301456A1 (en) Protein having 1,3-fucosyltransferase activity, and method for producing fucose-containing sugar
WO2021125245A1 (ja) 改変されたラクトースパーミアーゼを有する微生物及びラクトース含有オリゴ糖の製造法
JP2003274948A (ja) Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法
WO2021261564A1 (ja) ジペプチドの製造法
WO2023210244A1 (ja) Ｎａｍｐｔ活性を有する蛋白質およびｎｍｎの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14843890

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015536641

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14843890

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1