CN116848248A - 具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白和含有岩藻糖的糖质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，提供参与含有岩藻糖的糖质的转运的蛋白、和利用具有生产蛋白的能力的微生物高效地制造含有岩藻糖的糖质的方法。本发明涉及下述任一蛋白：[1]由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的蛋白；[2]由在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白；[3]由与序列号2或4所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白。

Description

具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白和含有岩藻糖的糖 质的制造方法
技术领域
本发明涉及与含有岩藻糖的糖质的排出相关的转运体和3-岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质的制造方法。
背景技术
据报道，人类母乳中所含的母乳低聚糖(HMO)具有作为益生元的肠内环境的改善作用、免疫激活、婴幼儿的认知功能发育等保健功能，由于其生理活性，被期待用作幼儿用配方奶粉中的添加剂、面向成人的保健功能材料(非专利文献1)。
作为HMO而已知的糖质中，2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质以物质的量比计占HMO整体的约60％(非专利文献2)，功能性在HMO中也尤其引人注目。
作为含有岩藻糖的糖质的制造方法，广泛使用利用了岩藻糖转移酶的微生物发酵法。非专利文献3公开了一种方法，其使用表达来自幽门螺杆菌((Helicobacter pylori))、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)等微生物的岩藻糖转移酶的微生物，以乳糖和GDP-岩藻糖为底物，通过发酵法来生产2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖。
专利文献1中公开了，大肠杆菌中作为与糖的排出相关的转运体而已知的SetA蛋白也参与2’-岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质的转运，并且公开了通过使该蛋白过量表达来提高含有岩藻糖的糖质的生产率的方法。
SetA蛋白是主要协同转运蛋白超家族(Major Facilitator Superfamily，MFS)转运体中属于SET家族的转运蛋白(非专利文献4)，但是，除此以外，尚不知晓同样属于SET家族且参与含有岩藻糖的糖质的转运的其它蛋白。
作为与SetA蛋白同样地负责转运低聚糖的转运体，公开了属于SP家族的粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)来源的CDT2蛋白与2’-岩藻糖基乳糖的转运相关(非专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本国专利第5580408号公报
非专利文献
非专利文献1：Int J Pediatrics(2019)2390240：1-8
非专利文献2：Curr Opin Biotechnol(2019)56：130-137
非专利文献3：Metabolic Engineering(2017)41：23-38
非专利文献4：J Biol Chem(1999)274：22977-22984
非专利文献5：Metabolic Engineering(2019)52：232-242
发明内容
发明所要解决的问题
但是，除了SetA蛋白、CDT2蛋白以外，尚无报道与含有岩藻糖的糖质的排出相关的蛋白，作为实现高效率的含有岩藻糖的糖质的制造方法的手段，需要进一步探索参与含有岩藻糖的糖质的转运的蛋白。
因此，本发明的目的在于，提供参与含有岩藻糖的糖质的转运的蛋白、以及利用具有生产蛋白的能力的微生物高效地制造含有岩藻糖的糖质的方法。
用于解决问题的方法
本发明人发现，通过使用具有生产含有特定氨基酸序列且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白的能力的微生物，与以往方法相比能够高效地制造3-岩藻糖基乳糖，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
1.下述[1]～[3]中的任一蛋白。
[1]由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的蛋白。
[2]由在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白。
[3]由与序列号2或4所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白。
2.根据上述1所述的蛋白，其中，上述含有岩藻糖的糖质为低聚糖。
3.一种DNA，其由序列号1或3所示的碱基序列或其同源序列构成，并且编码上述1或2所述的蛋白。
4.一种重组DNA，其含有上述3所述的DNA。
5.一种转化体，其是用上述4所述的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。
6.根据上述5所述的转化体，其为上述1所述的[1]～[3]中的任一蛋白的活性和上述含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。
7.根据上述6所述的转化体，其中，上述微生物为具有上述含有岩藻糖的糖质的生产能力的大肠杆菌。
8.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包括在培养基中培养上述5～7中任一项所述的转化体而在培养物中生成上述含有岩藻糖的糖质的步骤。
9.根据上述8所述的制造方法，其中，上述含有岩藻糖的糖质为低聚糖。
10.根据上述9所述的制造方法，其中，上述低聚糖为3-岩藻糖基乳糖。
发明效果
本发明的蛋白由特定氨基酸序列构成，由此具有优良的含有岩藻糖的糖质的转运活性。通过使用具有生产本发明的蛋白的能力的微生物，能够与以往相比高效地制造3-岩藻糖基乳糖等含有岩藻糖的糖质。
具体实施方式
1.本发明的蛋白
本发明的蛋白为以下的[1]～[3]中任一项所述的蛋白。
[1]由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的蛋白。
[2]由在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白。
[3]由与序列号2或4所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白。
“氨基酸的缺失”是指序列中的氨基酸残基的脱落或消失，“氨基酸的置换”是指序列中的氨基酸残基被置换为其它氨基酸残基，“氨基酸的插入”是指在序列中插入了新的氨基酸，“氨基酸的添加”是指以在序列中插入新的氨基酸残基的方式添加。
作为“缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸”的具体方式，有1～20个氨基酸被其它化学上类似的氨基酸置换的方式。例如，可列举将某个疏水性氨基酸置换为其它疏水性氨基酸的情况、将某个极性氨基酸置换为具有相同电荷的其它极性氨基酸的情况等。这种化学上类似的氨基酸对于每个氨基酸而言在该技术领域中是已知的。
若列举具体例，作为非极性(疏水性)氨基酸，可列举丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的碱性氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷的酸性氨基酸，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。
作为在成为对象的蛋白所具有的氨基酸序列中具有1～20个氨基酸的缺失、置换、插入或添加等的氨基酸序列，可列举与成为对象的蛋白所具有的氨基酸序列具有一定以上的序列一致性的氨基酸序列。可列举例如与成为对象的蛋白所具有的氨基酸序列具有优选60％以上、更优选以下依次为65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、进一步优选90％以上、特别优选95％以上的一致性的氨基酸序列。
在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸例如可以通过将想要确认进行了缺失、置换、插入或添加的蛋白的氨基酸序列与成为基础的蛋白的氨基酸序列进行比对来确认。
氨基酸序列的比对例如可以使用公知的比对程序ClustalW[Nucelic AcidsResearch 22，4673，(1994)]来制作。例如ClustalW可以通过http://www.ebi.ac.uk/clustalw/(European Bioinformatics Institute)来利用。使用ClustalW制作比对时的参数例如可以使用默认值。
在序列号2或4所示的氨基酸序列中置换、插入或添加1～20个氨基酸时，置换、插入或添加的氨基酸残基可以为天然型和非天然型。作为天然型氨基酸，可列举例如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下示出可相互置换的氨基酸的例子。同一组中所含的氨基酸可相互置换。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
含有岩藻糖的糖质的转运活性是指将细胞内的含有岩藻糖的糖质转运到细胞外的活性。
作为含有岩藻糖的糖质，例如，优选含有岩藻糖作为构成单糖的低聚糖，更优选链长为3～6且具有乳糖末端的低聚糖。更具体而言，可列举例如3-岩藻糖基乳糖、2’-岩藻糖基乳糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳糖基二岩藻四糖、乳-N-二岩藻糖六糖I、和乳-N-二岩藻糖六糖II，这些中，可列举3-岩藻糖基乳糖。
突变蛋白是指：使成为基础的蛋白中的氨基酸残基人为地缺失或置换、或在该蛋白中人为地插入或添加氨基酸残基而得到的蛋白。突变蛋白中，缺失、置换、插入或添加氨基酸可以是在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸。
置换、插入或添加的氨基酸可以是天然型和非天然型。作为天然型氨基酸的例子，可列举上述的天然型氨基酸。可相互置换的氨基酸的例子如上所述。同一组中所含的氨基酸可相互置换。
同源蛋白是指自然界中存在的生物所具有的蛋白，是来自进化上的起源相同的蛋白的一组蛋白。同源蛋白彼此结构和功能类似。
氨基酸序列、碱基序列的一致性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Nat.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)、FASTA(Methods Enzymol.，183，63，1990)来确定。基于该算法BLAST开发了被称为BLASTN、BLASTX的程序(J.Mol.Biol.，215，403，1990)。在基于BLAST使用BLASTN来分析碱基序列时，参数设为例如Score＝100、wordlength＝12。另外，在基于BLAST使用BLASTX来分析氨基酸序列时，参数设为例如score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gap ped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。
上述的突变蛋白或同源蛋白具有含有岩藻糖的糖质的转运活性例如可以通过以下方法来确认。首先，通过后述方法制作具有编码想要确认上述活性的突变蛋白或同源蛋白的DNA的重组DNA。然后，用该重组DNA转化母株，由此，由该母株制作该蛋白的活性高的转化体，比较该母株或该转化体的培养液中生成、蓄积的含有岩藻糖的糖质的量，由此可以确认。本说明书中，“母株”是指成为基因改造和转化等的对象的原始株。
2.本发明的DNA
本发明的DNA为编码上述[1]～[3]所述的蛋白的DNA。作为本发明的DNA，具体而言，可列举以下的[A1]～[A3]的DNA。
[A1]序列号1或3所示的碱基序列。
[A2]与由序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、并且编码具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白的DNA。
[A3]由与序列号1或3所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白的DNA。
上述中，杂交是指DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分进行杂交的步骤。因此，该与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分进行杂交的DNA的碱基序列可以是：作为Northern或Southern印迹分析的探针有用的长度的DNA，或者可以作为PCR分析的寡核苷酸引物使用的长度的DNA。
就作为探针使用的DNA而言，可列举例如至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的DNA，就作为引物使用的DNA而言，可列举例如至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的DNA。
DNA的杂交实验的方法是众所周知的，可以按照例如分子克隆第4版(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2012)、Methods for General and Molecular Bacteriology(ASM Press，1994)、Immunology methods manual(Academic press，1997)、以及多数其它的标准教科书来确定杂交的条件并进行实验。
另外，通过按照市售的杂交试剂盒所附的说明书也可以获得在严谨条件下进行杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒，可列举例如通过随机引物法制作探针并在严谨条件下进行杂交的随机引物DNA标记试剂盒(罗氏诊断公司制)。
上述严谨条件可列举例如下述条件：将固定有DNA的过滤器和探针DNA在含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特溶液、10％的硫酸葡聚糖、以及20μg/L的变性鲑鱼精DNA的溶液中在42℃下孵育一晚后，在例如约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该过滤器。
上述各种条件也可以通过添加或变更用于抑制杂交实验背景的封闭试剂来进行设定。上述的封闭试剂的添加也可以为了符合条件而伴有杂交条件的变更。
作为能够在上述严谨条件下杂交的DNA，可列举例如：由使用上述BLAST、FASTA等程序基于上述参数进行计算时与序列号1或3所示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成的DNA。
本发明的DNA例如可以如下获得：使用编码由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA，通过例如分子克隆第4版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols in Molecular Biology(JOHN WILEY&SONS,INC.)等中记载的位点特异性突变导入法导入突变而置换为编码其它氨基酸残基的碱基序列，从而获得。或者，也可以使用PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(宝生物公司制)等得到本发明的DNA。
编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA例如可以如下获得：使用可基于编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA的碱基序列设计的探针，对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌(大肠埃希氏菌)W3110株的染色体DNA文库进行Southern杂交而获得；或者，通过使用可基于编码具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA设计的引物DNA的、以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板的PCR[PCR Protocols，Academicpress(1990)]而获得。编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA具体可列举由序列号1所示的碱基序列构成的DNA。
编码序列号4所示的氨基酸序列的DNA例如可以如下获得：使用可基于编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA的碱基序列设计的探针，对微生物、优选埃希氏菌属、更优选大肠杆菌W3110株的染色体DNA文库进行Southern杂交而获得，或者，通过使用可基于编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA设计的引物DNA的、以大肠杆菌W3110株的染色体DNA为模板的PCR而获得。编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白的DNA具体可列举由序列号3所示的碱基序列构成的DNA。
编码上述[2]所述的、含有在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白的DNA例如可以通过将由序列号1或3所示的碱基序列构成的DNA作为模板供于易错PCR等而获得。
或者，也可以利用使用在各自的5’端具有以可导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的1组PCR引物的PCR通过位点特异性突变导入法(Gene，77，51，1989)来获得编码包含上述[2]的在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白的DNA。
另外，按照市售的位点特异性突变导入试剂盒附带的说明书也可以获得该DNA。作为市售的位点特异性突变导入试剂盒，可列举例如能够向想要导入目标突变的位置导入突变(缺失、置换、插入或添加)的PrimeSTAR(注册商标)Mutagenesis Basal Kit(宝生物公司制)。
即，首先将具有以可导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的质粒作为模板，设计5’侧15个碱基重叠的一对突变导入用引物。此时，重叠部分中含有目标突变。然后，使用该突变导入用引物，以具有想要导入目标突变的碱基序列的质粒为模板进行PCR。将由此得到的扩增片段转化至大肠杆菌中时，可以得到具有导入了目标突变的碱基序列的质粒。
编码包含与上述序列号2或4所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白的DNA例如可以通过以下的方法获得。具体而言，例如，针对各种基因序列数据库检索与序列号1或3所示的碱基序列具有优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列，使用可基于通过该检索得到的碱基序列或氨基酸序列设计的探针DNA或引物DNA、以及具有该DNA的微生物，通过与获得编码具有上述序列号2或4所示的氨基酸序列的蛋白的DNA的方法相同的方法，可以获得编码该同源蛋白的DNA。
碱基序列、氨基酸序列的一致性可以通过与上述1相同的方法来确定。通过上述方法获得的本发明的DNA在直接导入到宿主细胞中后、或者用适当的限制酶等切割、利用常规方法整合于载体并将得到的重组DNA导入到宿主细胞中后，使用通常使用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，74，5463，1977)、或AppliedBiosystems3500基因分析仪、Applied Biosystems 3730DNA分析仪(均为赛默飞世尔科技公司制)等碱基序列分析装置进行分析，由此可以确定该DNA的碱基序列。
作为确定本发明的DNA的碱基序列时可以使用的载体，可列举pBluescriptII KS(+)、pPCR-Script Amp SK(+)(均为安捷伦科技公司制)、pT7Blue(默克密理博公司制)、pCRII(赛默飞世尔科技公司制)、pCR-TRAP(ジーンハンター公司制)、以及pDIRECT(Nucleic Acids Res.，18，6069，1990)等。
作为上述宿主细胞，只要能导入上述载体并增殖则可以为任何宿主细胞，可列举例如大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18 mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制)、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522等。
作为整合本发明的DNA而得到的重组DNA向宿主细胞中的导入方法，只要是能够向宿主细胞中导入DNA的方法则均可使用，可列举例如使用钙离子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110，1972)、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、电穿孔法(Nucleic Acids Res.，16，6127，1988)等。
确定碱基序列的结果是，所获得的DNA为部分长度时，可以通过使用该部分长度DNA作为探针的针对染色体DNA文库的Southern杂交法等获得全长DNA。
进而，通过基于所确定的DNA的碱基序列使用日本テクノサービス公司制造的NTSM系列DNA合成装置等进行化学合成，也可以制备目标DNA。
3.本发明的重组DNA
本发明的重组DNA为能够在宿主细胞中自主复制的DNA，并且为在能够转录上述2的本发明的DNA的位置含有启动子的表达载体中整合有本发明的DNA的DNA。
在宿主细胞中能够整合于染色体且具有本发明的DNA的DNA也是本发明的重组DNA。重组DNA为能够整合于染色体的重组DNA的情况下，可以不含有启动子。
使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，本发明的重组DNA优选为由启动子、核糖体结合序列、上述2的本发明的DNA、以及转录终止序列构成的重组DNA。进而，可以含有控制启动子的基因。
在此，优选将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当的距离、例如6～18个碱基。另外，本发明的重组DNA中，转录终止序列对于本发明的DNA的表达不一定是必要的，但优选将转录终止序列配置在紧邻结构基因的下游。
在使用属于埃希氏菌属的微生物作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞时，作为表达载体，可列举例如pColdI、pSTV28、pUC118(均为宝生物公司制)、pET21a、pCDF-1b、pRSF-1b(均为默克密理博公司制)、pMAL-c5x(ニューイングランドバイオラブス公司制)、pGEX-4T-1、pTrc99A(均为GEヘルスケアバイオサイエンス公司制)、pTrcHis、pSE280(均为赛默飞世尔科技公司制)、pGEMEX-1(プロメガ公司制)、pQE-30、pQE-60、pQE80L(均为キアゲン公司制)、pET-3、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(均为安捷伦科技公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200(Agric.Biol.Chem.，48，669，1984)、pLSA1(Agric.Biol.Chem.，53，277，1989)、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2007，Vol.73，No.20，p6378-6385]、pPE167(Appl.Environ.Microbiol.2007，73：6378-6385)、pPAC31(国际公开第1998/12343号)、pUC19(Gene，33，103，1985)、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要是在属于埃希氏菌属的微生物的细胞中发挥功能的启动子，则任意启动子均可，可列举例如trp启动子、gapA启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。另外，可列举例如将2个trp启动子串联而成的启动子、tac启动子、trc启动子、lacT5启动子、lacT7启动子、letI启动子之类的人为设计改造的启动子。
在使用棒状杆菌型细菌作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞时，作为表达载体，可列举例如pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4(日本特开昭57-183799号公报)、pCG11(日本特开昭57-134500号公报)、pCG116、pCE54、pCB101(均参见日本特开昭58-105999号公报)、pCE51、pCE52、pCE53(均参见Molecular andGeneral Genetics，196，175，1984)等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要是在棒状杆菌型细菌的细胞中发挥功能的启动子，则任意启动子均可，可列举例如P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，p674-679，2000)。
在使用酵母菌株作为导入本发明的重组DNA的宿主细胞时，作为表达载体，可列举例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为使用上述表达载体时的启动子，只要是在酵母菌株的细胞中发挥功能的启动子，则任意启动子均可，可列举例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
本发明的重组DNA例如可以通过将利用上述2的方法制备的DNA片段进行限制酶处理等并插入到上述适当的表达载体的启动子的下游而制作。
在此，可以通过对构成本发明的DNA的碱基序列以成为最适合于宿主细胞的表达的密码子的方式置换碱基来提高该DNA所编码的蛋白的表达量。宿主细胞中的密码子使用频率的信息可以通过公共数据库获得。
4.本发明的转化体
本发明的转化体为用含有上述2中记载的本发明的DNA的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。本说明书中，“宿主细胞”是指成为基于基因导入的转化的对象的原始细胞。
作为本发明的转化体，具体而言，可列举例如上述[1]～[3]中的任一蛋白的活性和含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。作为上述的[1]～[3]中任一项记载的蛋白的活性得到了增强的微生物，可列举例如用具有上述[A1]～[A3]中任一项记载的DNA的重组DNA转化母株而得到的、与该母株相比含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。
作为用上述重组DNA转化母株而得到的、与该母株相比含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物，可列举例如以下的i)～iii)的微生物。
i)通过将具有上述[A1]～[A3]中任一项记载的DNA的重组DNA以能够在母株中自主复制的质粒形式导入或整合于母株的染色体中而该DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白的生产量增大的微生物。
ii)通过生产作为上述[2]的突变蛋白的、具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白的比活力得到了增强的蛋白而含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。
iii)通过生产作为上述[3]的同源蛋白的、具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白的比活力得到了增强的蛋白而含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。
作为确认上述[A1]～[A3]中任一项记载的DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白的生产量增大的方法，例如可以通过利用Northern印迹测定该DNA的转录量或利用Western印迹测定该蛋白的生产量、并与母株进行比较来确认。
作为确认具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白的比活力增强的方法，例如可以如下确认：在培养基中培养用编码突变蛋白的DNA转化母株而得到的转化株该转化体，由在培养物中蓄积的含有岩藻糖的糖质生成量和该蛋白量测定比活力，与同样测定的、具有含有岩藻糖的糖质的转运活性且未导入突变的蛋白的比活力进行比较，由此确认。
作为这样的本发明的转化体的例子，可列举后述实施例中记载的FucT/pSTV＿YdeA株和FucT/pMW118＿MdfA株。
导入本发明的重组DNA的宿主细胞可以为原核生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等中的任一者，优选为原核生物或酵母菌株，更优选为属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属、微杆菌属或假单胞菌属等的原核生物、或者属于酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属等的酵母菌株，最优选列举大肠杆菌[例如大肠杆菌BL21 codon plus、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制)、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(默克密理博公司制)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18 mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制)、大肠杆菌W、大肠杆菌JM101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、大肠杆菌ATCC9637、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、Brevibacterium immariophilum[例如Brevibacterium immariophilum ATCC14068]、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)[例如解糖短杆菌ATCC14066]、产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)[例如谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、谷氨酸棒杆菌ATCC13869]、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)[嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870]、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)[嗜氨微杆菌ATCC15354]或假单胞菌(Pseudomonas)[例如假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110等原核生物、或者酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或产朊假丝酵母(Candida utilis)等酵母菌株。
作为宿主细胞，可列举具有含有岩藻糖的糖质的生产能力的微生物，优选与含有岩藻糖的糖质的生物合成相关的蛋白的活性高于母株的微生物。作为与含有岩藻糖的糖质的生物合成相关的蛋白，可列举作为岩藻糖转移酶的反应底物的GDP-岩藻糖、作为岩藻糖转移酶的反应底物的受体糖质和岩藻糖转移酶。
作为宿主细胞，可列举例如以下的1)～3)。
1)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了生产作为岩藻糖转移酶的反应底物的GDP-岩藻糖的能力的微生物
2)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了供给作为岩藻糖转移酶的反应底物的受体糖质的能力的微生物
3)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了岩藻糖转移酶活性的微生物
以下对各宿主细胞进行说明。
1)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了生产作为岩藻糖转移酶的反应底物的GDP-岩藻糖的能力的微生物
作为对用作宿主细胞的微生物赋予或增强生成GDP-岩藻糖的能力的方法，具体而言，可列举例如基于各种基因操作的方法(Metabolic Engineering(2017)41：23-38)等公知的方法。
作为生产GDP-岩藻糖的能力，可列举由糖生产GDP-岩藻糖的能力。作为对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强由糖生产GDP-岩藻糖的能力的方法，可列举例如以下的(1a)～(1d)的方法。这些方法可以单独或组合使用。
(1a)使至少一种控制由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的机制缓和或解除的方法
(1b)使至少一种参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶的表达增强的方法
(1c)使至少一种编码参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶的基因的拷贝数增加的方法
(1d)将至少一种从由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径分支到该目标物质以外的代谢产物的代谢途径弱化或切断的方法
作为控制由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的机制的具体例，可列举例如基于与该生物合成途径的控制相关的转录调节因子(例如RcsA等)的控制机制等公知的机制。
作为参与由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径的酶的具体例，可列举例如甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶、GDP甘露糖-4,6-脱氢酶、GDP-L-岩藻糖合成酶等公知的酶。
作为从由糖生成GDP-岩藻糖的生物合成途径分支到该目标物质以外的代谢产物的代谢途径的具体例，可列举例如由GDP-岩藻糖向胆烷酸的代谢途径等公知的代谢途径。
2)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了供给作为岩藻糖转移酶的反应底物的受体糖质的能力的微生物
作为对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强供给受体糖质的能力的方法，可列举例如以下的(2a)～(2g)。这些方法可以单独或组合使用。
(2a)使至少一种控制由糖生成受体糖质的生物合成途径的机制缓和或解除的方法
(2b)使至少一种参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶的表达增强的方法
(2c)使至少一种编码参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶的基因的拷贝数增加的方法
(2d)使至少一种分解受体糖质的机制缓和或解除的方法
(2e)使至少一种参与受体糖质的细胞内摄入的酶的表达增强的方法
(2f)使至少一种编码参与受体糖质的细胞内摄入的酶的基因的拷贝数增加的方法
(2g)将至少一种由受体糖质分支到该目标物质以外的代谢产物的代谢途径弱化或切断的方法
作为受体糖质，可列举例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖或乳糖或者它们的组合，进而可列举含有它们作为部分结构的糖链。这些中，优选乳糖。
作为参与由糖生成受体糖质的生物合成途径的酶的具体例，可列举例如具有以葡萄糖和UDP-半乳糖为底物而生成乳糖的乳糖合成酶活性的酶等公知的酶。作为分解受体糖质的机制的具体例，可列举例如催化乳糖的水解而生成葡萄糖和半乳糖的β-半乳糖苷酶等公知的酶。
作为参与受体糖质的细胞内摄入的酶的具体例，可列举例如参与乳糖的细胞内摄入的乳糖渗透酶等公知的酶。作为上述赋予或增强供给受体糖质的能力的方法的具体例，可列举通过基因操作使β-半乳糖苷酶的活性下降或消失的方法(Metabolic Engineering，2017，41：23-38)等公知的方法。
3)对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强了岩藻糖转移酶活性的微生物
作为对用作宿主细胞的微生物人工赋予或增强岩藻糖转移酶活性的方法，可列举例如以下的(3a)和(3b)。这些方法可以单独或组合使用。
(3a)使至少一种岩藻糖转移酶的表达增强的方法
(3b)使至少一种编码岩藻糖转移酶的基因的拷贝数增加的方法
作为岩藻糖转移酶，可列举例如α1,2-岩藻糖转移酶、α1,3-岩藻糖转移酶、α1,4-岩藻糖转移酶、α1,6-岩藻糖转移酶，这些中，优选α1,3-岩藻糖转移酶。
作为α1,3-岩藻糖转移酶，具体而言，可列举例如以下的I)～III)的蛋白。
I)由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白
II)由在序列号6所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有α1,3-岩藻糖转移酶活性的突变蛋白
III)由与序列号6所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有α1,3-岩藻糖转移酶活性的同源蛋白
作为将上述3的重组DNA以能够在宿主细胞中自主复制的质粒形式导入的方法，可列举例如上述的使用钙离子的方法、原生质体法、电穿孔法、以及原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，4889，1984)、醋酸锂法(J.Bacteriol.，153，163，1983)等方法。
作为将重组DNA整合到宿主细胞的染色体中的方法，可列举例如同源重组法。作为同源重组法，可列举例如使用同源重组用质粒的方法，所述同源重组用质粒可以通过与在想要导入的宿主细胞内不能自主复制的具有抗药基因的质粒DNA连接而制作。作为利用大肠杆菌中频繁使用的同源重组的方法，可列举例如利用λ噬菌体的同源重组系统导入重组DNA的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6641-6645，2000)。
进而，使用利用了通过与重组DNA一起整合到染色体上的枯草杆菌果聚糖蔗糖酶而使大肠杆菌变成蔗糖敏感性这一点的选择法、利用了通过在具有链霉素抗性的突变rpsL基因的大肠杆菌中整合野生型rpsL基因而使大肠杆菌变成链霉素敏感性这一点的选择法[Mol.Microbiol.，55，137(2005)、Biosci.Biotechnol.Biochem.，71，2905(2007)]等，可以获得宿主细胞的染色体DNA上的目标区域被置换为重组DNA的大肠杆菌。
关于通过上述方法得到的转化体具有上述2中记载的本发明的DNA这一点，例如在该转化体为转化具有由糖生成GDP-岩藻糖或受体糖质的能力的宿主细胞而得到的转化体时，可以通过在培养基中培养该转化体并将培养物中蓄积的含有岩藻糖的糖质的生成量与母株进行比较来确认。
5.本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法
作为本发明的含有岩藻糖的糖质的制造方法，可列举基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包括在培养基中培养上述4的转化体而在培养物中生成含有岩藻糖的糖质的步骤。
作为基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中使用的本发明的转化体，优选为具有由糖生成GDP-岩藻糖的能力的转化体。
另外，作为基于发酵的含有岩藻糖的糖质的制造方法中使用的本发明的转化体，可以使用具有生成受体糖质的能力的转化体。
培养上述4的转化体的方法可以按照微生物培养中使用的常规方法来进行。
作为培养该转化体的培养基，只要是含有该转化体可同化的碳源、氮原、无机盐类等、能够高效进行该转化体的培养的培养基即可，可以使用天然培养基和合成培养基中的任意一种。
作为碳源，只要是该转化体可同化的碳源即可，可列举例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、醋酸或丙酸等有机酸、或者甘油、乙醇或丙醇等醇类等。
作为氮源，可列举例如氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵或磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各种发酵菌体和其消化物等。
作为无机盐，可列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。可以向培养基中添加作为含有岩藻糖的糖质的前体的乳糖等受体糖质，另外，可以向培养基中添加作为GDP-岩藻糖的前体的GTP、甘露糖等。
基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，所使用的转化体不具有生成GDP-岩藻糖的能力时，在培养中，向培养基中添加GDP-岩藻糖。另外，基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，所使用的转化体不具有生成GDP-岩藻糖的能力时，在培养中，代替向培养基中添加GDP-岩藻糖，可以将具有由糖生成GDP-岩藻糖的能力的微生物与本发明的转化体同时培养，由此向本发明的转化体中供给GDP-岩藻糖。
另外，为了供给或增强作为GDP-岩藻糖的前体的GTP，可以同时培养具有生产GTP的能力的微生物。作为具有生产GTP的能力的微生物，可列举例如通过各种基因操作而使参与GTP的生物合成途径的酶的表达增强的微生物(Biotechnol Bioeng，Sep3：2019，2412-2417)等公知的微生物。
基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，所使用的转化体不具有生成乳糖等受体糖质的能力时，在培养中，向培养基中添加乳糖等受体糖质。
另外，基于发酵法的含有岩藻糖的糖质的制造方法中，所使用的转化体不具有生成乳糖等受体糖质的能力时，在培养中，代替向培养基中添加乳糖等受体糖质，可以将具有由糖生成乳糖等受体糖质的能力的微生物与本发明的转化体同时培养，由此向本发明的转化体中供给乳糖等受体糖质。
培养通常优选在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度通常为15～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中的培养液pH通常保持在3.0～9.0。pH的调节可以使用无机或有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
[分析例]
实施例中，3-岩藻糖基乳糖的分析、定量通过以下所示的步骤进行。对培养后的含有微生物的培养液进行离心分离，回收上清。利用糖分析装置ICS-5000(赛默飞世尔科技公司制)对该上清中所含的3-岩藻糖基乳糖进行分析。
[分析条件]
柱：CarboPAC PA1
柱温：25℃
流动相：(流动相A)水
(流动相B)500mmol/L氢氧化钠
(流动相C)300mmol/L乙酸钠
流动相A、流动相B和流动相C的混合比：
(0～10分钟)80：20：0
(10～15分钟)80：20：0至70：20：10的梯度
(15～17分钟)70：20：10至0：20：80的梯度
(17～25分钟)0：20：80
(25～35分钟)80：20：0
流速：1.0mL/分钟
检测器：脉冲安培检测器
实施例
以下示出发明的实施例，但是本发明不受这些实施例限定。
[实施例1]3-岩藻糖基乳糖的制造中使用的微生物的制备
(1)基因缺损时作为标志物使用的DNA片段的获得
将由表1的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将表1的“模板”中记载的DNA作为模板，进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表1]
通过常规方法制备枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA。扩增DNA片段的cat含有pHSG396上的cat基因的上游约200bp至下游约50bp。扩增DNA片段的sacB含有枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA上的sacB基因的上游约300bp至下游约100bp。
然后，将扩增DNA片段的cat和sacB作为模板，使用由序列号8和11所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到含有cat基因和sacB基因的DNA(以下称为cat-sacB)片段。
(2)失去β-半乳糖苷酶活性、乳糖渗透酶活性和胆烷酸生成活性的大肠杆菌的制备
通过以下方法制备缺失了编码β-半乳糖苷酶的DNA(以下称为lacZ基因)、编码乳糖渗透酶的DNA(以下称为lacY基因)和编码胆烷酸生成相关蛋白的DNA(以下称为wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL或wcaM基因)的大肠杆菌。需要说明的是，lacZ和lacY(以下称为lacZY)、以及wcaJ、wzxC、wcaK、wcaL和wcaM(以下称为wcaJ-wzxC-wcaKLM)在大肠杆菌基因组上分别形成操纵子。
将通过常规方法制备的大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，将由表2的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR而扩增各DNA片段。
[表2]
lacZ上游1和lacZ上游2含有lacZ基因的起始密码子至起始密码子上游约1000bp的区域。lacY下游1和lacY下游2含有lacY基因的终止密码子下游约50bp至约1000bp。
将lacZ上游1、lacY下游1和cat-sacB片段以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，使用由序列号13和15所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到由在lacZ和lacY基因周边区域的序列中插入有cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下称为lacZY：：cat-sacB)片段。
将lacZ上游2和lacY下游2以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，将由序列号13和15所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到由不含lacZ和lacY、lacZ上游与lacY下游直接连接的序列构成的DNA(以下称为ΔlacZY)片段。
通过电穿孔法将lacZY：：cat-sacB片段导入到保持有含有编码λ重组酶的基因的质粒pKD46[Datsenko，K.A.，Warner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.97，6640-6645(2000)]的W3110株中，得到显示氯霉素抗性且蔗糖敏感性的转化体(lacZ和lacY基因被置换为lacZY：：cat-sacB的转化体)。
将ΔlacZY片段通过电穿孔法导入到该转化体中，得到显示氯霉素敏感性且蔗糖抗性的转化体(lacZY：：cat-sacB被置换为ΔlacZY的转化体)。从其中进一步得到显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46脱落的转化体)。将该转化体命名为W3110ΔlacZY。
同样地，将W3110株的基因组DNA作为模板，使用由表3的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表3]
wcaJ上游1和wcaJ上游2含有wcaJ基因的起始密码子至起始密码子的上游约1000bp的区域。wcaM下游1和wcaM下游2含有wcaM基因的终止密码子至终止密码子的下游约1000bp的区域。
将wcaJ上游1、wcaM下游1和cat-sacB片段以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，使用由序列号19和21所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到由在wcaJ-wzxC-wcaKLM操纵子周边区域的序列插入有cat-sacB片段的序列构成的DNA(以下称为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB)片段。
将wcaJ上游2和wcaM下游2以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，使用由序列号19和21所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到由不含wcaJ-wzxC-wcaKLM、wcaJ上游和wcaM下游直接连接的序列构成的DNA(以下称为ΔwcaJ-wzxC-wcaKLM)片段。
将wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB片段通过电穿孔法导入到上述所制备的W3110ΔlacZY株中，得到显示氯霉素抗性且蔗糖敏感性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM被置换为wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB的转化体)。
将ΔwcaJM片段通过电穿孔法导入到该转化体，得到显示氯霉素敏感性且蔗糖抗性的转化体(wcaJ-wzxC-wcaKLM：：cat-sacB被置换为ΔwcaJ-wzxC-wcaKLM的转化体)。进而，得到显示氨苄青霉素敏感性的转化体(pKD46脱落的转化体)。将该转化体命名为T166。
(3)具有α1,3-岩藻糖基转移酶活性的微生物的制备
将由表4的“引物组”所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将表4的“模板”中记载的DNA作为模板，进行PCR，得到各扩增DNA片段。
[表4]
通过常规方法制备大肠杆菌W3110株、Bacteroides reticulotermitis JCM10512株的基因组DNA。由序列号7所示的碱基序列构成的DNA为对编码脆弱拟杆菌ATCC25285株来源的α1,3-岩藻糖基转移酶的基因的部分序列进行了密码子优化以使其在大肠杆菌中表达的DNA。另外，序列号25和26、序列号28和29、序列号30和31、序列号27和32所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
首先，将cBrFucT上游、cBrFucT中游、和cBrFucT下游的3个片段以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，使用由序列号26和27所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到3个片段连接而成的DNA(以下称为cBrFucT片段)片段。
将rcsA、cBrFucT、和lacY片段以等摩尔比率进行混合而得到的物质作为模板，使用由序列号34和35所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到3个片段连接而成的DNA(以下称为rcsA-cBrFucT-lacY)片段。
将由序列号36和37所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，将质粒pPE167(Appl.Environ.Microbiol.2007，73：6378-6385)作为模板，进行PCR，得到约4.4kb的载体片段。此时，序列号34和37、序列号35和36所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将上述中得到的rcsA-cBrFucT-lacY片段和载体片段用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制)连接，由此得到α1,3-岩藻糖基转移酶表达质粒。
使用上述α1,3-岩藻糖基转移酶表达质粒转化上述(2)中制备的T166株，由此制备表达α1,3-岩藻糖基转移酶的微生物，命名为FucT株。
(4)大肠杆菌来源的转运体基因的表达得到了增强的微生物的制备
通过以下方法制备具有基因表达用质粒的大肠杆菌，所述质粒在uspA启动子下配置有大肠杆菌来源的属于药物：H+逆向转运体-1(drug：H+antiporter-1)家族的转运体基因(ydeA)。
将表达载体pSTV29(宝生物公司制)作为模板，使用由序列号38和39所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，进行PCR，得到pSTV29载体片段。
将大肠杆菌ATCC9637株的染色体DNA作为模板，使用由序列号40和41所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，进行PCR，对含有uspA启动子的DNA片段进行扩增。此时，序列号38和41、序列号39和40所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将得到的含有uspA启动子的DNA片段用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制)连接于pSTV29载体片段，由此得到表达载体pSTV。
将大肠杆菌W3110株的染色体DNA作为模板，使用由序列号43和44所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，进行PCR，扩增编码YdeA蛋白(具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白)的DNA片段。此时，序列号41和43、序列号42和44所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将上述中得到的编码YdeA的DNA片段用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制)连接于pSTV载体片段，由此得到表达载体pSTV＿YdeA。
接着，通过以下方法制备具有基因表达用质粒的大肠杆菌，所述质粒在lac启动子下配置有大肠杆菌来源的属于药物：H+逆向转运体-1家族的转运体基因(mdfA)。
将表达载体pMW118(ニッポンジーン公司制)作为模板，使用由序列号45和46所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，进行PCR，得到pMW118载体片段。
将大肠杆菌W3110株的染色体DNA作为模板，使用由序列号47和48所示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，进行PCR，对编码MdfA蛋白(具有序列号4所示的氨基酸序列的蛋白)的DNA片段进行扩增。此时，序列号45和48、序列号46和47所示的碱基序列含有与各自的5’末端互补的序列。
将得到的编码MdfA的DNA片段用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制)连接于pMW118载体片段，由此得到表达载体pMW118＿MdfA。
使用表达载体pSTV、pMW118、以及上述中得到的表达质粒pSTV＿YdeA和pMW118＿MdfA转化实施例1(3)中制备的FucT株，得到FucT/pSTV株、FucT/pMW118株、FucT/pSTV＿YdeA株和FucT/pMW118＿MdfA株。
[实施例2]使用强力表达转运体的微生物的基于发酵法的3-岩藻糖基乳糖的制造
将实施例1中得到的FucT/pSTV株、FucT/pMW118、FucT/pSTV＿YdeA株和FucT/pMW118＿MdfA株在LB平板上在30℃下培养24小时，接种于装有4mL含有100mg/L的卡那霉素、和25mg/L的氯霉素(pSTV29来源质粒表达株)或100mg/L的氨苄青霉素(pMW118来源质粒表达株)的LB培养基的大型试管，在30℃下振荡培养18小时。
之后，将0.2mL的所得到的培养液接种于装有4mL含有100mg/L的卡那霉素、和25mg/L的氯霉素(pSTV29来源质粒表达株)或100mg/L的氨苄青霉素(pMW118来源质粒表达株)的生产培养基[葡萄糖30g/L、乳糖一水合物10g/L、硫酸镁七水合物2g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸1g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物以外，用氢氧化钠水溶液调节到pH7.2后进行高压灭菌)(另行制备含有葡萄糖、乳糖一水合物和硫酸镁七水合物的水溶液后，进行高压灭菌，分别冷却后混合)]的大型试管，在30℃下振荡培养28小时。FucT/pMW118株和FucT/pMW118＿MdfA株在培养开始起5小时后以达到1mM的方式添加IPTG。
培养结束后，将培养液适当稀释后进行离心分离，通过糖分析装置ICS-5000分析上清中所含的3-岩藻糖基乳糖。将结果示于表5。
[表5]
菌株名 表达基因 3-岩藻糖基乳糖(g/L)
FucT/pSTV - 0.24
FucT/pSTV＿YdeA ydeA 5.71
FucT/pMW118 - 0.26
FucT/pMW118＿MdfA mdfA 5.84
如表5所示，与FucT/pSTV株和FucT/pMW118株相比，FucT/pSTV＿YdeA株和FucT/pMW118＿MdfA株显示出显著高的3-岩藻糖基乳糖生产率。
因此可知，通过使属于药物：H+逆向转运体-1家族的YdeA或MdfA强力表达，3-岩藻糖基乳糖的生产率提高。
参照特定方式详细地说明了本发明，但可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变更和修正，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。需要说明的是，本申请基于2021年2月8日提出的日本专利申请(日本特愿2021-018484)，通过引用而援引其整体。另外，本申请所引用的全部参照作为整体而引入。
序列表自由文本
序列号1：E.coli W3110来源的ydeA的碱基序列
序列号2：E.coli W3110来源的YdeA的氨基酸序列
序列号3：E.coli W3110来源的mdfA的碱基序列
序列号4：E.coli W3110来源的MdfA的氨基酸序列
序列号5：嵌合型FucT的碱基序列
序列号6：嵌合型FucT的氨基酸序列
序列号7：密码子优化型BfFucT的部分序列
序列号8、9：cat扩增用引物的碱基序列
序列号10、11：sacB扩增用引物的碱基序列
序列号12、13：lacZ上游1扩增用引物的碱基序列
序列号14、15：lacY下游1扩增用引物的碱基序列
序列号16：lacZ上游2扩增用引物的碱基序列
序列号17：lacY下游2扩增用引物的碱基序列
序列号18、19：wcaJ上游1扩增用引物的碱基序列
序列号20、21：wcaM下游1扩增用引物的碱基序列
序列号22：wcaJ上游2扩增用引物的碱基序列
序列号23：wcaM下游2扩增用引物的碱基序列
序列号24、25：rcsA扩增用引物的碱基序列
序列号26、28：cBrFucT上游扩增用引物的碱基序列
序列号27、31：cBrFucT下游扩增用引物的碱基序列
序列号29、30：cBrFucT中游扩增用引物的碱基序列
序列号32、33：lacY扩增用引物的碱基序列
序列号34、35：rcsA-cBrFucT-lacY扩增用引物的碱基序列
序列号36、37：pPE167扩增用引物的碱基序列
序列号38、39：pSTV29扩增用引物的碱基序列
序列号40、41：PuspA扩增用引物的碱基序列
序列号42：pSTV-PuspA扩增用引物的碱基序列
序列号43、44：ydeA扩增用引物的碱基序列
序列号45、46：pMW118扩增用引物的碱基序列
序列号47、48：mdfA扩增用引物的碱基序列
序列表
<110> 协和发酵生化株式会社（KYOWA HAKKO BIO CO., LTD.）
<120> 具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的蛋白和含有岩藻糖的糖质的制造方法（Protein with transport activity of fucose-containing carbohydrates andMethod for producing fucose-containing carbohydrates）
<130> W532523
<150> JP2021-018484
<151> 2021-02-08
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1191
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgacaacaa acactgtttc ccgcaaagtg gcgtggctac gggtcgttac gctggcagtc 60
gccgccttca tcttcaacac caccgaattt gtccctgttg gcctgctctc tgacattgcg 120
caaagttttc acatgcaaac cgctcaggtc ggcatcatgt tgaccattta cgcatgggta 180
gtagcgctaa tgtcattgcc ttttatgtta atgaccagtc aggttgaacg gcgcaaatta 240
ctgatctgcc tgtttgtggt gtttattgcc agccacgtac tgtcgttttt gtcgtggagc 300
tttaccgttc tggtgatcag tcgcattggt gtggcttttg cacatgcgat tttctggtcg 360
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ttaattgcca ccggtacagc actggcgatg gtcttaggtt tacctctcgg gcgcattgtg 480
ggccagtatt tcggttggcg aatgaccttc ttcgcgattg gtattggggc gcttatcacc 540
cttttgtgcc tgattaagtt acttccctta ctgcccagtg agcattccgg ttcactgaaa 600
agcctcccgc tattgttccg ccgcccggca ttgatgagca tttatttgtt aactgtggtg 660
gttgtcaccg cccattacac ggcatacagc tatatcgagc cttttgtaca aaacattgcg 720
ggattcagcg ccaactttgc cacggcatta ctgttattac tcggtggtgc gggcattatt 780
ggcagcgtga ttttcggtaa actgggtaat cagtatgcgt ctgcgttggt gagtacggcg 840
attgcgctgt tgctggtgtg cctggcattg ctgttacctg cggcgaacag tgaaatacac 900
ctcggggtgc tgagtatttt ctgggggatc gcgatgatga tcatcgggct tggtatgcag 960
gttaaagtgc tggcgctggc accagatgct accgacgtcg cgatggcgct attctccggc 1020
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tcaatgtcga tgattggtta tgtgggcgcg gtgcctgctt ttgccgcgtt aatttggtca 1140
atcattatat ttcgccgctg gccagtgaca ctcgaagaac agacgcaata g 1191
<210> 2
<211> 396
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
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1 5 10 15
Thr Leu Ala Val Ala Ala Phe Ile Phe Asn Thr Thr Glu Phe Val Pro
20 25 30
Val Gly Leu Leu Ser Asp Ile Ala Gln Ser Phe His Met Gln Thr Ala
35 40 45
Gln Val Gly Ile Met Leu Thr Ile Tyr Ala Trp Val Val Ala Leu Met
50 55 60
Ser Leu Pro Phe Met Leu Met Thr Ser Gln Val Glu Arg Arg Lys Leu
65 70 75 80
Leu Ile Cys Leu Phe Val Val Phe Ile Ala Ser His Val Leu Ser Phe
85 90 95
Leu Ser Trp Ser Phe Thr Val Leu Val Ile Ser Arg Ile Gly Val Ala
100 105 110
Phe Ala His Ala Ile Phe Trp Ser Ile Thr Ala Ser Leu Ala Ile Arg
115 120 125
Met Ala Pro Ala Gly Lys Arg Ala Gln Ala Leu Ser Leu Ile Ala Thr
130 135 140
Gly Thr Ala Leu Ala Met Val Leu Gly Leu Pro Leu Gly Arg Ile Val
145 150 155 160
Gly Gln Tyr Phe Gly Trp Arg Met Thr Phe Phe Ala Ile Gly Ile Gly
165 170 175
Ala Leu Ile Thr Leu Leu Cys Leu Ile Lys Leu Leu Pro Leu Leu Pro
180 185 190
Ser Glu His Ser Gly Ser Leu Lys Ser Leu Pro Leu Leu Phe Arg Arg
195 200 205
Pro Ala Leu Met Ser Ile Tyr Leu Leu Thr Val Val Val Val Thr Ala
210 215 220
His Tyr Thr Ala Tyr Ser Tyr Ile Glu Pro Phe Val Gln Asn Ile Ala
225 230 235 240
Gly Phe Ser Ala Asn Phe Ala Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Ala Gly Ile Ile Gly Ser Val Ile Phe Gly Lys Leu Gly Asn Gln Tyr
260 265 270
Ala Ser Ala Leu Val Ser Thr Ala Ile Ala Leu Leu Leu Val Cys Leu
275 280 285
Ala Leu Leu Leu Pro Ala Ala Asn Ser Glu Ile His Leu Gly Val Leu
290 295 300
Ser Ile Phe Trp Gly Ile Ala Met Met Ile Ile Gly Leu Gly Met Gln
305 310 315 320
Val Lys Val Leu Ala Leu Ala Pro Asp Ala Thr Asp Val Ala Met Ala
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Leu Phe Ser Gly Ile Phe Asn Ile Gly Ile Gly Ala Gly Ala Leu Val
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Gly Asn Gln Val Ser Leu His Trp Ser Met Ser Met Ile Gly Tyr Val
355 360 365
Gly Ala Val Pro Ala Phe Ala Ala Leu Ile Trp Ser Ile Ile Ile Phe
370 375 380
Arg Arg Trp Pro Val Thr Leu Glu Glu Gln Thr Gln
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<210> 3
<211> 1233
<212> DNA
<213> Escherichia coli
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
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Leu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Arg Arg Thr Val Arg Ser Leu Ile
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<211> 954
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of
Chimera-type FucT
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of
Chimera-type FucT
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290 295 300
Lys Trp Lys Met Val Cys Asn Pro Cys Arg Trp Phe Arg
305 310 315
<210> 7
<211> 264
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: partial base sequence of
codon-optimized BfFucT
<400> 7
cgtaagttct gcagcatcgt ggttagcaat aataaatggg cggacccgat tcgtgagacc 60
tttttcaaac tgctgagcag ctacaaaaag gtggacagcg gtggccgtgc gtggaacaac 120
atcggtggcc cggttgacaa caagctggat ttcatcagcc agtacaaatt caacattgcg 180
tttgagaaca gccgtgtgct gggttacacc accgaaaaga ttatggagcc gatgcaagtg 240
aacagcattc cggtttactg gggt 264
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cat
<400> 8
accaggcgtt taagggcacc 20
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cat
<400> 9
gactacgggc ctaaagtcga cagaataaat aaatcctggt gtccc 45
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of sacB
<400> 10
gtcgacttta ggcccgtagt ctgcaaat 28
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of sacB
<400> 11
tacggttagc catttgcctg c 21
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacZ Upstream 1
<400> 12
ggtgccctta aacgcctggt agctgtttcc tgtgtgaaat tg 42
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacZ Upstream 1
<400> 13
ccagtctggc cctgcacg 18
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacY Downstream 1
<400> 14
gcaggcaaat ggctaaccgt acgaccaaca tatcataacg gag 43
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacY Downstream 1
<400> 15
gtttccgctc tgtttgctgc 20
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacZ Upstream 2
<400> 16
ccgttatgat atgttggtcg agctgtttcc tgtgtgaaat tg 42
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of
amplification primer for amplification of lacY Downstream 2
<400> 17
cgaccaacat atcataacgg ag 22
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaJ Upstream 1
<400> 18
ggtgccctta aacgcctggt cgttgttcct gttattagcc c 41
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaJ Upstream 1
<400> 19
acgcggtcgc tatcagcaaa 20
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaM Downstream 1
<400> 20
gcaggcaaat ggctaaccgt aatttgcgac cattcctgga aaaa 44
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaM Downstream 1
<400> 21
acttcacaaa cgcctgcata tag 23
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaJ Upstream 2
<400> 22
ttccaggaat ggtcgcaaat cgttgttcct gttattagcc c 41
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of wcaM Downstream 2
<400> 23
atttgcgacc attcctggaa aaa 23
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of rcsA
<400> 24
atgtcaacga ttattatgga tttatg 26
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of rcsA
<400> 25
cattctagac ctccttaatt agcgcatgtt gacaaaaata cc 42
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Upstream
<400> 26
aggaggtcta gaatgaaatt gaaagtgaaa tttgtaga 38
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Downstream
<400> 27
ggatttcctc tcgagtcatc taaaccaacg acaag 35
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Upstream
<400> 28
attcagagct tcctgtgaat ta 22
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Middlestream
<400> 29
attcacagga agctctgaat cgtaagttct gcagcatcgt g 41
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Middlestream
<400> 30
accccagtaa accggaatgc 20
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of cBrFucT Downstream
<400> 31
gcattccggt ttactggggt aacagattgg ttgagttgga 40
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacY
<400> 32
ctcgagagga aatccattat gtactattta aaaaacacaa acttt 45
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of lacY
<400> 33
ttaagcgact tcattcacct gac 23
<210> 34
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of rcsA-cBrFucT-lacY
<400> 34
gaggagaaat taaccatgtc aacgattatt atggatttat g 41
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of rcsA-cBrFucT-lacY
<400> 35
agggcatcgg tcgacttaag cgacttcatt cacctgac 38
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pPE167
<400> 36
gtcgaccgat gcccttgaga g 21
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pPE167
<400> 37
ggttaatttc tcctctttaa tatcg 25
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pSTV29
<400> 38
ggaaggagta acactatgac catgattacg ccaagc 36
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pSTV29
<400> 39
accacaaaag cggttaacgc catgagcggc ctca 34
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of PuspA
<400> 40
aaccgctttt gtggtgacca 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of PuspA
<400> 41
agtgttactc cttccataaa gt 22
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pSTV-PuspA
<400> 42
gaattcactg gccgtcgttt 20
<210> 43
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of ydeA
<400> 43
ggaaggagta acactatgac aacaaacact gtttcccg 38
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of ydeA
<400> 44
acggccagtg aattcctatt gcgtctgttc ttcgag 36
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pMW118
<400> 45
accctggcgt tacccaac 18
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of pMW118
<400> 46
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of mdfA
<400> 47
acacaggaaa cagctatgca aaataaatta gcttccggt 39
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of the artificial sequence: base sequence of primer
for amplification of mdfA
<400> 48
gggtaacgcc agggtttacc cttcgtgaga atttcc 36

Claims (10)

1.下述[1]～[3]中的任一蛋白，
[1]由序列号2或4所示的氨基酸序列构成的蛋白，
[2]由在序列号2或4所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的突变蛋白，
[3]由与序列号2或4所示的氨基酸序列具有90％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有含有岩藻糖的糖质的转运活性的同源蛋白。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，所述含有岩藻糖的糖质为低聚糖。
3.一种DNA，其包含序列号1或3所示的碱基序列或其同源序列，并且编码权利要求1或2所述的蛋白。
4.一种重组DNA，其含有权利要求3所述的DNA。
5.一种转化体，其是用权利要求4所述的重组DNA转化宿主细胞而得到的转化体。
6.根据权利要求5所述的转化体，其为权利要求1所述的[1]～[3]中的任一蛋白的活性和所述含有岩藻糖的糖质的生产率得到了增强的微生物。
7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述微生物为具有所述含有岩藻糖的糖质的生产能力的大肠杆菌。
8.一种含有岩藻糖的糖质的制造方法，其包括在培养基中培养权利要求5～7中任一项所述的转化体而在培养物中生成所述含有岩藻糖的糖质的步骤。
9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，所述含有岩藻糖的糖质为低聚糖。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，所述低聚糖为3-岩藻糖基乳糖。
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