JP7035024B2 - テアニンの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、テアニンを生成する微生物及び該微生物を用いた、外部からエチルアミンを添加せず、副生物としてエチルアミンが蓄積、残存しない、テアニンの効率的な製造方法に関する。
テアニンは、茶に含まれるアミノ酸の一種で旨味の主成分として知られ、食品の香味成分として重要な物質である（特許文献１）。また、近年、リラックス作用、カフェイン興奮抑制作用、及び血圧降下作用等の様々な生理作用を有することが明らかになってきており、食品添加物としての需要が拡大している。
テアニンの製造方法として、シュードモナス属細菌から得られるグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンに作用させる方法（特許文献２）、グルタミンとエチルアミン誘導体にグルタミナーゼ又はグルタミナーゼ産生菌を作用させる方法（特許文献３）、ＡＴＰ存在下、メチロトローフ細菌が有するγ－グルタミルメチルアミド合成酵素をグルタミン酸とエチルアミンに作用させる方法（特許文献１）等が開示されているが、これらの方法では、その製造工程で反応基質としてエチルアミンを添加する必要がある。しかし、エチルアミンは沸点が非常に低いため、製造中にエチルアミンが揮発することは避けられず、揮発したエチルアミンが周辺環境や作業員の身体に悪影響を及ぼす可能性がある。また、例えば反応効率の向上を目的として沸点以上の温度でエチルアミンを反応させようとすると特別な設備が必要とり、上記の方法は、安全面、コスト面で問題がある（特許文献１）。よって、外部から基質としてエチルアミンを添加せず、副生物としてエチルアミンが蓄積、残存しないテアニンの製造方法が求められている。
テアニンの製造方法として、シュードモナス属細菌から得られるグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンに作用させる方法（特許文献２）、グルタミンとエチルアミン誘導体にグルタミナーゼ又はグルタミナーゼ産生菌を作用させる方法（特許文献３）、ＡＴＰ存在下、メチロトローフ細菌が有するγ－グルタミルメチルアミド合成酵素をグルタミン酸とエチルアミンに作用させる方法（特許文献１）等が開示されているが、これらの方法では、その製造工程で反応基質としてエチルアミンを添加する必要がある。しかし、エチルアミンは沸点が非常に低いため、製造中にエチルアミンが揮発することは避けられず、揮発したエチルアミンが周辺環境や作業員の身体に悪影響を及ぼす可能性がある。また、例えば反応効率の向上を目的として沸点以上の温度でエチルアミンを反応させようとすると特別な設備が必要とり、上記の方法は、安全面、コスト面で問題がある（特許文献１）。よって、外部から基質としてエチルアミンを添加せず、副生物としてエチルアミンが蓄積、残存しないテアニンの製造方法が求められている。
後述の、配列番号２、４、６又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質（それぞれ、図１及び図２中の、ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５及びＲＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５に該当）はシュードモナス属細菌が有する蛋白質であり、いずれもデータベース上にはアミノトランスフェラーゼとして登録されている（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．：ＮＰ＿７４７２８３、ＮＰ＿７４２７５９、ＷＰ＿０１２７２２０５３、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＯ．：ＡＩＳ１０４３０）。しかし、これらの蛋白質が実際にアミノトランスフェラーゼとして機能することの実験的な検証はされておらず、また、その基質及び触媒する化学反応に関する知見もない。
上記のとおり、エチルアミンを使用する既存のテアニンの製造方法は、安全面、コスト面で問題があった。
そこで、本発明は、外部からエチルアミンを添加しない、テアニンの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
そこで、本発明は、外部からエチルアミンを添加しない、テアニンの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
本発明は、以下の（１）～（１０）に関する。
（１）炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
（２）炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物。
（３）アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを含有する水性媒体中に、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素を共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（４）アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを含有する水性媒体中に、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びグルタミナーゼを共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（５）上記（１）又は（２）に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（６）上記（１）に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（７）上記（２）に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（８）微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）又は（２）に記載の微生物。
（９）微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（５）～（７）のいずれか１に記載のテアニンの製造方法。
（１０）炭素源が糖である、上記（１）又は（２）に記載の微生物。
（１）炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
（２）炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物。
（３）アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを含有する水性媒体中に、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素を共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（４）アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを含有する水性媒体中に、上記（１）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びグルタミナーゼを共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（５）上記（１）又は（２）に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（６）上記（１）に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（７）上記（２）に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（８）微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）又は（２）に記載の微生物。
（９）微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（５）～（７）のいずれか１に記載のテアニンの製造方法。
（１０）炭素源が糖である、上記（１）又は（２）に記載の微生物。
本発明により、テアニンを生成する微生物及び該微生物を用いた、外部からエチルアミンを添加せず、副生物としてエチルアミンが蓄積、残存しない、テアニンの効率的な製造方法が提供される。
１．本発明の微生物及び該微生物の造成方法
１－１．エチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物及び該微生物の造成方法
エチルアミン生成活性が増強した微生物
本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
１－１．エチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物及び該微生物の造成方法
エチルアミン生成活性が増強した微生物
本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、о－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、о－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がエチルアミン生成活性を有していることは、後述の方法により該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡで、エチルアミン生成活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるアセトアルデヒド及びアラニンを含む水溶液と接触させ、結果として生成するエチルアミンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
（エチルアミン生成活性が増強した微生物の具体例）
上記の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、例えば以下の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。
［４］上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
上記の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、例えば以下の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。
［４］上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等を挙げることができる。
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、例えば、親株において自律複製可能なＤＮＡであって、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
親株において染色体中への組込が可能なＤＮＡであって、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。
組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
親株において染色体中への組込が可能なＤＮＡであって、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。
組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物又は酵母菌株を、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。
また、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
また、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＴｒＳ３０［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００７、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．２０、ｐ．６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
親株にコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることがきる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
親株を該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物とは、１）該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大した微生物、又は２）上記［２］の変異蛋白質を生産することにより、エチルアミン生成活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物をいう。
上記［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
エチルアミン生成活性を有する蛋白質の比活性が増強したことを確認する方法としては、例えば、変異蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該変異蛋白質を精製し、該蛋白質、アセトアルデヒド及びアラニンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したエチルアミンと該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した、変異が導入されていないエチルアミン生成活性を有する蛋白質の比活性と比較することにより確認することができる。
（エチルアミン生成活性が増強した微生物の造成方法）
親株を上記［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物は、以下の方法で造成することができる。
親株を上記［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、該親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物は、以下の方法で造成することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはシュードモナス属、より好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ株からなる群より選ばれる微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］及び［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
上記［４］のＤＮＡのうち上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５、又は７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記の［２］のＤＮＡを取得することができる。すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
取得した上記の［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］又は３７００ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
上記の宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジーズ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等を挙げることができる。
上記のベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジーズ社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等を挙げることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
ここで、該ＤＮＡの塩基配列を宿主での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
上記のようにして調製したＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造方法に用いられる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
このような組換え体ＤＮＡの例としては、実施例において後述するｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５、及びｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５を挙げることができる。
組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、上記のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等の方法を挙げることができる。
組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、相同組換え法を挙げることができる。相同組換え法としては、例えば導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。また、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもエチルアミン生成活性が増強された微生物であることは、上述の方法により、上記［４］～［７］のいずれか１つに記載のＤＮＡの転写量又は該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量をノーザン・ブロッティング又はウェスタン・ブロッティングにより測定し、又は該蛋白質の比活性を測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株を挙げることができる。
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物
本発明の微生物は、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強しているのと同時に、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
本発明の微生物は、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強しているのと同時に、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性とは、γ－グルタルメチルアミド合成酵素が有する活性をいい、具体的には、エチルアミン、グルタミン酸及びＡＴＰを基質としてテアニンを生成する活性をいう。
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、例えば、特開２００９－２２５７０５号公報にて開示されているＭｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９株が有するγ－グルタルメチルアミド合成酵素、又は以下の［８］～［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質を挙げることができる。
［８］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質
［８］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質
（γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物の具体例）
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物としては、例えば上記Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９株が有するγ－グルタルメチルアミド合成酵素をコードするＤＮＡ、又は以下の［１１］～［１４］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強された微生物を挙げることができる。
［１１］上記［８］～［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１２］配列番号９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［１３］配列番号９で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１４］配列番号９で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物としては、例えば上記Ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｓ ｍａｙｓ ＴＧＭＳ Ｎｏ．９株が有するγ－グルタルメチルアミド合成酵素をコードするＤＮＡ、又は以下の［１１］～［１４］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強された微生物を挙げることができる。
［１１］上記［８］～［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１２］配列番号９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［１３］配列番号９で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１４］配列番号９で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記と同じである。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、上記のＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて上記のパラメータに基づいて計算したときに、配列番号９で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を挙げることができる。
γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．Ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｂ７２８ａ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記と同様のサザンハイブリダーゼーション又はＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記と同様の方法に従って取得することができる。
（γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物の造成方法）
該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもγ－グルタルメチルアミド合成酵素が増強された微生物は、上記と同様の方法に従って造成することができる。
該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもγ－グルタルメチルアミド合成酵素が増強された微生物は、上記と同様の方法に従って造成することができる。
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強された微生物であることは、γ－グルタルメチルアミド合成酵素をコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
当該蛋白質をコードするＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
当該蛋白質の比活性は、例えば、該蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該蛋白質を精製し、該蛋白質、エチルアミン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したテアニンと該蛋白質量から比活性を測定することにより確認することができる。
上記エチルアミン生成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素をコードするＤＮＡは、同一の組換え体ＤＮＡ上に存在していてもよいし、別々の組換え体ＤＮＡ上に存在していてもよい。
また、本発明の微生物は、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強しているのに加え、生成したテアニンが分解されるのを抑制する観点から、テアニンの分解活性が低下又は喪失していることが好ましい。そのような微生物としては、具体的には、γ－グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下又は喪失した微生物を挙げることができる。
また、本発明の微生物は、γ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強しているのに加え、生成したテアニンが分解されるのを抑制する観点から、テアニンの分解活性が低下又は喪失していることが好ましい。そのような微生物としては、具体的には、γ－グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下又は喪失した微生物を挙げることができる。
炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成する微生物
本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物である。
炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成する微生物とは、後述２－１の方法で該微生物を培地に培養したときに、炭素源を出発物質として、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを該微生物内に生成する微生物をいう。
そのような微生物としては、炭素源を出発物質としてアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成する微生物である限りにおいて制限はない。
例えば、任意の親株を用いて取得したエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を挙げることができる。また、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つに記載の微生物を親株として造成した、上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物、又は上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を親株として造成した、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つに記載の微生物を挙げることができる。
（Ａ）親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）及びアルデヒドレダクターゼ（ＹｑｈＤ）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物
（Ｂ）親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥｕｔＥ）の活性が増強した微生物
（Ｃ）親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）の活性が増強した微生物
（Ｄ）上記（Ａ）～（Ｃ）の微生物の形質を任意の組み合わせで有する微生物
本発明の微生物は、アセトアルデヒドやアラニンの供給量を増やす観点から、上記（Ｂ）又は（Ｃ）の形質を、好ましくは（Ｂ）及び（Ｃ）の形質を有することが好ましい。
その上で、アセトアルデヒドがエタノールに代謝されるのを抑制する観点から、上記（Ａ）の形質を有することがさらに好ましい。
例えば、任意の親株を用いて取得したエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を挙げることができる。また、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つに記載の微生物を親株として造成した、上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物、又は上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を親株として造成した、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか１つに記載の微生物を挙げることができる。
（Ａ）親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）及びアルデヒドレダクターゼ（ＹｑｈＤ）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物
（Ｂ）親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥｕｔＥ）の活性が増強した微生物
（Ｃ）親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）の活性が増強した微生物
（Ｄ）上記（Ａ）～（Ｃ）の微生物の形質を任意の組み合わせで有する微生物
本発明の微生物は、アセトアルデヒドやアラニンの供給量を増やす観点から、上記（Ｂ）又は（Ｃ）の形質を、好ましくは（Ｂ）及び（Ｃ）の形質を有することが好ましい。
その上で、アセトアルデヒドがエタノールに代謝されるのを抑制する観点から、上記（Ａ）の形質を有することがさらに好ましい。
（アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）及びアルデヒドレダクターゼ（ＹｑｈＤ）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物）
アルコールデヒドロゲナーゼとは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアセトアルデヒドをエタノールに還元する活性をいう。
アルコールデヒドロゲナーゼとは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。アルコールデヒドロゲナーゼ活性とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアセトアルデヒドをエタノールに還元する活性をいう。
アルデヒドレダクダーゼとは、アルデヒドレダクダーゼ活性を有する蛋白質をいう。アルデヒドレダクダーゼ活性とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素としてアセトアルデヒドをエタノールに還元する活性をいう。
親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物としては、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型の該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に、塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入することにより得られる、以下の（ａ）及び（ｂ）の微生物を挙げることができる。
（ａ）親株よりも、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
（ｂ）親株よりも、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
より好ましくは、該ＤＮＡの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。
（ａ）親株よりも、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
（ｂ）親株よりも、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物
より好ましくは、該ＤＮＡの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡとしては、親株が有するアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば以下の［１５］～［１８］のいずれか１つに記載のＤＮＡを挙げることができる。
［１５］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［１６］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［１８］配列番号１１で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１５］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［１６］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［１８］配列番号１１で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
アルデヒドレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、親株が有するアルデヒドレダクターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば以下の［１９］～［２２］のいずれか１つに記載のＤＮＡを挙げることができる。
［１９］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２０］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号１３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［２２］配列番号１３で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１９］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
［２０］配列番号１４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号１３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［２２］配列番号１３で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物は、例えば、上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を親株として、該親株のアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下又は喪失させることにより得ることができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等を挙げることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理を施し又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするＤＮＡと相同組換え法を用いて置換する方法、又は、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入した後、相同組換え法を用いて親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするＤＮＡと置換する方法、を挙げることができる。
アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれ配列番号１１又は１３で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入する方法、及び上記の方法で調製したＤＮＡを相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記と同じである。
親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物であることは、例えば、親株及び該微生物をアセトアルデヒドを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のエタノールの比を比較することにより確認することができる。
親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が低下又は喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が低下又は喪失した微生物の例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質をコードするＤＮＡの一部又は全部が欠損した微生物を挙げることができる。具体的には、実施例において後述するＷ３１１０Ａ株及びＷ３１１０ＡＥ株を挙げることができる。
（アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥｕｔＥ）の活性が増強した微生物）
アルデヒドデヒドロゲナーゼとは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とは、アセチルＣｏＡを基質としてアセトアルデヒドを生成する活性をいう。
アルデヒドデヒドロゲナーゼとは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とは、アセチルＣｏＡを基質としてアセトアルデヒドを生成する活性をいう。
親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物としては、以下の（ｃ）及び（ｄ）の微生物が挙げられる。
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、
ｉ）親株よりも該蛋白質の比活性が増強した微生物、又は、
ｉｉ）親株よりも該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物
（ｄ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、
ｉ）親株よりも該蛋白質の比活性が増強した微生物、又は、
ｉｉ）親株よりも該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物
（ｄ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物
上記（ｃ）の親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株よりも該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列において１～２０個のアミノ酸、好ましくは１～１０個のアミノ酸、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。
上記（ｃ）の親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株よりも該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を親株として、該親株のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記の方法を挙げることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、上記の方法を挙げることができる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１５で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、変異蛋白質を有する微生物から該変異蛋白質を精製し、該変異蛋白質、アセチルＣｏＡ及びその他の基質を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したアセトアルデヒドと該蛋白質量から比活性を測定し、同様に測定した変異が導入されていない、親株から取得したアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質の比活性と比較することにより確認することができる。
上記（ｃ）の親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株よりも該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写調節領域又はプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１～２０塩基、より好ましくは１～１０塩基、さらに好ましくは１～５塩基の塩基が欠失、置換、挿入又は付加しているプロモーター領域を有しているため、親株よりも該ＤＮＡの発現量が増大した微生物、若しくは、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該ＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、親株よりも該ＤＮＡの発現量が増大した微生物を挙げることができる。
上記（ｃ）の親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株よりも該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を親株として、該親株のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質のＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法又は組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより、得ることができる。
突然変異処理法は、上記の方法を挙げることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写調節領域及びプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理を施し又はエラープローンＰＣＲ等に供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡと、上記の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
また、親株のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することができる。
そのようなプロモーターとしては、上記のプロモーターを挙げることができる。
上記方法にて取得した微生物が、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
（ｄ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記ＤＮＡを保有させた微生物を挙げることができる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、例えば以下の［２３］～［２５］のいずれか１つに記載の蛋白質を挙げることができる。
［２３］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２４］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質
［２５］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質
［２３］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２４］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質
［２５］配列番号１６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質
上記において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質は、上記のエラープローンＰＣＲや部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
配列番号１６で表わされるアミノ酸配列において１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されていてもよい。
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であることは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して培地で培養し、培養物中のアセトアルデヒド量を測定することにより確認することができる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば以下の［２６］～［２９］のいずれか１つに記載のＤＮＡを挙げることができる。
［２６］上記［２３］～［２５］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２７］配列番号１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［２８］配列番号１５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２９］配列番号１５で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２６］上記［２３］～［２５］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２７］配列番号１５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［２８］配列番号１５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２９］配列番号１５で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記と同じである。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記のパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１５で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
上記（ｄ）のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
上記の方法で得られるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで上記のエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物を取得することができる。
また、調製したＤＮＡ断片を有し染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡで親株を形質転換し、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを染色体の任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物を取得することができる。染色体へＤＮＡを組み込む場合、組換え体ＤＮＡはプロモーターを含有していなくてもよい。
また、調製したＤＮＡ断片を有し染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡで親株を形質転換し、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを染色体の任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物を取得することができる。染色体へＤＮＡを組み込む場合、組換え体ＤＮＡはプロモーターを含有していなくてもよい。
原核生物を宿主細胞として用いる場合、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御するＤＮＡが含まれていてもよい。
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、発現ベクター及び該発現ベクターを用いる場合のプロモーターは、上記と同様の発現ベクター及びプロモーターが挙げられる。
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
上記方法にて取得した微生物が、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０ＡＥ株を挙げることができる。
（Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）の活性が増強した微生物）
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼとは、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性とは、ピルビン酸を基質としてＬ－アラニンを生成する活性をいう。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼとは、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をいう。Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性とは、ピルビン酸を基質としてＬ－アラニンを生成する活性をいう。
親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物を挙げることができる。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記ＤＮＡを保有させた微生物を挙げることができる。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、例えば以下の［３０］～［３２］のいずれか１つに記載の蛋白質を挙げることができる。
［３０］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３１］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質
［３２］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質
［３０］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３１］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質
［３２］配列番号１８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質
上記において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する変異蛋白質は、上記のエラープローンＰＣＲや部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することにより取得することができる。
配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質であることは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して培地で培養し、培養物中のアラニン量を測定することにより確認することができる。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば以下の［３３］～［３６］のいずれか１つに記載のＤＮＡを挙げることができる。
［３３］上記［３０］～［３２］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３４］配列番号１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［３５］配列番号１７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３６］配列番号１７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３３］上記［３０］～［３２］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３４］配列番号１７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［３５］配列番号１７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３６］配列番号１７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件に関する記載は、上記と同じである。
上記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記のパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１７で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、上記と同様の方法で取得することができる。
上記の方法で取得した微生物が、親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０Ａ株及びＷ３１１０ＡＥ株を挙げることができる。
１－２．エチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物及び該微生物の造成方法
エチルアミン生成活性が増強した微生物
本発明の微生物としては、上記１－１の微生物の他に、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を挙げることができる。
エチルアミン生成活性が増強した微生物
本発明の微生物としては、上記１－１の微生物の他に、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を挙げることができる。
親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強した微生物及び該微生物の造成方法については、上記１－１と同様である。
グルタミナーゼ活性が増強した微生物
１－２の本発明の微生物は、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強しているのと同時に、グルタミナーゼ活性が増強した微生物である。
グルタミナーゼとは、グルタミナーゼ活性を有する蛋白質をいう。グルタミナーゼ活性とは、エチルアミンとグルタミンを基質としてテアニンを生成する活性をいう。
１－２の本発明の微生物は、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性が増強しているのと同時に、グルタミナーゼ活性が増強した微生物である。
グルタミナーゼとは、グルタミナーゼ活性を有する蛋白質をいう。グルタミナーゼ活性とは、エチルアミンとグルタミンを基質としてテアニンを生成する活性をいう。
グルタミナーゼとしては、例えばシュードモナス属に属する微生物、より具体的にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＩＦＯ １２６９４株（特開平１１－２２５７８９号公報）が有するグルタミナーゼを挙げることができる。
親株よりもグルタミナーゼの活性が増強した微生物の例としては、グルタミナーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもグルタミナーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
親株よりもグルタミナーゼの活性が増強した微生物の例としては、グルタミナーゼをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもグルタミナーゼ活性が増強された微生物を挙げることができる。
グルタミナーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは細菌等の原核生物又は酵母由来の、より好ましくは原核生物由来の、特に好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＩＦＯ １２６９４株（特開平１１－２２５７８９号公報）のグルタミナーゼをコードするＤＮＡを挙げることができる。
該グルタミナーゼをコードするＤＮＡは、上記１－１と同様の方法に従って取得することができる。
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、上記１－１と同様の方法に従って取得することができる。
該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもグルタミナーゼ活性が増強された微生物は、上記１－１と同様の方法に従って造成することができる。
上記の方法で造成した微生物が、親株よりもグルタミナーゼ活性が増強された微生物であることは、グルタミナーゼをコードするＤＮＡの転写量、該蛋白質の生産量、又は該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
当該蛋白質をコードするＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより又は該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
グルタミナーゼの比活性は、例えば、該蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換して得られる形質転換株から該蛋白質を精製し、該蛋白質、エチルアミン及びグルタミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したテアニンと該蛋白質量から比活性を測定することにより確認することができる。
また、１－２の本発明の微生物は、グルタミナーゼ活性が増強しているのに加え、生成したテアニンが分解されるのを抑制する観点から、テアニンの分解活性が低下又は喪失していることが好ましい。そのような微生物としては、具体的には、γ－グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下又は喪失した微生物を挙げることができる。
また、１－２の本発明の微生物は、グルタミナーゼ活性が増強しているのに加え、生成したテアニンが分解されるのを抑制する観点から、テアニンの分解活性が低下又は喪失していることが好ましい。そのような微生物としては、具体的には、γ－グルタミルトランスペプチダーゼの活性が低下又は喪失した微生物を挙げることができる。
炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成する微生物
１－２の本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物である。
１－２の本発明の微生物は、炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物である。
炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成する微生物とは、後述の２－１の方法で該微生物を培地に培養したときに、炭素源を出発物質として、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを該微生物内に生成する微生物をいう。
そのような微生物としては、炭素源を出発物質としてアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成する微生物である限りにおいて制限はない。
例えば、任意の親株を用いて取得したエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を挙げることができる。また、以下の（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つに記載の微生物を親株として造成した、上記のエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物、又は上記のエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を親株として造成した、以下の（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つに記載の微生物を挙げることができる。
（Ｅ）親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）及びアルデヒドレダクターゼ（ＹｑｈＤ）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物
（Ｆ）親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥｕｔＥ）の活性が増強した微生物
（Ｇ）親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）の活性が増強した微生物
（Ｈ）上記（Ｅ）～（Ｇ）の微生物が有する形質を任意の組み合わせで有する微生物
１－２の本発明の微生物は、アセトアルデヒドやアラニンの供給量を増やす観点から、上記（Ｆ）又は（Ｇ）の形質を、好ましくは（Ｆ）及び（Ｇ）の形質を有することが好ましい。
その上で、アセトアルデヒドがエタノールに代謝されるのを抑制する観点から、上記（Ｅ）の形質を有することがさらに好ましい。
例えば、任意の親株を用いて取得したエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を挙げることができる。また、以下の（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つに記載の微生物を親株として造成した、上記のエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物、又は上記のエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を親株として造成した、以下の（Ｅ）～（Ｈ）のいずれか１つに記載の微生物を挙げることができる。
（Ｅ）親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）及びアルデヒドレダクターゼ（ＹｑｈＤ）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物
（Ｆ）親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥｕｔＥ）の活性が増強した微生物
（Ｇ）親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）の活性が増強した微生物
（Ｈ）上記（Ｅ）～（Ｇ）の微生物が有する形質を任意の組み合わせで有する微生物
１－２の本発明の微生物は、アセトアルデヒドやアラニンの供給量を増やす観点から、上記（Ｆ）又は（Ｇ）の形質を、好ましくは（Ｆ）及び（Ｇ）の形質を有することが好ましい。
その上で、アセトアルデヒドがエタノールに代謝されるのを抑制する観点から、上記（Ｅ）の形質を有することがさらに好ましい。
上記（Ｅ）の該親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ及びアルデヒドレダクターゼからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の蛋白質の活性が低下又は喪失した微生物、（Ｆ）該親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が増強した微生物、（Ｇ）該親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼの活性が増強した微生物、及び（Ｈ）上記（Ｅ）～（Ｇ）の微生物が有する形質を任意の組み合わせで有する微生物の造成方法については、上記１－１と同様である。
２．本発明のテアニンの製造方法
本発明のテアニンの製造方法は、以下の２－１及び２－２に記載の方法である。
本発明のテアニンの製造方法は、以下の２－１及び２－２に記載の方法である。
２－１．発酵法によるテアニンの製造方法
本発明のテアニンの製造方法としては、上記１－１又は上記１－２の微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法を挙げることができる。
本発明のテアニンの製造方法としては、上記１－１又は上記１－２の微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法を挙げることができる。
上記１－１及び上記１－２の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸、有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液のｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記の培養により、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することにより、テアニンを製造することができる。
生成したテアニンは、クロロギ酸９－フルオレニルメチル（東京化成工業社製、以下、Ｆｍｏｃという。）で誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析することができる。反応液中に生成したテアニンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
該培養物中からのテアニンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。菌体内にテアニンが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法等によって、テアニンを採取することができる
２－２．アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰ、又は、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを基質として用いるテアニンの製造方法
本発明のテアニンの製造方法としては、また、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰ、又は、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを基質として用いるテアニンの製造方法を挙げることもできる。
本発明のテアニンの製造方法としては、また、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰ、又は、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを基質として用いるテアニンの製造方法を挙げることもできる。
具体的には、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを含有する水性媒体中に、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素を共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することができる。
また、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを含有する水性媒体中に、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びグルタミナーゼを共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することもできる。
本発明のテアニンの製造方法で用いる、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質、γ－グルタルメチルアミド合成酵素、及びグルタミナーゼの水性媒体中の濃度は、それぞれ、通常０．００１～５００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．０１～３００ｇ／Ｌである。
アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ、及びグルタミンの水性媒体中の濃度は、それぞれ、通常０．１ｍＭ～１０Ｍであり、好ましくは１ｍＭ～１Ｍである。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等を挙げることができる。また、後述する酵素源として用いた微生物の培養液を、水性媒体として用いることもできる。
テアニンの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤又は有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ－２１５、日本油脂社製）等の非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２－４０Ｅ、日本油脂社製）等のカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）等の三級アミン類等、テアニンの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種又は数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ－２１５、日本油脂社製）等の非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２－４０Ｅ、日本油脂社製）等のカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）等の三級アミン類等、テアニンの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種又は数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／Ｌの濃度で用いることができる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、通常０．１～５０ｍｌ／Ｌの濃度で用いることができる。
テアニンの生成反応は、水性媒体中、通常ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行うことができる。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、ＡＤＰ、ＡＴＰ、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等を添加することができる。アデニン、ＡＭＰは、通常０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。
テアニンの生成反応は、水性媒体中、通常ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行うことができる。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、ＡＤＰ、ＡＴＰ、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等を添加することができる。アデニン、ＡＭＰは、通常０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で用いることができる。
上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質、γ－グルタルメチルアミド合成酵素、及びグルタミナーゼとしては、例えば、上記１－１の微生物又は上記１－２の微生物の培養物から精製したものを用いることができる。
基質として用いられるアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンとしては、特に制限はなく、例えば、市販のアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンを用いることができる。
また、上記１－１及び上記１－２の微生物のいずれか１種以上の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該微生物菌体内又は該水性媒体中に生成、蓄積させて得られるアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンを用いてもよい。
エネルギー供与体としては、上記２－１の炭素源を挙げることができる。
基質として用いられるアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンとしては、特に制限はなく、例えば、市販のアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンを用いることができる。
また、上記１－１及び上記１－２の微生物のいずれか１種以上の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該微生物菌体内又は該水性媒体中に生成、蓄積させて得られるアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンを用いてもよい。
エネルギー供与体としては、上記２－１の炭素源を挙げることができる。
また、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンからなる群より選ばれる物質を生成、蓄積する任意の微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源及びエネルギー供与体を水性媒体中に存在せしめ、該微生物菌体内又は該水性媒体中に生成、蓄積させて得られるアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸、ＡＴＰ及びグルタミンを用いてもよい。
エチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性又はグルタミナーゼ活性が増強した微生物の培養物又は該培養物の処理物を用いたテアニンの製造方法
また、酵素源として、精製した上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質、γ－グルタルメチルアミド合成酵素、及びグルタミナーゼにかえて、上記１－１及び上記１－２の微生物の培養物又は該培養物の処理物を用いることもできる。
また、酵素源として、精製した上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質、γ－グルタルメチルアミド合成酵素、及びグルタミナーゼにかえて、上記１－１及び上記１－２の微生物の培養物又は該培養物の処理物を用いることもできる。
微生物を培養する方法及び微生物を培養する培地については、上記２－１と同様である。
上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰ、又は、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該媒体からテアニンを採取することにより、テアニンを製造することができる。
培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、又は濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、及び該菌体の固定化物等の酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、及び当該処理した菌体から得られる精製酵素を、好ましくは上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、又は濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、及び該菌体の固定化物等の酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物を、さらに好ましくは上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、又は濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、及び該菌体の固定化物等の酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものを挙げることができる。
生成したテアニンの分析及び採取については、上記２－１と同様である。
本発明の好ましい実施形態として、以下のものが挙げられる。
（Ｉ）糖からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物であって、エシェリヒア属に属する微生物。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
（ＩＩ）上記（Ｉ）の微生物であって、親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）又は（ＩＩ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＩＶ）上記（Ｉ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／又はＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物。
（Ｖ）上記（ＩＶ）の微生物であって、親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ活性及び／又はアルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＶＩ）上記（Ｉ）～（Ｖ）のいずれかの微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＶＩＩ）上記（Ｉ）～（Ｖ）のいずれかの微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＶＩＩＩ）糖からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記（Ｉ）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物であって、エシェリヒア属に属する微生物。
（ＩＸ）上記（ＶＩＩＩ）の微生物であって、親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（Ｘ）上記（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＸＩ）上記（ＶＩＩＩ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／又はＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物。
（ＸＩＩ）上記（ＸＩ）の微生物であって、親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ活性及び／又はアルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＸＩＩＩ）上記（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＩ）のいずれかの微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＸＩＶ）上記（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＩ）のいずれかの微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（Ｉ）糖からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物であって、エシェリヒア属に属する微生物。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質
（ＩＩ）上記（Ｉ）の微生物であって、親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＩＩＩ）上記（Ｉ）又は（ＩＩ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＩＶ）上記（Ｉ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／又はＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物。
（Ｖ）上記（ＩＶ）の微生物であって、親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ活性及び／又はアルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＶＩ）上記（Ｉ）～（Ｖ）のいずれかの微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＶＩＩ）上記（Ｉ）～（Ｖ）のいずれかの微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＶＩＩＩ）糖からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ親株よりも、上記（Ｉ）の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物であって、エシェリヒア属に属する微生物。
（ＩＸ）上記（ＶＩＩＩ）の微生物であって、親株よりもＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（Ｘ）上記（ＶＩＩＩ）又は（ＩＸ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強し、かつ、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＸＩ）上記（ＶＩＩＩ）の微生物であって、親株よりもアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性及び／又はＬ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強した微生物。
（ＸＩＩ）上記（ＸＩ）の微生物であって、親株よりもアルコールデヒドロゲナーゼ活性及び／又はアルデヒドレダクターゼ活性が低下又は喪失した微生物。
（ＸＩＩＩ）上記（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＩ）のいずれかの微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
（ＸＩＶ）上記（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＩ）のいずれかの微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを基質として用いるテアニンの製造
（１）エチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物の造成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｂ７２８ａ株を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１９及び２０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、γ－グルタルメチルアミド合成酵素Ｐｓｙｒ＿２２７３（配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
（１）エチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物の造成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｂ７２８ａ株を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号１９及び２０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、γ－グルタルメチルアミド合成酵素Ｐｓｙｒ＿２２７３（配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株から上記と同じ方法により染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号２１及び２２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エチルアミン生成活性を有する蛋白質ＰＰ＿５１８２（配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。また、配列番号２３及び２４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エチルアミン生成活性を有する蛋白質ＰＰ＿０５９６（配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓから上記と同じ方法により染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号２５及び２６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エチルアミン生成活性を有する蛋白質ＪＭ４９＿０１７２５（配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ２５株から上記と同じ方法により染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号２７及び２８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、エチルアミン生成活性を有する蛋白質ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５（配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
上記で得られたＰｓｙｒ＿２２７３及びＰＰ＿５１８２をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２を得た。
同様に、上記で得られたＰｓｙｒ＿２２７３及びＰＰ＿０５９６をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６を得た。
同様に、上記で得られたＰｓｙｒ＿２２７３及びＪＭ４９＿０１７２５をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５を得た。
同様に、上記で得られたＰｓｙｒ＿２２７３及びＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５を得た。
取得した、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９ＡでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換し、それら発現プラスミドを保有する組換え大腸菌として、それぞれ、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得た。
（２）アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを基質として用いるテアニンの製造
実施例１（１）で得られたＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、終濃度１０ｍＭのアラニン、終濃度１０ｍＭのアセトアルデヒドを添加して、さらに３０℃で２１時間、振盪培養した。
実施例１（１）で得られたＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、終濃度１０ｍＭのアラニン、終濃度１０ｍＭのアセトアルデヒドを添加して、さらに３０℃で２１時間、振盪培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるテアニンをＦｍｏｃ（東京化成工業社製）にて誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析した。結果を表１に示す。
その結果、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株はテアニンを生産しなかったのに対し、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株はテアニンを生産した。
以上より、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素（Ｐｓｙｒ＿２２７３）をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０株よりもエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を用いて、外部からエチルアミンを添加することなく、テアニンを製造できることがわかった。
以上より、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素（Ｐｓｙｒ＿２２７３）をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０株よりもエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を用いて、外部からエチルアミンを添加することなく、テアニンを製造できることがわかった。
［実施例２］発酵法によるテアニンの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損及び遺伝子置換の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表２の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
（１）遺伝子欠損及び遺伝子置換の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表２の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、ｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。配列番号３０及び３１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡにはＳａｌＩ認識サイトが付与されている。
増幅ＤＮＡ断片のｃａｔ及びｓａｃＢを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液を鋳型とし、配列番号２９及び３２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
（２）Ｌ－アラニンデヒドロゲナーゼ活性が増強し、アルデヒドレダクターゼ活性が喪失した微生物の造成
アルデヒドレダクターゼをコードするＤＮＡ（以下、ｙｑｈＤ遺伝子という。）を、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの発現を支配するプロモーター（以下、ｉｌｖプロモーターという。）を上流に付したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＬ－アラニンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｌｄ遺伝子という。）に置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。
アルデヒドレダクターゼをコードするＤＮＡ（以下、ｙｑｈＤ遺伝子という。）を、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの発現を支配するプロモーター（以下、ｉｌｖプロモーターという。）を上流に付したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＬ－アラニンデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｌｄ遺伝子という。）に置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。
ａｌｄ遺伝子はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、その他のＤＮＡ断片はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、増幅した。
ｙｑｈＤ上流１及びｙｑｈＤ上流２はｙｑｈＤ遺伝子の開始コドンからその上流約１５００ｂｐを含む。ｙｑｈＤ下流１及びｙｑｈＤ下流２は、ｙｑｈＤ遺伝子の終止コドンからその下流約１５００ｂｐを含む。
ｙｑｈＤ上流１断片、ｙｑｈＤ下流１断片、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３５及び３８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｑｈＤ遺伝子周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｑｈＤ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
ｙｑｈＤ上流２断片、ｙｑｈＤ下流２断片、ｉｌｖプロモーター断片、ａｌｄ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３５及び３８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｉｌｖプロモーターを上流に付したａｌｄ遺伝子が挿入されたｙｑｈＤ遺伝子周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｑｈＤ：：Ｐｉｌｖ－ａｌｄという。）断片を得た。
ｙｑｈＤ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９７，６６４０－６６４５（２０００）］を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつスクロース感受性を示した形質転換体（ｙｑｈＤ遺伝子がｙｑｈＤ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換された形質転換体）を得た。
ｙｑｈＤ：：Ｐｉｌｖ－ａｌｄ断片を当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示した形質転換体（ｙｑｈＤ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｉｌｖ－ａｌｄに置換された形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＷ３１１０Ａ株と命名した。
（３）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が増強し、アルコールデヒドロゲナーゼ活性が喪失した微生物の造成
アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｄｈＥ遺伝子という。）を、ｉｌｖプロモーターを上流に付したアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、ｅｕｔＥ遺伝子という。）に置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。
アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｄｈＥ遺伝子という。）を、ｉｌｖプロモーターを上流に付したアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下、ｅｕｔＥ遺伝子という。）に置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。
常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表４の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
ａｄｈＥ上流１及びａｄｈＥ上流２はａｄｈＥ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ａｄｈＥ下流１及びａｄｈＥ下流２は、ａｄｈＥ遺伝子の終止コドンからその下流約１５００ｂｐを含む。
ａｄｈＥ上流１断片、ａｄｈＥ下流１断片、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたａｄｈＥ遺伝子周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ａｄｈＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
ａｄｈＥ上流２断片、ａｄｈＥ下流２断片、ｉｌｖプロモーター断片、ｅｕｔＥ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｉｌｖプロモーターを上流に付したｅｕｔＥ遺伝子が挿入されたａｄｈＥ遺伝子周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ａｄｈＥ：：Ｐｉｌｖ－ｅｕｔＥという。）断片を得た。
ａｄｈＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０Ａ株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつスクロース感受性を示した形質転換体（ａｄｈＥ遺伝子がａｄｈＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換された形質転換体）を得た。
ａｄｈＥ：：Ｐｉｌｖ－ｅｕｔＥ断片を当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示した形質転換体（ａｄｈＥ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｉｌｖ－ｅｕｔＥに置換された形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＷ３１１０ＡＥ株と命名した。
［実施例３］発酵法によるグルコースからのテアニンの製造－１
実施例２にて取得したＷ３１１０ＡＥ株を、実施例１に記載のｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９Ａで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得た。
当該微生物をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２１時間、振盪培養した。
実施例２にて取得したＷ３１１０ＡＥ株を、実施例１に記載のｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９Ａで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得た。
当該微生物をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２１時間、振盪培養した。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるテアニンをＦｍｏｃ（東京化成工業社製）にて誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析した。結果を表５に示す。
その結果、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ株はテアニンを生産しなかったのに対し、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＪＭ４９＿０１７２５株、及びＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｐｓｙｒ＿２２７３＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株はテアニンを生産した。
以上より、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素（Ｐｓｙｒ＿２２７３）をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０ＡＥ株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０ＡＥよりもエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を用いることにより、糖から効率的にテアニンを製造できることがわかった。
以上より、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素（Ｐｓｙｒ＿２２７３）をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０ＡＥ株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０ＡＥよりもエチルアミン生成活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物を用いることにより、糖から効率的にテアニンを製造できることがわかった。
また、このとき培地中にエチルアミンは残存しておらず、当該方法により、エチルアミンを外部から添加することなく、また、エチルアミンを副生物として培地中に蓄積することなくテアニンを製造できることがわかった。
［実施例４］アセトアルデヒド、アラニン、及びグルタミンを基質として用いるテアニンの製造
（１）エチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物の造成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＩＦＯ １２６９４株（特開平１１－２２５７８９号公報）を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。特開平１１－２２５７８９号公報のグルタミナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列をもとにプライマーを設計し、上記１－２に記載の方法にしたがって、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、グルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡ断片を増幅する。
（１）エチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物の造成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ ＩＦＯ １２６９４株（特開平１１－２２５７８９号公報）を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。特開平１１－２２５７８９号公報のグルタミナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列をもとにプライマーを設計し、上記１－２に記載の方法にしたがって、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、グルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡ断片を増幅する。
ＧＬＮ及び実施例１（１）で取得したＰＰ＿５１８２をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２を得る。
同様に、ＧＬＮ及び実施例１（１）で取得したＰＰ＿０５９６をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６を得る。
同様に、ＧＬＮ及び実施例１（１）で取得したＪＭ４９＿０１７２５をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５を得る。
同様に、ＧＬＮ及び実施例１（１）で取得したＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５をコードするＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （タカラバイオ社製）を用いて発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５を得る。
ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９ＡでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換し、それら発現プラスミドを保有する組換え大腸菌として、それぞれ、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得る。
（２）アセトアルデヒド、アラニン、及びグルタミンを基質として用いるテアニンの製造
Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養する。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合する）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、終濃度１０ｍＭのアラニン、終濃度１０ｍＭのアセトアルデヒドを添加して、さらに３０℃で２１時間、振盪培養する。
Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養する。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合する）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ、終濃度１０ｍＭのアラニン、終濃度１０ｍＭのアセトアルデヒドを添加して、さらに３０℃で２１時間、振盪培養する。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるテアニンをＦｍｏｃ（東京化成工業社製）にて誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析する。
その結果、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びグルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０株よりもエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を用いて、外部からエチルアミンを添加することなく、テアニンを製造できることがわかる。
その結果、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びグルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０株よりもエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を用いて、外部からエチルアミンを添加することなく、テアニンを製造できることがわかる。
［実施例５］発酵法によるグルコースからのテアニンの製造－２
実施例２にて取得したＷ３１１０ＡＥ株を、実施例４に記載のｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９Ａで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得る。
当該微生物をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養する。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合する）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２１時間、振盪培養する。
実施例２にて取得したＷ３１１０ＡＥ株を、実施例４に記載のｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５、ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５、又はｐＴｒｃ９９Ａで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿５１８２株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＰ＿０５９６株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＪＭ４９＿０１７２５株、Ｗ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ＿ＧＬＮ＿ＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５株、及びＷ３１１０ＡＥ／ｐＴｒｃ９９Ａ株を得る。
当該微生物をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養する。
その後、それぞれ試験管生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合する）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２１時間、振盪培養する。
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるテアニンをＦｍｏｃ（東京化成工業社製）にて誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析する。
その結果、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びグルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０ＡＥ株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０ＡＥ株よりもエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を用いることにより、糖から効率的にテアニンを製造できることがわかる。
その結果、エチルアミン生成活性を有する蛋白質（ＰＰ＿５１８２、ＰＰ＿０５９６、ＪＭ４９＿０１７２５、又はＰＦＬＵ＿ＲＳ０３３２５）及びグルタミナーゼＧＬＮをコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡでＷ３１１０ＡＥ株を形質転換して得られる、Ｗ３１１０ＡＥ株よりもエチルアミン生成活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物を用いることにより、糖から効率的にテアニンを製造できることがわかる。
また、このとき培地中にエチルアミンは残存していないことを確認することにより、当該方法により、エチルアミンを外部から添加することなく、また、エチルアミンを副生物として培地中に蓄積することなくテアニンを製造できることがわかる。
本発明により、テアニンを生成する微生物及び該微生物を用いた、外部からエチルアミンを添加せず、副生物としてエチルアミンが蓄積、残存しない、テアニンの効率的な製造方法が提供される。
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Claims (10)
- 炭素源からアセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを生成し、かつ形質転換により、親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素活性が増強した微生物。
［１］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセトアルデヒドとアラニンを基質としてエチルアミンを生成する活性（以下、エチルアミン生成活性という。）を有する変異蛋白質
［３］配列番号２、４、６、又は８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エチルアミン生成活性を有する相同蛋白質 - 炭素源からアセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを生成し、かつ形質転換により、親株よりも、請求項１の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質の活性及びグルタミナーゼ活性が増強した微生物。
- アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを含有する水性媒体中に、請求項１の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素を共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
- アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを含有する水性媒体中に、請求項１の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びグルタミナーゼを共存させることにより、テアニンを該水性媒体中に生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
- 請求項１又は２に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にテアニンを生成、蓄積させ、該培養物中からテアニンを採取することを特徴とする、テアニンの製造方法。
- 請求項１に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン、グルタミン酸及びＡＴＰを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とし、
前記培養物の処理物は、請求項１の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びγ－グルタルメチルアミド合成酵素を含む、テアニンの製造方法。 - 請求項２に記載の微生物の培養物又は該培養物の処理物、アセトアルデヒド、アラニン及びグルタミンを水性媒体中に共存せしめ、該水性媒体中にテアニンを生成、蓄積させ、該水性媒体中からテアニンを採取することを特徴とし、
前記培養物の処理物は、請求項１の［１］～［３］のいずれか１つに記載の蛋白質及びグルタミナーゼを含む、テアニンの製造方法。 - 微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項１又は２に記載の微生物。
- 微生物が、エシェリヒア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項５～７のいずれか１項に記載のテアニンの製造方法。
- 炭素源が糖である、請求項１又は２に記載の微生物。
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