CN110494553B - 茶氨酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，通过使用以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性、以及γ‑谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的情况下高效地制造茶氨酸。

Description

茶氨酸的制造方法
技术领域
本发明涉及生成茶氨酸的微生物和使用该微生物的不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的、茶氨酸的高效制造方法。
背景技术
茶氨酸是茶叶中所含的氨基酸的一种，已知作为鲜味的主要成分，是作为食品的香味成分的重要物质(专利文献1)。另外，近年来，已经明确其具有放松作用、咖啡因兴奋抑制作用和降血压作用等各种生理作用，作为食品添加剂的需求扩大。
作为茶氨酸的制造方法，公开了使由假单胞菌属细菌得到的谷氨酰胺酶作用于谷氨酰胺和乙胺的方法(专利文献2)、使谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酶产生菌作用于谷氨酰胺和乙胺衍生物的方法(专利文献3)、在ATP存在下使甲基营养菌所具有的γ-谷氨酰甲胺合成酶作用于谷氨酸和乙胺的方法(专利文献1)等，但这些方法中，在其制造步骤中需要添加乙胺作为反应底物。但是，由于乙胺的沸点非常低，因此在制造中无法避免乙胺的挥发，挥发的乙胺可能对周围环境和作业人员的身体产生不良影响。另外，例如在为了提高反应效率而要使乙胺在沸点以上的温度下反应时需要特殊的设备，上述方法在安全方面、成本方面存在问题(专利文献1)。因此，要求不从外部添加乙胺作为底物且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的茶氨酸的制造方法。
后述的由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质(分别对应于图1和图2中的PP_5182、PP_0596、JM49_01725和RFLU_RS03325)为假单胞菌属细菌所具有的蛋白质，均作为氨基转移酶登记在数据库中(NCBI参考序列登记号：NP_747283、NP_742759、WP_012722053、GenBank登记号：AIS10430)。但是，未进行这些蛋白质实际作为氨基转移酶发挥功能的实验性验证，另外，也没有关于其底物和所催化的化学反应的见解。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-225705号公报
专利文献2：日本特开平05-68578号公报
专利文献3：日本特开平11-225789号公报
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，使用乙胺的现有的茶氨酸的制造方法在安全方面、成本方面存在问题。
因此，本发明的课题在于提供不从外部添加乙胺的、茶氨酸的高效制造方法。
用于解决问题的方法
本发明涉及下述(1)～(10)项。
(1)一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP，并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强。
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质
[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质
[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质
(2)一种微生物，其由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺，并且上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强。
(3)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和γ-谷氨酰甲胺合成酶在含有乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
(4)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和谷氨酰胺酶在含有乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
(5)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，将上述(1)或(2)所述的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。
(6)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(1)所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
(7)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(2)所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
(8)如上述(1)或(2)所述的微生物，其中，微生物为属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物。
(9)如上述(5)～(7)中任一项所述的茶氨酸的制造方法，其中，微生物为属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物。
(10)如上述(1)或(2)所述的微生物，其中，碳源为糖。
发明效果
根据本发明，可提供生成茶氨酸的微生物和使用该微生物的不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的、茶氨酸的高效制造方法。
附图说明
图1表示基于使用γ-谷氨酰甲胺合成酶的发酵法的茶氨酸的制造方法中的、微生物内的假想代谢途径的示意图。AdhE：醇脱氢酶、YqhD：醛还原酶、EutE：醛脱氢酶、Ald：L-丙氨酸脱氢酶、Psyr_2273：γ-谷氨酰甲胺合成酶、PP_5182、PP_0596、JM49_01725和PFLU_RS03325：具有乙胺生成活性的蛋白质、TCA循环：柠檬酸循环
图2表示基于使用谷氨酰胺酶的发酵法的茶氨酸的制造方法中的、微生物内的假想代谢途径的示意图。AdhE：醇脱氢酶、YqhD：醛还原酶、EutE：醛脱氢酶、Ald：L-丙氨酸脱氢酶、PP_5182、PP_0596、JM49_01725和PFLU_RS03325：具有乙胺生成活性的蛋白质、TCA循环：柠檬酸循环
具体实施方式
1.本发明的微生物和该微生物的制造方法
1-1.乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物和该微生物的制造方法
乙胺生成活性增强的微生物
本发明的微生物是由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物。
[1]具有序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列的蛋白质
[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质
[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质
突变蛋白质是指人为地使原蛋白质中的氨基酸残基缺失或置换、或者人为地在该蛋白质中插入或添加氨基酸残基而得到的蛋白质。
同源蛋白质是指自然界中存在的生物所具有的、进化上的起源来源于同一蛋白质的一组蛋白质。同源蛋白质彼此的结构和功能类似。
突变蛋白质中，缺失、置换、插入或添加有氨基酸可以是在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加有1～20个氨基酸。
缺失、置换、插入或添加的氨基酸无论是天然型还是非天然型均可。作为天然型氨基酸，可以列举L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
以下，示出可以相互置换的氨基酸的示例。同一组中包含的氨基酸可以相互置换。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2一氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
氨基酸序列和碱基序列的一致性可以使用由Karlin和Altschul提出的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[Methods Enzymol.，183,63(1990)]来确定。基于该BLAST算法，开发出称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.，215,403(1990)]。在基于BLAST使用BLASTN对碱基序列进行分析的情况下，参数例如设定为得分(Score)＝100、字长(wordlength)＝12。另外，在基于BLAST使用BLASTX对氨基酸序列进行分析的情况下，参数例如设定为得分(Score)＝50、字长(wordlength)＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是公知的。
上述突变蛋白质或同源蛋白质具有乙胺生成活性可以通过下述方法进行确认：利用后述方法制作具有编码该蛋白质的DNA的重组体DNA，利用该重组体DNA对不具有乙胺生成活性的微生物、例如大肠杆菌(Escherichia coli)W3110株进行转化，对所得到的微生物进行培养，由所得到的培养物制备包含该蛋白质的细胞提取液，使该级分与包含作为底物的乙醛和丙氨酸的水溶液接触，结果生成乙胺，利用高效液相色谱(HPLC)或气相色谱对所生成的乙胺进行检测。
(乙胺生成活性增强的微生物的具体例)
作为上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性增强的微生物，可以列举例如利用具有下述[4]～[7]中任一项所述的DNA的重组体DNA对亲株进行转化而得到的、乙胺生成活性比该亲株增强的微生物。
[4]编码上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的DNA
[5]由序列号1、3、5或7所表示的碱基序列构成的DNA
[6]在严格条件下与由与序列号1、3、5或7所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有乙胺生成活性的同源蛋白质的DNA
[7]由与序列号1、3、5或7所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有乙胺生成活性的同源蛋白质的DNA
上述中，杂交是指DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分杂交的步骤。因此，与该具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分杂交的DNA的碱基序列可以是作为Northern或Southern印迹分析的探针有用、或者能够作为PCR分析的寡核苷酸引物使用的长度的DNA。作为用作探针的DNA，可以列举至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的DNA，作为用作引物的DNA，可以列举至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的DNA。
DNA的杂交实验的方法是熟知的，例如可以按照分子克隆第4版(冷泉港实验室出版社(2012))、Methods for General and Molecular Bacteriology(常用分子微生物学方法)(ASM出版社(1994))、Immunology methods manual(免疫方法手册)(学术出版社(1997))以及多数的其他标准教科书来确定杂交的条件，并进行实验。
另外，也可以按照市售的杂交试剂盒所附的说明书来获得在严格条件下杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒，可以列举例如利用随机引物法制作探针、在严格条件下进行杂交的随机引物DNA标记试剂盒(罗氏诊断公司制造)等。
上述严格条件可以列举例如下述条件：将固定有DNA的滤膜和探针DNA在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特(Denhardt)溶液、10％的硫酸葡聚糖和20μg/L的变性鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃下温育过夜，然后在例如约65℃的0.2×SSC溶液中对该滤膜进行清洗。
上述各种条件也可以通过添加或变更用于抑制杂交实验的背景的封闭试剂来设定。为了使条件适合，上述封闭试剂的添加可以伴随杂交条件的变更。
作为能够在上述严格条件下进行杂交的DNA，可以列举例如由使用上述BLAST、FASTA等程序基于上述参数进行计算时与序列号1、3、5或7所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成的DNA。
具有上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的重组体DNA例如为能够在亲株中自主复制的、将上述[4]～[7]中任一项所述的DNA整合到在能够对上述[4]～[7]中任一项所述的DNA进行转录的位置含有启动子的表达载体中而得到的DNA。
另外，在亲株中能够整合到染色体中的、具有上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的DNA也是具有上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的重组体DNA。
在重组体DNA为能够整合到亲株的染色体DNA中的DNA的情况下，也可以不含有启动子。
亲株是指作为基因改造和转化等的对象的原株。作为利用基因导入进行的转化的对象的原株也称为宿主株。
亲株可以为任何微生物，优选列举原核生物或酵母菌株，更优选列举属于埃希氏菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、微杆菌属或假单胞菌属等的原核生物、或者属于酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属等的酵母菌株，最优选列举大肠杆菌BL21 codon plus、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制造)、大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(默克密理博公司制造)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08 Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制造)、大肠杆菌W、大肠杆菌JM101、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌W1485、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC 14066、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 14067、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354或假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110等原核生物、或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)或产朊假丝酵母(Candida utilis)等酵母菌株。
在使用细菌等原核生物作为亲株的情况下，能够在亲株中自主复制的重组体DNA优选为由启动子、核糖体结合序列、上述[4]～[7]中任一项所述的DNA和转录终止序列构成的重组体DNA。也可以包含对启动子进行调控的基因。
优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的重组体DNA。
另外，能够在亲株中自主复制的重组体DNA中，该DNA的表达不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在结构基因下游配置转录终止序列。
在亲株使用属于埃希氏菌属的微生物的情况下，作为表达载体，可以列举例如pColdI、pSTV28、pUC118(均为宝生物公司制造)、pET21a、pCDF-1b、pRSF-1b(均为默克密理博公司制造)、pMAL-c2x(New England Biolabs公司制造)、pGEX-4T-1、pTrc99A(均为GEHealthcare BioSciences公司制造)、pTrcHis、pSE280(均为赛默飞世尔科技公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-30、pQE80L(均为Qiagen公司制造)、pET-3、pBluescriptII SK(+)、pBluescriptII KS(-)(均为安捷伦科技公司制造)、pKYP10(日本特开昭58—110600号公报)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2007，Vol.73，No.20，p.6378-6385]、pPAC31(国际公开第98/12343号)、pUC19[Gene，33，103(1985)]、pPA1(日本特开昭63-233798号公报)等。
作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要在属于埃希氏菌属的微生物的细胞中发挥功能，可以为任何启动子，例如可以使用trp启动子、ilv启动子等参与氨基酸生物合成的基因的启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、PSE启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个trp启动子串联而得到的启动子、tac启动子、trc启动子、lacT7启动子、let I启动子这样经人为设计改变的启动子。
在亲株使用属于棒状杆菌属、短杆菌属或微杆菌属的微生物等棒状细菌的情况下，作为表达载体，可以列举例如pCG1(日本特开昭57-134500号公报)、pCG2(日本特开昭58-35197号公报)、pCG4(日本特开昭57-183799号公报)、pCG11(日本特开昭57-134500号公报)、pCG116、pCE54、pCB101(均记载于日本特开昭58-105999号公报)、pCE51、pCE52、pCE53[均记载于Molecular and General Genetics，196，175(1984)]等。
作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要在属于棒状杆菌属、短杆菌属或微杆菌属的微生物等棒状细菌的细胞中发挥功能，可以为任何启动子，例如可以使用P54-6启动子[Appl.Microbiol.Biotechnol.，53,674-679(2000)]。
在亲株使用酵母菌株的情况下，作为表达载体，可以列举例如YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS 15等。
作为使用上述表达载体的情况下的启动子，只要在酵母菌株的细胞中发挥功能，可以为任何启动子，可以列举例如PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、ga11启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。
利用该重组体DNA对亲株进行转化而得到的、乙胺生成活性比该亲株增强的微生物是指：1)通过以能够在亲株中自主复制的质粒的形式导入该重组体DNA、或者通过将该重组体DNA整合到亲株的染色体中而使该DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的产量增大的微生物；或者2)通过生产上述[2]的突变蛋白质而使具有乙胺生成活性的蛋白质的比活性增强的微生物。
作为对上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的产量增大进行确认的方法，例如可以通过利用Northern印迹测定该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
作为对具有乙胺生成活性的蛋白质的比活性增强进行确认的方法，例如可以通过下述方法来确认：利用编码突变蛋白质的DNA对亲株进行转化，从所得到的转化株中纯化该突变蛋白质，使该蛋白质、乙醛和丙氨酸存在于水性介质中，根据该水性介质中生成、蓄积的乙胺和该蛋白质量测定比活性，与同样测定的未导入突变的具有乙胺生成活性的蛋白质的比活性进行比较。
(乙胺生成活性增强的微生物的制造方法)
利用具有上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的重组体DNA对亲株进行转化而得到的、乙胺生成活性比该亲株增强的微生物可以利用下述方法进行制造。
上述[4]的DNA中编码上述[1]的蛋白质的DNA和上述[5]的DNA例如可以通过使用可基于序列号1、3、5或7所表示的碱基序列进行设计的探针DNA的、针对微生物、优选假单胞菌属、更优选选自由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440株、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)SBW株组成的组中的微生物的染色体DNA文库进行的Southern杂交、或者使用可以基于该碱基序列进行设计的引物DNA的、以上述微生物的染色体DNA作为模板的PCR[PCR Protocols，学术出版社(1990)]来获得。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440株、绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)SBW株可以由独立行政法人日本国家技术与评估研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
上述[4]的DNA中编码上述[3]的同源蛋白质的DNA、以及上述[6]和[7]的DNA例如可以如下获得：对各种基因序列数据库检索与序列号1、3、5或7所表示的碱基序列具有95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列，或者对各种蛋白质序列数据库检索与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列，使用可以基于通过该检索得到的碱基序列或氨基酸序列进行设计的探针DNA或引物DNA以及具有该DNA的微生物，通过与获得上述DNA的方法同样的使用Southern杂交或PCR的方法等而获得。
上述[4]的DNA中编码上述[2]的突变蛋白质的DNA例如可以通过以由序列号1、3、5或7所表示的碱基序列构成的DNA作为模板进行易错PCR等而获得。
另外，通过使用在各自的5’端具有以导入目标突变(缺失、置换、插入或添加)的方式设计的碱基序列的1组PCR引物的PCR[Gene,77，51(1989)]也可以获得上述[2]的DNA。即，首先利用与该DNA的5’端对应的有义引物和在5’端具有与突变的序列互补的序列的、与紧挨在突变导入部位之前(5’侧)的序列对应的反义引物，以该DNA作为模板进行PCR，扩增出从该DNA的5’端至突变导入部位为止的片段A(在3’端导入有突变)。接着，利用在5’端具有突变的序列的、与紧挨在突变导入部位之后(3’侧)的序列对应的有义引物和与该DNA的3’端对应的反义引物，以该DNA作为模板进行PCR，扩增出在5’端导入有突变的从该DNA的突变导入部位至3’端为止的片段B。将这些扩增片段彼此纯化后混合，在不添加模板、引物的情况下进行PCR时，由于扩增片段A的有义链与扩增片段B的反义链具有共同的突变导入部位，因此发生杂交，作为引物兼模板使PCR的反应进行，扩增出导入有突变的DNA。
所获得的上述[4]～[7]中任一项所述的DNA直接、或者用适当的限制酶等切断，通过常规方法整合到载体中，将所得到的重组体DNA导入到宿主细胞中，然后使用通常所用的碱基序列分析方法、例如双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,5463(1977)]或3700DNA分析仪(应用生物系统公司制造)等碱基序列分析装置进行分析，由此能够确定该DNA的碱基序列。
作为上述宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue(均为安捷伦科技公司制造)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HST08Premium、大肠杆菌HST02、大肠杆菌HST04 dam-/dcm-、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌CJ236、大肠杆菌BMH71-18mutS、大肠杆菌MV1184、大肠杆菌TH2(均为宝生物公司制造)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌W1485、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522等。
作为上述载体，可以列举pBluescriptII KS(+)、pPCR-Script Amp SK(+)(均为安捷伦科技公司制造)、pT7Blue(默克密理博公司制造)、pCRII(赛默飞世尔科技公司制造)、pCR-TRAP(Gene Hunter公司制造)和pDIRECT[Nucleic Acids Res.，18,6069(1990)]等。
作为重组体DNA的导入方法，只要是向宿主细胞中导入DNA的方法均可以使用，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、电穿孔法[Nucleic Acids Res.，16,6127(1988)]等。
确定碱基序列的结果是，在所获得的DNA为部分长度的情况下，可以通过使用该部分长度DNA作为探针的对染色体DNA文库进行的Southern杂交法等获得全长DNA。
此外，也可以基于所确定的DNA的碱基序列，通过使用PerSeptive Biosystems公司制造的8905型DNA合成装置等进行化学合成而制备目标DNA。
在此，也可以通过按照使该DNA的碱基序列成为最适合于宿主中的表达的密码子的方式置换碱基来提高该DNA所编码的蛋白质的表达量。本发明的制造方法中使用的亲株中的密码子使用频率的信息可以通过公共数据库获得。
通过将如上制备的DNA片段插入到适当的表达载体的启动子的下游，能够制作本发明的制造方法中使用的微生物所具有的重组体DNA。
作为这样的重组体DNA的示例，可以列举在实施例中后述的pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182、pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596、pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725和pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325。
作为将重组体DNA作为能够在亲株中自主复制的质粒导入的方法，可以列举例如上述使用钙离子的方法、原生质体法、电穿孔法等方法。
作为将重组体DNA整合到亲株的染色体中的方法，可以列举同源重组法。作为同源重组法，可以列举例如使用可以与具有在想要导入的宿主细胞内无法自主复制的药剂耐性基因的质粒DNA连接而制作的同源重组用质粒的方法。另外，例如作为在大肠杆菌中常用的利用同源重组的方法，可以列举利用λ噬菌体的同源重组系统导入重组体DNA的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,6641-6645(2000)]。
此外，可以使用利用了通过与重组体DNA一起整合到染色体上的枯草杆菌果聚糖蔗糖酶使大肠杆菌成为蔗糖敏感性的原理的选择法、或者利用了通过在具有链霉素耐性的突变rpsL基因的大肠杆菌中整合野生型rpsL基因而使大肠杆菌成为链霉素敏感性的原理的选择法[Mol.Microbiol.，55，137(2005)；Biosci.Biotechnol.Biochem.，71，2905(2007)]等，获得亲株的染色体DNA上的目标区域被置换成重组体DNA的微生物。
利用上述方法制造的微生物是乙胺生成活性比亲株增强的微生物可以如下进行确认：根据上述方法，利用Northern印迹或蛋白免疫印迹测定上述[4]～[7]中任一项所述的DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的产量，或者测定该蛋白质的比活性，与亲株的量或比活性进行比较。
作为这样的微生物的示例，可以列举在实施例中后述的W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725株和W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株。
γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物
本发明的微生物是上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性增强、同时γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物。
γ-谷氨酰甲胺合成酶活性是指γ-谷氨酰甲胺合成酶所具有的活性，具体而言，是指以乙胺、谷氨酸和ATP作为底物生成茶氨酸的活性。
作为具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的蛋白质，只要是具有该活性的蛋白质则可以为任何蛋白质，可以列举例如日本特开2009-225705号公报中公开的专性甲基营养菌(Methylovorus mays)TGMS No.9株所具有的γ-谷氨酰甲胺合成酶、或者下述[8]～[10]中任一项所述的蛋白质。
[8]由序列号10所表示的氨基酸序列构成的蛋白质
[9]由在序列号10所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的突变蛋白质
[10]由与序列号10所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上％以上％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的同源蛋白质
(γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物的具体例)
作为γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物，可以列举例如利用具有编码上述专性甲基营养菌(Methylovorus mays)TGMS No.9株所具有的γ-谷氨酰甲胺合成酶的DNA、或者下述[11]～[14]中任一项所述的DNA的重组体DNA对亲株进行转化而得到的、γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物。
[11]编码上述[8]～[10]中任一项所述的蛋白质的DNA
[12]由序列号9所表示的碱基序列构成的DNA
[13]在严格条件下与由与序列号9所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的同源蛋白质的DNA
[14]由与序列号9所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的同源蛋白质的DNA
关于杂交和严格条件的记载与上述相同。
作为能够在上述严格条件下杂交的DNA，可以列举例如使用上述BLAST和FASTA等程序基于上述参数进行计算时与序列号9所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列。
编码具有γ-谷氨酰甲胺合成酶活性的蛋白质的DNA例如可以使用可基于序列号9所表示的碱基序列进行设计的探针DNA，以丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringae pv.Syringae)B728a株的基因组DNA作为模板，通过与上述同样的利用Southern杂交或PCR的方法等来获得。
具有该DNA的重组体DNA可以按照与上述同样的方法获得。
(γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物的制造方法)
利用该重组体DNA对亲株进行转化而得到的、γ-谷氨酰甲胺合成酶比该亲株增强的微生物可以按照与上述同样的方法进行制造。
利用上述方法制造的微生物为γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物可以通过将编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的DNA的转录量、该蛋白质的产量或该蛋白质的比活性与亲株的量或比活性进行比较来确认。
作为对编码该蛋白质的DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的产量的增大进行确认的方法，例如可以通过利用Northern印迹测定该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
该蛋白质的比活性例如可以通过下述方法来确认：利用编码该蛋白质的DNA对亲株进行转化，从所得到的转化株中纯化该蛋白质，使该蛋白质、乙胺、谷氨酸和ATP存在于水性介质中，根据该水性介质中生成、蓄积的茶氨酸和该蛋白质量测定比活性。
上述编码具有乙胺生成活性的蛋白质的DNA和编码γ-谷氨酰甲胺合成酶的DNA可以存在于同一重组体DNA上，也可以存在于分开的重组体DNA上。
另外，从γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强、并且抑制所生成的茶氨酸分解的观点出发，本发明的微生物优选茶氨酸的分解活性降低或丧失。作为这样的微生物，具体而言，可以列举谷氨酰转肽酶的活性降低或丧失的微生物。
由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的微生物
本发明的微生物是由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、并且上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物。
由碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的微生物是指，利用后述2-1的方法将该微生物在培养基中进行培养时，以碳源作为起始物质，在该微生物内生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的微生物。
作为这样的微生物，只要是以碳源作为起始物质生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的微生物则没有限制。
例如，可以列举使用任意的亲株获得的乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物。另外，可以列举：以下述(A)～(D)中任一项所述的微生物作为亲株制造的、上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物；或者以上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物作为亲株制造的、下述(A)～(D)中任一项所述的微生物。
(A)选自由醇脱氢酶(AdhE)和醛还原酶(YqhD)组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比亲株降低或丧失的微生物
(B)醛脱氢酶(EutE)的活性比亲株增强的微生物
(C)L-丙氨酸脱氢酶(Ald)的活性比亲株增强的微生物
(D)以任意的组合具有上述(A)～(C)的微生物的性状的微生物
从增加乙醛、丙氨酸的供给量的观点出发，优选本发明的微生物具有上述(B)或(C)的性状、优选具有(B)和(C)的性状。
在此基础上，从抑制乙醛被代谢成乙醇的观点出发，进一步优选具有上述(A)的性状。
(选自由醇脱氢酶(AdhE)和醛还原酶(YqhD)组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性降低或丧失的微生物)
醇脱氢酶是指具有醇脱氢酶活性的蛋白质。醇脱氢酶活性是指以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸作为辅酶、将乙醛还原成乙醇的活性。
醛还原酶是指具有醛还原酶活性的蛋白质。醛还原酶活性是指以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶、将乙醛还原成乙醇的活性。
作为选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比亲株降低或丧失的微生物，可以列举通过在编码未导入有存在于染色体DNA上的突变的野生型的该蛋白质的DNA的碱基序列中导入碱基的缺失、置换、插入或添加而得到的下述(a)和(b)的微生物。
(a)与亲株相比，该蛋白质的比活性降低至80％以下、优选50％以下、更优选30％以下、进一步优选20％以下、特别优选10％以下、最优选0％的微生物
(b)与亲株相比，该DNA的转录量或该蛋白质的产量降低至80％以下、优选50％以下、更优选30％以下、进一步优选20％以下、特别优选10％以下、最优选0％的微生物
更优选可以列举该DNA的一部分或全部缺失的微生物。
作为编码醇脱氢酶的DNA，只要是编码亲株所含有的具有醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA，可以为任意一种，可以列举例如下述[15]～[18]中任一项所述的DNA。
[15]编码由序列号12所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA
[16]由与序列号12所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且编码具有醇脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
[17]由序列号11所表示的碱基序列构成的DNA
[18]由与序列号11所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有醇脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
作为编码醛还原酶的DNA，只要是编码亲株所含有的具有醛还原酶活性的蛋白质的DNA，可以为任意一种，可以列举例如下述[19]～[22]中任一项所述的DNA。
[19]编码由序列号14所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA
[20]由与序列号14所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且编码具有醛还原酶活性的同源蛋白质的DNA
[21]由序列号13所表示的碱基序列构成的DNA
[22]由与序列号13所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有醛还原酶活性的同源蛋白质的DNA
选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比亲株降低或丧失的微生物例如可以通过下述方法得到：以上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物作为亲株，使用通常的突变处理法或基于重组DNA技术的基因置换法等使该亲株的选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性降低或丧失。
作为突变处理法，可以列举例如使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的方法(微生物实验手册、1986年、131页、Kodansha Scientific公司)、紫外线照射法等。
基于重组DNA技术的基因置换法可以列举例如：通过对编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA实施使用试管内的突变剂的突变处理或供于易错PCR等而导入突变后，使用同源重组法与亲株的染色体DNA上存在的编码该蛋白质的DNA进行置换的方法；或者在编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA中导入一个以上的碱基的缺失、置换、插入或添加后，使用同源重组法与亲株的染色体DNA上存在的编码该蛋白质的DNA进行置换的方法。
编码醇脱氢酶和醛还原酶的DNA例如可以使用可分别基于序列号11或13所表示的碱基序列进行设计的探针DNA，以例如大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，利用与上述同样的使用Southern杂交或PCR的方法等而获得。
在编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA中导入一个以上的碱基的缺失、置换、插入或添加的方法、以及通过同源重组等将利用上述方法制备的DNA与亲株的染色体DNA上的目标区域置换的方法与上述相同。
微生物为选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比亲株降低或丧失的微生物例如可以通过将亲株和该微生物在包含乙醛的培养基中培养，对培养液中和微生物细胞内的乙醇之比进行比较来确认。
微生物为编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株降低或丧失的微生物例如可以通过利用Northern印迹测定该微生物的该基因的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该微生物的该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
作为编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株降低或丧失的微生物的示例，可以列举编码选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的DNA的一部分或全部缺失的微生物。具体而言，可以列举在实施例中后述的W3110A株和W3110AE株。
(醛脱氢酶(EutE)的活性增强的微生物)
醛脱氢酶是指具有醛脱氢酶活性的蛋白质。醛脱氢酶活性是指以乙酰CoA(乙酰辅酶A)作为底物生成乙醛的活性。
作为醛脱氢酶活性比亲株增强的微生物，可以列举下述(c)和(d)的微生物。
(c)通过对亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行改造而得到的、
i)该蛋白质的比活性比亲株增强的微生物、或者
ii)该DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株增大的微生物
(d)通过利用包含编码该蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而得到的、该DNA的拷贝数比亲株增大的微生物
作为上述(c)的通过对亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行改造而得到的、i)该蛋白质的比活性比亲株增强的微生物，可以列举下述具有突变型蛋白质的微生物，该突变型蛋白质具有在亲株所含有的具有醛脱氢酶活性的蛋白质的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸、优选1～10个氨基酸、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，因此与亲株的该蛋白质相比，其比活性增强。
上述(c)的通过对亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行改造而得到的、i)该蛋白质的比活性比亲株增强的微生物例如可以通过下述方法得到：以上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物作为亲株，使用通常的突变处理法或基于重组DNA技术的基因置换法等使该亲株的具有醛脱氢酶活性的蛋白质的比活性增强。
突变处理法可以列举上述方法。
基于重组DNA技术的基因置换法可以列举上述方法。
编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA例如可以使用可基于序列号15所表示的碱基序列进行设计的探针DNA，以例如大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，通过上述使用Southern杂交或PCR的方法等而获得。
微生物为具有醛脱氢酶活性的蛋白质的比活性比亲株增强的微生物例如可以通过下述方法来确认：从具有突变蛋白质的微生物中纯化该突变蛋白质，使该突变蛋白质、乙酰CoA和其他底物存在于水性介质中，根据该水性介质中生成、蓄积的乙醛和该蛋白质量测定比活性，与同样测定的由未导入突变的亲株获得的具有醛脱氢酶活性的蛋白质的比活性进行比较。
作为上述(c)的通过对亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行改造而得到的、ii)该DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株增大的微生物，可以列举：具有在亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的转录调节区域或启动子区域的碱基序列中缺失、置换、插入或添加了1个碱基以上、优选1～20个碱基、更优选1～10个碱基、进一步优选1～5个碱基的碱基的启动子区域，因而该DNA的表达量比亲株增大的微生物；或者将亲株的染色体DNA上存在的该DNA的启动子区域与公知的强启动子序列进行置换而得到的、该DNA的表达量比亲株增大的微生物。
上述(c)的通过对亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行改造而得到的、ii)该DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株增大的微生物例如可以通过下述方法得到：以上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物作为亲株，使用通常的突变处理法或基于重组DNA技术的基因置换法等使该亲株的具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的转录量或该蛋白质的产量增大。
突变处理法可以列举上述方法。
基于重组DNA技术的基因置换法可以列举下述方法：通过对具有编码亲株所含有的具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的转录调节区域和启动子区域、例如该蛋白质的起始密码子的上游侧200bp、优选100bp的碱基序列的DNA实施试管内的突变处理或供于易错PCR等而在该DNA中导入突变后，使用上述同源重组法与亲株的染色体DNA上存在的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA进行置换。
另外，通过将亲株的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的启动子区域与公知的强启动子序列进行置换，也能够获得具有醛脱氢酶活性的蛋白质的产量比亲株提高的微生物。
作为这样的启动子，可以列举上述启动子。
利用上述方法获得的微生物为编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的转录量或该蛋白质的产量比亲株增大的微生物例如可以通过利用Northern印迹测定该微生物的该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该微生物的该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
作为(d)通过利用包含编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株微生物进行转化而得到的、该DNA的拷贝数比亲株增大的微生物，可以列举通过利用包含编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而使染色体DNA上的上述DNA的拷贝数增大的微生物；以及在染色体DNA外以质粒DNA的形式保有上述DNA的微生物。
作为具有醛脱氢酶活性的蛋白质，只要是具有该活性的蛋白质，可以为任意一种，可以列举例如下述[23]～[25]中任一项所述的蛋白质。
[23]具有序列号16所表示的氨基酸序列的蛋白质
[24]由在序列号16所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有醛脱氢酶活性的突变蛋白质
[25]由与序列号16所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有醛脱氢酶活性的同源蛋白质
上述中，由缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸残基的氨基酸序列构成、并且具有醛脱氢酶活性的突变蛋白质可以通过使用上述易错PCR或定点诱变法在编码具有例如序列号16所表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA中导入突变而获得。
关于在序列号16所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个以上的氨基酸，可以在同一序列中的任意位置缺失、置换或添加有1个或多个氨基酸残基。
上述突变蛋白质或同源蛋白质为具有醛脱氢酶活性的蛋白质例如可以通过下述方法来确认：使用DNA重组法制作表达想要确认活性的蛋白质的转化体，在培养基中培养，测定培养物中的乙醛量。
作为编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA，只要是编码具有该活性的蛋白质的DNA，可以为任意一种，可以列举例如下述[26]～[29]中任一项所述的DNA。
[26]编码上述[23]～[25]中任一项所述的蛋白质的DNA
[27]具有序列号15所表示的碱基序列的DNA
[28]在严格条件下与由与序列号15所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有醛脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
[29]由与序列号15所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有醛脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
关于杂交和严格条件的记载与上述相同。
作为能够在上述严格条件下杂交的DNA，可以列举例如使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时与由序列号15所表示的碱基序列构成的DNA具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的DNA。
编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA例如可以使用可基于序列号15所表示的碱基序列进行设计的探针DNA，以例如大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，通过上述使用Southern杂交或PCR的方法等而获得。
上述(d)的利用包含编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而得到的、编码该蛋白质的基因的拷贝数比亲株增大的微生物可以利用下述方法获得。
基于利用上述方法得到的编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA，根据需要制备包含编码该蛋白质的部分的适当长度的DNA片段。另外，通过按照使编码该蛋白质的部分的碱基序列成为最适于宿主细胞中的表达的密码子的方式置换碱基，能够获得生产率提高的转化体。
通过将上述DNA片段插入到适当的表达载体的启动子的下游，制作能够在亲株中自主复制的重组体DNA。通过利用该重组体DNA对上述乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物进行转化，能够获得编码该蛋白质的DNA的拷贝数比亲株增大的微生物。
另外，利用具有所制备的DNA片段并能够整合到染色体中的重组体DNA对亲株进行转化，将编码醛脱氢酶的DNA整合到染色体的任意位置，由此，也能够获得编码该蛋白质的DNA的拷贝数比亲株增大的微生物。在将DNA整合到染色体中的情况下，重组体DNA可以不含有启动子。
在使用原核生物作为宿主细胞的情况下，能够在亲株中自主复制的重组体DNA优选为由启动子、核糖体结合序列、该DNA、转录终止序列构成的重组体DNA。也可以包含对启动子进行调控的DNA。
在使用能够在亲株中自主复制的重组体DNA的情况下，表达载体和使用该表达载体的情况下的启动子可以列举与上述同样的表达载体和启动子。
在使用能够在亲株中自主复制的重组体DNA的情况下，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。
在使用能够在亲株中自主复制的重组体DNA的情况下，不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在结构基因下游配置转录终止序列。
利用上述方法获得的微生物为编码具有醛脱氢酶活性的蛋白质的DNA的拷贝数比亲株增大的微生物例如可以通过利用Northern印迹测定该微生物的该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该微生物的该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
作为这样的微生物的示例，可以列举在实施例中后述的W3110AE株。
(L-丙氨酸脱氢酶(Ald)的活性增强的微生物)
L-丙氨酸脱氢酶是指具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质。L-丙氨酸脱氢酶活性是指以丙酮酸作为底物生成L-丙氨酸的活性。
作为L-丙氨酸脱氢酶活性比亲株增强的微生物，可以列举利用包含编码该蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而得到的、该DNA的拷贝数比亲株增大的微生物。
作为利用包含编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而得到的、该DNA的拷贝数比亲株增大的微生物，可以列举通过利用包含编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而使染色体DNA上的上述DNA的拷贝数增大的微生物；以及在染色体DNA外以质粒DNA的形式保有上述DNA的微生物。
作为具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质，只要是具有该活性的蛋白质，可以为任意一种，可以列举例如下述[30]～[32]中任一项所述的蛋白质。
[30]具有序列号18所表示的氨基酸序列的蛋白质
[31]由在序列号18所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有L-丙氨酸脱氢酶活性的突变蛋白质
[32]由与序列号18所表示的氨基酸序列具有95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、最优选99％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有L-丙氨酸脱氢酶活性的同源蛋白质
上述中，由缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个氨基酸残基的氨基酸序列构成、并且具有L-丙氨酸脱氢酶活性的突变蛋白质可以通过使用上述易错PCR或定点诱变法在例如编码具有序列号18所表示的氨基酸序列的蛋白质的DNA中导入突变而获得。
关于在序列号18所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个、优选1～10个、最优选1～5个以上的氨基酸，可以是在同一序列中的任意位置缺失、置换、插入或添加有1个或多个氨基酸残基。
上述突变蛋白质或同源蛋白质为具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质例如可以通过下述方法来确认：使用DNA重组法制作表达想要确认活性的蛋白质的转化体，在培养基中培养，测定培养物中的丙氨酸量。
作为编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA，只要是编码具有该活性的蛋白质的DNA，可以为任意一种，可以列举例如下述[33]～[36]中任一项所述的DNA。
[33]编码上述[30]～[32]中任一项所述的蛋白质的DNA
[34]具有序列号17所表示的碱基序列的DNA
[35]在严格条件下与由与序列号17所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交、并且编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
[36]由与序列号17所表示的碱基序列具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的碱基序列构成、并且编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的同源蛋白质的DNA
关于杂交和严格条件的记载与上述相同。
作为能够在上述严格条件下杂交的DNA，可以列举例如使用上述BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时与由序列号17所表示的碱基序列构成的DNA具有至少95％以上、优选97％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的一致性的DNA。
编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA例如可以使用可基于序列号17所表示的碱基序列进行设计的探针DNA，以例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168株的基因组DNA作为模板，通过上述使用Southern杂交或PCR的方法等而获得。
通过利用包含编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA的重组体DNA对亲株的微生物进行转化而得到的、编码该蛋白质的基因的拷贝数比亲株增大的微生物可以利用与上述同样的方法获得。
利用上述方法获得的微生物为编码具有L-丙氨酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA的拷贝数比亲株增大的微生物例如可以通过利用Northern印迹测定该微生物的该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该微生物的该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
作为这样的微生物的示例，可以列举在实施例中后述的W3110A株和W3110AE株。
1-2.乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性增强的微生物和该微生物的制造方法
乙胺生成活性增强的微生物
作为本发明的微生物，除了上述1-1的微生物以外，还可以列举由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺、并且上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强的微生物。
关于上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性比亲株增强的微生物和该微生物的制造方法，与上述1-1相同。
谷氨酰胺酶活性增强的微生物
1-2的本发明的微生物是上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性增强、同时谷氨酰胺酶活性增强的微生物。
谷氨酰胺酶是指具有谷氨酰胺酶活性的蛋白质。谷氨酰胺酶活性是指以乙胺和谷氨酰胺作为底物生成茶氨酸的活性。
作为谷氨酰胺酶，可以列举例如属于假单胞菌属的微生物，更具体而言，可以列举硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)IFO 12694株(日本特开平11-225789号公报)所具有的谷氨酰胺酶。
作为谷氨酰胺酶的活性比亲株增强的微生物的示例，可以列举利用具有编码谷氨酰胺酶的DNA的重组体DNA对亲株进行转化而得到的、谷氨酰胺酶活性比该亲株增强的微生物。
编码谷氨酰胺酶的DNA可以列举编码优选来源于细菌等原核生物或酵母的、更优选来源于原核生物的、特别优选硝基还原假单胞菌IFO 12694株(日本特开平11-225789号公报)的谷氨酰胺酶的DNA。
该编码谷氨酰胺酶的DNA可以按照与上述1-1同样的方法获得。
具有该DNA的重组体DNA可以按照与上述1-1同样的方法获得。
利用该重组体DNA对亲株进行转化而得到的、谷氨酰胺酶活性比该亲株增强的微生物可以按照与上述1-1同样的方法制造。
利用上述方法制造的微生物为谷氨酰胺酶活性比亲株增强的微生物可以通过将编码谷氨酰胺酶的DNA的转录量、该蛋白质的产量或该蛋白质的比活性与亲株的量或比活性进行比较来确认。
作为对编码该蛋白质的DNA的转录量或该DNA所编码的蛋白质的产量的增大进行确认的方法，例如可以通过利用Northern印迹测定该DNA的转录量、或者利用蛋白免疫印迹测定该蛋白质的产量，并与亲株的量进行比较来确认。
谷氨酰胺酶的比活性例如可以通过下述方法来确认：利用编码该蛋白质的DNA对亲株进行转化，从所得到的转化株中纯化该蛋白质，使该蛋白质、乙胺和谷氨酰胺存在于水性介质中，根据该水性介质中生成、蓄积的茶氨酸和该蛋白质量测定比活性。
另外，从使谷氨酰胺酶活性增强、并且抑制所生成的茶氨酸分解的观点出发，1-2的本发明的微生物优选茶氨酸的分解活性降低或丧失。作为这样的微生物，具体而言，可以列举谷氨酰转肽酶的活性降低或丧失的微生物。
由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的微生物
1-2的本发明的微生物是由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺、并且上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强的微生物。
由碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的微生物是指，利用后述2-1的方法将该微生物在培养基中进行培养时，以碳源作为起始物质，在该微生物内生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的微生物。
作为这样的微生物，只要是以碳源作为起始物质生成丙氨酸和谷氨酰胺的微生物则没有限制。
可以列举例如使用任意的亲株获得的乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性增强的微生物。另外，可以列举以下述(E)～(H)中任一项所述的微生物作为亲株而制造的、上述乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性增强的微生物；或者以上述乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性增强的微生物作为亲株而制造的、下述(E)～(H)中任一项所述的微生物。
(E)选自由醇脱氢酶(AdhE)和醛还原酶(YqhD)组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比亲株降低或丧失的微生物
(F)醛脱氢酶(EutE)的活性比亲株增强的微生物
(G)L-丙氨酸脱氢酶(Ald)的活性比亲株增强的微生物
(H)以任意的组合具有上述(E)～(G)的微生物所具有的性状的微生物
从增加乙醛、丙氨酸的供给量的观点出发，优选1-2的本发明的微生物具有上述(F)或(G)的性状、优选具有(F)和(G)的性状。
在此基础上，从抑制乙醛被代谢成乙醇的观点出发，进一步优选具有上述(E)的性状。
关于上述(E)的选自由醇脱氢酶和醛还原酶组成的组中的至少一种以上的蛋白质的活性比该亲株降低或丧失的微生物、(F)醛脱氢酶的活性比该亲株增强的微生物、(G)L-丙氨酸脱氢酶的活性比该亲株增强的微生物、以及(H)以任意的组合具有上述(E)～(G)的微生物所具有的性状的微生物的制造方法，与上述1-1相同。
2.本发明的茶氨酸的制造方法
本发明的茶氨酸的制造方法为下述2-1和2-2中记载的方法。
2-1.利用发酵法的茶氨酸的制造方法
作为本发明的茶氨酸的制造方法，可以列举下述的茶氨酸的制造方法，其特征在于，将上述1-1或上述1-2的微生物在培养基中进行培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。
对上述1-1和上述1-2的微生物进行培养的方法可以按照微生物的培养中使用的通常的方法来进行。
作为对该微生物进行培养的培养基，只要是含有该微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等、能够高效地进行该微生物的培养的培养基，则可以使用天然培养基和合成培养基中的任意一种。
作为碳源，只要是该微生物可同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、乙酸或丙酸等有机酸、或者甘油、乙醇或丙醇等醇类等。
作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸、有机酸的铵盐、其他含氮化合物、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕、豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养通常可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度通常为15～40℃，培养时间通常为5小时～7天。培养中的培养液的pH通常保持于3.0～9.0。pH的调节可以使用无机或有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来进行。
另外，培养中，可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。在对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等，在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
通过上述培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，从该培养物中收集茶氨酸，由此能够制造茶氨酸。
生成的茶氨酸可以利用氯甲酸9-芴基甲酯(东京化成工业公司制造、以下称为Fmoc)进行衍生物化，利用HPLC进行分析。反应液中生成的茶氨酸的收集可以通过使用活性炭或离子交换树脂等的通常的方法来进行。
从该培养物中收集茶氨酸的操作通常可以通过将离子交换树脂法、沉淀法等公知的方法组合来实施。在茶氨酸蓄积于菌体内的情况下，例如可以将菌体用超声波等进行破碎，通过离心分离除去菌体，利用离子交换树脂法等从所得到的上清中收集茶氨酸。
2-2.使用乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、或者乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺作为底物的茶氨酸的制造方法
作为本发明的茶氨酸的制造方法，还可以列举使用乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、或者乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺作为底物的茶氨酸的制造方法。
具体而言，可以使上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和γ-谷氨酰甲胺合成酶在含有乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
另外，也可以使上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质和谷氨酰胺酶在含有乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
本发明的茶氨酸的制造方法中使用的上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质、γ-谷氨酰甲胺合成酶和谷氨酰胺酶在水性介质中的浓度分别通常为0.001～500g/L、优选为0.01～300g/L。
乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺在水性介质中的浓度分别通常为0.1mM～10M、优选为1mM～1M。
作为水性介质，可以列举水、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液、甲醇、乙醇等醇类、乙酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类等。另外，也可以将用作后述酶源的微生物的培养液作为水性介质使用。
茶氨酸的生成反应中，可以根据需要添加植酸等螯合剂、表面活性剂或有机溶剂。
作为表面活性剂，只要促进茶氨酸的生成即可，可以将聚氧乙烯-十八烷基胺(例如NYMEEN S-215、日本油脂公司制造)等非离子表面活性剂、十六烷基三甲基溴化铵、烷基二甲基苄基氯化铵(例如阳离子F2—40E、日本油脂公司制造)等阳离子型表面活性剂、月桂酰肌氨酸盐等阴离子型表面活性剂、烷基二甲胺(例如叔胺FB、日本油脂公司制造)等叔胺类等中的一种或多种混合使用。表面活性剂通常可以以0.1～50g/L的浓度使用。
作为有机溶剂，可以列举二甲苯、甲苯、脂肪族醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常可以以0.1～50ml/L的浓度使用。
茶氨酸的生成反应可以在水性介质中在通常pH5～10、优选pH6～8、20～50℃的条件下进行1～96小时。为了促进该生成反应，可以添加腺嘌呤、腺苷-5’-单磷酸(AMP)、ADP、ATP、硫酸镁、氯化镁等。腺嘌呤、AMP通常可以以0.01～100mmol/L的浓度使用。
作为上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质、γ-谷氨酰甲胺合成酶和谷氨酰胺酶，例如可以使用从上述1-1的微生物或上述1-2的微生物的培养物中纯化得到的上述物质。
作为用作底物的乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺，没有特别限制，例如可以使用市售的乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺。
另外，也可以使用上述1-1和上述1-2的微生物中的任意一种以上的微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源和能量供体存在于水性介质中，使用在该微生物菌体内或该水性介质中生成、蓄积而得到的乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺。
作为能量供体，可以列举上述2-1的碳源。
另外，也可以使用使选自由乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺组成的组中的物质生成、蓄积的任意微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源和能量供体存在于水性介质中，使用在该微生物菌体内或该水性介质中生成、蓄积而得到的乙醛、丙氨酸、谷氨酸、ATP和谷氨酰胺。
使用乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物 的培养物或该培养物的处理物的茶氨酸的制造方法
另外，作为酶源，也可以使用上述1-1和上述1-2的微生物的培养物或该培养物的处理物来代替纯化的上述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质、γ-谷氨酰甲胺合成酶和谷氨酰胺酶。
关于对微生物进行培养的方法和对微生物进行培养的培养基，与上述2-1相同。
使用通过上述培养得到的微生物的培养物或该培养物的处理物作为酶源，使该酶源、乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、或者乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺存在于水性介质中，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，从该介质中收集茶氨酸，由此能够制造茶氨酸。
作为培养物的处理物，可以列举上述培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、对该培养物进行离心分离或过滤等而得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物和该菌体的固定化物等包含保持与该培养物同样的功能的活菌体作为酶源的物质、以及该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎处理物、由该处理后的菌体得到的粗制酶提取物和由该处理后的菌体得到的纯化酶，优选列举上述培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、对该培养物进行离心分离或过滤等而得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物和该菌体的固定化物等包含保持与该培养物同样的功能的活菌体作为酶源的物质、以及该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎处理物，进一步优选列举上述培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、对该培养物进行离心分离或过滤等而得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物和该菌体的固定化物等包含保持与该培养物同样的功能的活菌体作为酶源的物质。
关于所生成的茶氨酸的分析和收集，与上述2-1相同。
作为本发明的优选实施方式，可以列举下述实施方式。
(I)一种属于埃希氏菌属的微生物，其是由糖生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP、并且下述[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强的微生物。
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质
[2]由在序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入或添加了1～20个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有以乙醛和丙氨酸作为底物生成乙胺的活性(以下称为乙胺生成活性)的突变蛋白质
[3]由与序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列具有95％以上的一致性的氨基酸序列构成、并且具有乙胺生成活性的同源蛋白质
(II)如上述(I)的微生物，其中，与亲株相比，L-丙氨酸脱氢酶活性增强、并且醛还原酶活性降低或丧失。
(III)如上述(I)或(II)的微生物，其中，与亲株相比，醛脱氢酶活性增强、并且醇脱氢酶活性降低或丧失。
(IV)如上述(I)的微生物，其中，与亲株相比，醛脱氢酶活性和/或L-丙氨酸脱氢酶活性增强。
(V)如上述(IV)的微生物，其中，与亲株相比，醇脱氢酶活性和/或醛还原酶活性降低或丧失。
(VI)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，将上述(I)～(V)中任一项的微生物在培养基中进行培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。
(VII)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(I)～(V)中任一项的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP共存于水性介质中，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
(VIII)一种属于埃希氏菌属的微生物，其是由糖生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺、并且上述(I)的[1]～[3]中任一项所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强的微生物。
(IX)如上述(VIII)的微生物，其中，与亲株相比，L-丙氨酸脱氢酶活性增强、并且醛还原酶活性降低或丧失。
(X)如上述(VIII)或(IX)的微生物，其中，与亲株相比，醛脱氢酶活性增强、并且醇脱氢酶活性降低或丧失。
(XI)如上述(VIII)的微生物，其中，与亲株相比，醛脱氢酶活性和/或L-丙氨酸脱氢酶活性增强。
(XII)如上述(X1)的微生物，其中，与亲株相比，醇脱氢酶活性和/或醛还原酶活性降低或丧失。
(XIII)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，将上述(VIII)～(XII)中任一项的微生物在培养基中进行培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。
(XIV)一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使上述(VIII)～(XII)中任一项的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺共存于水性介质中，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸。
以下示出本发明的实施例，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
[实施例1]使用乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP作为底物的茶氨酸的制造
(1)乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性增强的微生物的制造
利用公知的培养方法对丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringaepv.syringae)B728a株进行培养，分离纯化出该微生物的染色体DNA。以由序列号19和20所表示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，以该染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增出编码γ-谷氨酰甲胺合成酶Psyr_2273(由序列号10所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的DNA片段。
同样地，利用与上述相同的方法由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440株分离纯化出染色体DNA。以由序列号21和22所表示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，以该染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增出编码具有乙胺生成活性的蛋白质PP_5182(由序列号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的DNA片段。另外，以由序列号23和24所表示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，以该染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增出编码具有乙胺生成活性的蛋白质PP_0596(由序列号4所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的DNA片段。
同样地，利用与上述相同的方法由绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)分离纯化出染色体DNA。以由序列号25和26所表示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，以该染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增出编码具有乙胺生成活性的蛋白质JM49_01725(由序列号6所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的DNA片段。
同样地，利用与上述相同的方法由荧光假单胞菌(Pseudomonas fiuorescens)SBW25株分离纯化出染色体DNA。以由序列号27和28所表示的碱基序列构成的寡核苷酸作为引物组，以该染色体DNA作为模板，进行PCR，扩增出编码具有乙胺生成活性的蛋白质PFLU_RS03325(由序列号8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的DNA片段。
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将上述得到的编码Psyr_2273和PP_5182的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182。
同样地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将上述得到的编码Psyr_2273和PP_0596的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596。
同样地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将上述得到的编码Psyr_2273和JM4901725的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725。
同样地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将上述得到的编码Psyr_2273和PFLU_RS03325的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325。
利用所获得的pTrc99A_Psyr_2273PP_5182、pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596、pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725、pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325或pTrc99A对大肠杆菌W3110株进行转化，作为保有这些表达质粒的重组大肠杆菌，分别得到W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273JM4901725株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株和W3110/pTrc99A株。
(2)使用乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP作为底物的茶氨酸的制造
将实施例1(1)中得到的W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株和W3110/pTrc99A株分别在30℃下在LB板上培养过夜，接种到装有5mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基的粗型试管中，在30℃下振荡培养12小时。
然后，分别接种0.05mL至装有5mL的试管生产培养基[葡萄糖30g/L、硫酸镁七水合物2g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸1g/L、磷酸二氢钾14g/L、磷酸氢二钾16g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于除葡萄糖和硫酸镁七水合物以外的成分，利用氢氧化钠水溶液调节至pH7.2后进行高压灭菌，对于葡萄糖和硫酸镁七水合物，另行制备含有葡萄糖和硫酸镁七水合物的水溶液后进行高压灭菌，分别冷却后进行混合)]的粗型试管中，在30℃下培养5小时后，添加终浓度1mM的IPTG、终浓度10mM的丙氨酸、终浓度10mM的乙醛，进一步在30℃下振荡培养21小时。
培养结束后，离心分离培养液而除去菌体，利用Fmoc(东京化成工业公司制造)将上清中含有的茶氨酸衍生物化，利用HPLC进行分析。将结果示于表1。
[表1]
Figure BDA0002226514690000441
其结果是，W3110/pTrc99A株未生产出茶氨酸，与之相对，W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110/pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725株和W3110/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株生产出茶氨酸。
由以上可知，使用利用包含编码具有乙胺生成活性的蛋白质(PP_5182、PP_0596、JM49_01725或PFLU_RS03325)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(Psyr_2273)的DNA的重组体DNA对W3110株进行转化而得到的、乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比W3110株增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺的情况下制造茶氨酸。
[实施例2]利用发酵法的茶氨酸的制造中使用的微生物的制造
(1)在基因缺失和基因置换时用作标志物的DNA片段的获得
以由表2的“引物组”中所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，以表2的“模板”中记载的DNA作为模板，进行PCR，扩增出各DNA片段。
[表2]
Figure BDA0002226514690000451
枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA利用常规方法进行制备。扩增DNA片段的cat包含cat基因的上游约200bp至下游约100bp。扩增DNA片段的sacB包含sacB基因的上游约300bp至下游约100bp。由序列号30和31所表示的碱基序列构成的DNA中附加有SalI识别位点。
利用限制酶SalI对扩增DNA片段的cat和sacB进行切割，使用DNA连接试剂盒Ver.2(宝生物公司制造)进行连接。以该连接反应液作为模板，使用由序列号29和32所表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到包含cat基因和sacB基因的DNA(以下称为cat-sacB)片段。
(2)L-丙氨酸脱氢酶活性增强、醛还原酶活性丧失的微生物的制造
利用下述方法制造将编码醛还原酶的DNA(以下称为yqhD基因)置换成在上游附加有支配ilvGMEDA操纵子的表达的启动子(以下称为ilv启动子)的枯草芽孢杆菌来源的编码L-丙氨酸脱氢酶的DNA(以下称为ald基因)的大肠杆菌。
对于ald基因，以枯草芽孢杆菌168株的基因组DNA作为模板，对于其他DNA片段，以大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，使用由表3的“引物组”中所示的碱基序列构成的DNA作为引物组进行PCR，进行扩增。
[表3]
Figure BDA0002226514690000461
yqhD上游1和yqhD上游2包含yqhD基因的起始密码子至其上游约1500bp。yqhD下游1和yqhD下游2包含yqhD基因的终止密码子至其下游约1500bp。
以yqhD上游1片段、yqhD下游1片段和cat-sacB片段的等摩尔比率的混合物作为模板，使用由序列号35和38所表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到包含插入有cat-sacB片段的yqhD基因周边区域的DNA(以下称为yqhD：：cat-sacB)片段。
以yqhD上游2片段、yqhD下游2片段、ilv启动子片段、ald片段的等摩尔比率的混合物作为模板，使用由序列号35和38所表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到包含插入有在上游附加有ilv启动子的ald基因的yqhD基因周边区域的DNA(以下称为yqhD：：Pilv-ald)片段。
利用电穿孔法将yqhD：：cat-sacB片段导入至保有包含编码λ重组酶的基因的质粒pKD46[Datsenko,K.A.,Warner,B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.97，6640-6645(2000)]的大肠杆菌W3110株中，得到显示出氯霉素耐性和蔗糖敏感性的转化体(yqhD基因被置换成yqhD：：cat-sacB的转化体)。
利用电穿孔法将yqhD：：Pilv-ald片段导入至该转化体中，得到显示出氯霉素敏感性和蔗糖耐性的转化体(yqhD：：cat-sacB被置换成Pilv-ald的转化体)。进而，得到pKD46脱落的转化体。将该微生物命名为W3110A株。
(3)醛脱氢酶活性增强、醇脱氢酶活性丧失的微生物的制造
利用下述方法制造将编码醇脱氢酶的DNA(以下称为adhE基因)置换成在上游附加有ilv启动子的编码醛脱氢酶的基因(以下称为eutE基因)的大肠杆菌。
以利用常规方法制备的大肠杆菌W3110株的基因组DNA作为模板，使用由表4的“引物组”中所示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，扩增出各DNA片段。
[表4]
Figure BDA0002226514690000471
adhE上游1和adhE上游2包含adhE基因的起始密码子至其上游约1000bp。adhE下游1和adhE下游2包含adhE基因的终止密码子至其下游约1500bp。
以adhE上游1片段、adhE下游1片段和cat-sacB片段的等摩尔比率的混合物作为模板，使用由序列号43和46所表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到包含插入有cat-sacB片段的adhE基因周边区域的DNA(以下称为adhE：：cat-sacB)片段。
以adhE上游2片段、adhE下游2片段、ilv启动子片段、eutE片段的等摩尔比率的混合物作为模板，使用由序列号43和46所表示的碱基序列构成的DNA作为引物组，进行PCR，得到包含插入有在上游附加有ilv启动子的eutE基因的adhE基因周边区域的DNA(以下称为adhE：：Pilv-eutE)片段。
利用电穿孔法将adhE：：cat-sacB片段导入至保有包含编码λ重组酶的基因的质粒pKD46的大肠杆菌W3110A株中，得到显示出氯霉素耐性和蔗糖敏感性的转化体(adhE基因被置换成adhE：：cat-sacB的转化体)。
利用电穿孔法将adhE：：Pilv-eutE片段导入至该转化体中，得到显示出氯霉素敏感性和蔗糖耐性的转化体(adhE：：cat-sacB被置换成Pilv-eutE的转化体)。进而，得到pKD46脱落的转化体。将该微生物命名为W3110AE株。
[实施例3]利用发酵法由葡萄糖进行的茶氨酸的制造-1
利用实施例1中记载的pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182、pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596、pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725、pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325或pTrc99A对实施例2中获得的W3110AE株进行转化，分别得到W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725株、W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株和W3110AE/pTrc99A株。
将该微生物分别在30℃下在LB板上培养过夜，接种到装有5mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基的粗型试管中，在30℃下振荡培养12小时。
然后，分别接种0.05mL至装有5mL的试管生产培养基[葡萄糖30g/L、硫酸镁七水合物2g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸1g/L、磷酸二氢钾14g/L、磷酸氢二钾16g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于除葡萄糖和硫酸镁七水合物以外的成分，利用氢氧化钠水溶液调节至pH7.2后进行高压灭菌，对于葡萄糖和硫酸镁七水合物，另行制备含有葡萄糖和硫酸镁七水合物的水溶液后进行高压灭菌，分别冷却后进行混合)]的粗型试管中，在30℃下培养5小时后，添加终浓度1mM的IPTG，进一步在30℃下振荡培养21小时。
培养结束后，离心分离培养液而除去菌体，利用Fmoc(东京化成工业公司制造)将上清中含有的茶氨酸衍生物化，利用HPLC进行分析。将结果示于表5。
[表5]
Figure BDA0002226514690000491
其结果是，W3110AE/pTrc99A株未生产出茶氨酸，与之相对，W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PP_5182株、W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PP_0596株、W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_JM49_01725株和W3110AE/pTrc99A_Psyr_2273_PFLU_RS03325株生产出茶氨酸。
由以上可知，通过使用利用包含编码具有乙胺生成活性的蛋白质(PP_5182、PP_0596、JM49_01725或PFLU_RS03325)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(Psyr_2273)的DNA的重组体DNA对W3110AE株进行转化而得到的、乙胺生成活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比W3110AE增强的微生物，能够由糖高效地制造茶氨酸。
另外，此时在培养基中未残留乙胺，可知利用该方法，能够在不从外部添加乙胺、并且不会在培养基中蓄积乙胺作为副产物的情况下制造茶氨酸。
[实施例4]使用乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺作为底物的茶氨酸的制造
(1)乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性增强的微生物的制造
利用公知的培养方法对硝基还原假单胞菌IFO 12694株(日本特开平11-225789号公报)进行培养，分离纯化出该微生物的染色体DNA。基于日本特开平11-225789号公报的编码谷氨酰胺酶的DNA的碱基序列来设计引物，按照上述1-2中记载的方法，以该染色体DNA作为模板进行PCR，对编码谷氨酰胺酶GLN的DNA片段进行扩增。
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将GLN和实施例1(1)中获得的编码PP_5182的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_GLN_PP_5182。
同样地，利用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将GLN和实施例1(1)中获得的编码PP_0596的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_GLN_PP_0596。
同样地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将GLN和实施例1(1)中获得的编码JM49_01725的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_GLN_JM49_01725。
同样地，使用In-Fusion HD克隆试剂盒(宝生物公司制造)将GLN和实施例1(1)中获得的编码PFLU_RS03325的DNA片段与表达载体pTrc99A(GE Healthcare BioSciences公司制造)连接，由此得到表达质粒pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325。
利用pTrc99A_GLN_PP_5182、pTrc99A_GLN_PP_0596、pTrc99A_GLN_JM49_01725、pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325或pTrc99A对大肠杆菌W3110株进行转化，作为保有这些表达质粒的重组大肠杆菌，分别得到W3110/pTrc99A_GLN_PP_5182株、W3110/pTrc99A_GLN_PP_0596株、W3110/pTrc99A_GLN_JM49_01725株、W3110/pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325株和W3110/pTrc99A株。
(2)使用乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺作为底物的茶氨酸的制造
将W3110/pTrc99A_GLN_PP_5182株、W3110/pTrc99A_GLN_PP_0596株、W3110/pTrc99A_GLN_JM49_01725株、W3110/pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325株和W3110/pTrc99A株分别在30℃下在LB板上培养过夜，接种到装有5mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基的粗型试管中，在30℃下振荡培养12小时。
然后，分别接种0.05mL至装有5mL的试管生产培养基[葡萄糖30g/L、硫酸镁七水合物2g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸1g/L、磷酸二氢钾14g/L、磷酸氢二钾16g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于除葡萄糖和硫酸镁七水合物以外的成分，利用氢氧化钠水溶液调节至pH7.2后进行高压灭菌，对于葡萄糖和硫酸镁七水合物，另行制备含有葡萄糖和硫酸镁七水合物的水溶液后进行高压灭菌，分别冷却后进行混合)]的粗型试管中，在30℃下培养5小时后，添加终浓度1mM的IPTG、终浓度10mM的丙氨酸、终浓度10mM的乙醛，进一步在30℃下振荡培养21小时。
培养结束后，离心分离培养液而除去菌体，利用Fmoc(东京化成工业公司制造)将上清中含有的茶氨酸衍生物化，利用HPLC进行分析。
其结果可知，通过使用利用包含编码具有乙胺生成活性的蛋白质(PP_5182、PP_0596、JM49_01725或PFLU_RS03325)和谷氨酰胺酶GLN的DNA的重组体DNA对W3110株进行转化而得到的、乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性比W3110株增强的微生物，能够在不从外部添加乙胺的情况下制造茶氨酸。
[实施例5]利用发酵法由葡萄糖进行的茶氨酸的制造-2
利用实施例4中记载的pTrc99A_GLN_PP_5182、pTrc99A_GLN_PP_0596、pTrc99A_GLN_JM49_01725、pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325或pTrc99A对实施例2中获得的W3110AE株进行转化，分别得到W3110AE/pTrc99A_GLN_PP_5182株、W3110AE/pTrc99A_GLN_PP_0596株、W3110AE/pTrc99A_GLN_JM49_01725株、W3110AE/pTrc99A_GLN_PFLU_RS03325株和W3110AE/pTrc99A株。
将该微生物分别在30℃下在LB板上培养过夜，接种到装有5mL含有100mg/L的氨苄青霉素的LB培养基的粗型试管中，在30℃下振荡培养12小时。
然后，分别接种0.05mL至装有5mL的试管生产培养基[葡萄糖30g/L、硫酸镁七水合物2g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、硫酸铵2g/L、柠檬酸1g/L、磷酸二氢钾14g/L、磷酸氢二钾16g/L、硫胺素盐酸盐10mg/L、硫酸亚铁七水合物50mg/L、硫酸锰五水合物10mg/L(对于除葡萄糖和硫酸镁七水合物以外的成分，利用氢氧化钠水溶液调节至pH7.2后进行高压灭菌，对于葡萄糖和硫酸镁七水合物，另行制备含有葡萄糖和硫酸镁七水合物的水溶液后进行高压灭菌，分别冷却后进行混合)]的粗型试管中，在30℃下培养5小时后，添加终浓度1mM的IPTG，进一步在30℃下振荡培养21小时。
培养结束后，离心分离培养液而除去菌体，利用Fmoc(东京化成工业公司制造)将上清中含有的茶氨酸衍生物化，利用HPLC进行分析。
其结果可知，通过使用利用包含编码具有乙胺生成活性的蛋白质(PP_5182、PP_0596、JM49_01725或PFLU_RS03325)和谷氨酰胺酶GLN的DNA的重组体DNA对W3110AE株进行转化而得到的、乙胺生成活性和谷氨酰胺酶活性比W3110AE株增强的微生物，能够由糖高效地制造茶氨酸。
另外，确认到此时在培养基中未残留乙胺，由此可知，利用该方法，能够在不从外部添加乙胺、并且不会在培养基中蓄积乙胺作为副产物的情况下制造茶氨酸。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供生成茶氨酸的微生物、以及使用该微生物的不从外部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的、茶氨酸的高效制造方法。
序列表自由文本
序列号19-人工序列的说明：合成DNA
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序列号48-人工序列的说明：合成DNA
序列号49-人工序列的说明：合成DNA
序列号50-人工序列的说明：合成DNA
序列表
<110> 协和发酵生化株式会社(KYOWA HAKKO BIO CO., LTD.)
<120> 茶氨酸的制造方法(Process for producing Theanine)
<130> FP18-0200-00
<150> JP 2017-079893
<151> 2017-04-13
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1359)
<400> 1
atg agc gtc aac aac ccg caa acc cgt gaa tgg caa acc ctg agc ggg 48
Met Ser Val Asn Asn Pro Gln Thr Arg Glu Trp Gln Thr Leu Ser Gly
1 5 10 15
gag cat cac ctc gca cct ttc agt gac tac aag cag ctg aag gag aag 96
Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys
20 25 30
ggg ccg cgc atc atc acc aag gcc cag ggt gtg cat ttg tgg gat agc 144
Gly Pro Arg Ile Ile Thr Lys Ala Gln Gly Val His Leu Trp Asp Ser
35 40 45
gag ggg cac aag atc ctc gac ggc atg gcc ggt cta tgg tgc gtg gcg 192
Glu Gly His Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala
50 55 60
gtc ggc tac gga cgt gaa gag ctg gtg cag gcg gcg gaa aaa cag atg 240
Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Glu Lys Gln Met
65 70 75 80
cgc gag ctg ccg tac tac aac ctg ttc ttc cag acc gct cac ccg cct 288
Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro
85 90 95
gcg ctc gag ctg gcc aag gcg atc acc gac gtg gcg ccg aaa ggt atg 336
Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Thr Asp Val Ala Pro Lys Gly Met
100 105 110
acc cat gtg ttc ttc acc ggc tcc ggc tcc gaa ggc aac gac act gtg 384
Thr His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val
115 120 125
ctg cgc atg gtg cgt cac tac tgg gcg ctg aag ggc aaa ccg cac aag 432
Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Pro His Lys
130 135 140
cag acc atc atc ggc cgc atc aac ggt tac cac ggc tcc acc ttc gcc 480
Gln Thr Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Phe Ala
145 150 155 160
ggt gca tgc ctg ggc ggt atg agc ggc atg cac gag cag ggt ggc ctg 528
Gly Ala Cys Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Glu Gln Gly Gly Leu
165 170 175
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Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu
180 185 190
gga ggc gac atg acc cct gac gaa ttc ggt gtc tgg gcc gcc gag cag 624
Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln
195 200 205
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Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Asp Asn Val Ala Ala Phe
210 215 220
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Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Glu
225 230 235 240
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Thr Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Leu
245 250 255
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Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala
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340 345 350
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Met Ile Cys Arg Thr Phe Cys Phe Glu Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala
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420 425 430
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<212> PRT
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Leu Glu Ala Ile Gln
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130 135 140
aag atc atc ggc cgt gcc cgt ggt tac cat ggc gtg aac atc gcc ggt 480
Lys Ile Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Ile Ala Gly
145 150 155 160
acc agc ctg ggt ggc gtc aac ggt aac cgc aag atg ttt ggc cag ctg 528
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Ser Lys Gly Leu Pro Glu Glu Gly Gly Ile Ala Leu Ala Asp Glu Met
195 200 205
ctc aag ctg atc gag ctg cac gat gcc tcc aac atc gca gca gtc atc 672
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405 410 415
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<211> 448
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400> 4
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<211> 1365
<212> DNA
<213> 绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1362)
<400> 5
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65 70 75 80
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Gly Ala Ser Leu Gly Gly Met Thr Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu
165 170 175
ccg atc ccg ggc atc gtg cat atc cca cag cct tac tgg ttc ggt gaa 576
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180 185 190
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Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Thr Trp Ala Ala Asn Gln
195 200 205
ctg gaa gag aag att ctc gaa ctc ggc gtc gat aac gtc ggc gcc ttc 672
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225 230 235 240
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Ser Tyr Trp Pro Arg Ile Lys Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp Ile Leu
245 250 255
ttc gtc gcc gac gag gtg atc tgt ggg ttc ggg cgt acc ggt gag tgg 816
Phe Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp
260 265 270
ttc ggt agc gat ttc tac gac ctc aag ccg gac atg atg acc atc gcc 864
Phe Gly Ser Asp Phe Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Met Met Thr Ile Ala
275 280 285
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290 295 300
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Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Leu Gly Ala Ile Glu Leu
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<211> 454
<212> PRT
<213> 绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）
<400> 6
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Asp
225 230 235 240
Ser Tyr Trp Pro Arg Ile Lys Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp Ile Leu
245 250 255
Phe Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp
260 265 270
Phe Gly Ser Asp Phe Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Met Met Thr Ile Ala
275 280 285
Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Leu Val Val Arg
290 295 300
Asp Glu Val Val Ala Val Leu Asn Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly
305 310 315 320
Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu Glu Asn
325 330 335
Ile Arg Ile Met Arg Asp Glu Lys Ile Ile Glu Arg Val Lys Ala Glu
340 345 350
Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Asn Asp His Pro
355 360 365
Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Leu Gly Ala Ile Glu Leu
370 375 380
Val Gln Asp Lys Ala Thr Arg Ala Arg Tyr Val Gly Lys Gly Val Gly
385 390 395 400
Met Ile Cys Arg Gln Phe Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala
405 410 415
Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Thr Lys Glu
420 425 430
Glu Ile Asp Glu Leu Val Ser Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr
435 440 445
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<211> 1350
<212> DNA
<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1347)
<400> 7
atg aac atg ccc gaa aac gcc cca tcg tcc ctg gcc agc caa ttg aag 48
Met Asn Met Pro Glu Asn Ala Pro Ser Ser Leu Ala Ser Gln Leu Lys
1 5 10 15
ctg gac gct cac tgg atg ccg tac acg gcc aac cgt aac ttt cag cga 96
Leu Asp Ala His Trp Met Pro Tyr Thr Ala Asn Arg Asn Phe Gln Arg
20 25 30
gac ccg cgc ctg atc gtg gcg gct gaa ggt agt tgg ttg att gat gac 144
Asp Pro Arg Leu Ile Val Ala Ala Glu Gly Ser Trp Leu Ile Asp Asp
35 40 45
aag ggg cgc aag gtg tat gac tcg ttg tcg ggc ctg tgg acc tgc ggc 192
Lys Gly Arg Lys Val Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly
50 55 60
gcc ggg cac acg cgt aag gag atc cag gaa gcg gtc gcc aag caa ctg 240
Ala Gly His Thr Arg Lys Glu Ile Gln Glu Ala Val Ala Lys Gln Leu
65 70 75 80
ggg act ttg gac tac tcg ccg ggc ttc cag tac ggt cat ccg ttg tcc 288
Gly Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Gly His Pro Leu Ser
85 90 95
ttc caa ttg gcg gaa aag atc acc gac ctg acc cct ggc aac ctg aat 336
Phe Gln Leu Ala Glu Lys Ile Thr Asp Leu Thr Pro Gly Asn Leu Asn
100 105 110
cat gtg ttc ttc acc gat tcc ggc tcc gag tgc gcc gat acc gcg gtg 384
His Val Phe Phe Thr Asp Ser Gly Ser Glu Cys Ala Asp Thr Ala Val
115 120 125
aaa atg gtg cgt gcg tac tgg cgc ctc aaa ggc cag gcc acc aag acc 432
Lys Met Val Arg Ala Tyr Trp Arg Leu Lys Gly Gln Ala Thr Lys Thr
130 135 140
aag atg atc ggt cgc gcc cgt ggt tat cac ggt gtg aac atc gcc ggt 480
Lys Met Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Ile Ala Gly
145 150 155 160
acc agc ctg ggt ggc gtc aac ggt aac cgt aag tta ttt ggc cag ggc 528
Thr Ser Leu Gly Gly Val Asn Gly Asn Arg Lys Leu Phe Gly Gln Gly
165 170 175
ttg atg gac gtt gac cat ctg ccg cac acg ttg ctg gca agc aat gcc 576
Leu Met Asp Val Asp His Leu Pro His Thr Leu Leu Ala Ser Asn Ala
180 185 190
ttc tcc cgc ggc atg ccg gag cag ggc ggt atc gcg ttg gcc gat gag 624
Phe Ser Arg Gly Met Pro Glu Gln Gly Gly Ile Ala Leu Ala Asp Glu
195 200 205
ctg ctc aag ctg att gaa ttg cac gat gcg tcg aac atc gct gcg gtg 672
Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala Ser Asn Ile Ala Ala Val
210 215 220
ttt gtc gag ccg atg gcg ggt tcc gct ggc gtg ctg gtg ccg cct cag 720
Phe Val Glu Pro Met Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Pro Pro Gln
225 230 235 240
ggt tac ctc aag cgc ctg cgt gag atc tgc gat caa cac aac atc ctg 768
Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile Cys Asp Gln His Asn Ile Leu
245 250 255
ctg gtg ttc gat gaa gtg atc acc ggt ttc ggc cgt act ggc tcg atg 816
Leu Val Phe Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Ser Met
260 265 270
ttc ggt gcc gac agc ttc ggc gtg acc ccg gac ctg atg tgc atc gcc 864
Phe Gly Ala Asp Ser Phe Gly Val Thr Pro Asp Leu Met Cys Ile Ala
275 280 285
aag caa gtc acc aac ggc gcc atc ccg atg ggc gcg gtg atc gcc agc 912
Lys Gln Val Thr Asn Gly Ala Ile Pro Met Gly Ala Val Ile Ala Ser
290 295 300
agc gag atc tat cag acg ttc atg aac cag gcg acg ccg gag tac gca 960
Ser Glu Ile Tyr Gln Thr Phe Met Asn Gln Ala Thr Pro Glu Tyr Ala
305 310 315 320
gtt gag ttt ccg cac ggc tac acc tat tcg gcg cac ccg gta gcc tgc 1008
Val Glu Phe Pro His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala His Pro Val Ala Cys
325 330 335
gcc gcc ggc ctg gct gca ttg gag ctg ttg cag aag gaa aac ctg gtg 1056
Ala Ala Gly Leu Ala Ala Leu Glu Leu Leu Gln Lys Glu Asn Leu Val
340 345 350
cag agc gtc gcc gaa gtc gcc ccg cac ttt gag aat gcg ctg cat ggc 1104
Gln Ser Val Ala Glu Val Ala Pro His Phe Glu Asn Ala Leu His Gly
355 360 365
ctg aag ggc agc aag aac gtc atc gac atc cgc aac tac ggg ctt gcg 1152
Leu Lys Gly Ser Lys Asn Val Ile Asp Ile Arg Asn Tyr Gly Leu Ala
370 375 380
ggc gct atc cag att gcc ccg cgt gac ggt gat gcg atc gtg cgc ccc 1200
Gly Ala Ile Gln Ile Ala Pro Arg Asp Gly Asp Ala Ile Val Arg Pro
385 390 395 400
ttt gag gcc ggc atg gcc ttg tgg aaa gcc ggt ttc tac gtg cgt ttt 1248
Phe Glu Ala Gly Met Ala Leu Trp Lys Ala Gly Phe Tyr Val Arg Phe
405 410 415
ggt ggc gac acc ctg cag ttc ggg cca acc ttc aac agc aag ccg cag 1296
Gly Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr Phe Asn Ser Lys Pro Gln
420 425 430
gac ctg gat cgc ctg ttc gat gcg gtc ggc gaa gtg ctg aac aag atc 1344
Asp Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Val Leu Asn Lys Ile
435 440 445
gac tga 1350
Asp
<210> 8
<211> 449
<212> PRT
<213> 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）
<400> 8
Met Asn Met Pro Glu Asn Ala Pro Ser Ser Leu Ala Ser Gln Leu Lys
1 5 10 15
Leu Asp Ala His Trp Met Pro Tyr Thr Ala Asn Arg Asn Phe Gln Arg
20 25 30
Asp Pro Arg Leu Ile Val Ala Ala Glu Gly Ser Trp Leu Ile Asp Asp
35 40 45
Lys Gly Arg Lys Val Tyr Asp Ser Leu Ser Gly Leu Trp Thr Cys Gly
50 55 60
Ala Gly His Thr Arg Lys Glu Ile Gln Glu Ala Val Ala Lys Gln Leu
65 70 75 80
Gly Thr Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Phe Gln Tyr Gly His Pro Leu Ser
85 90 95
Phe Gln Leu Ala Glu Lys Ile Thr Asp Leu Thr Pro Gly Asn Leu Asn
100 105 110
His Val Phe Phe Thr Asp Ser Gly Ser Glu Cys Ala Asp Thr Ala Val
115 120 125
Lys Met Val Arg Ala Tyr Trp Arg Leu Lys Gly Gln Ala Thr Lys Thr
130 135 140
Lys Met Ile Gly Arg Ala Arg Gly Tyr His Gly Val Asn Ile Ala Gly
145 150 155 160
Thr Ser Leu Gly Gly Val Asn Gly Asn Arg Lys Leu Phe Gly Gln Gly
165 170 175
Leu Met Asp Val Asp His Leu Pro His Thr Leu Leu Ala Ser Asn Ala
180 185 190
Phe Ser Arg Gly Met Pro Glu Gln Gly Gly Ile Ala Leu Ala Asp Glu
195 200 205
Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala Ser Asn Ile Ala Ala Val
210 215 220
Phe Val Glu Pro Met Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Pro Pro Gln
225 230 235 240
Gly Tyr Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile Cys Asp Gln His Asn Ile Leu
245 250 255
Leu Val Phe Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Ser Met
260 265 270
Phe Gly Ala Asp Ser Phe Gly Val Thr Pro Asp Leu Met Cys Ile Ala
275 280 285
Lys Gln Val Thr Asn Gly Ala Ile Pro Met Gly Ala Val Ile Ala Ser
290 295 300
Ser Glu Ile Tyr Gln Thr Phe Met Asn Gln Ala Thr Pro Glu Tyr Ala
305 310 315 320
Val Glu Phe Pro His Gly Tyr Thr Tyr Ser Ala His Pro Val Ala Cys
325 330 335
Ala Ala Gly Leu Ala Ala Leu Glu Leu Leu Gln Lys Glu Asn Leu Val
340 345 350
Gln Ser Val Ala Glu Val Ala Pro His Phe Glu Asn Ala Leu His Gly
355 360 365
Leu Lys Gly Ser Lys Asn Val Ile Asp Ile Arg Asn Tyr Gly Leu Ala
370 375 380
Gly Ala Ile Gln Ile Ala Pro Arg Asp Gly Asp Ala Ile Val Arg Pro
385 390 395 400
Phe Glu Ala Gly Met Ala Leu Trp Lys Ala Gly Phe Tyr Val Arg Phe
405 410 415
Gly Gly Asp Thr Leu Gln Phe Gly Pro Thr Phe Asn Ser Lys Pro Gln
420 425 430
Asp Leu Asp Arg Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Val Leu Asn Lys Ile
435 440 445
Asp
<210> 9
<211> 1335
<212> DNA
<213> 丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1332)
<400> 9
atg ttg cca ccc gaa aca cag cgt ctg atc gaa cag cac ggc atc aag 48
Met Leu Pro Pro Glu Thr Gln Arg Leu Ile Glu Gln His Gly Ile Lys
1 5 10 15
tac gta ctg gct cag ttc gtc gac att cat ggt tcg gcc aag acc aaa 96
Tyr Val Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Ser Ala Lys Thr Lys
20 25 30
tcg gtt cct gtg aca ggt ctg gaa atg gtt gca gag gac ggt gcc ggc 144
Ser Val Pro Val Thr Gly Leu Glu Met Val Ala Glu Asp Gly Ala Gly
35 40 45
ttt gcc ggt ttc gcg atc tgc ggg atg ggc atg gag cct cat ggg ccg 192
Phe Ala Gly Phe Ala Ile Cys Gly Met Gly Met Glu Pro His Gly Pro
50 55 60
gac ttc atg gcc agg ggt gat ctg tcg tcg ctg acc ccg gtg cca tgg 240
Asp Phe Met Ala Arg Gly Asp Leu Ser Ser Leu Thr Pro Val Pro Trp
65 70 75 80
cag ccg ggc tat gga cgg gtg gtg tgc atc ggc cat gtg gat ggc aaa 288
Gln Pro Gly Tyr Gly Arg Val Val Cys Ile Gly His Val Asp Gly Lys
85 90 95
ccc tgg ccc tat gac agc cgc tat gtg ctg cag cag cag gtc gaa cgc 336
Pro Trp Pro Tyr Asp Ser Arg Tyr Val Leu Gln Gln Gln Val Glu Arg
100 105 110
ctc agt cag cgt ggc tgg agc ctc aat acc ggc ctg gag ccc gag ttc 384
Leu Ser Gln Arg Gly Trp Ser Leu Asn Thr Gly Leu Glu Pro Glu Phe
115 120 125
agc ctg ttc aag cgc gat gtc acc ggc agc ctg cag atg gtc gat gcc 432
Ser Leu Phe Lys Arg Asp Val Thr Gly Ser Leu Gln Met Val Asp Ala
130 135 140
agc gat aac ctc gac aag cct tgc tac gac tac aag ggg ctg tcg cgc 480
Ser Asp Asn Leu Asp Lys Pro Cys Tyr Asp Tyr Lys Gly Leu Ser Arg
145 150 155 160
tct cgc gag ttt ctc gag cgc ctg acc gag gca ttg cag ccg gtg ggt 528
Ser Arg Glu Phe Leu Glu Arg Leu Thr Glu Ala Leu Gln Pro Val Gly
165 170 175
ttc gac att tat cag atc gat cat gaa gac gcc aac ggc cag ttc gag 576
Phe Asp Ile Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe Glu
180 185 190
atc aat tac acc tac agc gag gcc atg gaa tcg gct gac cgt ttc acc 624
Ile Asn Tyr Thr Tyr Ser Glu Ala Met Glu Ser Ala Asp Arg Phe Thr
195 200 205
ttc ttc cgc atg gcc gcc ggt gag atc gcc aat gac atg ggc atg atc 672
Phe Phe Arg Met Ala Ala Gly Glu Ile Ala Asn Asp Met Gly Met Ile
210 215 220
tgc tcg ttc atg ccc aag ccc gat ccc aaa cgg gcc ggc aat ggc atg 720
Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Asp Pro Lys Arg Ala Gly Asn Gly Met
225 230 235 240
cac ttt cac ttg tcg atc gcc agt gcc agt aac aag aac ctg ttc cac 768
His Phe His Leu Ser Ile Ala Ser Ala Ser Asn Lys Asn Leu Phe His
245 250 255
gat gcc agc gat ccg agc ggc atg ggg ttg tcg acg ctg gcc tat cac 816
Asp Ala Ser Asp Pro Ser Gly Met Gly Leu Ser Thr Leu Ala Tyr His
260 265 270
ttc gct gcg ggc ctg ctg gct cac ggg cct gcg ctg tgc gcc ttt gcg 864
Phe Ala Ala Gly Leu Leu Ala His Gly Pro Ala Leu Cys Ala Phe Ala
275 280 285
gca ccc acg gtc aac tcc tac aaa cgc ctg gtg gtc ggc aac tca ctg 912
Ala Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Asn Ser Leu
290 295 300
tcg ggc gcc acc tgg gcc ccg gcg ttt att gcc ttc ggc gcc aac aac 960
Ser Gly Ala Thr Trp Ala Pro Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ala Asn Asn
305 310 315 320
cgc tcg gcg atg gtg cgc gtg ccc tat ggc cgc ctg gag ttt cgt ctg 1008
Arg Ser Ala Met Val Arg Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Phe Arg Leu
325 330 335
ccc gac gcc ggt tgc aat ccg tat ctg gtc agc gcc gca atc att gcc 1056
Pro Asp Ala Gly Cys Asn Pro Tyr Leu Val Ser Ala Ala Ile Ile Ala
340 345 350
gca ggc ctg gac ggt atc gac cgg caa ctg gag atc gat cac gtc tgc 1104
Ala Gly Leu Asp Gly Ile Asp Arg Gln Leu Glu Ile Asp His Val Cys
355 360 365
aac gag aac ctc tac aaa ttg agc ctc gaa gag atc gcc gca cgg ggc 1152
Asn Glu Asn Leu Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Glu Ile Ala Ala Arg Gly
370 375 380
atc aag acc ctg ccg cag tcg ctc aac gaa gcc tgc gac gcg ctg caa 1200
Ile Lys Thr Leu Pro Gln Ser Leu Asn Glu Ala Cys Asp Ala Leu Gln
385 390 395 400
gcc gac ccg ttg ttt ggc gaa gtg ctg ggc agc gag att gtc gat gaa 1248
Ala Asp Pro Leu Phe Gly Glu Val Leu Gly Ser Glu Ile Val Asp Glu
405 410 415
ttc atc cgc ctc aag cgc atg gag tgg gtg gaa tac agc cgc cac gtg 1296
Phe Ile Arg Leu Lys Arg Met Glu Trp Val Glu Tyr Ser Arg His Val
420 425 430
agc gat tgg gaa gtg aag cgc tat atc gaa ttt ttc tag 1335
Ser Asp Trp Glu Val Lys Arg Tyr Ile Glu Phe Phe
435 440
<210> 10
<211> 444
<212> PRT
<213> 丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）
<400> 10
Met Leu Pro Pro Glu Thr Gln Arg Leu Ile Glu Gln His Gly Ile Lys
1 5 10 15
Tyr Val Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Ser Ala Lys Thr Lys
20 25 30
Ser Val Pro Val Thr Gly Leu Glu Met Val Ala Glu Asp Gly Ala Gly
35 40 45
Phe Ala Gly Phe Ala Ile Cys Gly Met Gly Met Glu Pro His Gly Pro
50 55 60
Asp Phe Met Ala Arg Gly Asp Leu Ser Ser Leu Thr Pro Val Pro Trp
65 70 75 80
Gln Pro Gly Tyr Gly Arg Val Val Cys Ile Gly His Val Asp Gly Lys
85 90 95
Pro Trp Pro Tyr Asp Ser Arg Tyr Val Leu Gln Gln Gln Val Glu Arg
100 105 110
Leu Ser Gln Arg Gly Trp Ser Leu Asn Thr Gly Leu Glu Pro Glu Phe
115 120 125
Ser Leu Phe Lys Arg Asp Val Thr Gly Ser Leu Gln Met Val Asp Ala
130 135 140
Ser Asp Asn Leu Asp Lys Pro Cys Tyr Asp Tyr Lys Gly Leu Ser Arg
145 150 155 160
Ser Arg Glu Phe Leu Glu Arg Leu Thr Glu Ala Leu Gln Pro Val Gly
165 170 175
Phe Asp Ile Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe Glu
180 185 190
Ile Asn Tyr Thr Tyr Ser Glu Ala Met Glu Ser Ala Asp Arg Phe Thr
195 200 205
Phe Phe Arg Met Ala Ala Gly Glu Ile Ala Asn Asp Met Gly Met Ile
210 215 220
Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Asp Pro Lys Arg Ala Gly Asn Gly Met
225 230 235 240
His Phe His Leu Ser Ile Ala Ser Ala Ser Asn Lys Asn Leu Phe His
245 250 255
Asp Ala Ser Asp Pro Ser Gly Met Gly Leu Ser Thr Leu Ala Tyr His
260 265 270
Phe Ala Ala Gly Leu Leu Ala His Gly Pro Ala Leu Cys Ala Phe Ala
275 280 285
Ala Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Asn Ser Leu
290 295 300
Ser Gly Ala Thr Trp Ala Pro Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ala Asn Asn
305 310 315 320
Arg Ser Ala Met Val Arg Val Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Phe Arg Leu
325 330 335
Pro Asp Ala Gly Cys Asn Pro Tyr Leu Val Ser Ala Ala Ile Ile Ala
340 345 350
Ala Gly Leu Asp Gly Ile Asp Arg Gln Leu Glu Ile Asp His Val Cys
355 360 365
Asn Glu Asn Leu Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Glu Ile Ala Ala Arg Gly
370 375 380
Ile Lys Thr Leu Pro Gln Ser Leu Asn Glu Ala Cys Asp Ala Leu Gln
385 390 395 400
Ala Asp Pro Leu Phe Gly Glu Val Leu Gly Ser Glu Ile Val Asp Glu
405 410 415
Phe Ile Arg Leu Lys Arg Met Glu Trp Val Glu Tyr Ser Arg His Val
420 425 430
Ser Asp Trp Glu Val Lys Arg Tyr Ile Glu Phe Phe
435 440
<210> 11
<211> 2676
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2673)
<400> 11
atg gct gtt act aat gtc gct gaa ctt aac gca ctc gta gag cgt gta 48
Met Ala Val Thr Asn Val Ala Glu Leu Asn Ala Leu Val Glu Arg Val
1 5 10 15
aaa aaa gcc cag cgt gaa tat gcc agt ttc act caa gag caa gta gac 96
Lys Lys Ala Gln Arg Glu Tyr Ala Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Asp
20 25 30
aaa atc ttc cgc gcc gcc gct ctg gct gct gca gat gct cga atc cca 144
Lys Ile Phe Arg Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Ala Arg Ile Pro
35 40 45
ctc gcg aaa atg gcc gtt gcc gaa tcc ggc atg ggt atc gtc gaa gat 192
Leu Ala Lys Met Ala Val Ala Glu Ser Gly Met Gly Ile Val Glu Asp
50 55 60
aaa gtg atc aaa aac cac ttt gct tct gaa tat atc tac aac gcc tat 240
Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Asn Ala Tyr
65 70 75 80
aaa gat gaa aaa acc tgt ggt gtt ctg tct gaa gac gac act ttt ggt 288
Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Val Leu Ser Glu Asp Asp Thr Phe Gly
85 90 95
acc atc act atc gct gaa cca atc ggt att att tgc ggt atc gtt ccg 336
Thr Ile Thr Ile Ala Glu Pro Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile Val Pro
100 105 110
acc act aac ccg act tca act gct atc ttc aaa tcg ctg atc agt ctg 384
Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu
115 120 125
aag acc cgt aac gcc att atc ttc tcc ccg cac ccg cgt gca aaa gat 432
Lys Thr Arg Asn Ala Ile Ile Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Asp
130 135 140
gcc acc aac aaa gcg gct gat atc gtt ctg cag gct gct atc gct gcc 480
Ala Thr Asn Lys Ala Ala Asp Ile Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Ala
145 150 155 160
ggt gct ccg aaa gat ctg atc ggc tgg atc gat caa cct tct gtt gaa 528
Gly Ala Pro Lys Asp Leu Ile Gly Trp Ile Asp Gln Pro Ser Val Glu
165 170 175
ctg tct aac gca ctg atg cac cac cca gac atc aac ctg atc ctc gcg 576
Leu Ser Asn Ala Leu Met His His Pro Asp Ile Asn Leu Ile Leu Ala
180 185 190
act ggt ggt ccg ggc atg gtt aaa gcc gca tac agc tcc ggt aaa cca 624
Thr Gly Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro
195 200 205
gct atc ggt gta ggc gcg ggc aac act cca gtt gtt atc gat gaa act 672
Ala Ile Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Val Val Ile Asp Glu Thr
210 215 220
gct gat atc aaa cgt gca gtt gca tct gta ctg atg tcc aaa acc ttc 720
Ala Asp Ile Lys Arg Ala Val Ala Ser Val Leu Met Ser Lys Thr Phe
225 230 235 240
gac aac ggc gta atc tgt gct tct gaa cag tct gtt gtt gtt gtt gac 768
Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp
245 250 255
tct gtt tat gac gct gta cgt gaa cgt ttt gca acc cac ggc ggc tat 816
Ser Val Tyr Asp Ala Val Arg Glu Arg Phe Ala Thr His Gly Gly Tyr
260 265 270
ctg ttg cag ggt aaa gag ctg aaa gct gtt cag gat gtt atc ctg aaa 864
Leu Leu Gln Gly Lys Glu Leu Lys Ala Val Gln Asp Val Ile Leu Lys
275 280 285
aac ggt gcg ctg aac gcg gct atc gtt ggt cag cca gcc tat aaa att 912
Asn Gly Ala Leu Asn Ala Ala Ile Val Gly Gln Pro Ala Tyr Lys Ile
290 295 300
gct gaa ctg gca ggc ttc tct gta cca gaa aac acc aag att ctg atc 960
Ala Glu Leu Ala Gly Phe Ser Val Pro Glu Asn Thr Lys Ile Leu Ile
305 310 315 320
ggt gaa gtg acc gtt gtt gat gaa agc gaa ccg ttc gca cat gaa aaa 1008
Gly Glu Val Thr Val Val Asp Glu Ser Glu Pro Phe Ala His Glu Lys
325 330 335
ctg tcc ccg act ctg gca atg tac cgc gct aaa gat ttc gaa gac gcg 1056
Leu Ser Pro Thr Leu Ala Met Tyr Arg Ala Lys Asp Phe Glu Asp Ala
340 345 350
gta gaa aaa gca gag aaa ctg gtt gct atg ggc ggt atc ggt cat acc 1104
Val Glu Lys Ala Glu Lys Leu Val Ala Met Gly Gly Ile Gly His Thr
355 360 365
tct tgc ctg tac act gac cag gat aac caa ccg gct cgc gtt tct tac 1152
Ser Cys Leu Tyr Thr Asp Gln Asp Asn Gln Pro Ala Arg Val Ser Tyr
370 375 380
ttc ggt cag aaa atg aaa acg gcg cgt atc ctg att aac acc cca gcg 1200
Phe Gly Gln Lys Met Lys Thr Ala Arg Ile Leu Ile Asn Thr Pro Ala
385 390 395 400
tct cag ggt ggt atc ggt gac ctg tat aac ttc aaa ctc gca cct tcc 1248
Ser Gln Gly Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Leu Ala Pro Ser
405 410 415
ctg act ctg ggt tgt ggt tct tgg ggt ggt aac tcc atc tct gaa aac 1296
Leu Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Gly Asn Ser Ile Ser Glu Asn
420 425 430
gtt ggt ccg aaa cac ctg atc aac aag aaa acc gtt gct aag cga gct 1344
Val Gly Pro Lys His Leu Ile Asn Lys Lys Thr Val Ala Lys Arg Ala
435 440 445
gaa aac atg ttg tgg cac aaa ctt ccg aaa tct atc tac ttc cgc cgt 1392
Glu Asn Met Leu Trp His Lys Leu Pro Lys Ser Ile Tyr Phe Arg Arg
450 455 460
ggc tcc ctg cca atc gcg ctg gat gaa gtg att act gat ggc cac aaa 1440
Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Asp Glu Val Ile Thr Asp Gly His Lys
465 470 475 480
cgt gcg ctc atc gtg act gac cgc ttc ctg ttc aac aat ggt tat gct 1488
Arg Ala Leu Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Phe Asn Asn Gly Tyr Ala
485 490 495
gat cag atc act tcc gta ctg aaa gca gca ggc gtt gaa act gaa gtc 1536
Asp Gln Ile Thr Ser Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Glu Thr Glu Val
500 505 510
ttc ttc gaa gta gaa gcg gac ccg acc ctg agc atc gtt cgt aaa ggt 1584
Phe Phe Glu Val Glu Ala Asp Pro Thr Leu Ser Ile Val Arg Lys Gly
515 520 525
gca gaa ctg gca aac tcc ttc aaa cca gac gtg att atc gcg ctg ggt 1632
Ala Glu Leu Ala Asn Ser Phe Lys Pro Asp Val Ile Ile Ala Leu Gly
530 535 540
ggt ggt tcc ccg atg gac gcc gcg aag atc atg tgg gtt atg tac gaa 1680
Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ile Met Trp Val Met Tyr Glu
545 550 555 560
cat ccg gaa act cac ttc gaa gag ctg gcg ctg cgc ttt atg gat atc 1728
His Pro Glu Thr His Phe Glu Glu Leu Ala Leu Arg Phe Met Asp Ile
565 570 575
cgt aaa cgt atc tac aag ttc ccg aaa atg ggc gtg aaa gcg aaa atg 1776
Arg Lys Arg Ile Tyr Lys Phe Pro Lys Met Gly Val Lys Ala Lys Met
580 585 590
atc gct gtc acc acc act tct ggt aca ggt tct gaa gtc act ccg ttt 1824
Ile Ala Val Thr Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe
595 600 605
gcg gtt gta act gac gac gct act ggt cag aaa tat ccg ctg gca gac 1872
Ala Val Val Thr Asp Asp Ala Thr Gly Gln Lys Tyr Pro Leu Ala Asp
610 615 620
tat gcg ctg act ccg gat atg gcg att gtc gac gcc aac ctg gtt atg 1920
Tyr Ala Leu Thr Pro Asp Met Ala Ile Val Asp Ala Asn Leu Val Met
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gac atg ccg aag tcc ctg tgt gct ttc ggt ggt ctg gac gca gta act 1968
Asp Met Pro Lys Ser Leu Cys Ala Phe Gly Gly Leu Asp Ala Val Thr
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cac gcc atg gaa gct tat gtt tct gta ctg gca tct gag ttc tct gat 2016
His Ala Met Glu Ala Tyr Val Ser Val Leu Ala Ser Glu Phe Ser Asp
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Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Ala
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Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His
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Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly
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Ser Ala Pro Gly Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ile Glu Lys Leu Leu Ala
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<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
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225 230 235 240
Pro Val Val Val Asp Glu Thr Ala Asp Leu Ala Arg Ala Ala Gln Ser
245 250 255
Ile Val Lys Gly Ala Ser Phe Asp Asn Asn Ile Ile Cys Ala Asp Glu
260 265 270
Lys Val Leu Ile Val Val Asp Ser Val Ala Asp Glu Leu Met Arg Leu
275 280 285
Met Glu Gly Gln His Ala Val Lys Leu Thr Ala Glu Gln Ala Gln Gln
290 295 300
Leu Gln Pro Val Leu Leu Lys Asn Ile Asp Glu Arg Gly Lys Gly Thr
305 310 315 320
Val Ser Arg Asp Trp Val Gly Arg Asp Ala Gly Lys Ile Ala Ala Ala
325 330 335
Ile Gly Leu Lys Val Pro Gln Glu Thr Arg Leu Leu Phe Val Glu Thr
340 345 350
Thr Ala Glu His Pro Phe Ala Val Thr Glu Leu Met Met Pro Val Leu
355 360 365
Pro Val Val Arg Val Ala Asn Val Ala Asp Ala Ile Ala Leu Ala Val
370 375 380
Lys Leu Glu Gly Gly Cys His His Thr Ala Ala Met His Ser Arg Asn
385 390 395 400
Ile Glu Asn Met Asn Gln Met Ala Asn Ala Ile Asp Thr Ser Ile Phe
405 410 415
Val Lys Asn Gly Pro Cys Ile Ala Gly Leu Gly Leu Gly Gly Glu Gly
420 425 430
Trp Thr Thr Met Thr Ile Thr Thr Pro Thr Gly Glu Gly Val Thr Ser
435 440 445
Ala Arg Thr Phe Val Arg Leu Arg Arg Cys Val Leu Val Asp Ala Phe
450 455 460
Arg Ile Val
465
<210> 17
<211> 1137
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1134)
<400> 17
atg atc ata ggg gtt cct aaa gag ata aaa aac aat gaa aac cgt gtc 48
Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val
1 5 10 15
gca tta aca ccc ggg ggc gtt tct cag ctc att tca aac ggc cac cgg 96
Ala Leu Thr Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg
20 25 30
gtg ctg gtt gaa aca ggc gcg ggc ctt gga agc gga ttt gaa aat gaa 144
Val Leu Val Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu
35 40 45
gcc tat gag tca gca gga gcg gaa atc att gct gat ccg aag cag gtc 192
Ala Tyr Glu Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val
50 55 60
tgg gac gcc gaa atg gtc atg aaa gta aaa gaa ccg ctg ccg gaa gaa 240
Trp Asp Ala Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu
65 70 75 80
tat gtt tat ttt cgc aaa gga ctt gtg ctg ttt acg tac ctt cat tta 288
Tyr Val Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu
85 90 95
gca gct gag cct gag ctt gca cag gcc ttg aag gat aaa gga gta act 336
Ala Ala Glu Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr
100 105 110
gcc atc gca tat gaa acg gtc agt gaa ggc cgg aca ttg cct ctt ctg 384
Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu
115 120 125
acg cca atg tca gag gtt gcg ggc aga atg gca gcg caa atc ggc gct 432
Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala
130 135 140
caa ttc tta gaa aag cct aaa ggc gga aaa ggc att ctg ctt gcc ggg 480
Gln Phe Leu Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly
145 150 155 160
gtg cct ggc gtt tcc cgc gga aaa gta aca att atc gga gga ggc gtt 528
Val Pro Gly Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val
165 170 175
gtc ggg aca aac gcg gcg aaa atg gct gtc ggc ctc ggt gca gat gtg 576
Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val
180 185 190
acg atc att gac tta aac gca gac cgc ttg cgc cag ctt gat gac atc 624
Thr Ile Ile Asp Leu Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile
195 200 205
ttc ggc cat cag att aaa acg tta att tct aat ccg gtc aat att gct 672
Phe Gly His Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala
210 215 220
gat gct gtg gcg gaa gcg gat ctc ctc att tgc gcg gta tta att ccg 720
Asp Ala Val Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro
225 230 235 240
ggt gct aaa gct ccg act ctt gtc act gag gaa atg gta aaa caa atg 768
Gly Ala Lys Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met
245 250 255
aaa ccc ggt tca gtt att gtt gat gta gcg atc gac caa ggc ggc atc 816
Lys Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile
260 265 270
gtc gaa act gtc gac cat atc aca aca cat gat cag cca aca tat gaa 864
Val Glu Thr Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu
275 280 285
aaa cac ggg gtt gtg cat tat gct gta gcg aac atg cca ggc gca gtc 912
Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val
290 295 300
cct cgt aca tca aca atc gcc ctg act aac gtt act gtt cca tac gcg 960
Pro Arg Thr Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala
305 310 315 320
ctg caa atc gcg aac aaa ggg gca gta aaa gcg ctc gca gac aat acg 1008
Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr
325 330 335
gca ctg aga gcg ggt tta aac acc gca aac gga cac gtg acc tat gaa 1056
Ala Leu Arg Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu
340 345 350
gct gta gca aga gat cta ggc tat gag tat gtt cct gcc gag aaa gct 1104
Ala Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala
355 360 365
tta cag gat gaa tca tct gtg gcg ggt gct taa 1137
Leu Gln Asp Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala
370 375
<210> 18
<211> 378
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 18
Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val
1 5 10 15
Ala Leu Thr Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg
20 25 30
Val Leu Val Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu
35 40 45
Ala Tyr Glu Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val
50 55 60
Trp Asp Ala Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu
65 70 75 80
Tyr Val Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr
100 105 110
Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu
115 120 125
Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala
130 135 140
Gln Phe Leu Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val
165 170 175
Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val
180 185 190
Thr Ile Ile Asp Leu Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile
195 200 205
Phe Gly His Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala
210 215 220
Asp Ala Val Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro
225 230 235 240
Gly Ala Lys Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met
245 250 255
Lys Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile
260 265 270
Val Glu Thr Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu
275 280 285
Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val
290 295 300
Pro Arg Thr Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala
305 310 315 320
Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr
325 330 335
Ala Leu Arg Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu
340 345 350
Ala Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala
355 360 365
Leu Gln Asp Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala
370 375
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 19
cacaggaaac agaccatgtt gccacccgaa acaca 35
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 20
gttaatttct cctctttaat ttagaaaaat tcgatatagc 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 21
ttaaagagga gaaattaacc atgagcgtca acaacccgca 40
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 22
gagctcgaat tccatttatt gaatcgcctc aaggg 35
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 23
agaggagaaa ttaaccatga acatgcccga aactgg 36
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 24
gagctcgaat tccatttagt cgatcaggtt cagggtt 37
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
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agaggagaaa ttaaccatga ccagcaacaa cccgca 36
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 26
gagctcgaat tccatttagc cctgcaacgc actca 35
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 27
agaggagaaa ttaaccatga acatgcccga aaacgc 36
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 28
gagctcgaat tccatttagt cgatcttgtt cagcact 37
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 29
acggaagatc acttcgcaga 20
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 30
gtcgaccaac gcgcggggag aggcgg 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 31
cagctggacc agttgcaatc caaacg 26
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 32
cggttagcca tttgcctgct 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 33
ggatgaacta cgaggaaggg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 34
agttagtacc tccttatgaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 35
ctggcacagc ttcctgctaa 20
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 36
tctgcgaagt gatcttccgt tacttgctcc ctttgctggg 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 37
agcaggcaaa tggctaaccg gctttttacg cctcaaactt 40
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 38
cgaccatttt ccgccaccat 20
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 39
cccttcctcg tagttcatcc tacttgctcc ctttgctggg 40
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 40
ttcataagga ggtactaact atgatcatag gggttcctaa 40
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 41
aagtttgagg cgtaaaaagc ttaagcaccc gccacagat 39
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 42
atctgtggcg ggtgcttaag ctttttacgc ctcaaactt 39
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 43
gcaatagcca caaagaaacc 20
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 44
tctgcgaagt gatcttccgt aatgctctcc tgataatgtt 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 45
agcaggcaaa tggctaaccg cagtagcgct gtctggcaac 40
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 46
ggcagccaat acttactggc 20
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 47
cccttcctcg tagttcatcc aatgctctcc tgataatgtt 40
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 48
ttcataagga ggtactaact atgaatcaac aggatattga 40
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 49
gttgccagac agcgctactg ttaaacaatg cgaaacgcat 40
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<400> 50
atgcgtttcg cattgtttaa cagtagcgct gtctggcaac 40

Claims (10)

1.一种微生物，其利用碳源生成乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP，并且通过基因改造或转化，下述[1]所述的蛋白质的活性和γ-谷氨酰甲胺合成酶活性比亲株增强，亲株是指作为基因改造和转化的对象的原株，
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
2.一种微生物，其利用碳源生成乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺，并且通过基因改造或转化，下述[1]所述的蛋白质的活性和谷氨酰胺酶活性比亲株增强，亲株是指作为基因改造和转化的对象的原株，
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的微生物，其中，微生物为属于埃希氏菌属(Escherichia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物。
4.如权利要求1或2所述的微生物，其中，碳源为糖。
5.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使下述[1]所述的蛋白质和γ-谷氨酰甲胺合成酶在含有乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸，
[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
6.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使下述[1]所述的蛋白质和谷氨酰胺酶在含有乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺的水性介质中共存，由此在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸，[1]由序列号2、4、6或8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
7.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的微生物在培养基中培养，在培养物中生成、蓄积茶氨酸，并从该培养物中收集茶氨酸。
8.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使权利要求1所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸、谷氨酸和ATP在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸，所述处理物为包含保持与该培养物同样的功能的活菌体作为酶源的物质、由处理后的菌体得到的粗制酶提取物或由处理后的菌体得到的纯化酶。
9.一种茶氨酸的制造方法，其特征在于，使权利要求2所述的微生物的培养物或该培养物的处理物、乙醛、丙氨酸和谷氨酰胺在水性介质中共存，在该水性介质中生成、蓄积茶氨酸，并从该水性介质中收集茶氨酸，所述处理物为包含保持与该培养物同样的功能的活菌体作为酶源的物质、由处理后的菌体得到的粗制酶提取物或由处理后的菌体得到的纯化酶。
10.如权利要求7～9中任一项所述的茶氨酸的制造方法，其中，微生物为属于埃希氏菌属或棒状杆菌属的微生物。
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