JP2003274948A - Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法 - Google Patents
Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法Info
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- JP2003274948A JP2003274948A JP2002080710A JP2002080710A JP2003274948A JP 2003274948 A JP2003274948 A JP 2003274948A JP 2002080710 A JP2002080710 A JP 2002080710A JP 2002080710 A JP2002080710 A JP 2002080710A JP 2003274948 A JP2003274948 A JP 2003274948A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率的なＵＤＰ−グルクロン酸の製造法を提
供する。 【解決手段】 本発明によれば、ウリジン−５’−三リ
ン酸の前駆物質と糖とからＵＤＰ−グルコースを生成す
る能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理
物、およびＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を
有する蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養
物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素
源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せし
め、該水性媒体中にＵＤＰ−グルクロン酸を生成蓄積さ
せ、該水性媒体中からＵＤＰ−グルクロン酸を採取する
ことを特徴とする効率的なＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法を
提供することができる。
供する。 【解決手段】 本発明によれば、ウリジン−５’−三リ
ン酸の前駆物質と糖とからＵＤＰ−グルコースを生成す
る能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理
物、およびＵＤＰ-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を
有する蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養
物または該培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素
源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せし
め、該水性媒体中にＵＤＰ−グルクロン酸を生成蓄積さ
せ、該水性媒体中からＵＤＰ−グルクロン酸を採取する
ことを特徴とする効率的なＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法を
提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＵＤＰ−グルクロ
ン酸の製造法に関する。ＵＤＰ−グルクロン酸は眼科領
域での手術や骨関節炎の治療などに用いられるヒアルロ
ン酸の酵素合成や様々な化合物のグルクロニル化に用い
るグルクロン酸転移酵素の基質として有用である。
ン酸の製造法に関する。ＵＤＰ−グルクロン酸は眼科領
域での手術や骨関節炎の治療などに用いられるヒアルロ
ン酸の酵素合成や様々な化合物のグルクロニル化に用い
るグルクロン酸転移酵素の基質として有用である。
【０００２】
【従来の技術】ＵＤＰ−グルクロン酸（以下、ＵＤＰ−
ＧｌｃＡと略す）の製造法に関しては、ＵＤＰ−グルコ
ース（以下、ＵＤＰ−Ｇｌｃと略す）あるいはグルコー
ス−１−リン酸を基質としたウシ、モルモット、ウサギ
あるいは大腸菌由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと略す）を用いる方法
が知られている［J. Am. Chem. Soc., 117, 5869 (199
5)、J. Org. Chem., 56,5603 (1991)、Tetrahedron, 4
7, 5119 (1991)］が、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の
処理物を酵素源として利用したＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造
に関する報告はない。
ＧｌｃＡと略す）の製造法に関しては、ＵＤＰ−グルコ
ース（以下、ＵＤＰ−Ｇｌｃと略す）あるいはグルコー
ス−１−リン酸を基質としたウシ、モルモット、ウサギ
あるいは大腸菌由来のＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと略す）を用いる方法
が知られている［J. Am. Chem. Soc., 117, 5869 (199
5)、J. Org. Chem., 56,5603 (1991)、Tetrahedron, 4
7, 5119 (1991)］が、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質を生産する形質転換体の培養物または該培養物の
処理物を酵素源として利用したＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造
に関する報告はない。
【０００３】ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨに関しては、Escheric
hia coli、Bacillus subtilis由来の酵素および該蛋白
質をコードするＤＮＡに関する報告[J. Bacteriol., 17
7, 4562 (1995)、Mol. Microbiol., 17, 611 (1995)、M
ol. Microbiol., 31, 795 (1999)]があるが、いずれも
該ＤＮＡがＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡであることを確認したに過ぎない。すな
わち、該ＤＮＡを発現する細胞から精製されたＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を用いてＵＤＰ−Ｇｌｃ
よりＵＤＰ−ＧｌｃＡが生産できることは示されている
が、該生産方法は、基質として精製されたＵＤＰ−Ｇｌ
ｃおよび補酵素としてＮＡＤを必要とすることから、経
済性、効率性の面から実用的な製造法とは言えない。ま
た、該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養
物または該培養物の処理物を酵素源として利用したＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＡの製造に関する記載はない。
hia coli、Bacillus subtilis由来の酵素および該蛋白
質をコードするＤＮＡに関する報告[J. Bacteriol., 17
7, 4562 (1995)、Mol. Microbiol., 17, 611 (1995)、M
ol. Microbiol., 31, 795 (1999)]があるが、いずれも
該ＤＮＡがＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡであることを確認したに過ぎない。すな
わち、該ＤＮＡを発現する細胞から精製されたＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を用いてＵＤＰ−Ｇｌｃ
よりＵＤＰ−ＧｌｃＡが生産できることは示されている
が、該生産方法は、基質として精製されたＵＤＰ−Ｇｌ
ｃおよび補酵素としてＮＡＤを必要とすることから、経
済性、効率性の面から実用的な製造法とは言えない。ま
た、該蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養
物または該培養物の処理物を酵素源として利用したＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＡの製造に関する記載はない。
【０００４】Pasteurella multocidaにおいては、既知
のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨのアミノ酸配列と相同性が高いこ
とからＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと推測されている蛋白質が存
在するという報告 [FEMS Microbiol. Lett., 166, 289
(1998)、Proc. Natl. Acad.Sci., 98, 3460 (2001)] が
あるが、実際にＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有することは
確認されていない。
のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨのアミノ酸配列と相同性が高いこ
とからＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと推測されている蛋白質が存
在するという報告 [FEMS Microbiol. Lett., 166, 289
(1998)、Proc. Natl. Acad.Sci., 98, 3460 (2001)] が
あるが、実際にＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有することは
確認されていない。
【０００５】WO 98/12343にはＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性
の強い微生物を用いたＵＤＰ−ＧｌｃＡの効率的な製造
方法が記載されているが、さらなるＵＤＰ−ＧｌｃＡの
生産性の向上をはかるため、よりＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性の強い微生物を用いたＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法の開
発が望まれている。
の強い微生物を用いたＵＤＰ−ＧｌｃＡの効率的な製造
方法が記載されているが、さらなるＵＤＰ−ＧｌｃＡの
生産性の向上をはかるため、よりＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性の強い微生物を用いたＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法の開
発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＡ効率的な製造法を提供することを目的とする。
ｌｃＡ効率的な製造法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＵＤＰ−
Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物の培養物または該
培養物の処理物およびＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養物また
は該培養物の処理物を酵素源として用いることによりＵ
ＤＰ−ＧｌｃＡを効率的に生産できることを見出し、本
発明を完成するに至った。
Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物の培養物または該
培養物の処理物およびＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の培養物また
は該培養物の処理物を酵素源として用いることによりＵ
ＤＰ−ＧｌｃＡを効率的に生産できることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は以下の（１）〜（１７）に
関する。 （１） ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略
す）の前駆物質と糖とからＵＤＰ−グルコース（以下、
ＵＤＰ−Ｇｌｃと略す）を生産する能力を有する微生物
の培養物または該培養物の処理物、およびＵＤＰ-グル
コースデヒドロゲナーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと
略す）活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として
用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体
中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−グルクロン酸
（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略す）を生成蓄積させ、該
水性媒体中からＵＤＰ−ＧｌｃＡを採取することを特徴
とするＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法。 （２） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の
乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の
乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理
物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または
該菌体の固定化物であることを特徴とする、上記（１）
の製造法。 （３） 前駆物質が、オロット酸、オロチジン、ウラシ
ル、ウリジンおよびウリジン−５’−一リン酸からなる
群より選ばれる前駆物質である上記（１）の製造法。 （４） 糖が、グルコースまたはフラクトースである上
記（１）の製造法。 （５） ＵＴＰの前駆物質と糖からＵＤＰ−Ｇｌｃを生
産する能力を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微
生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）の
製造法。 （６） 形質転換体が、微生物に組換え体ＤＮＡを導入
して得られる形質転換体である上記（１）の製造法。 （７） 微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウ
ム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物からな
る群より選ばれる微生物である上記（６）の製造法。 （８） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、パ
スツレラ属、バチルス属、およびエシェリヒア属に属す
る微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製造
法。 （９） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、配
列番号１、２および３からなる群より選ばれる配列番号
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である上記
（１）の製造法。 （１０） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、
配列番号１、２および３からなる群より選ばれるいずれ
か１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１
つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製造
法。 （１１） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、
配列番号１、２および３から選ばれるいずれか１つの配
列番号で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を
有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ
−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製
造法。 （１２） 組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体
ＤＮＡである上記（６）の製造法。 （１３） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれる配列番号で表されるアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え
体ＤＮＡである上記（６）の製造法。 （１４） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである上記
（６）の製造法。 （１５） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ
酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで
ある上記（６）の製造法。 （１６） 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５および６
からなる群より選ばれる配列番号で表される塩基配列を
有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである上記
（６）の製造法。 （１７） 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５および６
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ
−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを
含有する組換え体ＤＮＡである上記（６）の製造法。
関する。 （１） ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴＰと略
す）の前駆物質と糖とからＵＤＰ−グルコース（以下、
ＵＤＰ−Ｇｌｃと略す）を生産する能力を有する微生物
の培養物または該培養物の処理物、およびＵＤＰ-グル
コースデヒドロゲナーゼ（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨと
略す）活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素源として
用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体
中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−グルクロン酸
（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略す）を生成蓄積させ、該
水性媒体中からＵＤＰ−ＧｌｃＡを採取することを特徴
とするＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法。 （２） 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の
乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の
乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理
物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または
該菌体の固定化物であることを特徴とする、上記（１）
の製造法。 （３） 前駆物質が、オロット酸、オロチジン、ウラシ
ル、ウリジンおよびウリジン−５’−一リン酸からなる
群より選ばれる前駆物質である上記（１）の製造法。 （４） 糖が、グルコースまたはフラクトースである上
記（１）の製造法。 （５） ＵＴＰの前駆物質と糖からＵＤＰ−Ｇｌｃを生
産する能力を有する微生物が、エシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微
生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）の
製造法。 （６） 形質転換体が、微生物に組換え体ＤＮＡを導入
して得られる形質転換体である上記（１）の製造法。 （７） 微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウ
ム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物からな
る群より選ばれる微生物である上記（６）の製造法。 （８） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、パ
スツレラ属、バチルス属、およびエシェリヒア属に属す
る微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製造
法。 （９） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、配
列番号１、２および３からなる群より選ばれる配列番号
で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である上記
（１）の製造法。 （１０） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、
配列番号１、２および３からなる群より選ばれるいずれ
か１つの配列番号で表されるアミノ酸配列において、１
つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製造
法。 （１１） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質が、
配列番号１、２および３から選ばれるいずれか１つの配
列番号で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を
有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ
−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である上記（１）の製
造法。 （１２） 組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体
ＤＮＡである上記（６）の製造法。 （１３） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれる配列番号で表されるアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え
体ＤＮＡである上記（６）の製造法。 （１４） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである上記
（６）の製造法。 （１５） 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２および３
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ
酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する
蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡで
ある上記（６）の製造法。 （１６） 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５および６
からなる群より選ばれる配列番号で表される塩基配列を
有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである上記
（６）の製造法。 （１７） 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５および６
からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号で表さ
れる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ
−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを
含有する組換え体ＤＮＡである上記（６）の製造法。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の製造法に用いられるＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質としては、ＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質であれば、いずれの蛋白
質も用いることができるが、好ましくはパスツレラ属、
バチルス属およびエシェリヒア属に属する微生物からな
る群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性
を有する蛋白質、より好ましくはパスツレラ・マルトシ
ダ、バチルス・サチルスおよびエシェリヒア・コリから
なる群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性を有する蛋白質をあげることができる。より具体的に
は、 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （４）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列
から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列において、１
つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＤＨ活性を有する蛋白質 （５）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列
から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列と５０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、
かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質 （６）公知のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質の
アミノ酸配列または配列番号３で表されるアミノ酸配列
からなる蛋白質と相同性が高いことからＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＤＨと推定される蛋白質 をあげることができる。
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質としては、ＵＤＰ−
ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質であれば、いずれの蛋白
質も用いることができるが、好ましくはパスツレラ属、
バチルス属およびエシェリヒア属に属する微生物からな
る群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性
を有する蛋白質、より好ましくはパスツレラ・マルトシ
ダ、バチルス・サチルスおよびエシェリヒア・コリから
なる群より選ばれる微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性を有する蛋白質をあげることができる。より具体的に
は、 （１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質 （４）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列
から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列において、１
つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加され
たアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤＰ−Ｇ
ｌｃＤＨ活性を有する蛋白質 （５）配列番号１、２および３で表されるアミノ酸配列
から選ばれるいずれか１つのアミノ酸配列と５０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、
かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質 （６）公知のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質の
アミノ酸配列または配列番号３で表されるアミノ酸配列
からなる蛋白質と相同性が高いことからＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＤＨと推定される蛋白質 をあげることができる。
【００１０】上記（４）において、１以上のアミノ酸が
欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質は、
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edit
ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)
（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucl
eic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 79,6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部
位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１、２お
よび３から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位
特異的変異を導入することにより、取得することができ
る。
欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質は、
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edit
ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)
（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコール
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucl
eic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 79,6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部
位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１、２お
よび３から選ばれるいずれか１つの配列番号で表される
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位
特異的変異を導入することにより、取得することができ
る。
【００１１】欠失、置換、挿入若しくは付加されるアミ
ノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異
法等の周知の方法により欠失、置換、挿入若しくは付加
できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１
〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましく
は１〜５個である。配列番号１、２および３から選ばれ
るいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは
付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１
または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは
付加があることを意味し、欠失、置換、挿入若しくは付
加が同時に生じてもよく、置換、挿入もしくは付加され
るアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然
型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギ
ン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン
酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイ
シン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、
L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファ
ン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげら
れる。
ノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異
法等の周知の方法により欠失、置換、挿入若しくは付加
できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１
〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましく
は１〜５個である。配列番号１、２および３から選ばれ
るいずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列にお
いて１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは
付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１
または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは
付加があることを意味し、欠失、置換、挿入若しくは付
加が同時に生じてもよく、置換、挿入もしくは付加され
るアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然
型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギ
ン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン
酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイ
シン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、
L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファ
ン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげら
れる。
【００１２】以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の
例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換
可能である。 Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリ
ン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオ
ニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチル
アラニン、シクロヘキシルアラニン Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギ
ン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミ
ノスベリン酸 Ｃ群：アスパラギン、グルタミン Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノ
ブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸 Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシ
プロリン Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン また、配列番号１、２および３から選ばれるいずれか１
つの配列番号で表されるアミノ酸配列において１以上の
アミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加された蛋
白質がＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質であるた
めには、配列番号１、２および３から選ばれるいずれか
１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と、５０％以
上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有し
ていることが好ましい。
例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換
可能である。 Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリ
ン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオ
ニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチル
アラニン、シクロヘキシルアラニン Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギ
ン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミ
ノスベリン酸 Ｃ群：アスパラギン、グルタミン Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノ
ブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸 Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシ
プロリン Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン また、配列番号１、２および３から選ばれるいずれか１
つの配列番号で表されるアミノ酸配列において１以上の
アミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加された蛋
白質がＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質であるた
めには、配列番号１、２および３から選ばれるいずれか
１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と、５０％以
上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有し
ていることが好ましい。
【００１３】アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karl
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enz
ymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができ
る。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLAST
Xとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Bio
l., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによっ
て塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えば
Score＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基
づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合に
は、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3と
する。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合に
は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http:/
/www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
in and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enz
ymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができ
る。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLAST
Xとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Bio
l., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによっ
て塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えば
Score＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基
づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合に
は、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3と
する。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合に
は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http:/
/www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００１４】上記（６）において、公知のＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質としては、配列番号３で表さ
れるアミノ酸配列からなるEscherichia coliのKfiD蛋白
質、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるBacill
us subtilisのTuaD蛋白質をあげることができる。配列
番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、パス
ツレラ・マルトシダのPM0776蛋白質［Proc. Natl. Aca
d. Sci., 98, 3460(2001)］であり、本発明においてＵ
ＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有することが明らかになった蛋
白質である。
ｃＤＨ活性を有する蛋白質としては、配列番号３で表さ
れるアミノ酸配列からなるEscherichia coliのKfiD蛋白
質、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるBacill
us subtilisのTuaD蛋白質をあげることができる。配列
番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、パス
ツレラ・マルトシダのPM0776蛋白質［Proc. Natl. Aca
d. Sci., 98, 3460(2001)］であり、本発明においてＵ
ＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有することが明らかになった蛋
白質である。
【００１５】上記公知のＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有す
る蛋白質のアミノ酸配列または配列番号３で表されるア
ミノ酸配列と相同性が高いことからＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ
と推定される蛋白質としては、Salmonella typhimurium
由来のGenBank accession No. AE008792、Salmonella e
nterica由来のGenBank accession No. AL627273、Salmo
nella flexner由来のGenBank accession No. X71970、V
ibrio cholerae由来のGenBank accession No. AB01295
6、Bacillus halodurans由来のGenBank accession No.
AP001519、Streptococcus pneumoniae由来のGenBank ac
cession No. AF026471、Streptococcus pyogenes由来の
GenBank accession No. AE006637、Campylobacter jeju
ni由来のGenBank accession No. AL139078、Paramecium
bursaria由来のGenBank accession No. U42580、Lacto
coccus lactis由来のGenBank accession No. AF10029
7、Agrobacterium tumefacience由来のGenBank accessi
on No. AE009345、Aquifex aeolicus由来のGenBank acc
ession No. AE000669、Synechocystis sp.由来のGenBan
k accession No. D90901、Caulobacter crescentus由来
のGenBank accession No. AE005907、Brucella meliten
sis由来のGenBank accession No. AE009707、Burkholde
r pseudomallei由来のGenBank accession No.AF15942
8、Zymomonas mobilis由来のGenBank accession No. AF
213822、Bacteroides fragilis由来のGenBank accessio
n No. AF285774、Mesorhizobium loti由来のGenBank ac
cession No. AP003006、Xylella fastidiosa由来のGenB
ank accession No. AE003988、Sinorhizobium meliloti
由来のGenBank accession No. AL591786、Rhizobium me
liloti由来のGenBank accession No. AJ222661、Nostoc
sp. 由来のGenBank accession No. AP003583、Mycobac
terium avium由来のGenBank accession No. AF143772、
およびAzospirillum brasilense由来のGenBank accessi
on No. U20583、に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
をあげることができる。
る蛋白質のアミノ酸配列または配列番号３で表されるア
ミノ酸配列と相同性が高いことからＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ
と推定される蛋白質としては、Salmonella typhimurium
由来のGenBank accession No. AE008792、Salmonella e
nterica由来のGenBank accession No. AL627273、Salmo
nella flexner由来のGenBank accession No. X71970、V
ibrio cholerae由来のGenBank accession No. AB01295
6、Bacillus halodurans由来のGenBank accession No.
AP001519、Streptococcus pneumoniae由来のGenBank ac
cession No. AF026471、Streptococcus pyogenes由来の
GenBank accession No. AE006637、Campylobacter jeju
ni由来のGenBank accession No. AL139078、Paramecium
bursaria由来のGenBank accession No. U42580、Lacto
coccus lactis由来のGenBank accession No. AF10029
7、Agrobacterium tumefacience由来のGenBank accessi
on No. AE009345、Aquifex aeolicus由来のGenBank acc
ession No. AE000669、Synechocystis sp.由来のGenBan
k accession No. D90901、Caulobacter crescentus由来
のGenBank accession No. AE005907、Brucella meliten
sis由来のGenBank accession No. AE009707、Burkholde
r pseudomallei由来のGenBank accession No.AF15942
8、Zymomonas mobilis由来のGenBank accession No. AF
213822、Bacteroides fragilis由来のGenBank accessio
n No. AF285774、Mesorhizobium loti由来のGenBank ac
cession No. AP003006、Xylella fastidiosa由来のGenB
ank accession No. AE003988、Sinorhizobium meliloti
由来のGenBank accession No. AL591786、Rhizobium me
liloti由来のGenBank accession No. AJ222661、Nostoc
sp. 由来のGenBank accession No. AP003583、Mycobac
terium avium由来のGenBank accession No. AF143772、
およびAzospirillum brasilense由来のGenBank accessi
on No. U20583、に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質
をあげることができる。
【００１６】ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質の
アミノ酸配列と５０％以上の相同性があるアミノ酸配列
を有する蛋白質とは、上記BLASTまたはFASTA等を用い
て、上記パラメーターに基づき計算したときに、該ＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列と少
なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ま
しくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同
性を有しているアミノ酸配列からなる蛋白質である。
アミノ酸配列と５０％以上の相同性があるアミノ酸配列
を有する蛋白質とは、上記BLASTまたはFASTA等を用い
て、上記パラメーターに基づき計算したときに、該ＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列と少
なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ま
しくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同
性を有しているアミノ酸配列からなる蛋白質である。
【００１７】本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、上記の本発明の製造法に用いられる蛋白質をコード
するＤＮＡをあげることができる。具体的には、配列番
号４、５および６から選ばれるいずれか１つの配列番号
で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列
の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
ｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、上記の本発明の製造法に用いられる蛋白質をコード
するＤＮＡをあげることができる。具体的には、配列番
号４、５および６から選ばれるいずれか１つの配列番号
で表される塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列
の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡをあげることができる。
【００１８】上記のストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズ可能なＤＮＡとは、上記（１）〜（３）のいず
れか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列
の相補配列の一部、または全部からなるＤＮＡをプロー
ブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロッ
トハイブリダイゼーション法等を用いることにより得ら
れるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプ
ラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、
0.7〜1.0 mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブ
リダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のＳＳＣ溶
液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150 mmol/l塩化ナ
トリウム、15 mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同
定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼ
ーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical
Approach, Second Edition, Oxford University (1995)
等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハ
イブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記した
BLASTおよびFASTA等を用いて、上記パラメーターに基づ
いて計算したときに、配列番号４、５および６から選ば
れるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列と少な
くとも５０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは
８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは
９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができ
る。
リダイズ可能なＤＮＡとは、上記（１）〜（３）のいず
れか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列
の相補配列の一部、または全部からなるＤＮＡをプロー
ブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロッ
トハイブリダイゼーション法等を用いることにより得ら
れるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプ
ラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、
0.7〜1.0 mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブ
リダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のＳＳＣ溶
液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150 mmol/l塩化ナ
トリウム、15 mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同
定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼ
ーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレ
ント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロ
ジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical
Approach, Second Edition, Oxford University (1995)
等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハ
イブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、上記した
BLASTおよびFASTA等を用いて、上記パラメーターに基づ
いて計算したときに、配列番号４、５および６から選ば
れるいずれか１つの配列番号で表される塩基配列と少な
くとも５０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは
８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは
９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができ
る。
【００１９】本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換株は、例えば上記方法により作製した該蛋白質をコ
ードするＤＮＡをモレキュラー・クローニング第３版記
載の方法に従ってベクターＤＮＡと連結することで組換
え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いてモレキ
ュラー・クローニング第３版記載の方法に従って宿主細
胞を形質転換することにより取得することができる。
ｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換株は、例えば上記方法により作製した該蛋白質をコ
ードするＤＮＡをモレキュラー・クローニング第３版記
載の方法に従ってベクターＤＮＡと連結することで組換
え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを用いてモレキ
ュラー・クローニング第３版記載の方法に従って宿主細
胞を形質転換することにより取得することができる。
【００２０】以下に、本発明の製造法に用いられるＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を発現する形質転換
体の作製について説明する。 （１）ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡの調製 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡは、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微
生物を用いても調製できる。該微生物として具体的には
サルモネラ属、ビブリオ属、ストレプトコッカス属、キ
ャンピロバクター属、パラメシウム属、ラクトコッカス
属、アグロバクテリウム属、アキフェックス属、シネコ
システィス属、カウロバクター属、ブルセラ属、バーク
ホルダー属、ザイモモナス属、バクテロイデス属、メソ
リゾビウム属、キシレラ属、シノリゾビウム属、リゾビ
ウム属、ノストック属、マイコバクテリウム属、アゾス
ピリウム属、パスツレラ属、バチルス属、またはエシェ
リヒア属に属する微生物、より具体的にはパスツレラ・
マルトシダ Pm70株(ミネソタ大学より分与可能)、バチ
ルス・サチルス168株 (ATCC23857)、またはエシェリヒ
ア・コリK5株(ATCC23508)等をあげることができる。
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を発現する形質転換
体の作製について説明する。 （１）ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡの調製 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡは、該酵素活性を有する微生物であればいずれの微
生物を用いても調製できる。該微生物として具体的には
サルモネラ属、ビブリオ属、ストレプトコッカス属、キ
ャンピロバクター属、パラメシウム属、ラクトコッカス
属、アグロバクテリウム属、アキフェックス属、シネコ
システィス属、カウロバクター属、ブルセラ属、バーク
ホルダー属、ザイモモナス属、バクテロイデス属、メソ
リゾビウム属、キシレラ属、シノリゾビウム属、リゾビ
ウム属、ノストック属、マイコバクテリウム属、アゾス
ピリウム属、パスツレラ属、バチルス属、またはエシェ
リヒア属に属する微生物、より具体的にはパスツレラ・
マルトシダ Pm70株(ミネソタ大学より分与可能)、バチ
ルス・サチルス168株 (ATCC23857)、またはエシェリヒ
ア・コリK5株(ATCC23508)等をあげることができる。
【００２１】パスツレラ属、バチルス属、またはエシェ
リヒア属に属する微生物は、公知の方法により培養でき
る。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）により、
該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断
片は、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有するとされている蛋
白質をコードする、公知のＤＮＡの塩基配列に基づいた
プライマーセットを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし
たＰＣＲ[PCR Protocols, Hamana Press (1993)]により
取得できる。上記のようにして取得できるＤＮＡとして
は、配列番号４、５および６で表される塩基配列を有す
るＤＮＡをあげることができる。
リヒア属に属する微生物は、公知の方法により培養でき
る。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコ
ールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）により、
該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断
片は、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有するとされている蛋
白質をコードする、公知のＤＮＡの塩基配列に基づいた
プライマーセットを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし
たＰＣＲ[PCR Protocols, Hamana Press (1993)]により
取得できる。上記のようにして取得できるＤＮＡとして
は、配列番号４、５および６で表される塩基配列を有す
るＤＮＡをあげることができる。
【００２２】また、公知の塩基配列に基づいて設計され
た合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション
法などにより目的とするＤＮＡを取得することもでき
る。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡは合成ＤＮＡを用いて常法[PCR Protoco
ls, Hamana Press (1993)]に従ってＰＣＲ法などによ
り、人工的に合成することも可能である。 （２）ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡの作製 上記（１）で調製した本発明のＤＮＡをそのまま、ある
いは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクター
に連結する。
た合成ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション
法などにより目的とするＤＮＡを取得することもでき
る。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡは合成ＤＮＡを用いて常法[PCR Protoco
ls, Hamana Press (1993)]に従ってＰＣＲ法などによ
り、人工的に合成することも可能である。 （２）ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコード
するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡの作製 上記（１）で調製した本発明のＤＮＡをそのまま、ある
いは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクター
に連結する。
【００２３】該ＤＮＡを連結するベクターとしては、大
腸菌Ｋ１２株中で自立複製可能なベクターであればファ
ージベクター、プラスミドベクター等いずれも使用可能
であるが、具体的には、ZAP Express[ストラタジーン社
製、Strategies, 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK
(+)[ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 94
94 (1989)]、λzap II（ストラタジーン社製）、λgt1
0、λgt11[DNA Cloning, APractical Approach, 1, 49
(1985)]、λ TriplEx（クローンテック社製）、λExCel
l（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製） 、pU
C18[Gene, 33, 103(1985)]等をあげることができる。
腸菌Ｋ１２株中で自立複製可能なベクターであればファ
ージベクター、プラスミドベクター等いずれも使用可能
であるが、具体的には、ZAP Express[ストラタジーン社
製、Strategies, 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK
(+)[ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 94
94 (1989)]、λzap II（ストラタジーン社製）、λgt1
0、λgt11[DNA Cloning, APractical Approach, 1, 49
(1985)]、λ TriplEx（クローンテック社製）、λExCel
l（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製） 、pU
C18[Gene, 33, 103(1985)]等をあげることができる。
【００２４】該ベクターに（１）で取得した本発明のＤ
ＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いる
エシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微
生物であればいずれでも用いることができるが、具体的
には、Escherichia coli XL1-Blue MRF' [ストラタジー
ン社製、Strategies, 5, 81 (1992)]、Escherichia col
i C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]、Escherichia col
i Y1088 [Science, 222, 778 (1983)]、Escherichia co
li Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、Escherichia c
oli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、Escheric
hia coli K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]、Esch
erichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等をあげ
ることができる。
ＮＡを連結して得られる組換え体ＤＮＡの宿主に用いる
エシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微
生物であればいずれでも用いることができるが、具体的
には、Escherichia coli XL1-Blue MRF' [ストラタジー
ン社製、Strategies, 5, 81 (1992)]、Escherichia col
i C600 [Genetics, 39, 440 (1954)]、Escherichia col
i Y1088 [Science, 222, 778 (1983)]、Escherichia co
li Y1090 [Science, 222, 778 (1983)]、Escherichia c
oli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)]、Escheric
hia coli K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)]、Esch
erichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等をあげ
ることができる。
【００２５】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレ
ーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等
をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-2483942）、エレクトロポレ
ーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等
をあげることができる。
【００２６】上記のようにして得られた形質転換体から
組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本
発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基
配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例
えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5
463 (1977)]またはABI PRISM 3700 DNAシーケンサ（ア
プライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置
を用いることができる。
組換え体ＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本
発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基
配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例
えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5
463 (1977)]またはABI PRISM 3700 DNAシーケンサ（ア
プライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置
を用いることができる。
【００２７】配列番号４で表される塩基配列を有するプ
ラスミドであるpPM0776SKは、平成１４年２月２６日付
けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンター、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第
６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７
９５２として寄託されている。 （３） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産
する能力を有する形質転換体の作製 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力
を有する形質転換体の作製は、モレキュラー・クローニ
ング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキ
ュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例
えば以下の方法により、行うことができる。
ラスミドであるpPM0776SKは、平成１４年２月２６日付
けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンター、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央第
６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７
９５２として寄託されている。 （３） ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産
する能力を有する形質転換体の作製 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力
を有する形質転換体の作製は、モレキュラー・クローニ
ング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキ
ュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例
えば以下の方法により、行うことができる。
【００２８】即ち、上記で取得されたＤＮＡを基にし
て、必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当
な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発
現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体Ｄ
ＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクター
に適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体
を作製することができる。
て、必要に応じて該蛋白質をコードする部分を含む適当
な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発
現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体Ｄ
ＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクター
に適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体
を作製することができる。
【００２９】宿主細胞としては、細菌、酵母等、目的と
する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いるこ
とができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可
能で、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる
位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
する遺伝子を発現できるものであればいずれも用いるこ
とができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可
能で、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる
位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３０】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物
中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボ
ソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より
構成されたベクターであることが好ましい。プロモータ
ーを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
場合は、ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物
中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボ
ソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より
構成されたベクターであることが好ましい。プロモータ
ーを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３１】発現ベクターとしては、例えば、pHelix1
（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280
（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pQE-8（キアゲン社製）、pKYP10（特開昭58-1106
00）、pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (198
4)]、pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、p
GEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82, 4306 (198
5)]、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、p
Trs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)
より調製]、pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32
（FERM BP-5408）より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pG
HA2 [Escherichia coli IGHA2（FERM B-400）より調
製、特開昭60-221091]、pGKA2 [Escherichia coli IGKA
2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091]、pTerm
2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB1
10、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392
(1990)]、pGEX（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製）、pETシステム（ノバジェン社製）等をあげる
ことができる。
（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（ア
マシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280
（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社
製）、pQE-8（キアゲン社製）、pKYP10（特開昭58-1106
00）、pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (198
4)]、pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、p
GEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 82, 4306 (198
5)]、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、p
Trs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30(FERM BP-5407)
より調製]、pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32
（FERM BP-5408）より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pG
HA2 [Escherichia coli IGHA2（FERM B-400）より調
製、特開昭60-221091]、pGKA2 [Escherichia coli IGKA
2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091]、pTerm
2（US4686191、US4939094、US5160735）、pSupex、pUB1
10、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392
(1990)]、pGEX（アマシャム・ファルマシア・バイオテ
ク社製）、pETシステム（ノバジェン社製）等をあげる
ことができる。
【００３２】プロモーターとしては、宿主細胞中で機能
するものであればいかなるものでもよい。例えば、trp
プロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモー
ター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌や
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×
２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプ
ロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ
ー等も用いることができる。
するものであればいかなるものでもよい。例えば、trp
プロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモー
ター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌や
ファージ等に由来するプロモーターをあげることができ
る。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×
２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプ
ロモーターのように人為的に設計改変されたプロモータ
ー等も用いることができる。
【００３３】リボソーム結合配列であるシャイン−ダル
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいて
は、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも
必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配
置することが好ましい。
ガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当
な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用
いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいて
は、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも
必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配
置することが好ましい。
【００３４】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY32
76、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Escherichia coli GI698、Escherichia coli TB1、Serr
atia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefa
ciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bac
illus amyloliquefaciens、Corynebacterium ammoniage
nes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevi
bacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacteriu
m flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、C
orynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacteri
um acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammo
niaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomo
nas sp. D-0110等をあげることができる。
チア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス
属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-B
lue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli D
H1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY32
76、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM10
9、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.4
9、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、
Escherichia coli GI698、Escherichia coli TB1、Serr
atia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefa
ciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bac
illus amyloliquefaciens、Corynebacterium ammoniage
nes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevi
bacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacteriu
m flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、C
orynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacteri
um acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammo
niaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomo
nas sp. D-0110等をあげることができる。
【００３５】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 17,
107 (1982)やMol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)に記
載の方法等をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]、プ
ロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 17,
107 (1982)やMol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)に記
載の方法等をあげることができる。
【００３６】酵母を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp2
4（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等
をあげることができる。プロモーターとしては、酵母菌
株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよ
く、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子の
プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモー
ター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、gal
1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック
ポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP
1プロモーター等をあげることができる。
現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp2
4（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等
をあげることができる。プロモーターとしては、酵母菌
株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよ
く、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子の
プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモー
ター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、gal
1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック
ポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP
1プロモーター等をあげることができる。
【００３７】宿主細胞としては、Saccharomyces属、Sch
izosaccharomyces属、Kluyveromyces属、Trichosporon
属、Schwanniomyces属、Pichia属、Candida属等に属す
る微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizo
saccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichos
poron pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candidau
tilis等をあげることができる。
izosaccharomyces属、Kluyveromyces属、Trichosporon
属、Schwanniomyces属、Pichia属、Candida属等に属す
る微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizo
saccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichos
poron pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candidau
tilis等をあげることができる。
【００３８】組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enz
ymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (1978)]、酢酸リチウ
ム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげ
ることができる。
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法[Methods Enz
ymol., 194, 182 (1990)]、スフェロプラスト法[Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (1978)]、酢酸リチウ
ム法[J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげ
ることができる。
【００３９】ＵＤＰ−ＧｌｃＡの調製に用いられる上記
で作製された形質転換体の培養は、宿主の培養に用いら
れる通常の方法に従って行うことができる。本発明の製
造法に用いられる形質転換体がエシェリヒア・コリ等の
原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られ
た形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地
として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行え
る培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いても
よい。
で作製された形質転換体の培養は、宿主の培養に用いら
れる通常の方法に従って行うことができる。本発明の製
造法に用いられる形質転換体がエシェリヒア・コリ等の
原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られ
た形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地
として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行え
る培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いても
よい。
【００４０】炭素源としては、該形質転換体が資化し得
るものであればよく、グルコース、フラクトース、スク
ロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデン
プン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の
有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類
等を用いることができる。窒素源としては、アンモニ
ア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸
のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解
物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることがで
きる。
るものであればよく、グルコース、フラクトース、スク
ロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデン
プン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の
有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類
等を用いることができる。窒素源としては、アンモニ
ア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸
のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解
物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることがで
きる。
【００４１】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通
常 16時間〜 7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保
持することが好ましい。 pHの調整は、無機または有機
の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニ
アなどを用いて行う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通
常 16時間〜 7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保
持することが好ましい。 pHの調整は、無機または有機
の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニ
アなどを用いて行う。
【００４２】また、培養中必要に応じて、アンピシリ
ン、テトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生
物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導
性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換し
た微生物を培養するときには、必要に応じてインデュー
サーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモータ
ーを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養
するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド等を、trpプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡ
で形質転換した微生物を培養するときにはインドールア
クリル酸等を培地に添加してもよい。
ン、テトラサイクリンやクロラムフェニコール等の抗生
物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導
性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換し
た微生物を培養するときには、必要に応じてインデュー
サーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモータ
ーを用いた組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物を培養
するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド等を、trpプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡ
で形質転換した微生物を培養するときにはインドールア
クリル酸等を培地に添加してもよい。
【００４３】このようにして得られた形質転換体の培養
物または該培養物を種々処理した培養物の処理物、およ
びＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−Ｇｌｃを生産す
る能力を有する微生物の培養物または該培養物を種々処
理した培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、
ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、
該水性媒体中にＵＤＰ−ＧｌｃＡを精製蓄積させること
でＵＤＰ−ＧｌｃＡを製造することができる。
物または該培養物を種々処理した培養物の処理物、およ
びＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−Ｇｌｃを生産す
る能力を有する微生物の培養物または該培養物を種々処
理した培養物の処理物を酵素源として用い、該酵素源、
ＵＴＰの前駆物質および糖を水性媒体中に存在せしめ、
該水性媒体中にＵＤＰ−ＧｌｃＡを精製蓄積させること
でＵＤＰ−ＧｌｃＡを製造することができる。
【００４４】ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−Ｇｌ
ｃを生産する能力を有する微生物としては、該能力を有
する微生物であれば、いずれも本発明の製造法に利用す
ることができるが、好ましくはエシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属およびサッカロマイセス属に属する微生
物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスおよびサッカロマイセス・セ
レビシエなどをあげることができる。
ｃを生産する能力を有する微生物としては、該能力を有
する微生物であれば、いずれも本発明の製造法に利用す
ることができるが、好ましくはエシェリヒア属、コリネ
バクテリウム属およびサッカロマイセス属に属する微生
物、より好ましくはエシェリヒア・コリ、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスおよびサッカロマイセス・セ
レビシエなどをあげることができる。
【００４５】また、ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)また
はグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)、ホスホグルコムター
ゼ(EC 2.7.5.1)、グルコース−１−リン酸ウリジルト
ランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)およびピロホスファタ
ーゼ(EC 3.6.1.1)から選ばれる１以上の酵素活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株も該微生物とし
て用いることができる。該形質転換としては、エシェリ
ヒア・コリ由来のグルコース−１−リン酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼおよびピロホスファターゼ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ(pNT12)を保有するエシェリヒア・コリ
をあげることができる(WO98/12343)。
はグルコキナーゼ(EC 2.7.1.2)、ホスホグルコムター
ゼ(EC 2.7.5.1)、グルコース−１−リン酸ウリジルト
ランスフェラーゼ(EC 2.7.7.9)およびピロホスファタ
ーゼ(EC 3.6.1.1)から選ばれる１以上の酵素活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株も該微生物とし
て用いることができる。該形質転換としては、エシェリ
ヒア・コリ由来のグルコース−１−リン酸ウリジルトラ
ンスフェラーゼおよびピロホスファターゼ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ(pNT12)を保有するエシェリヒア・コリ
をあげることができる(WO98/12343)。
【００４６】さらに、本発明のＵＴＰの前駆物質と糖と
からＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物は、
ＵＴＰの前駆体からＵＴＰを生産する能力を有する微生
物と、ＵＴＰと糖からＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を
有する微生物の２種の微生物の組み合わせであってもよ
い。ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物は、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能
力を有する微生物であればいずれも本発明に用いること
ができるが、例えばコリネバクテリウム属およびエシェ
リヒア属に属する微生物、具体的にはコリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスおよびエシェリヒア・コリをあげ
ることができる。
からＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物は、
ＵＴＰの前駆体からＵＴＰを生産する能力を有する微生
物と、ＵＴＰと糖からＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を
有する微生物の２種の微生物の組み合わせであってもよ
い。ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能力を有す
る微生物は、ＵＴＰの前駆物質からＵＴＰを生産する能
力を有する微生物であればいずれも本発明に用いること
ができるが、例えばコリネバクテリウム属およびエシェ
リヒア属に属する微生物、具体的にはコリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスおよびエシェリヒア・コリをあげ
ることができる。
【００４７】ＵＴＰと糖からＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する
能力を有する微生物は、ＵＴＰと糖からＵＤＰ−Ｇｌｃ
を生産する能力を有する微生物であれば、いずれも本発
明に用いることができるが、例えばヘキソキナーゼま
たはグルコキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、グル
コース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび
ピロホスファターゼから選ばれる１以上の酵素活性を
遺伝子組換え技術により増強した形質転換株をあげるこ
とができる。より具体的には、エシェリヒア・コリ由来
のグルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ
およびピロホスファターゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
(pNT12)を保有するエシェリヒア・コリをあげることが
できる(WO98/12343)。
能力を有する微生物は、ＵＴＰと糖からＵＤＰ−Ｇｌｃ
を生産する能力を有する微生物であれば、いずれも本発
明に用いることができるが、例えばヘキソキナーゼま
たはグルコキナーゼ、ホスホグルコムターゼ、グル
コース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼおよび
ピロホスファターゼから選ばれる１以上の酵素活性を
遺伝子組換え技術により増強した形質転換株をあげるこ
とができる。より具体的には、エシェリヒア・コリ由来
のグルコース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ
およびピロホスファターゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
(pNT12)を保有するエシェリヒア・コリをあげることが
できる(WO98/12343)。
【００４８】本発明の製造法に用いられるＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換株が、上記ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−Ｇ
ｌｃを生産する能力を有する場合は、該形質転換株のみ
を酵素源として用い、ＵＤＰ−ＧｌｃＡを製造すること
ができる。本発明の製造法に用いられるＵＴＰの前駆物
質としてはオロット酸、オロチジン、ウリジン、ウラシ
ルおよびウリジン−５’−一リン酸等をあげることがで
きる。該前駆物質は、精製品および該前駆物質の塩なら
びに夾雑物が反応を阻害しない限り、微生物により生産
された該前駆物質を含有する培養液および該培養液から
の粗精製物などを用いることができる。該前駆物質は0.
1 mmol/l〜1.0 mol/l、好ましくは0.01〜0.5 mol/lの濃
度で用いられる。
ｃＤＨ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質
転換株が、上記ＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤＰ−Ｇ
ｌｃを生産する能力を有する場合は、該形質転換株のみ
を酵素源として用い、ＵＤＰ−ＧｌｃＡを製造すること
ができる。本発明の製造法に用いられるＵＴＰの前駆物
質としてはオロット酸、オロチジン、ウリジン、ウラシ
ルおよびウリジン−５’−一リン酸等をあげることがで
きる。該前駆物質は、精製品および該前駆物質の塩なら
びに夾雑物が反応を阻害しない限り、微生物により生産
された該前駆物質を含有する培養液および該培養液から
の粗精製物などを用いることができる。該前駆物質は0.
1 mmol/l〜1.0 mol/l、好ましくは0.01〜0.5 mol/lの濃
度で用いられる。
【００４９】本発明の製造法に用いられる糖としてはグ
ルコース、フラクトース等をあげることができる。該糖
は、精製品を用いてもよいし、これらを含有するもの
で、夾雑物が反応を阻害しないものであればいずれも用
いることができる。糖は反応開始時に一括して添加して
もよいし、反応中分割して、あるいは連続的に添加する
こともでき、0.1 mmol/l〜2.0 mol/lの濃度で用いられ
る。
ルコース、フラクトース等をあげることができる。該糖
は、精製品を用いてもよいし、これらを含有するもの
で、夾雑物が反応を阻害しないものであればいずれも用
いることができる。糖は反応開始時に一括して添加して
もよいし、反応中分割して、あるいは連続的に添加する
こともでき、0.1 mmol/l〜2.0 mol/lの濃度で用いられ
る。
【００５０】培養物の処理物としては、培養物の濃縮
物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処
理物、または該菌体の固定化物などをあげることができ
る。ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成において用いられる酵素源
は、該酵素源としてＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤ
Ｐ−Ｇｌｃを生産する能力とＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を
有する蛋白質を生産する能力の両方を有する形質転換体
を用いる場合は、該単一の形質転換体の培養物または該
培養物の処理物の活性として、ＵＴＰの前駆物質と糖
とからＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物の
培養物または該培養物の処理物とＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の
培養物または該培養物の処理物を用いる場合は、各々の
微生物および形質転換体の培養物または該培養物の処理
物を合わせて用いたときの活性として、37℃で1分間に1
μmolのＵＤＰ−ＧｌｃＡを生成することのできる活性
を1単位（U）として、0.1 mU/l〜10,000 U/l であり、
好ましくは 1 mU/l〜1,000 U/lの濃度で用いる。
物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌
体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界
面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処
理物、または該菌体の固定化物などをあげることができ
る。ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成において用いられる酵素源
は、該酵素源としてＵＴＰの前駆物質と糖とからＵＤ
Ｐ−Ｇｌｃを生産する能力とＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を
有する蛋白質を生産する能力の両方を有する形質転換体
を用いる場合は、該単一の形質転換体の培養物または該
培養物の処理物の活性として、ＵＴＰの前駆物質と糖
とからＵＤＰ−Ｇｌｃを生産する能力を有する微生物の
培養物または該培養物の処理物とＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活
性を有する蛋白質を生産する能力を有する形質転換体の
培養物または該培養物の処理物を用いる場合は、各々の
微生物および形質転換体の培養物または該培養物の処理
物を合わせて用いたときの活性として、37℃で1分間に1
μmolのＵＤＰ−ＧｌｃＡを生成することのできる活性
を1単位（U）として、0.1 mU/l〜10,000 U/l であり、
好ましくは 1 mU/l〜1,000 U/lの濃度で用いる。
【００５１】ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成において用いられ
る水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、
ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノー
ル、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどの
エステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドな
どのアミド類などをあげることができる。また、酵素源
として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いるこ
とができる。
る水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、
ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノー
ル、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどの
エステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドな
どのアミド類などをあげることができる。また、酵素源
として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いるこ
とができる。
【００５２】ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成において、必要に
応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシ
ルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）な
どの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウ
ム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニ
ウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社
製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコ
シネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチ
ルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの
三級アミン類など、ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成を促進する
ものであればいずれでもよく、１種または数種を混合し
て使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50
g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレ
ン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチ
ルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられ
る。
応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシ
ルアミン（例えばナイミーンS-215、日本油脂社製）な
どの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウ
ム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニ
ウムクロライド（例えばカチオンF2-40E、日本油脂社
製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコ
シネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチ
ルアミン（例えば三級アミンFB、日本油脂社製）などの
三級アミン類など、ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成を促進する
ものであればいずれでもよく、１種または数種を混合し
て使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50
g/lの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレ
ン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチ
ルなどが挙げられ、通常0.1〜50 ml/lの濃度で用いられ
る。
【００５３】上記ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成反応におい
て、必要に応じてＮＡＤ、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2等を添
加することができる。ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成反応は水
性媒体中、 pH 5〜10、好ましくは pH 6〜8、20〜50℃
の条件で1〜96時間行う。水性媒体中に生成したＵＤＰ
−ＧｌｃＡの定量は公知の方法に準じて行うことができ
る[WO 01/23400、J. Org. Chem., 56, 5603 (1991)]。
て、必要に応じてＮＡＤ、ＭｇＣｌ2、ＭｎＣｌ2等を添
加することができる。ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生成反応は水
性媒体中、 pH 5〜10、好ましくは pH 6〜8、20〜50℃
の条件で1〜96時間行う。水性媒体中に生成したＵＤＰ
−ＧｌｃＡの定量は公知の方法に準じて行うことができ
る[WO 01/23400、J. Org. Chem., 56, 5603 (1991)]。
【００５４】反応液中に生成したＵＤＰ−ＧｌｃＡは、
イオン交換樹脂やゲルろ過などを用いる通常の方法によ
って単離精製することができ、例えば、J. Org. Chem.,
56,5603 (1991)に記載の方法に準じて単離精製するこ
とができる。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
イオン交換樹脂やゲルろ過などを用いる通常の方法によ
って単離精製することができ、例えば、J. Org. Chem.,
56,5603 (1991)に記載の方法に準じて単離精製するこ
とができる。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
【００５５】
【実施例】実施例１ Pasteurella multocida由来のＵ
ＤＰ−ＧｌｃＤＨを生産する形質転換株の造成Pasteurella multocida Pm70株(ミネソタ大学より分与)
を公知の方法[FEMS Microbiol. Lett., 166, 289 (199
8)]に従って培養した。培養後、カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されて
いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製した。
ＤＰ−ＧｌｃＤＨを生産する形質転換株の造成Pasteurella multocida Pm70株(ミネソタ大学より分与)
を公知の方法[FEMS Microbiol. Lett., 166, 289 (199
8)]に従って培養した。培養後、カレント・プロトコー
ルズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されて
いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製した。
【００５６】Pasteurella multocidaのＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＤＨ活性を有する蛋白質をコードするとされているpm07
76遺伝子の塩基配列[Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 346
0 (2001)]に基づき、配列番号７および配列番号８で表
される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し、
該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Pasteurell
a multocida Pm70株の染色体ＤＮＡを鋳型として以下の
方法によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
0.1μg、プライマー各 0.5μmol/l、Ｐｆｕ ＤＮＡポ
リメラーゼ（ストラタジーン社製）2.5 units、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社
製）4μl、deoxy NTP 各200μmol/lを含む反応液40μl
を用い、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間を1工
程とする反応を30回繰り返すことにより行い、約1.2kb
のＰＣＲ産物を取得した。
ＤＨ活性を有する蛋白質をコードするとされているpm07
76遺伝子の塩基配列[Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 346
0 (2001)]に基づき、配列番号７および配列番号８で表
される塩基配列を有するＤＮＡをパーセプティブ・バイ
オシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成機を用いて合成し、
該ＤＮＡをプライマーセットとして用いて、Pasteurell
a multocida Pm70株の染色体ＤＮＡを鋳型として以下の
方法によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ
0.1μg、プライマー各 0.5μmol/l、Ｐｆｕ ＤＮＡポ
リメラーゼ（ストラタジーン社製）2.5 units、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社
製）4μl、deoxy NTP 各200μmol/lを含む反応液40μl
を用い、94℃で1分間、37℃で2分間、72℃で3分間を1工
程とする反応を30回繰り返すことにより行い、約1.2kb
のＰＣＲ産物を取得した。
【００５７】該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳
動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの
反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添
加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層
に 2 倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に3
0分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。
動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの
反応液と等量のＴＥ飽和フェノール／クロロホルムを添
加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層
に 2 倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に3
0分間放置した。該液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得
た。
【００５８】該ＤＮＡの沈殿を20μl のＴＥ[10 mmol/l
Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA (pH8.0)]に溶解した。該溶
解液 5μlを用い、ＤＮＡを制限酵素ClaIおよびBamHIで
切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分
離した後、ジーンクリーンIIキット（フナコシ社より購
入）によりＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ遺伝子を含む 1.2 kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA (pH8.0)]に溶解した。該溶
解液 5μlを用い、ＤＮＡを制限酵素ClaIおよびBamHIで
切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分
離した後、ジーンクリーンIIキット（フナコシ社より購
入）によりＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ遺伝子を含む 1.2 kbの
ＤＮＡ断片を回収した。
【００５９】pBluescriptII SK(+) 0.2 mg を制限酵素C
laIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に 3.0 kbのＤＮＡ断片を
回収した。該 1.2 kbおよび 3.0 kbの断片をライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、16℃で16時間、連
結反応を行った。
laIおよびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りＤＮＡ断片を分離し、同様に 3.0 kbのＤＮＡ断片を
回収した。該 1.2 kbおよび 3.0 kbの断片をライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いて、16℃で16時間、連
結反応を行った。
【００６０】該連結反応液を用いてEscherichia coli N
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地（バ
クトトリプトン 10 g/l、酵母エキス 10 g/l、塩化ナト
リウム 5 g/l、寒天 15g/l）に塗布後、30℃で一晩培養
した。生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公
知の方法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpPM0
776SKと命名した。pPM0776SKは、平成１４年２月２６日
付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央
第６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−
７９２５として寄託されている。
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地（バ
クトトリプトン 10 g/l、酵母エキス 10 g/l、塩化ナト
リウム 5 g/l、寒天 15g/l）に塗布後、30℃で一晩培養
した。生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公
知の方法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドの
構造を制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpPM0
776SKと命名した。pPM0776SKは、平成１４年２月２６日
付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１ 中央
第６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−
７９２５として寄託されている。
【００６１】次に、pPM0776SK 0.2μg を制限酵素ClaI
およびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動により
ＤＮＡ断片を分離し、1.2 kbのＤＮＡ断片を回収した。
pPAC31 0.2μg を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に 5.5 kbのＤＮＡ断片を回収した。該1.2 kbおよび
5.5 kbの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
およびBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動により
ＤＮＡ断片を分離し、1.2 kbのＤＮＡ断片を回収した。
pPAC31 0.2μg を制限酵素ClaIおよびBamHIで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同
様に 5.5 kbのＤＮＡ断片を回収した。該1.2 kbおよび
5.5 kbの断片をライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
【００６２】該連結反応液を用いてEscherichia coli N
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、30℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより前述の公知の方法に準じてプラスミドを抽
出し、発現プラスミドであるpPT104を取得した。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
M522株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質
転換体をアンピシリン50μg/mlを含むＬＢ寒天培地に塗
布後、30℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体の
コロニーより前述の公知の方法に準じてプラスミドを抽
出し、発現プラスミドであるpPT104を取得した。該プラ
スミドの構造を制限酵素消化により確認した（図１）。
【００６３】実施例２ ＵＤＰ−ＧｌｃＡの生産
実施例1で得られたEscherichia coli NM522/pPT104株お
よびグルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼおよびピロホスファターゼを発現するEscherichia
coli NM522/pNT12株 (WO98/12343)をアンピシリン 50μ
g/mlを含むＬＢ培地 125 mlの入った 1Ｌ容バッフル付
き三角フラスコに接種し、28℃で 220 rpmの条件で 17
時間培養した。該培養液 125 mlをアンピシリン50μg/m
l を含むＴＢ培地 [グルコース10 g/l、バクトトリプト
ン（ディフコ社製） 12 g/l 、酵母エキス（ディフコ社
製） 24 g/l 、KH2PO4 2.3 g/l 、K2HPO4 12.5 g/l （p
H無調整）] 2.5 Lの入った5 L容培養槽に接種し、600 r
pm、通気量 2.5 L/分の条件で 30℃で4時間培養した
後、40℃で3時間培養を行った。培養中、28％アンモニ
ア水を用いて培養液のpHを7.0に維持し、必要に応じて
グルコースを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
よびグルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラ
ーゼおよびピロホスファターゼを発現するEscherichia
coli NM522/pNT12株 (WO98/12343)をアンピシリン 50μ
g/mlを含むＬＢ培地 125 mlの入った 1Ｌ容バッフル付
き三角フラスコに接種し、28℃で 220 rpmの条件で 17
時間培養した。該培養液 125 mlをアンピシリン50μg/m
l を含むＴＢ培地 [グルコース10 g/l、バクトトリプト
ン（ディフコ社製） 12 g/l 、酵母エキス（ディフコ社
製） 24 g/l 、KH2PO4 2.3 g/l 、K2HPO4 12.5 g/l （p
H無調整）] 2.5 Lの入った5 L容培養槽に接種し、600 r
pm、通気量 2.5 L/分の条件で 30℃で4時間培養した
後、40℃で3時間培養を行った。培養中、28％アンモニ
ア水を用いて培養液のpHを7.0に維持し、必要に応じて
グルコースを添加した。該培養液を遠心分離し湿菌体を
取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存するこ
とが可能で、使用前に解凍して用いることができた。
【００６４】Corynebacterium ammoniagenes ATCC21170
株をグルコース 50 g/l 、ポリペプトン（日本製薬社
製） 10 g/l 、酵母エキス（オリエンタル酵母社製） 1
0 g/l、尿素 5 g/l 、(NH4)2SO4 5 g/l 、KH2PO4 1 g/l
、K2HPO4 3 g/l 、MgSO4・7H2O 1 g/l 、CaCl2・2H2O
0.1 g/l 、FeSO4・7H2O 10 mg/l 、ZnSO4・7H2O 10 mg/
l、MnSO4・4〜6H2O 20 mg/l 、Ｌ−システイン 20 mg/l
、Ｄ−パントテン酸カルシウム 10 mg/l 、ビタミンＢ
１ 5 mg/l 、ニコチン酸 5 mg/l 、およびビオチン30μ
g/l （10 mol/l NaOHで pH 7.2に調整）の組成からなる
液体培地 25 mlの入った 300 ml容バッフル付き三角フ
ラスコに接種し、28℃、220 rpmの条件で、24時間培養
した。
株をグルコース 50 g/l 、ポリペプトン（日本製薬社
製） 10 g/l 、酵母エキス（オリエンタル酵母社製） 1
0 g/l、尿素 5 g/l 、(NH4)2SO4 5 g/l 、KH2PO4 1 g/l
、K2HPO4 3 g/l 、MgSO4・7H2O 1 g/l 、CaCl2・2H2O
0.1 g/l 、FeSO4・7H2O 10 mg/l 、ZnSO4・7H2O 10 mg/
l、MnSO4・4〜6H2O 20 mg/l 、Ｌ−システイン 20 mg/l
、Ｄ−パントテン酸カルシウム 10 mg/l 、ビタミンＢ
１ 5 mg/l 、ニコチン酸 5 mg/l 、およびビオチン30μ
g/l （10 mol/l NaOHで pH 7.2に調整）の組成からなる
液体培地 25 mlの入った 300 ml容バッフル付き三角フ
ラスコに接種し、28℃、220 rpmの条件で、24時間培養
した。
【００６５】該培養液 20 mlを上記と同一組成の液体培
地 250 mlの入った2Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接
種し、28℃、 220 rpm 条件で、24時間培養した。得ら
れた培養液を種培養液として用いた。該種培養液 250 m
lを、グルコース 150 g/l、肉エキス（極東製薬社製）
5 g/l、KH2PO4 10 g/l 、K2HPO4 10 g/l 、MgSO4・7H2O
10 g/l 、CaCl2・2H2O 0.1 g/l 、FeSO4・7H2O 20 mg/l 、
ZnSO4・7H2O 10 mg/l 、MnSO4・4〜6H2O 20 mg/l （別殺
菌）、β−アラニン15 mg/l （別殺菌）、Ｌ−システイ
ン 20 mg/l 、ビオチン100μg/l、尿素 2 g/l 、および
ビタミンＢ１ 5 mg/l（別殺菌）（10 mol/l NaOHで pH
7.2に調整）の組成からなる液体培地2.25 Lの入った5 L
容培養槽に接種し、32℃、600 rpm、通気量 2.5 L/分の
条件で24時間培養を行った。培養中、28％アンモニア水
を用いて、培養液のpHを6.8に維持した。
地 250 mlの入った2Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接
種し、28℃、 220 rpm 条件で、24時間培養した。得ら
れた培養液を種培養液として用いた。該種培養液 250 m
lを、グルコース 150 g/l、肉エキス（極東製薬社製）
5 g/l、KH2PO4 10 g/l 、K2HPO4 10 g/l 、MgSO4・7H2O
10 g/l 、CaCl2・2H2O 0.1 g/l 、FeSO4・7H2O 20 mg/l 、
ZnSO4・7H2O 10 mg/l 、MnSO4・4〜6H2O 20 mg/l （別殺
菌）、β−アラニン15 mg/l （別殺菌）、Ｌ−システイ
ン 20 mg/l 、ビオチン100μg/l、尿素 2 g/l 、および
ビタミンＢ１ 5 mg/l（別殺菌）（10 mol/l NaOHで pH
7.2に調整）の組成からなる液体培地2.25 Lの入った5 L
容培養槽に接種し、32℃、600 rpm、通気量 2.5 L/分の
条件で24時間培養を行った。培養中、28％アンモニア水
を用いて、培養液のpHを6.8に維持した。
【００６６】該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが可
能で、使用前に解凍して用いることができた。Escheric
hia coli NM522/pNT12株湿菌体 25 g/l 、Escherichia
coli NM522/pPT104株湿菌体 25 g/l 、Corynebacterium
ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 150 g/l 、グルコー
ス 100 g/l 、オロット酸20 g/l 、KH2PO4 15 g/l 、Mg
SO4・7H2O 5 g/l 、フィチン酸 5 g/l 、ナイミーンS-21
5 4 g/l、キシレン 10 ml/lの組成からなる反応液 30 m
lを 200 ml容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティッ
ク・スターラーにて攪拌（900 rpm）し、32℃で23 時間
反応を行った。反応中4 mol/l NaOHを用いて、該反応液
のpH を7.2に維持し、必要に応じてグルコース、KH2PO4
を添加した。
た。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが可
能で、使用前に解凍して用いることができた。Escheric
hia coli NM522/pNT12株湿菌体 25 g/l 、Escherichia
coli NM522/pPT104株湿菌体 25 g/l 、Corynebacterium
ammoniagenes ATCC21170株湿菌体 150 g/l 、グルコー
ス 100 g/l 、オロット酸20 g/l 、KH2PO4 15 g/l 、Mg
SO4・7H2O 5 g/l 、フィチン酸 5 g/l 、ナイミーンS-21
5 4 g/l、キシレン 10 ml/lの組成からなる反応液 30 m
lを 200 ml容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティッ
ク・スターラーにて攪拌（900 rpm）し、32℃で23 時間
反応を行った。反応中4 mol/l NaOHを用いて、該反応液
のpH を7.2に維持し、必要に応じてグルコース、KH2PO4
を添加した。
【００６７】反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにて分
析し、反応液中に34mM (22g/l)のＵＤＰ−ＧｌｃＡが生
成蓄積していることを確認した。ＨＰＬＣによる分析条
件を以下に示す。 分析条件 カラム：YMC-Pack ODS-AQ(150mm × 4.6mm) 溶離液：0.5M KH2PO4 流速：1.0ml/min 検出：UV 262nm
析し、反応液中に34mM (22g/l)のＵＤＰ−ＧｌｃＡが生
成蓄積していることを確認した。ＨＰＬＣによる分析条
件を以下に示す。 分析条件 カラム：YMC-Pack ODS-AQ(150mm × 4.6mm) 溶離液：0.5M KH2PO4 流速：1.0ml/min 検出：UV 262nm
【００６８】
【発明の効果】本発明により、ＵＤＰ−ＧｌｃＡを効率
的に製造することができる。
的に製造することができる。
【００６９】
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【００７０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
<120> Process for the production of UDP-glucronic acid
<130> H14-0251A4
<140>
<141>
<160> 8
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 390
<212> PRT
<213> Pasteurella multocida
<400> 1
Met Lys Lys Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Tyr Val Gly Leu Ser Asn
1 5 10 15
Ala Val Leu Leu Ala Gln His His Asn Val Ile Leu Leu Asp Ile Asp
20 25 30
Gln Asn Lys Val Asp Leu Ile Asn Asn Lys Lys Ser Pro Ile Thr Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Glu Asp Phe Leu Gln Asn Lys Ser Leu Thr Met Met Ala
50 55 60
Thr Thr Asp Lys Glu Val Ala Leu Lys Asn Ala Asp Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asn Thr Glu Thr Gly Tyr Phe Asn Thr Ser
85 90 95
Thr Val Glu Ala Val Ile Glu Gln Thr Leu Ser Ile Asn Pro Gln Ala
100 105 110
Thr Ile Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Val Gly Phe Thr Glu Asn Met
115 120 125
Arg Glu Lys Phe Asn Thr Pro Asn Leu Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu
130 135 140
Arg Glu Gly Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile
145 150 155 160
Val Gly Ser Thr Ser Tyr Gln Ala Lys Val Phe Ala Asp Met Leu Thr
165 170 175
Gln Cys Ala Arg Lys Lys Asp Val Thr Val Leu Phe Thr His Asn Thr
180 185 190
Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn Thr Tyr Leu Ala Met Arg
195 200 205
Val Ala Phe Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr Ala Ser Leu His His Leu
210 215 220
Asn Thr Lys Asp Ile Ile Asn Gly Ile Ser Thr Asp Pro Arg Ile Gly
225 230 235 240
Thr His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr Cys Leu Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Pro Gln Asn
260 265 270
Leu Ile Glu Ala Ile Val Lys Ser Asn Glu Thr Arg Lys Arg Phe Ile
275 280 285
Thr His Asp Val Leu Asn Lys Lys Pro Lys Thr Val Gly Ile Tyr Arg
290 295 300
Leu Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ala Ser Ala Ile Leu
305 310 315 320
Asp Ile Met Pro His Leu Lys Glu Asn Gly Val Glu Ile Val Ile Tyr
325 330 335
Glu Pro Thr Leu Asn Gln Gln Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Val Ile Asn
340 345 350
Gln Leu Ser Glu Phe Ile Asn Arg Ser Asp Val Ile Leu Ala Asn Arg
355 360 365
Ser Glu Pro Asp Leu Asn Gln Cys Ser His Lys Ile Tyr Thr Arg Asp
370 375 380
Ile Phe Gly Gly Asp Ala
385 390
<210> 2
<211> 461
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
Met Lys Lys Ile Ala Val Ile Gly Thr Gly Tyr Val Gly Leu Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Phe Ala Glu Ile Gly Asn Lys Val Val Cys Cys Asp Ile
20 25 30
Asp Glu Ser Lys Ile Arg Ser Leu Lys Asn Gly Val Ile Pro Ile Tyr
35 40 45
Glu Pro Gly Leu Ala Asp Leu Val Glu Lys Asn Val Leu Asp Gln Arg
50 55 60
Leu Thr Phe Thr Asn Asp Ile Pro Ser Ala Ile Arg Ala Ser Asp Ile
65 70 75 80
Ile Tyr Ile Ala Val Gly Thr Pro Met Ser Lys Thr Gly Glu Ala Asp
85 90 95
Leu Thr Tyr Val Lys Ala Ala Ala Lys Thr Ile Gly Glu His Leu Asn
100 105 110
Gly Tyr Lys Val Ile Val Asn Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Thr Gly
115 120 125
Lys Leu Val Gln Ser Ile Val Gln Lys Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ser
130 135 140
Phe Asp Val Val Ser Asn Pro Glu Phe Leu Arg Glu Gly Ser Ala Ile
145 150 155 160
His Asp Thr Met Asn Met Glu Arg Ala Val Ile Gly Ser Thr Ser His
165 170 175
Lys Ala Ala Ala Ile Ile Glu Glu Leu His Gln Pro Phe His Ala Pro
180 185 190
Val Ile Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ala Glu Met Ile Lys Tyr Ala Ala
195 200 205
Asn Ala Phe Leu Ala Thr Lys Ile Ser Phe Ile Asn Asp Ile Ala Asn
210 215 220
Ile Cys Glu Arg Val Gly Ala Asp Val Ser Lys Val Ala Asp Gly Val
225 230 235 240
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Gly Arg Lys Phe Leu Lys Ala Gly Ile Gly
245 250 255
Phe Gly Gly Ser Cys Phe Pro Lys Asp Thr Thr Ala Leu Leu Gln Ile
260 265 270
Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Pro Phe Lys Leu Ile Glu Ala Val Ile Glu
275 280 285
Thr Asn Glu Lys Gln Arg Val His Ile Val Asp Lys Leu Leu Thr Val
290 295 300
Met Gly Ser Val Lys Gly Arg Thr Ile Ser Val Leu Gly Leu Ala Phe
305 310 315 320
Lys Pro Asn Thr Asn Asp Val Arg Ser Ala Pro Ala Leu Asp Ile Ile
325 330 335
Pro Met Leu Gln Gln Leu Gly Ala His Val Lys Ala Tyr Asp Pro Ile
340 345 350
Ala Ile Pro Glu Ala Ser Ala Ile Leu Gly Glu Gln Val Glu Tyr Tyr
355 360 365
Thr Asp Val Tyr Ala Ala Met Glu Asp Thr Asp Ala Cys Leu Ile Leu
370 375 380
Thr Asp Trp Pro Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Val Lys Val Lys Thr
385 390 395 400
Leu Leu Lys Gln Pro Val Ile Ile Asp Gly Arg Asn Leu Phe Ser Leu
405 410 415
Glu Glu Met Gln Ala Ala Gly Tyr Ile Tyr His Ser Ile Gly Arg Pro
420 425 430
Ala Val Arg Gly Thr Glu Pro Ser Asp Lys Tyr Phe Pro Gly Leu Pro
435 440 445
Leu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Leu Gly Ser Val Asn Leu
450 455 460
<210> 3
<211> 392
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 3
Met Phe Gly Thr Leu Lys Ile Thr Val Ser Gly Ala Gly Tyr Val Gly
1 5 10 15
Leu Ser Asn Gly Ile Leu Met Ala Gln Asn His Glu Val Val Ala Phe
20 25 30
Asp Thr His Gln Lys Lys Val Asp Leu Leu Asn Asp Lys Leu Ser Pro
35 40 45
Ile Glu Asp Lys Glu Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Thr Lys Ile Leu Asn
50 55 60
Phe Arg Ala Thr Thr Asn Lys Tyr Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Asn Tyr
65 70 75 80
Val Ile Ile Ala Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe
85 90 95
Asp Thr Ser Ser Val Glu Ala Val Ile Arg Asp Val Thr Glu Ile Asn
100 105 110
Pro Asn Ala Ile Met Val Val Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Phe Thr
115 120 125
Lys Thr Ile Lys Glu His Leu Gly Ile Asn Asn Ile Ile Phe Ser Pro
130 135 140
Glu Phe Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu His Pro Ser
145 150 155 160
Arg Ile Ile Ile Gly Glu Cys Ser Glu Arg Ala Glu Arg Leu Ala Val
165 170 175
Leu Phe Gln Glu Gly Ala Ile Lys Gln Asn Ile Pro Val Leu Phe Thr
180 185 190
Asp Ser Thr Glu Ala Glu Ala Ile Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu
195 200 205
Ala Met Arg Val Ala Phe Phe Asn Glu Leu Asp Ser Tyr Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Gly Leu Asn Thr Arg Gln Ile Ile Asp Gly Val Cys Leu Asp Pro
225 230 235 240
Arg Ile Gly Asn Tyr Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr
245 250 255
Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val
260 265 270
Pro Asn Lys Leu Ile Ser Ala Ile Val Asp Ala Asn Arg Thr Arg Lys
275 280 285
Asp Phe Ile Thr Asn Val Ile Leu Lys His Arg Pro Gln Val Val Gly
290 295 300
Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Asp Ser
305 310 315 320
Ser Ile Leu Gly Ile Ile Lys Arg Ile Lys Lys Lys Gly Val Lys Val
325 330 335
Ile Ile Tyr Glu Pro Leu Ile Ser Gly Asp Thr Phe Phe Asn Ser Pro
340 345 350
Leu Glu Arg Glu Leu Ala Ile Phe Lys Gly Lys Ala Asp Ile Ile Ile
355 360 365
Thr Asn Arg Met Ser Glu Glu Leu Asn Asp Val Val Asp Lys Val Tyr
370 375 380
Ser Arg Asp Leu Phe Lys Cys Asp
385 390
<210> 4
<211> 1170
<212> DNA
<213> Pasteurella multocida
<400> 4
atg aag aaa att aca att gct ggg gct ggc tat gtt ggt tta tcc aat 48
Met Lys Lys Ile Thr Ile Ala Gly Ala Gly Tyr Val Gly Leu Ser Asn
1 5 10 15
gca gta tta tta gct caa cac cac aat gtg atc tta tta gat att gat 96
Ala Val Leu Leu Ala Gln His His Asn Val Ile Leu Leu Asp Ile Asp
20 25 30
caa aat aaa gtt gat tta att aat aat aaa aaa tcg ccc atc aca gat 144
Gln Asn Lys Val Asp Leu Ile Asn Asn Lys Lys Ser Pro Ile Thr Asp
35 40 45
aaa gaa atc gaa gat ttc tta caa aat aaa tca ctg aca atg atg gca 192
Lys Glu Ile Glu Asp Phe Leu Gln Asn Lys Ser Leu Thr Met Met Ala
50 55 60
aca aca gat aaa gaa gtg gca tta aaa aac gca gac ttt gtc atc atc 240
Thr Thr Asp Lys Glu Val Ala Leu Lys Asn Ala Asp Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
gca acg cca aca gac tat aat acc gaa aca ggt tat ttt aat aca tcc 288
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asn Thr Glu Thr Gly Tyr Phe Asn Thr Ser
85 90 95
act gtt gaa gct gtc att gaa caa acc ctt tca atc aat cca caa gca 336
Thr Val Glu Ala Val Ile Glu Gln Thr Leu Ser Ile Asn Pro Gln Ala
100 105 110
acg att att ata aaa tca aca att ccc gtt ggt ttt acc gaa aac atg 384
Thr Ile Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Val Gly Phe Thr Glu Asn Met
115 120 125
cgt gaa aaa ttt aat acc cca aat ctt atc ttt tca cct gaa ttt cta 432
Arg Glu Lys Phe Asn Thr Pro Asn Leu Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu
130 135 140
aga gag gga aaa gcc ctt tac gat aat ttg tat cca agc aga att att 480
Arg Glu Gly Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile
145 150 155 160
gtt ggc agt act tct tat caa gca aaa gta ttt gcc gat atg ttg aca 528
Val Gly Ser Thr Ser Tyr Gln Ala Lys Val Phe Ala Asp Met Leu Thr
165 170 175
cag tgt gcc aga aaa aaa gat gta act gtt tta ttt aca cac aat act 576
Gln Cys Ala Arg Lys Lys Asp Val Thr Val Leu Phe Thr His Asn Thr
180 185 190
gag gcc gaa gct gtt aaa tta ttt gca aat acg tat ctc gca atg cga 624
Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn Thr Tyr Leu Ala Met Arg
195 200 205
gtt gcc ttt ttt aat gaa tta gat act tat gcg agt ctt cac cat tta 672
Val Ala Phe Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr Ala Ser Leu His His Leu
210 215 220
aat aca aaa gac att atc aat ggt att tct act gat cct cgc att ggt 720
Asn Thr Lys Asp Ile Ile Asn Gly Ile Ser Thr Asp Pro Arg Ile Gly
225 230 235 240
aca cac tac aat aac cca agt ttc ggc tat ggc ggt tat tgt tta ccc 768
Thr His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr Cys Leu Pro
245 250 255
aaa gac act aaa cag tta ctg gct aac tat gct gac gtg cct caa aat 816
Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Ala Asp Val Pro Gln Asn
260 265 270
ctc att gaa gcc att gtc aaa tct aat gaa acc aga aaa cgt ttc att 864
Leu Ile Glu Ala Ile Val Lys Ser Asn Glu Thr Arg Lys Arg Phe Ile
275 280 285
act cat gat gta tta aat aag aaa cct aaa act gtt ggt att tat cgt 912
Thr His Asp Val Leu Asn Lys Lys Pro Lys Thr Val Gly Ile Tyr Arg
290 295 300
tta atc atg aag tca ggt tct gat aac ttc aga gct tct gct att ctc 960
Leu Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ala Ser Ala Ile Leu
305 310 315 320
gat att atg ccg cat ctc aaa gaa aac ggt gtt gag att gtg att tat 1008
Asp Ile Met Pro His Leu Lys Glu Asn Gly Val Glu Ile Val Ile Tyr
325 330 335
gag cca acc tta aat caa cag gca ttt gag gac tac ccc gtt att aat 1056
Glu Pro Thr Leu Asn Gln Gln Ala Phe Glu Asp Tyr Pro Val Ile Asn
340 345 350
caa ctc tct gaa ttt att aat cgc tct gat gtc att ctc gct aat cgt 1104
Gln Leu Ser Glu Phe Ile Asn Arg Ser Asp Val Ile Leu Ala Asn Arg
355 360 365
tct gag cca gat tta aat caa tgt tcc cat aaa atc tat aca aga gat 1152
Ser Glu Pro Asp Leu Asn Gln Cys Ser His Lys Ile Tyr Thr Arg Asp
370 375 380
att ttt ggc ggt gat gct 1170
Ile Phe Gly Gly Asp Ala
385 390
<210> 5
<211> 1383
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 5
gtg aaa aaa ata gct gtc att gga aca ggt tat gta gga ctc gta tca 48
Met Lys Lys Ile Ala Val Ile Gly Thr Gly Tyr Val Gly Leu Val Ser
1 5 10 15
ggc act tgc ttt gcg gag atc ggc aat aaa gtt gtt tgc tgt gat atc 96
Gly Thr Cys Phe Ala Glu Ile Gly Asn Lys Val Val Cys Cys Asp Ile
20 25 30
gat gaa tca aaa atc aga agc ctg aaa aat ggg gta atc cca atc tat 144
Asp Glu Ser Lys Ile Arg Ser Leu Lys Asn Gly Val Ile Pro Ile Tyr
35 40 45
gaa cca ggg ctt gca gac tta gtt gaa aaa aat gtg ctg gat cag cgc 192
Glu Pro Gly Leu Ala Asp Leu Val Glu Lys Asn Val Leu Asp Gln Arg
50 55 60
ctg acc ttt acg aac gat atc ccg tct gcc att cgg gcc tca gat att 240
Leu Thr Phe Thr Asn Asp Ile Pro Ser Ala Ile Arg Ala Ser Asp Ile
65 70 75 80
att tat att gca gtc gga acg cct atg tcc aaa aca ggt gaa gct gat 288
Ile Tyr Ile Ala Val Gly Thr Pro Met Ser Lys Thr Gly Glu Ala Asp
85 90 95
tta acg tac gtc aaa gcg gcg gcg aaa aca atc ggt gag cat ctt aac 336
Leu Thr Tyr Val Lys Ala Ala Ala Lys Thr Ile Gly Glu His Leu Asn
100 105 110
ggc tac aaa gtg atc gta aat aaa agc aca gtc ccg gtt gga aca ggg 384
Gly Tyr Lys Val Ile Val Asn Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Thr Gly
115 120 125
aaa ctg gtg caa tct atc gtt caa aaa gcc tca aag ggg aga tac tca 432
Lys Leu Val Gln Ser Ile Val Gln Lys Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ser
130 135 140
ttt gat gtt gta tct aac cct gaa ttc ctt cgg gaa ggg tca gcg att 480
Phe Asp Val Val Ser Asn Pro Glu Phe Leu Arg Glu Gly Ser Ala Ile
145 150 155 160
cat gac acg atg aat atg gag cgt gcc gtg att ggt tca aca agt cat 528
His Asp Thr Met Asn Met Glu Arg Ala Val Ile Gly Ser Thr Ser His
165 170 175
aaa gcc gct gcc atc att gag gaa ctt cat cag cca ttc cat gct cct 576
Lys Ala Ala Ala Ile Ile Glu Glu Leu His Gln Pro Phe His Ala Pro
180 185 190
gtc att aaa aca aac cta gaa agt gca gaa atg att aaa tac gcc gcg 624
Val Ile Lys Thr Asn Leu Glu Ser Ala Glu Met Ile Lys Tyr Ala Ala
195 200 205
aat gca ttt ctg gcg aca aag att tcc ttt atc aac gat atc gca aac 672
Asn Ala Phe Leu Ala Thr Lys Ile Ser Phe Ile Asn Asp Ile Ala Asn
210 215 220
att tgt gag cga gtc ggc gca gac gtt tca aaa gtt gct gat ggt gtt 720
Ile Cys Glu Arg Val Gly Ala Asp Val Ser Lys Val Ala Asp Gly Val
225 230 235 240
ggt ctt gac agc cgt atc ggc aga aag ttc ctt aaa gct ggt att gga 768
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Gly Arg Lys Phe Leu Lys Ala Gly Ile Gly
245 250 255
ttc ggc ggt tca tgt ttt cca aag gat aca acc gcg ctg ctt caa atc 816
Phe Gly Gly Ser Cys Phe Pro Lys Asp Thr Thr Ala Leu Leu Gln Ile
260 265 270
gca aaa tcg gca ggc tat cca ttc aag ctc atc gaa gct gtc att gaa 864
Ala Lys Ser Ala Gly Tyr Pro Phe Lys Leu Ile Glu Ala Val Ile Glu
275 280 285
acg aac gaa aag cag cgt gtt cat att gta gat aaa ctt ttg act gtt 912
Thr Asn Glu Lys Gln Arg Val His Ile Val Asp Lys Leu Leu Thr Val
290 295 300
atg gga agc gtc aaa ggg aga acc att tca gtc ctg gga tta gcc ttc 960
Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ ａａａ ｃｃｇ ａａｔ ａｃｇ ａａｃ ｇａｔ ｇｔｇ ａｇａ ｔｃｃ
ｇｃｔ ｃｃａ ｇｃｇ ｃｔｔ ｇａｔ ａｔｔ ａｔｃ １００８ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ ３２５
３３０ ３３５ ｃｃａ ａｔｇ ｃｔｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃｔｇ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃａｔ
ｇｔａ ａａａ ｇｃａ ｔａｃ ｇａｔ ｃｃｇ ａｔｔ １０５６ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ ３４０ ３４５
３５０ ｇｃｔ ａｔｔ ｃｃｔ ｇａａ ｇｃｔ ｔｃａ ｇｃｇ ａｔｃ ｃｔｔ
ｇｇｃ ｇａａ ｃａｇ ｇｔｃ ｇａｇ ｔａｔ ｔａｃ １１０４ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ ３５５ ３６０
３６５ ａｃａ ｇａｔ ｇｔｇ ｔａｔ ｇｃｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇａａ ｇａｃ
ａｃｔ ｇａｔ ｇｃａ ｔｇｃ ｃｔｇ ａｔｔ ｔｔａ １１５２ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ３７０ ３７５
３８０ ａｃｇ ｇａｔ ｔｇｇ ｃｃｇ ｇａａ ｇｔｇ ａａａ ｇａａ ａｔｇ
ｇａｇ ｃｔｔ ｇｔａ ａａａ ｇｔｇ ａａａ ａｃｃ １２００ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ３８５ ３９０
３９５ ４００ ｃｔｃ ｔｔａ ａａａ ｃａｇ ｃｃａ ｇｔｃ ａｔｃ ａｔｔ ｇａｃ
ｇｇｃ ａｇａ ａａｔ ｔｔａ ｔｔｔ ｔｃａ ｃｔｔ １２４８ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ４０５
４１０ ４１５ ｇａａ ｇａｇ ａｔｇ ｃａｇ ｇｃａ ｇｃｃ ｇｇａ ｔａｃ ａｔｔ
ｔａｔ ｃａｃ ｔｃｔ ａｔｃ ｇｇｃ ｃｇｔ ｃｃｃ １２９６ 420 425 430 gct gtt cgg gga acg gaa ccc tct gac aag tat ttt ccg ggc ttg ccg 1344 Ala Val Arg Gly Thr Glu Pro Ser Asp Lys Tyr Phe Pro Gly Leu Pro 435 440 445 ctt gaa gaa ttg gct aaa gac ttg gga agc gtc aat tta 1383 Leu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Leu Gly Ser Val Asn Leu 450 455 460 <210> 6 <211> 1176 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atg ttc gga aca cta aaa ata act gtt tca ggc gct ggt tac gtt ggg 48 Met Phe Gly Thr Leu Lys Ile Thr Val Ser Gly Ala Gly Tyr Val Gly 1 5 10 15 ctt tca aat gga att cta atg gct caa aat cat gaa gtg gtt gca ttt 96 Leu Ser Asn Gly Ile Leu Met Ala Gln Asn His Glu Val Val Ala Phe 20 25 30 gat acc cat caa aaa aaa gtt gac tta ctt aat gat aaa ctc tct cct 144 Asp Thr His Gln Lys Lys Val Asp Leu Leu Asn Asp Lys Leu Ser Pro 35 40 45 ata gag gat aag gaa att gaa aat tat ctt tca act aaa ata ctt aat 192 Ile Glu Asp Lys Glu Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Thr Lys Ile Leu Asn 50 55 60 ttt cgc gca act act aac aaa tat gaa gcc tat aaa aat gcc aat tac 240 Phe Arg Ala Thr Thr Asn Lys Tyr Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Asn Tyr 65 70 75 80 gtt att att gct aca cca acg aat tat gac cca ggt tca aat tac ttt 288 Val Ile Ile Ala Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe 85 90 95 gat aca tca agc gtt gaa gct gtc att cgt gac gta acg gaa atc aac 336 Asp Thr Ser Ser Val Glu Ala Val Ile Arg Asp Val Thr Glu Ile Asn 100 105 110 cca aac gca att atg gtg gtt aaa tct acg gtc cca gta ggt ttc aca 384 Pro Asn Ala Ile Met Val Val Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Phe Thr 115 120 125 aaa aca att aaa gaa cat tta ggt att aat aat att atc ttc tct cca 432 Lys Thr Ile Lys Glu His Leu Gly Ile Asn Asn Ile Ile Phe Ser Pro 130 135 140 gaa ttt tta cga gaa gga aga gcc cta tac gat aat ctc cat cca tct 480 Glu Phe Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu His Pro Ser 145 150 155 160 cgc att att atc ggt gaa tgt tct gaa cgg gca gaa cgt ttg gca gtg 528 Arg Ile Ile Ile Gly Glu Cys Ser Glu Arg Ala Glu Arg Leu Ala Val 165 170 175 tta ttt cag gaa gga gcg att aaa caa aat ata ccc gtt tta ttt aca 576 Leu Phe Gln Glu Gly Ala Ile Lys Gln Asn Ile Pro Val Leu Phe Thr 180 185 190 gat tct acg gaa gcg gaa gcg att aag tta ttt tca aat act tat ttg 624 Asp Ser Thr Glu Ala Glu Ala Ile Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu 195 200 205 gct atg cga gtt gca ttt ttt aat gaa ttg gat agt tac gca gaa agt 672 Ala Met Arg Val Ala Phe Phe Asn Glu Leu Asp Ser Tyr Ala Glu Ser 210 215 220 ttt ggt ctg aat acg cgt cag att att gac ggt gtt tgt ttg gat ccg 720 Phe Gly Leu Asn Thr Arg Gln Ile Ile Asp Gly Val Cys Leu Asp Pro 225 230 235 240 cgc att ggt aat tac tac aat aat cct tct ttt ggt tat ggt ggc tac 768 Arg Ile Gly Asn Tyr Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr 245 250 255 tgt ttg cca aaa gat acc aag caa tta tta gcc aac tat cag tct gtt 816 Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val 260 265 270 ccg aat aaa ctt ata tct gca att gtt gat gct aac cgt aca cgt aag 864 Pro Asn Lys Leu Ile Ser Ala Ile Val Asp Ala Asn Arg Thr Arg Lys 275 280 285 gac ttt atc act aat gtt att ttg aaa cat aga cca caa gtt gtg ggg 912 Asp Phe Ile Thr Asn Val Ile Leu Lys His Arg Pro Gln Val Val Gly 290 295 300 gtt tat cgt ttg att atg aaa agt ggt tca gat aat ttt aga gat tct 960 Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Asp Ser 305 310 315 320 tct att ctt ggt att ata aag cgt atc aag aaa aaa ggc gtg aaa gta 1008 Ser Ile Leu Gly Ile Ile Lys Arg Ile Lys Lys Lys Gly Val Lys Val 325 330 335 att att tat gag ccg ctt att tct gga gat aca ttc ttt aac tca cct 1056 Ile Ile Tyr Glu Pro Leu Ile Ser Gly Asp Thr Phe Phe Asn Ser Pro 340 345 350 ttg gaa cgg gag ctg gcg atc ttt aaa ggg aaa gct gat att att atc 1104 Leu Glu Arg Glu Leu Ala Ile Phe Lys Gly Lys Ala Asp Ile Ile Ile 355 360 365 act aac cga atg tca gag gag ttg aac gat gtg gtc gac aaa gtc tat 1152 Thr Asn Arg Met Ser Glu Glu Leu Asn Asp Val Val Asp Lys Val Tyr 370 375 380 agt cgc gat ttg ttt aaa tgt gac 1176 Ser Arg Asp Leu Phe Lys Cys Asp 385 390 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 ggaatcgata tgaagaaaat tacaattgct 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 ccaggatcct taagcatcac cgccaaaaat 30
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ ａａａ ｃｃｇ ａａｔ ａｃｇ ａａｃ ｇａｔ ｇｔｇ ａｇａ ｔｃｃ
ｇｃｔ ｃｃａ ｇｃｇ ｃｔｔ ｇａｔ ａｔｔ ａｔｃ １００８ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｉｌｅ ３２５
３３０ ３３５ ｃｃａ ａｔｇ ｃｔｇ ｃａｇ ｃａｇ ｃｔｇ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃａｔ
ｇｔａ ａａａ ｇｃａ ｔａｃ ｇａｔ ｃｃｇ ａｔｔ １０５６ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ ３４０ ３４５
３５０ ｇｃｔ ａｔｔ ｃｃｔ ｇａａ ｇｃｔ ｔｃａ ｇｃｇ ａｔｃ ｃｔｔ
ｇｇｃ ｇａａ ｃａｇ ｇｔｃ ｇａｇ ｔａｔ ｔａｃ １１０４ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ ３５５ ３６０
３６５ ａｃａ ｇａｔ ｇｔｇ ｔａｔ ｇｃｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇａａ ｇａｃ
ａｃｔ ｇａｔ ｇｃａ ｔｇｃ ｃｔｇ ａｔｔ ｔｔａ １１５２ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ３７０ ３７５
３８０ ａｃｇ ｇａｔ ｔｇｇ ｃｃｇ ｇａａ ｇｔｇ ａａａ ｇａａ ａｔｇ
ｇａｇ ｃｔｔ ｇｔａ ａａａ ｇｔｇ ａａａ ａｃｃ １２００ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ３８５ ３９０
３９５ ４００ ｃｔｃ ｔｔａ ａａａ ｃａｇ ｃｃａ ｇｔｃ ａｔｃ ａｔｔ ｇａｃ
ｇｇｃ ａｇａ ａａｔ ｔｔａ ｔｔｔ ｔｃａ ｃｔｔ １２４８ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ４０５
４１０ ４１５ ｇａａ ｇａｇ ａｔｇ ｃａｇ ｇｃａ ｇｃｃ ｇｇａ ｔａｃ ａｔｔ
ｔａｔ ｃａｃ ｔｃｔ ａｔｃ ｇｇｃ ｃｇｔ ｃｃｃ １２９６ 420 425 430 gct gtt cgg gga acg gaa ccc tct gac aag tat ttt ccg ggc ttg ccg 1344 Ala Val Arg Gly Thr Glu Pro Ser Asp Lys Tyr Phe Pro Gly Leu Pro 435 440 445 ctt gaa gaa ttg gct aaa gac ttg gga agc gtc aat tta 1383 Leu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Leu Gly Ser Val Asn Leu 450 455 460 <210> 6 <211> 1176 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atg ttc gga aca cta aaa ata act gtt tca ggc gct ggt tac gtt ggg 48 Met Phe Gly Thr Leu Lys Ile Thr Val Ser Gly Ala Gly Tyr Val Gly 1 5 10 15 ctt tca aat gga att cta atg gct caa aat cat gaa gtg gtt gca ttt 96 Leu Ser Asn Gly Ile Leu Met Ala Gln Asn His Glu Val Val Ala Phe 20 25 30 gat acc cat caa aaa aaa gtt gac tta ctt aat gat aaa ctc tct cct 144 Asp Thr His Gln Lys Lys Val Asp Leu Leu Asn Asp Lys Leu Ser Pro 35 40 45 ata gag gat aag gaa att gaa aat tat ctt tca act aaa ata ctt aat 192 Ile Glu Asp Lys Glu Ile Glu Asn Tyr Leu Ser Thr Lys Ile Leu Asn 50 55 60 ttt cgc gca act act aac aaa tat gaa gcc tat aaa aat gcc aat tac 240 Phe Arg Ala Thr Thr Asn Lys Tyr Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Asn Tyr 65 70 75 80 gtt att att gct aca cca acg aat tat gac cca ggt tca aat tac ttt 288 Val Ile Ile Ala Thr Pro Thr Asn Tyr Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe 85 90 95 gat aca tca agc gtt gaa gct gtc att cgt gac gta acg gaa atc aac 336 Asp Thr Ser Ser Val Glu Ala Val Ile Arg Asp Val Thr Glu Ile Asn 100 105 110 cca aac gca att atg gtg gtt aaa tct acg gtc cca gta ggt ttc aca 384 Pro Asn Ala Ile Met Val Val Lys Ser Thr Val Pro Val Gly Phe Thr 115 120 125 aaa aca att aaa gaa cat tta ggt att aat aat att atc ttc tct cca 432 Lys Thr Ile Lys Glu His Leu Gly Ile Asn Asn Ile Ile Phe Ser Pro 130 135 140 gaa ttt tta cga gaa gga aga gcc cta tac gat aat ctc cat cca tct 480 Glu Phe Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu His Pro Ser 145 150 155 160 cgc att att atc ggt gaa tgt tct gaa cgg gca gaa cgt ttg gca gtg 528 Arg Ile Ile Ile Gly Glu Cys Ser Glu Arg Ala Glu Arg Leu Ala Val 165 170 175 tta ttt cag gaa gga gcg att aaa caa aat ata ccc gtt tta ttt aca 576 Leu Phe Gln Glu Gly Ala Ile Lys Gln Asn Ile Pro Val Leu Phe Thr 180 185 190 gat tct acg gaa gcg gaa gcg att aag tta ttt tca aat act tat ttg 624 Asp Ser Thr Glu Ala Glu Ala Ile Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu 195 200 205 gct atg cga gtt gca ttt ttt aat gaa ttg gat agt tac gca gaa agt 672 Ala Met Arg Val Ala Phe Phe Asn Glu Leu Asp Ser Tyr Ala Glu Ser 210 215 220 ttt ggt ctg aat acg cgt cag att att gac ggt gtt tgt ttg gat ccg 720 Phe Gly Leu Asn Thr Arg Gln Ile Ile Asp Gly Val Cys Leu Asp Pro 225 230 235 240 cgc att ggt aat tac tac aat aat cct tct ttt ggt tat ggt ggc tac 768 Arg Ile Gly Asn Tyr Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Gly Tyr 245 250 255 tgt ttg cca aaa gat acc aag caa tta tta gcc aac tat cag tct gtt 816 Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr Gln Ser Val 260 265 270 ccg aat aaa ctt ata tct gca att gtt gat gct aac cgt aca cgt aag 864 Pro Asn Lys Leu Ile Ser Ala Ile Val Asp Ala Asn Arg Thr Arg Lys 275 280 285 gac ttt atc act aat gtt att ttg aaa cat aga cca caa gtt gtg ggg 912 Asp Phe Ile Thr Asn Val Ile Leu Lys His Arg Pro Gln Val Val Gly 290 295 300 gtt tat cgt ttg att atg aaa agt ggt tca gat aat ttt aga gat tct 960 Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys Ser Gly Ser Asp Asn Phe Arg Asp Ser 305 310 315 320 tct att ctt ggt att ata aag cgt atc aag aaa aaa ggc gtg aaa gta 1008 Ser Ile Leu Gly Ile Ile Lys Arg Ile Lys Lys Lys Gly Val Lys Val 325 330 335 att att tat gag ccg ctt att tct gga gat aca ttc ttt aac tca cct 1056 Ile Ile Tyr Glu Pro Leu Ile Ser Gly Asp Thr Phe Phe Asn Ser Pro 340 345 350 ttg gaa cgg gag ctg gcg atc ttt aaa ggg aaa gct gat att att atc 1104 Leu Glu Arg Glu Leu Ala Ile Phe Lys Gly Lys Ala Asp Ile Ile Ile 355 360 365 act aac cga atg tca gag gag ttg aac gat gtg gtc gac aaa gtc tat 1152 Thr Asn Arg Met Ser Glu Glu Leu Asn Asp Val Val Asp Lys Val Tyr 370 375 380 agt cgc gat ttg ttt aaa tgt gac 1176 Ser Arg Asp Leu Phe Lys Cys Asp 385 390 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 ggaatcgata tgaagaaaat tacaattgct 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 ccaggatcct taagcatcac cgccaaaaat 30
【図１】 図１は、ＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナー
ゼ発現プラスミドであるｐＰＴ１０４の構築過程を示す
図である。
ゼ発現プラスミドであるｐＰＴ１０４の構築過程を示す
図である。
Ｐｌａｃ：ラクトースプロモーター
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ｃＩ８５７：温度感受性リプレッサー
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｐｍ０７７６：パスツレラ・マルトシダ由来のＵＤＰ−
グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子
グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子
Claims (17)
- 【請求項１】 ウリジン−５’−三リン酸（以下、ＵＴ
Ｐと略す）の前駆物質と糖とからＵＤＰ−グルコース
（以下、ＵＤＰ−Ｇｌｃと略す）を生産する能力を有す
る微生物の培養物または該培養物の処理物、およびＵＤ
Ｐ-グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＤＨと略す）活性を有する蛋白質を生産する能力を有
する形質転換体の培養物または該培養物の処理物を酵素
源として用い、該酵素源、ＵＴＰの前駆物質および糖を
水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＵＤＰ−グル
クロン酸（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＡと略す）を生成蓄積
させ、該水性媒体中からＵＤＰ−ＧｌｃＡを採取するこ
とを特徴とするＵＤＰ−ＧｌｃＡの製造法。 - 【請求項２】 培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培
養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該
菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性
剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、
または該菌体の固定化物であることを特徴とする、請求
項１に記載の製造法。 - 【請求項３】 前駆物質が、オロット酸、オロチジン、
ウラシル、ウリジンおよびウリジン−５’−一リン酸か
らなる群より選ばれる前駆物質である請求項１に記載の
製造法。 - 【請求項４】 糖が、グルコースまたはフラクトースで
ある請求項１に記載の製造法。 - 【請求項５】 ＵＴＰの前駆物質と糖からＵＤＰ−Ｇｌ
ｃを生産する能力を有する微生物が、エシェリヒア属、
コリネバクテリウム属、およびサッカロマイセス属に属
する微生物からなる群より選ばれる微生物である請求項
１に記載の製造法。 - 【請求項６】 形質転換体が、微生物に組換え体ＤＮＡ
を導入して得られる形質転換体である請求項１に記載の
製造法。 - 【請求項７】 微生物が、エシェリヒア属、コリネバク
テリウム属、およびサッカロマイセス属に属する微生物
からなる群より選ばれる微生物である請求項６に記載の
製造法。 - 【請求項８】 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質
が、パスツレラ属、バチルス属、およびエシェリヒア属
に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＵ
ＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である請求項１に
記載の製造法。 - 【請求項９】 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質
が、配列番号１、２および３からなる群より選ばれる配
列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である請
求項１に記載の製造法。 - 【請求項１０】 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白
質が、配列番号１、２および３からなる群より選ばれる
いずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列におい
て、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＵＤ
Ｐ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質である請求項１に記
載の製造法。 - 【請求項１１】 ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白
質が、配列番号１、２および３からなる群より選ばれる
いずれか１つの配列番号で表されるアミノ酸配列と５０
％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質で
あり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質であ
る請求項１に記載の製造法。 - 【請求項１２】 組換え体ＤＮＡが、ＵＤＰ−ＧｌｃＤ
Ｈ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組
換え体ＤＮＡである請求項６に記載の製造法。 - 【請求項１３】 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２お
よび３からなる群より選ばれる配列番号で表されるアミ
ノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
組換え体ＤＮＡである請求項６に記載の製造法。 - 【請求項１４】 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２お
よび３からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号
で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸
が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質を
コードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求
項６に記載の製造法。 - 【請求項１５】 組換え体ＤＮＡが、配列番号１、２お
よび３からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号
で表されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有する
アミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する組換え体Ｄ
ＮＡである請求項６に記載の製造法。 - 【請求項１６】 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５お
よび６からなる群より選ばれる配列番号で表される塩基
配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請
求項６に記載の製造法。 - 【請求項１７】 組換え体ＤＮＡが、配列番号４、５お
よび６からなる群より選ばれるいずれか１つの配列番号
で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
ＵＤＰ−ＧｌｃＤＨ活性を有する蛋白質をコードするＤ
ＮＡを含有する組換え体ＤＮＡである請求項６に記載の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002080710A JP2003274948A (ja) | 2002-03-22 | 2002-03-22 | Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002080710A JP2003274948A (ja) | 2002-03-22 | 2002-03-22 | Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274948A true JP2003274948A (ja) | 2003-09-30 |
Family
ID=29206473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002080710A Pending JP2003274948A (ja) | 2002-03-22 | 2002-03-22 | Ｕｄｐ−グルクロン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003274948A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112608960A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-06 | 江南大学 | 一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法 |
| CN114507649A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-17 | 吉林大学 | 嗜热酶及一锅法高效合成udp-葡萄糖和udp-葡萄糖醛酸的方法 |
| CN114981438A (zh) * | 2020-01-23 | 2022-08-30 | 池田食研株式会社 | 葡糖醛酸的制造方法 |
-
2002
- 2002-03-22 JP JP2002080710A patent/JP2003274948A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114981438A (zh) * | 2020-01-23 | 2022-08-30 | 池田食研株式会社 | 葡糖醛酸的制造方法 |
| CN112608960A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-06 | 江南大学 | 一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法 |
| CN114507649A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-17 | 吉林大学 | 嗜热酶及一锅法高效合成udp-葡萄糖和udp-葡萄糖醛酸的方法 |
| CN114507649B (zh) * | 2022-02-16 | 2023-11-21 | 吉林大学 | 嗜热酶及一锅法高效合成udp-葡萄糖和udp-葡萄糖醛酸的方法 |
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