CN111004742B - 具有二氯甲烷降解性能的微杆菌zy及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，本发明公开了一种微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY，名称为Microbacterium keratanolyticum，保藏号：CCTCC NO:M 2019953。本发明还同时提供了上述微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY的用途：生物降解二氯甲烷。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株具有二氯甲烷降解能力的新菌株-微杆菌ZY(Microbacterium keratanolyticum ZY)及其应用。
背景技术
二氯甲烷(DCM)在医药合成、化工、农业、感光材料方面的应用日益增多。据统计，DCM在生产、运输到使用整个过程中会有溢出，大约80％未被处理直接排放到大气中，这是DCM大气污染的主要污染源，累积在生态生物圈中。虽然部分DCM在大气中易被光解，但其来源具有很强的持续性，因此，DCM在大气中的浓度依然很高。
DCM是一种不稳定的卤代烃，在常温下易挥发，遇热会分解出盐酸、一氧化碳、二氧化碳和剧毒光气，从而加重对人体的危害。目前的研究表明，它具有一定的遗传毒性，美国将其列为可疑致癌物。大部分研究认为，DCM对DNA的损伤机理是其代谢活动转化为甲醛从而产生毒性作用，会引起DNA断裂、交联、形成加合物等等。根据DCM的活性和化学结构，其可能会和DNA共价结合而引起DNA的链性交联，其中DNA加合是DNA损伤的标志之一，也是导致细胞癌变的一个前提条件。
对于DCM处理的方法，国内外主要包括焚烧法、吸收法、氧化法、冷凝法和生物降解等方式。其中吸附法、焚烧法等物理化学方法主要用于处理DCM含量较高的工业废气，但是对于污泥、水体和空气中低浓度(<3mg/m3)的DCM，降解的效果差，成本较高，耗能较大，很容易产生二次污染。生物降解法基于微生物以DCM为碳源和能源，把其当做代谢的底物，使得DCM达到被降解的目的。它的特点是工艺投资少、反应条件温和、运行费用低、操作简单，值得被广泛的运用。
微杆菌目前已知的用途是：
1、Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)促进丹参毛状根增重。
2、Microbacterium sp.J-1(CCTCC NO:M 2015055)能降解多种邻苯二甲酸酯。
3、Microbacterium oxydans(CGMCC No.9072)能降解多环芳烃。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有二氯甲烷降解性能的微杆菌ZY及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一株微杆菌(Microbacteriumkeratanolyticum)ZY，为Microbacterium keratanolyticum，保藏号：CCTCC NO:M2019953。
其保藏信息如下：保藏名称：Microbacterium keratanolyticum ZY,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019953，保藏时间2019年11月20日。
本发明的微杆菌ZY菌株的特征为：菌落颜色为黄色，菌落呈小型单个菌落，菌落内部呈半透明，无孢子。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌。它生长最适pH值为7.0，最适温度为30℃。该菌株16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供微杆菌ZY在生物降解二氯甲烷中的应用；即，微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY的用途为能生物降解二氯甲烷。
二氯甲烷是无色透明液体，有具有类似醚的刺激性气味。不溶于水，溶于乙醇和乙醚，是不可燃低沸点溶剂。
进一步，所述的应用为：将微杆菌ZY种子培养后获得的种子液经离心，并用无机盐溶液清洗重悬，接种至含二氯甲烷的液体选择培养基中，以二氯甲烷为碳源，在20～40℃(优选30℃)、(160±30)rpm条件下培养，实现二氯甲烷的降解。
所述二氯甲烷液体选择培养基的终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO41000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷50-500mg/L(优选100mg·L-1)，MgSO4·7H2O200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO30.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.02mg·L-1，溶剂为超纯水；pH为4.0～8.0。
进一步，优选所述含菌细胞悬液的OD600值为1.5，所述含菌悬液的菌重为50mg·L-1。
本发明所述含菌悬液按如下步骤制备：
(1)斜面培养：将微杆菌ZY接种至斜面培养基，30℃培养3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO41800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0，琼脂18～20g·L-1(优选18g·L-1)；
(2)种子培养：从菌体斜面挑取1接种环的单菌落接种至50mL的LB液体培养基(种子培养基)，30℃培养20h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaNO3 14.5g·L-1，酵母浸粉5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0；
(3)发酵培养：将种子液离心并用无机盐溶液清洗重悬，按菌重为50mg·L-1的接种量接种至发酵培养基，30℃培养，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株具有二氯甲烷降解性能的微杆菌ZY及其降解二氯甲烷的应用，目前暂未发现过微杆菌这一属种能降解二氯甲烷。微杆菌ZY在2d内能对初始浓度为100mg·L-1的二氯甲烷降解率达到98％以上，该降解菌对工业废水中二氯甲烷的处理具有重要意义。
本发明为二氯甲烷降解筛选可用菌株，进行生物降解二氯甲烷，对二氯甲烷废水的处理提供一种新方法，具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为菌株ZY的透射电镜照片；
图2为菌株ZY的系统发育树图；
图3为菌株ZY的生长曲线图；
图4不同pH下菌株ZY的二氯甲烷降解性能比较；
图5不同温度下菌株ZY的二氯甲烷降解性能比较；
图6不同初始二氯甲烷浓度下菌株ZY的二氯甲烷降解性能比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、Microbacterium keratanolyticum ZY的分离、纯化及其鉴定
1)、Microbacterium keratanolyticum ZY的分离及纯化
Microbacterium keratanolyticum ZY是从浙江某药业公司的废水处理池污泥中筛选而得，具体步骤如下：
二氯甲烷液体基础培养基：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO41800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，余量为作为溶剂的超纯水，pH7.0，常规灭菌(即，110℃灭菌40min)。
二氯甲烷固体选择培养基：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO41800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，18～20g·L-1(优选18g·L-1)琼脂，余量为作为溶剂的超纯水，pH 7.0，110℃灭菌40min。
取浙江燎原药业股份有限公司废水处理池中的污泥，污泥与培养基等比例混合曝气培养，加入二氯甲烷为碳源，驯化两个月。每3～4天更换一次培养基，更换前静置污泥，并更换上清液的液体培养基。同时，每日测定污泥pH，待pH有明显降低后，取5mL污泥接种于含100mg·L-1的二氯甲烷液体选择培养基的培养瓶中，30℃，160rpm振荡培养，待二氯甲烷完全降解完后，再转接到下一个培养瓶中进行新一轮的富集培养，持续7个周期后，取100μL菌液涂布于二氯甲烷固体选择培养基。后再固体培养基中挑取菌落，经多次平板划线分离纯化，得到单菌落即二氯甲烷降解菌种，记为菌株ZY。
本发明的微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY，其保藏信息如下：
保藏名称：Microbacterium keratanolyticum ZY,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2019953，保藏时间2019年11月20日。
2)、菌株ZY的鉴定
a、菌株ZY的生理生化特征
菌落颜色为黄色，菌落呈小型单个菌落，内部呈半透明，光滑湿润，易挑取，无孢子。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌，革兰氏染色阳性(图1所示)。其生长最适pH值为7.0，最适温度为30℃。
b、菌株ZY的16S rRNA序列分析
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株ZY为Microbacteriumkeratanolyticum。具体步骤如下：
采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，浙江天科生物科技有限公司)提取和纯化菌株ZY的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物F27和1492R对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：
F27：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’
1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
PCR反应体系为(50μL)：模板DNA 1.75μL，引物F27和引物R1492各1μL，MgCl2(25mmol·L-1)3μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)4μL，重蒸水34μL。
PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(浙江天科)，测序结果如SEQ ID NO：1所示。
将ZY的16S rDNA序列与上传到同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Microbacterium属，与Microbacterium keratanolyticum同源性最高，达到99％，图2为该菌株的系统发育树图。
实施例2、微杆菌ZY生长曲线的测定
将1接种环的微杆菌ZY单菌落接种于50ml的LB液体培养基中，置于30℃，160rpm摇床中培养，每隔一段时间(如图3所述)，取其菌液测定其OD600，作出生长曲线。图3为该菌株的生长曲线图。
实施例3、微杆菌ZY发酵培养液
(1)斜面培养：将微杆菌ZY接种至斜面培养基，30℃培养3天，获得菌体斜面；
所述斜面培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0，琼脂18～20g·L-1(优选18g·L-1)；
(2)种子培养：从菌体斜面挑取1接种环的单菌落接种至50ml的LB液体培养基(种子培养基)，30℃培养20h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaNO3 14.5g·L-1，酵母浸粉5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0；
(3)发酵培养：将种子液离心(10000rpm的转速下离心5分钟)，去除离心所得的上清液，将离心所得的菌体用无机盐溶液(未加二氯甲烷的发酵培养基)清洗后重悬；
按菌重为50mg·L-1的接种量(菌体干重)接种至发酵培养基，30℃、160rpm振荡培养2d，获得发酵培养液即为含菌悬液；
所述发酵培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0。
上述发酵培养基中去除二氯甲烷100mg·L-1，即为无机盐溶液。
采用Dionex ICS-2100离子色谱仪测定二氯甲烷的脱氯率，即从培养瓶中取5mL培养液作为样品，先将样品离心，取上清液，使用0.45μm的有机滤膜对样品进行初次过滤，然后采用C18柱对样品中的有机物质进行二次吸附处理，最后再使用0.2μm的滤膜对样品进行处理。然后取滤液用离子色谱法测出氯离子的浓度。所得结果为：在100mg·L-1初始二氯甲烷浓度下，微杆菌ZY基本能降解二氯甲烷，二氯甲烷脱氯率为98.3％。
实施例4：Microbacterium keratanolyticum ZY二氯甲烷降解性能检测
1.考察不同初始pH条件下微杆菌ZY降解二氯甲烷的性能
在不同初始pH下实施微杆菌ZY降解二氯甲烷的实验，发现pH＝7.0为最佳pH，此时降解率最高，具体实施步骤如下：
以二氯甲烷为碳源(浓度100mg·L-1)，将种子液离心并用无机盐溶液清洗重悬，按菌重为50mg·L-1的接种量(实施例3方法制备)接种于不同pH值的二氯甲烷液体选择培养基(pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，30℃，160rpm振荡培养2d，获得培养液。
即，将实施例3步骤(3)的发酵培养基的pH值7.0分别改成4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其余等同于实施例3。
结果如图4所示，菌株ZY对强酸的环境适应性相对较差，当pH为7.0时，菌株ZY对二氯甲烷的降解效果最好，二氯甲烷脱氯率高。
2.考察不同温度下微杆菌ZY降解二氯甲烷的性能
在不同温度下实施微杆菌ZY降解二氯甲烷的实验，结果表明其最佳温度为30℃，具体实施方案如下：
以二氯甲烷为碳源(浓度100mg·L-1)，将种子液离心并用无机盐溶液清洗重悬，按菌重为50mg·L-1的接种量(实施例3方法制备)接种于二氯甲烷液体选择培养基中，并分别以20℃、25℃、30℃、35℃、40℃5个温度梯度，160rpm振荡培养2d，获得培养液。
即，将实施例3步骤(3)的发酵培养温度由30℃分别改成20℃、25℃、35℃、40℃，其余等同于实施例3。
结果如图5所示，数据表明，菌株ZY降解二氯甲烷的最佳温度为30℃左右。
3.考察不同初始二氯甲烷浓度下微杆菌ZY降解二氯甲烷的性能
在不同初始二氯甲烷浓度下实施微杆菌ZY的降解实验，结果表明其在二氯甲烷浓度50-500mg·L-1下都能降解二氯甲烷，具体实施方案如下：
以二氯甲烷为碳源，将种子液离心并用无机盐溶液清洗重悬，按菌重为50mg·L-1的接种量(实施例3方法制备)分别接种于初始二氯甲烷浓度分别为50mg·L-1、100mg·L-1、150mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1、500mg·L-1的6个液体选择培养基中，30℃，160rpm振荡培养2d，获得培养液。
即，将实施例3步骤(3)的发酵培养基中二氯甲烷浓度由100mg·L-1分别改成50mg·L-1、、150mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1、500mg·L-1，其余等同于实施例3。
结果如图6所示：在100mg·L-1初始二氯甲烷浓度下，微杆菌ZY基本能降解二氯甲烷，二氯甲烷脱氯率为98.3％。
对比例、参照实施例3，将发明过程中获得的其余菌株先制备菌液，然后按照其优选培养条件以相同的接种量进行接种，在二氯甲烷初始浓度为100mg/L，在30℃，160rpm振荡培养2d进行检测，所得结果与本发明的对比如下表1：
表1
| 菌株名称 | 来源 | 二氯甲烷脱氯率 |
| 微杆菌ZY | 本发明筛选所得 | 98.3％ |
| 产碱杆菌ZY1 | 本发明筛选所得 | 50.1％ |
| 甲基杆菌ZY2 | 本发明筛选所得 | 70.1％ |
另：目前现有的微杆菌菌株未告知具有降解二氯甲烷的功能；且按照本发明的上述方法进行检测，二氯甲烷脱氯率与本发明的微杆菌ZY根本无法相比。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 具有二氯甲烷降解性能的微杆菌ZY 及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> 微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)
<400> 1
cttgctcttg tggatcagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagcaacct gccccggact 60
ctgggataag cgctggaaac ggcgtctaat actggatacg agtagcgacc gcatggtcag 120
ctattggaaa gaatttcggt ctgggatggg ctcgcggcct atcagcttgt tggtgaggta 180
atggctcacc aaggcgtcga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac 240
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca 300
agcctgatgc agcaacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctcttttag 360
tagggaagaa gcgaaagtga cggtacctgc agaaaaagcg ccggctaact acgtgccagc 420
agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt 480
aggcggtttg tcgcgtctgc tgtgaaatct gggggctcaa cccccagcct gcagtgggta 540
cgggcagact agagtgcggt aggggagatt ggaattcctg gtgtagcggt ggaatgcgca 600
gatatcagga ggaacaccga tggcgaaggc agatctctgg gccgtaactg acgctgagga 660
gcgaaagggt ggggagcaaa caggcttaga taccctggta gtccaccccg taaacgttgg 720
gaactagttg tggggtccat tccacggatt ccgtgacgca gctaacgcat taagttcccc 780
gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc 840
ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacatata 900
cgagaacggg ccagaaatgg tcaactcttt ggacactcgt aaacaggtgg tgcatggttg 960
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgttct 1020
atgttgccag cacgtaatgg tgggaactca tgggatactg ccggggtcaa ctcggaggaa 1080
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg ggcttcacgc atgctacaat 1140
ggccggtaca aagggctgca ataccgcgag gtggagcgaa tcccaaaaag ccggtcccag 1200
ttcggattga ggtctgcaac tcgacctcat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca 1260
gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcaa gtcatgaaag 1320
tcggtaacac ctgaa 1335
Claims (4)
1.一种解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY，其特征在于，所述菌株ZY保藏编号为：CCTCC NO:M 2019953。
2.如权利要求1所述的解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY的用途，其特征在于：生物降解二氯甲烷。
3.根据权利要求2所述的解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY的用途，其特征在于：将微杆菌ZY种子培养后获得的种子液离心，用无机盐溶液清洗重悬，接种至含二氯甲烷的液体选择培养基中，以二氯甲烷为碳源，在20～40℃、160±30rpm条件下培养，实现二氯甲烷的降解；
所述二氯甲烷液体选择培养基的终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO41000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷50-500mg/L，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水；
pH为4.0-8.0。
4.根据权利要求3所述的解角质微杆菌(Microbacterium keratanolyticum)ZY的用途，其特征在于含菌悬液按如下步骤制备：
(1)斜面培养：将微杆菌ZY接种至斜面培养基，30℃培养3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO41800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0，琼脂18～20g·L-1；
(2)种子培养：从菌体斜面挑取1接种环的单菌落接种至50mL的LB液体培养基，30℃培养20h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaNO3 14.5g·L-1，酵母浸粉5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0；
(3)发酵培养：将种子液离心并用无机盐溶液清洗重悬，按菌重为50mg·L-1的接种量接种至发酵培养基，30℃培养，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：Na2HPO4·12H2O 4500mg·L-1，KH2PO4 1000mg·L-1，(NH4)2SO4 1800mg·L-1，二氯甲烷100mg·L-1，MgSO4·7H2O 200mg·L-1，葡萄糖10mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.02mg·L-1，FeSO4·7H2O 1mg·L-1，H3BO3 0.014mg·L-1，MnSO4·4H2O 0.1mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.1mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.02mg·L-1，溶剂为超纯水，pH值7.0。
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