CN113801821B - 新奥尔良分枝杆菌wcj及其在降解有机污染物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新奥尔良分枝杆菌WCJ及其在降解有机污染物中的应用，所述的应用是将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种至pH＝4‑9、含有机污染物的无机盐培养液中，在25‑35℃条件下进行培养，实现有机污染物的降解。本发明新奥尔良分枝杆菌WCJ对于正己烷具有高效的降解效果，可以较为完全地把污染物转化为CO2、H2O等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解其他乙酸丁酯、石油醚、乙醇等工业常见污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。

Description

新奥尔良分枝杆菌WCJ及其在降解有机污染物中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株新菌株--新奥尔良分枝杆菌WCJ及其在降解有机污染物中的应用。
(二)背景技术
正己烷是一种有机化合物，属于直链饱和脂肪烃类，由原油裂解及分馏获得，有微弱特殊气味的无色液体。其具有挥发性，几乎不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇。主要用作溶剂，如植物油抽提溶剂、丙烯聚合溶剂、橡胶和涂料溶剂、颜料稀释剂。用于大豆、米糠、棉籽等各种食用油脂和香辛料中油脂等的抽提。此外，正己烷异构化是生产高辛烷值汽油调和组分的重要工艺之一。
正己烷虽属低毒类，但由于其具有高挥发性和高脂溶性，可在体内蓄积并产生神经毒性，而被认为高危险性毒物。正己烷是一种可导致神经纤维变性的神经类毒物。急性吸入高浓度的正己烷可出现头晕、头痛、胸闷、眼和上呼吸道黏膜刺激及麻醉症状，甚至意识不清。经口摄入可出现恶心、呕吐、支气管和胃肠道刺激症状，严重者发生中枢性呼吸抑制，人摄入约50g可致死。
因此研究环境中正己烷的高效降解对人类健康很有必要，通过文献检索，发现有关分枝杆菌以菲为唯一碳源来实现菲高效降解的报道，未发现有关分枝杆菌以正己烷为唯一碳源来实现高效降解的报道。本发明的分枝杆菌(Mycolicibacterium neworleansense)WCJ能以正己烷等为唯一碳源实现降解，并且生长环境温和，易扩大培养。该降解菌的发现对于工业废水废气中烷烃类污染物的高效净化具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是克服现有技术中的不足，提供一种新奥尔良分枝杆菌WCJ及其在降解有机污染物中的应用，该菌株具有高效、去除能力强的有机污染物(特别是正己烷)降解能力。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种新菌株--新奥尔良分枝杆菌(Mycolicibacteriumneworleansense)WCJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2021651，保藏日期：2021年05月31日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
本发明新奥尔良分枝杆菌WCJ的基本特征为：菌落呈白色、菜花状、无芽孢、无鞭毛；边缘不整齐，不透光，易挑取，菌苔沿划线生长；好氧，革兰氏染色阳性。
本发明还提供一种所述新奥尔良分枝杆菌WCJ在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种至pH＝4-9(优选pH＝6-7)、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃条件下进行培养，实现有机污染物的降解。
进一步，所述有机污染物包括正己烷、乙酸丁酯、石油醚或乙醇。
进一步，所述新奥尔良分枝杆菌WCJ以静息细胞形式加入，所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为10-50mg/L，优选20mg/L。
进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为85-405mg/L，优选135mg/L。
进一步，所述无机盐培养液组成为：K2HPO4·3H2O 0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO3 1.7g/L、NH4Cl 0.98g/L、MgCl·6H2O 0.2033g/L、CaCl·2H2O 0.011g/L、FeCl30.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO4·5H2O 0.02g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、NaMoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl·6H2O 0.02g/L、H3BO3 0.014g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L，溶剂为去离子水。
进一步，所述新奥尔良分枝杆菌WCJ以静息细胞形式接种，所述静息细胞静息细胞按如下步骤制备：
(1)斜面培养：将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种于斜面LB固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
(2)扩大培养：用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃，培养24～36h，获得OD600＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得新奥尔良分枝杆菌WCJ静息细胞；所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明提供的新奥尔良分枝杆菌WCJ取自污水厂污泥，对于正己烷等有机污染物具有高效的降解效果，可以较为完全地把污染物转化为CO2、H2O等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解其他乙酸丁酯、石油醚、乙醇等工业常见污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
本发明所述的新奥尔良分枝杆菌WCJ能将正己烷完全降解为无机物(CO2、H2O)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于335mg/L以内的正己烷的去除率高达100％。因此，该分枝杆菌对于工业常见污染物(如正己烷、乙酸丁酯、石油醚等)具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。
(四)附图说明
图1为菌株WCJ在LB培养基上菌落形态照片。
图2为菌株WCJ的透射电子显微镜照片。
图3为菌株WCJ的系统发育树图。
图4为新奥尔良分枝杆菌WCJ对于不同浓度正己烷的降解曲线。
图5为新奥尔良分枝杆菌WCJ在不同pH下对于85mg/L正己烷的降解曲线。
图6为新奥尔良分枝杆菌WCJ在40h时不同pH下对于85mg/L正己烷的降解率。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所述无机盐培养液组成为：K2HPO4·3H2O 0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO31.7g/L、NH4Cl 0.98g/L、MgCl·6H2O 0.2033g/L、CaCl·2H2O 0.011g/L、FeCl3 0.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO4·5H2O0.02g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、NaMoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl·6H2O0.02g/L、H3BO3 0.014g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L，溶剂为去离子水。
所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
实施例1：菌株WCJ的分离、纯化及其鉴定。
1、菌株WCJ的分离及纯化。
菌株WCJ是从活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌，具体步骤如下：
在300mL摇瓶中加入50mL无机盐培养液，并加入10mL采集自某污水处理厂的活性污泥和终浓度30mg/L的正己烷，在30℃进行富集培养，待正己烷浓度为初始加入浓度的50％时，从中取出5mL富集液于50mL新鲜无机盐培养液中，加入相同量的正己烷(使其浓度为30mg/L)，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液用无菌水稀释1500倍后划线LB固体培养基，30℃培养，选择单菌落划线接种至LB固体培养基，30℃培养24h，菌落形态照片见图1。将单菌落加入无机盐培养液，并加入终浓度30mg/L正己烷作为唯一的碳源及能源，30℃培养24h进行验证，得到目的菌株WCJ，通过透射电子显微镜确定其形态(图2)。
2、菌株WCJ的鉴定
(1)菌株WCJ特征：菌落呈白色、菜花状；边缘不整齐，不透光，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为椭圆杆菌，无鞭毛，大小为500×1300nm，革兰氏染色阳性。
(2)通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为Mycolicibacterium neworleansense，具体步骤如下：
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取和纯化菌株WCJ的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的DNA进行PCR扩增，引物分别为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))，16S rRNA测序结果(SEQ ID NO.1所示)上传至NCBI，获得登录号MZ735372，同时将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。发现其属于Mycolicibacterium属，与Mycolicibacterium sp.105、Mycolicibacterium sp.CA8和Mycolicibacteriumsp.fortuitum strain ATCC 49404具有99％的同源性。从结果中选取10株Mycolicibacterium具有代表性的菌株，以16S rRNA基因序列同源性为基础，采用MEGA7.0软件构建系统发育树，如图3。通过遗传距离及16S rRNA序列对比，鉴定为新奥尔良分枝杆菌(Mycolicibacterium neworleansense)。
16S rRNA测序结果(SEQ ID NO.1所示)：
(3)菌株WCJ对梅里埃GN卡上47种碳源的利用能力。
利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对47中不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应，菌株WCJ可较强利用2种碳源，对其他45种碳源不能利用。
表1菌株WCJ梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应结果(GN卡)
表注：+，阳性反应；-：阴性反应
经上述鉴定，将菌株WCJ鉴定为新奥尔良分枝杆菌(Mycolicibacteriumneworleansense)WCJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2021651，保藏日期：2021年05月31日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
实施例2、新奥尔良分枝杆菌WCJ静息细胞的获得
1、斜面培养：
将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24～36h，再将活化的细菌画线于固体LB平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行LB试管斜面常规(4℃)保存。
2、扩大培养
将步骤1中斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24～36h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得新奥尔良分枝杆菌WCJ静息细胞。
实施例3：新奥尔良分枝杆菌WCJ对不同浓度正己烷的降解性能检测。
将无机盐培养液分装于体积均为300mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入正己烷作为唯一碳源使其终浓度分别为85、195、230、335、405mg/L，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的正己烷浓度，绘制菌株不同初始浓度正己烷随着时间变化的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当正己烷浓度低于335mg/L时，菌株WCJ可以快速地降解所有添加的底物。
实施例4：新奥尔良分枝杆菌WCJ在不同初始pH环境下对85mg/L的正己烷的降解性能检测。
用1mol/L NaOH水溶液或1mol/L H2SO4水溶液调节无机盐培养液为不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，在初始正己烷浓度为85mg/L的条件下接入实施例2方法制备的新奥尔良分枝杆菌WCJ静息细胞，使各平行样中的初始细胞干重为20mg/L。将样品于30℃，160rpm恒温摇床里振荡培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的正己烷浓度，绘制菌株不同pH环境下正己烷随着时间变化的去除率曲线以及在40h时不同pH下对于85mg/L的正己烷的降解率，结果见图5所示。结果表明，在各pH下，新奥尔良分枝杆菌WCJ均能降解正己烷，且在pH为6和7时对正己烷的降解效果最好。
实施例5：新奥尔良分枝杆菌WCJ对不同碳源底物的降解能力
在实际应用中，不仅仅存在正己烷这一种有机污染物，工业废气中一般包含多种挥发性有机废气。因此，研究新奥尔良分枝杆菌WCJ对其他底物的降解效果很有必要，采用实施例3实验操作，使初始细胞干重为20mg/L，在pH值为7.0，温度30℃的条件下发现该菌株对乙酸丁酯、石油醚、乙醇有不同程度的降解能力，具体情况如表2所示。菌株WCJ分别能在24h、48h和24h内将35.3mg/L乙酸丁酯、26mg/L石油醚和31.56mg/L乙醇去除100％、75％和70％。
表2细菌WCJ对不同碳源的降解效果
底物名称 底物初始浓度(mg/L) 降解时间/(h) 去除率/(％)
乙酸丁酯 35.3 24 100％
石油醚 26 48 75％
乙醇 31.56 24 70％
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 新奥尔良分枝杆菌WCJ及其在降解有机污染物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1388
<212> DNA
<213> 新奥尔良分枝杆菌(Mycolicibacterium neworleansense)
<400> 1
ttcgacggct ccctccacaa gggttaggcc accgggcttc gggtgttacc gactttcatg 60
acgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcagcgtt gctgatctgc 120
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gcagatcacc cacgtgttac tcacccgttc gccactcgag accccgaagg gcctttccgt 1380
tcgactgc 1388

Claims (5)

1.一种新奥尔良分枝杆菌WCJ在降解有机污染物中的应用，其特征在于，所述的应用是将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种至pH＝4-9、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃条件下进行培养，实现有机污染物的降解；所述有机污染物为正己烷、乙酸丁酯、石油醚或乙醇；新奥尔良分枝杆菌(Mycolicibacterium neworleansense)WCJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2021651，保藏日期：2021年05月31日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述新奥尔良分枝杆菌WCJ以静息细胞形式加入所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为10-50mg/L。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液中有机污染物为正己烷时，正己烷的初始浓度为85-405mg/L。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液组成为：K2HPO4·3H2O0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO3 1.7g/L、NH4Cl 0.98g/L、MgCl·6H2O 0.2033g/L、CaCl·2H2O 0.011g/L、FeCl3 0.0162g/L，微量元素母液5ml/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO4·5H2O 0.02g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·4H2O 0.1g/L、NaMoO4·2H2O 0.02g/L、CoCl·6H2O 0.02g/L、H3BO3 0.014g/L、ZnSO4·7H2O 0.10g/L，溶剂为去离子水。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述新奥尔良分枝杆菌WCJ以静息细胞形式接种，所述静息细胞按如下步骤制备：
(1)斜面培养：将新奥尔良分枝杆菌WCJ接种于斜面LB固体培养基，30℃培养24～36h，获得斜面菌体，所述LB固体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；
(2)扩大培养：用接种环挑取步骤(1)获得的斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃，培养24～36h，获得OD600＝0.1～0.2的菌液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得新奥尔良分枝杆菌WCJ静息细胞；所述LB液体培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
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1株氯苯高效降解菌的分离鉴定及降解特性;叶杰旭等;《环境科学》;第38卷(第2期);第802-808页 *

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