CN110494552B - 一株具有极强硫酸盐还原能力的菌株及其应用 - Google Patents

一株具有极强硫酸盐还原能力的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了一株具有硫酸盐还原能力的中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibrio sp.)XJ01菌株，保藏编号为CGMCC No.16138。对于0.5‑1g/L的SO4 2‑，该菌株在1天内可去除90％以上，5天内去除SO4 2‑最大含量50g/L，可用于快速还原硫酸盐。

Description

一株具有极强硫酸盐还原能力的菌株及其应用
技术领域
本发明是关于一株硫酸盐还原菌及其应用，具体地说，是关于一株中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)及其应用，所述菌株对硫酸盐具有极高的还原能力。本发明涉及微生物的筛选和应用领域。
背景技术
硫酸盐还原菌是参与油藏中硫循环、引起油藏硫化氢等硫化物含量增加的主要微生物类群。因其具有很强的环境适应能力，在处理高浓度硫酸盐废水、降解有机物和炼油工业等方面的潜在应用成为众多学者的研究热点。国内外学者对硫酸盐还原菌做了大量的工作，据统计，截止2015年，仅仅是以脱硫化命名的硫酸盐还原菌已定有50属、220多种(万云洋和赵国屏，2017)。但目前国内外学者分离得到的硫酸盐还原菌还原能力普遍较低，一般在<9g/L的硫酸根浓度下生长，鲜有报道具有极强硫酸盐还原能力菌株。
当前领域中需要继续寻找还原能力高、还原速率快的硫酸盐还原菌，以期望在高浓度硫酸盐废水等领域有良好应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种还原能力高、还原速率快的硫酸盐还原菌。
本发明的另一目的在于提供所述菌的应用，具体是可望在高浓度硫酸盐废水等领域有良好应用
本案发明人从采自辽河油田井口采出液中筛选得到一株能够快速、高效还原硫酸盐的还原菌，本发明中命名为XJ01菌株，根据形态、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析，可鉴定XJ01可能为脱硫弧菌目中的一株潜在新种。本发明中亦称该菌株为中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)。该中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)已于2018年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为：CGMCC No.16138，分类命名：中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibrio sp.)。
本发明的中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)具有极强的硫酸盐还原能力。在不同初始硫酸盐浓度的培养基中生长的实验结果表明：
(1)菌株可在[SO4 2-]＝0.5g/L硫酸盐还原率1d达到100％；
(2)[SO4 2-]＝1g/L硫酸盐还原率1d超过90％，2d即可达到最高100％；
(3)[SO4 2-]＝10g/L，2d时硫酸盐还原率最高，60％；
(4)[SO4 2-]＝20g/L，3d硫酸盐还原率最高达44％；
(5)[SO4 2-]＝30g/L，5d内硫酸盐还原率最高达37％；
(6)[SO4 2-]＝40g/L，5d内硫酸盐还原率最高达25％；
(7)[SO4 2-]＝50g/L，5d内硫酸盐还原率最高达13％；
(8)[SO4 2-]＞50g/L，菌株不再生长；
由此可见该菌株具有极强的硫酸盐还原能力。
从而，一方面，本发明提供了一种硫酸盐还原菌，其为中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibrio sp.)，其保藏编号为CGMCC No.16138。
本发明提供的硫酸盐还原菌中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibrio sp.)，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。
另一方面，本发明还提供了一种硫酸盐还原菌菌制剂，该菌制剂中含有本发明所述的硫酸盐还原菌，为可以为固态或液态菌制剂。
另一方面，本发明还提供了一种所述的硫酸盐还原菌或所述的硫酸盐还原菌菌制剂的方法，该方法包括：将所述的硫酸盐还原菌或所述的硫酸盐还原菌菌制剂在发酵培养基中培养。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述培养基中[SO4 2-]小于等于50g/L，优选为1g/L～50g/L，最适宜[SO4 2-]为10g/L。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述培养条件为：pH值6-9，温度20-45℃。
另一方面，本发明还提供了一种硫酸盐还原菌的代谢产物，其是按照上述培养硫酸盐还原菌的方法制备得到的。
另一方面，本发明还提供了所述的硫酸盐还原菌、或所述的硫酸盐还原菌菌制剂、或所述的代谢产物，在硫酸盐还原中的应用。
根据本发明的具体实施方案，是利用所述硫酸盐还原菌处理含有硫酸盐的废液。更具体应用时，所述废液中[SO4 2-]小于等于50g/L。优选地，所述废液中[SO4 2-]为0.5g/L～50g/L。更优选地，所述废液中[SO4 2-]为1g/L～10g/L。
本发明的中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)还原硫酸盐的能力高、还原速率快，可望在高浓度硫酸盐废水等领域有良好应用。
附图说明
图1为本发明的中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)的扫描电镜照片。
图2为实施例中所构建的筛选菌株和相似菌种的系统发育树。
图3A-图3B显示测定本发明的中石大脱硫弧菌XJ01菌株在不同初始硫酸盐浓度下随时间的还原能力的结果。
用于专利程序的微生物保存：
保藏日期：2018年07月20日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.16138；
分类命名：中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibrio sp.)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)的特点及应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1：硫酸盐还原菌中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)的分离及鉴定
1.取样和富集培养
在厌氧培养箱中取适量辽河油田采出液(41°05.538′N 121°44.050′E)，接入美国石油协会(API)推荐的硫酸盐还原菌培养基(以下简称API培养基)，主要成分有A溶液(g/L)：氯化钠，10；七水硫酸镁，0.01；磷酸氢二钾，0.01；酵母浸粉，1.0；乳酸钠(60％)，4mL；半胱氨酸盐酸盐，0.5；刃天青，0.001；用10M氢氧化钾调节pH至6.5。B溶液(g/L)：硫酸亚铁铵，0.2；抗坏血酸，0.2。
由于药品中存在高温下易分解、氧化的成分，需要采取不同的方法灭菌，因此将培养基分成A、B溶液分开配置。
首先配置A溶液，准确称取A溶液规定的药品，溶解于1L的去离子水中，充分溶解后分装至厌氧管(每管4mL)盖紧塞子，待充气。对配制好的培养基进行充氮除氧。开启真空泵与充气装置，先将厌氧管抽真空，然后充入氮气(分压在0.2-0.5之间均可)，如此，反复6次即可。充好气后用针头将厌氧管内超过常压的氮气放掉，然后在15磅，121℃下灭菌20min，冷却待用。
另配制新鲜的B溶液，用0.25μm无菌滤器注入灭过菌的空厌氧瓶中做成储存液。
待A培养基配好后，加入0.2mL的B溶液，配成完整的培养基，储存液不用时放入4℃冰箱保存。
35℃培养下7d。若培养基明显出现黑色浑浊，抽取培养基液面上方的气体，与浸湿的醋酸铅试纸反应，试纸变成黑色，且可以闻到浓烈的臭鸡蛋气味，则表明硫酸盐还原菌已大量繁殖，将上述菌液做接种液富集2～3次。
2.纯化
将前述“1.取样和富集培养”中富集培养液采用亨盖特滚管法获得单菌落，观察菌落形态，选取菌落独立无重叠、大小、表面特征、边缘和颜色等形态特征有差异的菌落，35℃培养下1～2d。可将所挑取的单菌落在显微镜下染色观察，如果不纯，再多次重复上述步骤直到得到纯菌株。
3.鉴定
经上述“2.纯化”步骤，本发明筛选得到一株菌株XJ01，进行如下鉴定：
(1)形态、生理生化鉴定
参照《环境地质微生物学实验指导》。XJ01为严格厌氧、革兰氏阴性菌、能运动、弧形，大小0.4-0.6μm×2.5-3.7μm、有鞭毛(图1)。菌株生长pH范围6-9(最适生长pH 7)，生长温度范围20-45℃(最适生长温度35℃)，生长不需要氯化钠。过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，可以利用乳酸、丙三醇、乳酸钠、柠檬酸三钠和甲醇作电子供体，能以硫酸盐和亚硫酸盐作为电子受体。
(2)分子生物学鉴定
取处于对数生长期的菌株，用细菌脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(
Figure GDA0003272005410000041
Figure GDA0003272005410000051
)提取菌液总DNA。以总DNA为模板，用通用引物27F和1492R(由
Figure GDA0003272005410000052
合成)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，反应体系：10×buffer(含Mg2+)，5μL；2.5mM dNTP，2μL；10uM正向引物，1μL；10uM反向引物，1μL；模板，2μL；Taq，0.5μL；ddH2O，38.5μL。反应条件：模板预变性5min，94℃变性1min，55℃复性1.5min，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后一个循环72℃延伸20min。PCR产物送至上海生工测序，所得序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
TATCTGAGCTGCGTCTACCGATTCTGCGTTCAACGGTACAGGCCTGAGTAAAGCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGATGATCTGCCCATGAGTTGGGAATAACGGCTGGAAACGGTCGCTAATACCGAATACGCTCCGATTTCACATTTCGGGGGAAAGGTGGCCTCTGCTTGCAAGCTACCGCTCATGGATGAGTCCGCGTCCCATTAGCTAGTTGGCGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGGAACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAACCTCTGTCAGGAGGGAAGAACCGCCATGGTGCTAATCAGCCATGGTCTGACGGTACCTCCAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCTGTTTGGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGCGGCTCAACCGCGGAATTGCCCTTGATACTGCTGGACTTGAGTTCGGGAGAGGGTGGCGGAATTCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGATATCTGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCACCTGGACCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGGATGCTAGGTGTCGGGGCCTTGAGCTTCGGTGCCGCAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTGAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCCAGGCTTGACATCCGGGAAACCCTCCCGAAAAGGAGGGGTGCTCTTCGGAGAATCCCGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTACCAGGCGATGCTGGGCACTCTATGGAGACCGCCCCGGTTAACGGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGCCTGGGGCTACACACGTACTACAATGGCGCACACAAAGGGCAGCGATACCGTGAGGTGGAGCCAATCCCAAAAAATGCGTCCCAGTCCGGATTGCAGTCTGCAACTCGACTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATTCGAGATCAGCATGCTCGGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCGGTTTTACCCGATACCGGTGAGCCAACCGCAAGGAGGCAGCCGTCTACGTAGACCCGG
采用EzTaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)进行同源性比对，利用MEGA5.0软件中的邻位连接法构建筛选菌株和相似菌种的系统发育树(图2)。分析发现XJ01T与长达脱硫弧菌(Desulfovibrio longreachensis)AB16910aT的相似性最高(97.89％)，其次是Desulfovibrio termitidis DSM 5308T(97.37％)，Desulfovibriooxamicus NCIMB 9442T(97.30％)和Desulfovibrio vulgaris HildenboroughT(93.77％)。
综合来看，本发明纯化得到的菌株XJ01可能为脱硫弧菌目中的一株新种。该菌株XJ01已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期：2018年07月20日，保藏编号为：CGMCC No.16138，分类命名：中石大脱硫弧菌(Cupidesulfovibriosp.)。
实施例2：硫酸盐还原菌中石大脱硫弧菌XJ01菌株(Cupidesulfovibrio sp.XJ01)在不同初始硫酸盐浓度下的还原能力
以乳酸钠作碳源考察不同SO4 2-浓度对菌株XJ01硫酸盐还原率的影响，在富集培养基的基础上做以下改动：用氯化亚铁代替硫酸亚铁铵(氯化亚铁提供铁离子，采用硫酸镁提供所有硫酸根，以便于计算)。
将菌株XJ01以10％(v/v)的接种量接种于初始SO4 2-浓度分别为0.5、1、10、20、30、40和50g/L培养基中，最适培养条件下分别培养1、2、3、4、5d后测定SO4 2-浓度，采用USEPASulfaVer4试剂浊度法测定菌液中SO4 2-浓度。
结果可参见图3A-图3B，本实施例的结果表明：
(1)菌株可在[SO4 2-]＝0.5g/L硫酸盐还原率1d达到100％；
(2)[SO4 2-]＝1g/L硫酸盐还原率1d超过90％，2d即可达到最高100％；
(3)[SO4 2-]＝10g/L，2d时硫酸盐还原率最高，60％；
(4)[SO4 2-]＝20g/L，3d硫酸盐还原率最高达44％；
(5)[SO4 2-]＝30g/L，5d内硫酸盐还原率最高达37％；
(6)[SO4 2-]＝40g/L，5d内硫酸盐还原率最高达25％；
(7)[SO4 2-]＝50g/L，5d内硫酸盐还原率最高达13％；
(8)[SO4 2-]＞50g/L，菌株不再生长；
由此可见该菌株具有极强的硫酸盐还原能力。
序列表
<110> 中国石油大学(北京)
<120> 一株具有极强硫酸盐还原能力的菌株及其应用
<130> WPI18CN0267X-CN
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 中石大脱硫弧菌(Cupdesulfovibrio sp.)
<400> 1
tatctgagct gcgtctaccg attctgcgtt caacggtaca ggcctgagta aagcggcgca 60
cgggtgagta acgcgtggat gatctgccca tgagttggga ataacggctg gaaacggtcg 120
ctaataccga atacgctccg atttcacatt tcgggggaaa ggtggcctct gcttgcaagc 180
taccgctcat ggatgagtcc gcgtcccatt agctagttgg cggggtaatg gcccaccaag 240
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gacgccgcgt gagggatgaa ggccttcggg tcgtaaacct ctgtcaggag ggaagaaccg 420
ccatggtgct aatcagccat ggtctgacgg tacctccaaa ggaagcaccg gctaactccg 480
tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaatcact gggcgtaaag 540
cgcacgtagg ctgtttggta agtcaggggt gaaatcccgc ggctcaaccg cggaattgcc 600
cttgatactg ctggacttga gttcgggaga gggtggcgga attccaggtg taggagtgaa 660
atccgtagat atctggagga acatcagtgg cgaaggcggc cacctggacc gatactgacg 720
ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa 780
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cccgcctggg gagtacggtc gcaaggctga aactcaaaga aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag tatgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccca ggcttgacat 960
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tggctgtcgt cagctcgtgc cgtgaggtgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc 1080
tatccttagt tgctaccagg cgatgctggg cactctatgg agaccgcccc ggttaacggg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gcctggggct acacacgtac 1200
tacaatggcg cacacaaagg gcagcgatac cgtgaggtgg agccaatccc aaaaaatgcg 1260
tcccagtccg gattgcagtc tgcaactcga ctgcatgaag ttggaatcgc tagtaattcg 1320
agatcagcat gctcgggtga atgcgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac 1380
gaaagtcggt tttacccgat accggtgagc caaccgcaag gaggcagccg tctacgtaga 1440
cccgg 1445

Claims (12)

1.一种硫酸盐还原菌，其为中石大脱硫弧菌（Cupidesulfovibrio sp.），其保藏编号为CGMCC No. 16138。
2.一种硫酸盐还原菌菌制剂，该菌制剂中含有权利要求1所述的硫酸盐还原菌，为固态或液态菌制剂。
3.培养权利要求1所述的硫酸盐还原菌的方法，该方法包括：将权利要求1所述的硫酸盐还原菌在发酵培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养基中[SO4 2-]小于等于50g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述培养基中[SO4 2-]为1g/L~50g/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养基中[SO4 2-]为10g/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述培养条件为：pH值6-9，温度20-45°C。
8.权利要求1所述的硫酸盐还原菌或权利要求2所述的硫酸盐还原菌菌制剂在硫酸盐还原中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，是利用所述硫酸盐还原菌处理含有硫酸盐的废液。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述废液中[SO4 2-]小于等于50g/L。
11.根据权利要求9所述的应用，其中，所述废液中[SO4 2-]为0.5g/L~50g/L。
12.根据权利要求9所述的应用，其中，所述废液中[SO4 2-]为1g/L~10g/L。
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Citations (4)

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