CN109355223B - 一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌n2及其应用 - Google Patents

一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌n2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌N2及其应用。该菌是从对虾养殖水体分离获得的。研究证实，该枯草芽孢杆菌N2可迅速有效地降低水体中的氨氮含量，并不会将氨氮转变为亚硝酸盐再次对养殖对象造成胁迫或伤害；此外，该菌与卤虫悉生实验表明菌株在较高浓度时也不会对养殖动物产生毒害作用，还有一定益生作用；菌株耐受性较广，盐度及环境pH对细菌生长影响较小，无论在海水淡水、环境偏酸偏碱所分离菌株N2均能良好生长，并且高效发挥功能；在海水养殖业中意义重大，将该枯草芽孢杆菌N2接种于养殖水体中，水质稳定，养殖对象健康生长，适应性强，安全性高。该菌可作为新型微生态制剂的良好菌株，具有较好的应用前景。

Description

一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌N2及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌N2及其应用。
背景技术
随着养殖规模的扩大和养殖密度的提高，环境污染和经济制约等问题日益严重，极大阻碍了水产养殖业的发展。特别是在集约化水产养殖系统中，为追求产量和经济效益，大量的饲料、肥料以及药物投入和养殖鱼虾类代谢物沉积，导致池塘内源性污染严重，养殖生态环境恶化，残饵及粪便经微生物分解后产生大量的氨氮，高浓度氨氮对养殖对象具有很强的毒性，往往会导致养殖对象大规模死亡，造成巨大的经济损失。在报道的文献中认为一个健康的水体中氨氮浓度不应超过0.2mg/L。因此，筛选能降低水体中氨氮的微生物菌种并应用于水产养殖意义重大。
从上世纪80年代初，我国已开始将微生态制剂应用于水产养殖业，其中最主要的为硝化细菌和反硝化细菌，它们多为光合自养菌，其存在发挥作用起始时间较长，质量不稳定，难以成为优势菌等缺陷。市售微生态制剂菌株及其功能描述模糊，无科学严谨的技术指导，缺乏产品降解氨氮的效果评估，施用后水质改善效果往往微乎其微。而从自然养殖水体中分离到的枯草芽孢杆菌为异养菌，菌株明确，杆菌利用水体中额外添加的碳源作为能源，以氨氮作为氮源同化为自身有机物积累在细菌体内，经检测及效果评估，质量稳定、安全、无毒副作用、本身就为水体优势菌，降解氨氮效果显著，更加适合作为微生态制剂，科学地应用于水产养殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2及其应用。所述的枯草芽孢杆菌N2降解氨氮效果显著，适应性广，可应用于治理水产养殖水体，稳定水质，且对养殖动物安全。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明是从对虾养殖水体，通过在基础培养基(M63)中加入蔗糖等碳源，加入硫酸铵作为氮源，富集含有降氨氮能力的异养细菌，通过相应上述培养基的琼脂平板进行纯化，再次挑单菌落到上述培养基中，挑选出生长速度快降氨氮能力最强的菌株；最后通过16SrDNA分子鉴定，确定为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)的细菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2。
进一步地，对本发明分离得到的枯草芽孢杆菌N2进行氨氮浓度、细菌浓度随时间变化的分析，其结果表明，该枯草芽孢杆菌N2在菌体生长的过程中将氨氮同化为自身有机物，枯草芽孢杆菌N2的对数生长期为降解氨氮最快的时期，在细菌生长达到稳定期时，水体中氨氮几乎全部去除。将枯草芽孢杆菌N2作为益生菌以5×106个/mL的量接种于南美白对虾养殖水体中，氨氮维持在较低水平，对虾生长良好。
因此，上述的枯草芽孢杆菌N2具有氨氮降解能力，可应用于治理水产养殖水体，降解水产养殖水体中的氨氮，净化稳定水质。
因此，本发明提供上述的枯草芽孢杆菌N2在降解水体中氨氮的应用。
优选，是降解水产养殖水体中的氨氮的应用。
与现有技术相比，本发明的创新性和有益效果在于：
本发明筛选到的枯草芽孢杆菌N2可迅速有效地降低水体中的氨氮含量，且方式为同化作用，并不会将氨氮转变为亚硝酸盐再次对养殖对象造成胁迫或伤害；该菌与卤虫悉生实验表明菌株在较高浓度时也不会对养殖动物产生毒害作用，还有一定益生作用；菌株耐受性较广，盐度及环境pH对细菌生长影响较小，无论在海水、淡水、环境偏酸、偏碱所分离菌株N2均能良好生长，并且高效发挥功能；在海水养殖业中意义重大，将该枯草芽孢杆菌N2接种于养殖水体中，养殖对象健康生长，适应性强，安全性高。该菌可作为新型微生态制剂的良好菌株，具有较好的应用前景。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2于2018年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No.60439。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌N2在2216E培养基平板上的菌落形态特征图；
图2为枯草芽孢杆菌N2在不同pH下的细胞数量变化图；
图3为枯草芽孢杆菌N2在不同盐度下的细胞数量变化图；
图4为枯草芽孢杆菌N2在不同温度下的细胞数量变化图；
图5为南美白对虾养殖水体中氨氮含量与枯草芽孢杆菌N2细胞浓度之间的关系图；
图6为南美白对虾养殖水体中氨氮含量随时间的变化图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1具有降氨氮功能的枯草芽孢杆菌N2的富集及筛选
样品来源：中国科学院南海海洋研究所养殖房凡纳滨对虾(南美白对虾)养殖水体。
具体的实施步骤如下：在无菌条件下，将对虾养殖水体以1％v/v的接种量接种于装有100mL液体筛选培养基的250mL锥形瓶，置于摇床中200rpm 30℃培养48h；取该培养液100μL涂布于固体筛选培养基中，30℃恒温箱中培养24h，挑取单菌落，再次接种于液体筛选培养基中进行纯培养，纯培养36h后取培养液稀释10倍测定培养液中氨氮含量，挑取出降解氨氮效果最好的株菌，菌株号为N2，命名为N2菌株。
上述的液体筛选培养基每升含氯化钠20g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.5g、磷酸氢二钾0.5g、蔗糖2g、酵母提取物0.2g，硫酸铵1mg，溶剂为去离子水；
配制方法为：将氯化钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钾和酵母提取物，混合，溶于适量的水，在121℃灭菌20分钟，然后加入抽滤灭菌的硫酸铵溶液和蔗糖溶液，混匀，使每升筛选培养基中含氯化钠20g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.5g、磷酸氢二钾0.5g、蔗糖2g、酵母提取物0.2g，硫酸铵1mg。
上述的固体筛选培养基是在液体筛选培养基组分中加入质量分数为1.5％的琼脂粉，混合制得。
实施例2枯草芽孢杆菌N2菌种的鉴定
1、形态观察
将纯培养菌株按平板划线法接种于2216E固体培养基表面，30℃恒温箱中培养24h后观察菌落形态特征。N2菌株菌落照片见图1，该菌落呈点状，白色不透明，边缘光滑，菌落凸起。
2216E固体培养基是在2216E液体培养基组分中加入质量分数为1.5％的琼脂粉，混合制得。所述的2216E液体培养基每升含蛋白胨5g、酵母浸粉1g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶0.034g、硼酸0.022g、硅酸钠0.004g、氟化钠0.0024g、硝酸铵0.0016g、磷酸氢二钠0.008g，溶剂为去离子水。
配方方法：按配方量称取各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。
2、生理生化鉴定
采用Biolog genIII微孔板对N2菌株进行生理生化鉴定。将纯化的N2菌株，取单菌落用稀释液(NaCl 0.4％，吉冷胶0.02％，121℃灭菌20分钟，用时每20mL加100μL 7.66％巯基乙酸钠溶液)稀释至合适浊度，透光率为90～98％，将稀释液加至biology全自动生化鉴定板中，每孔加100μL，30℃培养20h后上机读数，记录读数结果，进行菌株对95种碳源的利用分析，结果见表1，鉴定结果显示，该N2菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
表1 N2菌株生理生化鉴定项目及结果
Figure BDA0001858702810000051
Figure BDA0001858702810000061
注：“+”表示生长或阳性反应，“-”表示不生长或阴性反应。
3、分子鉴定
取N2菌株纯培养菌液离心，去上清，以菌体沉淀提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用通用引物27F/1492R(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA扩增并测序，其序列见序列表中SEQ ID NO.1所示，将测序所得到的基因组序列经Blast搜索比对，该N2菌株与Bacillus subtilis有较高同源性，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。结合形态、生理生化特征(如表1所示)及16S rDNA序列分析，鉴定为Bacillus subtilis，将其命名为：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)N2。该菌株于2018年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No.60439。
实施例3枯草芽孢杆菌N2最适生长条件的探究
分别研究不同pH、温度、NaCl质量分数(盐度)对枯草芽孢杆菌N2生长的影响。其中，不同的温度为：20℃、25℃、30℃、37℃、43℃；不同的pH值为：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的NaCl质量分数为：0％、1％、2％、3％、4％、5％。
以上实验除了考察因素外，发酵条件都是将枯草芽孢杆菌N2培养液以1％(v/v)的接种量接种于LB发酵培养基中，在30℃、200rpm下培养24h后，取样测定各条件的OD600值，以不接菌的LB发酵培养基作空白对照。以培养温度、pH值、NaCl质量分数为横坐标，OD600值为纵坐标绘制各自曲线。结果见图2-4，由图2-4可知，枯草芽孢杆菌N2能在0～5％的盐度下生长，为广盐性细菌，最适生长温度为30℃，最适生长pH值为6，在pH为8的情况下，该菌生长也较为迅速。其在盐度为0，温度30℃，pH为6的条件下生长最好。
LB发酵培养基每升含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，溶剂为去离子水；配制方法为：按配方量称取各组分，溶于去离子水，混合均匀，121℃灭菌20分钟，即得。
实施例4枯草芽孢杆菌N2去除水体中氨氮效率与细胞浓度关系的研究
取对虾养殖水体经0.22μm滤膜抽滤后，用硫酸铵调节氨氮至终浓度为3mg/L左右，加入蔗糖至终浓度为2g/L，分装至已灭菌的500mL的锥形瓶中，每瓶加入体积为250mL。实验组为将枯草芽孢杆菌N2培养液以1％(v/v)的接种量接种于含250mL养殖水体的锥形瓶中，对照组为不加任何菌种，于0h、3h、6h、9h、12h、15h、24h取水样，以无菌水为空白测定实验组水体的OD600值，反映水体中的细菌浓度，利用OPA荧光法测定不同时间点的氨氮含量，结果见图5。
如图5所示，养殖水体中氨氮含量随枯草芽孢杆菌N2的生长不断降低，枯草芽孢杆菌N2在菌体生长时以水体中氨氮作为氮源同化为自身有机物储存在细胞内，在细菌对数生长期时氨氮降解速率最快，在接种后的12h，细菌生长达到稳定期，水体中已无氨氮存在，且含量一直维持在0的状态，在有氨氮存在的水体中该枯草芽孢杆菌N2对氨氮降解率在12h时高达100％。
实施例5菌株安全性测定
以卤虫(Artemiasalina)为动物模型，检测分离菌株对卤虫的安全性。称取1g卤虫卵，75％无水乙醇消毒处理12h，放入1000mL灭菌海水，于25℃连续充氧曝气孵化20h。取12孔板每孔随机取30尾孵化出的卤虫于2mL无菌海水中，并在室温下适应6h，每孔加入细菌至终浓度1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL，以不加细菌的孔作为阴性对照，以加了相同浓度致病菌哈氏弧菌的孔作为阳性对照，所有处理设置3个重复，每隔12h，置于体表显微镜下挑出死亡的卤虫，连续观察2d，计算卤虫存活率以及其对的半致死浓度，死亡率计算公式如下：
死亡率/％＝(每隔12h挑出的死亡数)/总卤虫数×100％
当死亡率为50％时，对应的细菌浓度即为半致死计量浓度。结果见表2。
表2不同浓度筛选菌株N2和哈氏弧菌NCIMB1280感染48h卤虫死亡率
Figure BDA0001858702810000091
卤虫保护性实验结果表明，在接种感染后的48h，阴性对照组存活率为69％，试验组菌株N2存活率最高为89％，阳性对照组哈氏弧菌存活率仅为2％，菌株N2半致死浓度为107cfu/mL，证实N2对养殖动物无毒。
实施例6枯草芽孢杆菌N2在养殖水体中的安全性检测及氨氮降解效率
将枯草芽孢杆菌N2摇床过夜培养，取适量菌液于6000rpm离心10min，去上清，用无菌海水清洗沉淀三遍，再次离心，以5×106个/mL的接种量添加至含8L养殖水体的饲养了南美白对虾10尾的对虾养殖缸，对照组不加细菌，正常投喂饲料，连续一周观察缸内对虾存活状态及氨氮含量。实验期间对虾健康生长，无死虾病虾出现，如图6所示，实验组氨氮含量维持在0.5mg/L的水平，对照组氨氮连续上升至3.4mg/L，实验组与对照组之间在对虾存活率方面无差异，由此说明该枯草芽孢杆菌N2在对虾养殖水体中能控制氨氮含量，稳定水质且具有非常高的养殖动物安全性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株具有氨氮降解功能的枯草芽孢杆菌N2及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌 N2(Bacillus subtilis N2)
<400> 1
cgggcgggtg ctatactgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
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agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
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aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960
gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020
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ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaaggg 1440
aacagaa 1447

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N2，保藏编号为：GDMCC No.60439。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌N2在降解水体中氨氮的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是降解水产养殖水体中的氨氮的应用。
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