CN111100824B - 一株芽孢杆菌及其在养殖水体中脱氮除硫的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一株芽孢杆菌及其在养殖水体中脱氮除硫的应用，属于环境微生物、环境工程技术领域。该菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16，保藏编号为GDMCC No：60942。所述菌株从养殖池塘底泥中筛选得到，再应用于养殖水体不存在生态安全风险，符合生物安全法规。该菌株具有自养及反硝化性能，可以利用无机碳为唯一碳源，氨态氮、硝酸盐氮或亚硝酸氮为唯一氮源进行新陈代谢，达到去除氮源的目的；具有除硫性能，可以利用硫化物作为电子供体氧化硫化物获取能量；同时，对亚硝酸盐的耐受力强，生长良好。所述菌株可制成微生态制剂，应用于养殖水体的脱氮除硫处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。

Description

一株芽孢杆菌及其在养殖水体中脱氮除硫的应用
技术领域
本发明属于环境微生物、环境工程技术领域，涉及一株具有脱氮除硫功能的芽孢杆菌及其在养殖水体中脱氮除硫的应用。
背景技术
近年来，我国的水产养殖业迅速发展，集约化养殖、高密度养殖规模不断扩大。为了追求更高的经济效益，会投放大量的饲料。集中投饵料会造成养殖水体中积累大量的残余饵料、动物粪便和死亡的动物尸体，导致水体中的氮元素含量严重超过水质标准，严重破坏养殖池塘生态环境，同时微生物分解作用还会产生硫化氢气体，最终造成经济损失。
氮元素作为生物生长的必需元素，对水产养殖的影响巨大。一般认为，水体中的氮气和硝态氮对水产动物是无害的，然而较高浓度的氨态氮、亚硝态氮对水产动物具有较高的毒性。氨态氮、亚硝态氮和硫化氢积累会造成一系列的不利影响。水体脱氮除硫的传统方法主要有物理法、化学法。相比较于物理化学方法，生物法具有处理成本低、无二次污染等优点，所以一般采用生物法进行水体处理。
随着生物学和生物技术的发展，研究者们对原有的生物脱氮除硫方法进行探索和改进，生物法成为处理养殖水体的新方向。微生物菌种是采用生物法进行脱氮除硫技术的核心。因此，筛选脱氮除硫性能优良的菌株成为解决上述问题的有效途径。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16。该菌株具备良好的脱氮除硫性能，72h时水体中硝态氮去除率可以达到97％；24h时水体中的亚硝态氮的去除率可以达到99.9％；48h时水体中的硫化物的去除率可以达到99.8％。该芽孢杆菌菌株可开发成微生态制剂应用于养殖水体的脱氮除硫处理。
本发明的另一目的在于提供上述芽孢杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一株芽孢杆菌，菌株命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16，是从池塘底泥中分离纯化获得。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：60942，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2020年1月2日。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16，具有以下表型特征：在28℃下，固体LB平板上培养16～24h后，单菌落呈现乳白色、不透明、边缘整齐；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阳性，菌体呈短杆状，大小约为2.0μm×0.5μm。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的16S rDNA基因序列特征：其16S rDNA具有如序列表中如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1441bp。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16，根据其形态特征和16S rDNA基因序列在GenBank中的BLAST结果，鉴定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
一种生物制剂，基于上述芽孢杆菌制备得到。
所述的生物制剂由该芽孢杆菌经液体培养制备得到，优选包含以下步骤：将该芽孢杆菌接种至LB液体培养基中培养，即可获得生物制剂。
所述的培养指在28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养24h。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16能够在好氧的条件下，利用氨态氮盐或硝酸盐或亚硝酸盐为唯一氮源生长，同时还可以利用硫化物氧化来获取生长所需能量。
具体的，以有机物为电子受体，
Figure BDA0002376796240000021
为电子供体，将
Figure BDA0002376796240000022
氧化为
Figure BDA0002376796240000023
或
Figure BDA0002376796240000024
能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，
Figure BDA0002376796240000025
或
Figure BDA0002376796240000026
为电子受体，将其还原为氮气；以硫化物为电子供体进行氧化，来获取生长所需能量。
本发明所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16可用于水体脱氮除硫，在实际应用中，可将菌株置于养殖水体中实现脱氮除硫的目的。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在水体中的投加量为105～107cfu/mL。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16菌株，该菌株从养殖池塘底泥中筛选得到，再应用于养殖水体不存在生态安全风险，符合生物安全法规。
(2)本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16菌株具有自养及反硝化性能，可以利用无机碳为唯一碳源，氨态氮、硝酸盐氮或亚硝酸氮为唯一氮源进行新陈代谢，达到去除氮源的目的；对水体中的
Figure BDA0002376796240000031
有很强的去除作用，利用该菌株处理72h后，水体中
Figure BDA0002376796240000033
的去除率可以达到97％，水体中的
Figure BDA0002376796240000032
的去除率可以达到99.99％。可见，该菌株对养殖水体中的无机氮有很强的去除作用，相对于传统的化学法和物理法除氮措施，具有成本低、操作简单和处理效果好的优点。
(3)本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16菌株具有除硫性能，可以利用硫化物作为电子供体氧化硫化物获取能量；对水体中的硫化物有很强的去除作用，利用该菌株处理48h后，水体中硫化物的去除率可以达到99.8％。
(4)本发明提供的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)SC16菌株对亚硝酸盐的耐受力强，在250mg/L的
Figure BDA0002376796240000034
水体中依然生长良好。
(5)本发明提供的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)SC16菌株可制成微生态制剂，应用于养殖水体的脱氮除硫处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益。
附图说明
图1是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在固体LB平板上的形态以及扫描电镜形态。
图2是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16菌株16S rDNA PCR扩增凝胶电泳图；其中，泳道M为DNAmarker DL2000；泳道1～5为扩增的芽孢杆菌SC16菌株16SrDNA条带。
图3是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16基于16SrDNA基因序列构建的系统发育进化树。
图4是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在28℃对硝态氮的降解曲线。
图5是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在28℃时对氨态氮的降解曲线。
图6是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在28℃时对亚硝态氮的降解曲线。
图7是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在不同亚硝态氮浓度条件下的降解曲线。
图8是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在不同亚硝态氮浓度条件下的生长曲线。
图9是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在28℃时对硫化物的降解曲线。
图10是芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16在28℃时对硫化物的降解效果。其中，A是实验组(添加芽孢杆菌SC16)去除硫化物的效果；B是对照组(未添加芽孢杆菌SC16)去除硫化物的效果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》(第四版，中国环境科学出版社，2002)。菌密度(OD600)通过酶标仪(EPOCH,
Figure BDA0002376796240000041
Instruments.Inc)进行测定。
实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。
实施例1：所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的分离和筛选
样品为取自养殖鱼塘的底泥，从底泥样品中取5mL泥水混合液，至95mL灭菌的DM富集培养基中。然后放入28℃恒温摇床以200rpm转速富集培养24h。连续富集培养三次，将第三次富集液进行10倍梯度稀释，均匀涂布于溴百里酚蓝(BTB)固体培养基(琼脂20g/L，其余成分见下)。在28℃恒温培养箱培养3d后，挑取周围培养基出现蓝色晕圈的菌株至LB培养基。在LB培养基上划线纯化并编号保藏，经初筛共得到19个菌株，其中包括一株菌株SC16。
DM富集培养基的配方为：KNO3 0.5g/L，CH3COONa 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.07g/L，KH2PO4 0.4g/L，微量元素溶液1mL，Tris缓冲液12mL，pH7.0。
微量元素溶液的配方为：ZnSO4 2.2g/L，FeSO4·7H2O 3.0g/L，CaCl2 5.5g/L，MnCl2·4H2O 5.0g/L，CuSO4·5H2O 1.6g/L，CoCl2·6H2O 1.6g/L，(NH4)6Mo7O4·2H2O 1.1g/L。
BTB固体培养基的配方为：L-Asparagine 10.0g/L，KNO3 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，FeCl2·6H2O 0.05g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，1％的溴百里酚蓝1mL。
LB培养基的配方为：细菌学蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。以上培养基均121℃处理20min。
实施例2：菌株SC16的形态学鉴定和系统进化树分析
(1)形态学鉴定
用接种环挑取实施例1中保藏的菌株SC16的种子液于LB固体平板上划线，28℃恒温培养24h。取单菌落进行革兰氏染色，染色完成后在显微镜下观察。同时挑取单菌落于LB液体培养基中进行扩大培养。取LB固体平板，在平板上面铺一层透明的无菌玻璃纸，将上述种子液用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释十倍，取稀释液于玻璃纸上涂板，28℃恒温培养24h。将玻璃纸切片(1cm×1cm)，将其放于2.5％的戊二醛中固定1.5h。取固定样品，分别用30％、50％、70％、90％、100％的无水乙醇进行洗脱10min。取洗脱后的样品，真空干燥2h。取干燥样品，固定于铜台，喷金后进行扫描电镜拍照。
结果显示：菌株SC16为革兰氏阳性，在固体LB平板上的菌落为乳白色，形状近圆形，表面光滑，边缘整齐，湿润有光泽。菌株SC16在扫描电镜下的形态为短杆状，单个排列，大小约为2.0μm×0.5μm(长×宽)，见图1。
(2)进化树的建立
取SC16菌株活化种子液进行菌落PCR。反应引物为通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
其反应体系如下：
ddH<sub>2</sub>O 15.5μL
10×KODBuffer缓冲液 2.50μL
dNTPs(2mmol/L) 2.00μL
MgSO<sub>4</sub>(25mmol/L) 1.50μL
引物27F(10μmol/μL) 0.75μL
引物1492R(10μmol/μL) 0.75μL
模板 1.00μL
KODplusneo酶 0.50μL
总体积 25μL
反应程序如下：预变性：95℃，5min；变性：94℃、1min，退火：56℃、1min，延伸：68℃、1min，30个循环；延伸：68℃，10min；完成并4℃保存。PCR扩增凝胶电泳结果见图2，选取合适的PCR扩增产物送华大基因测序。将得到16S rDNA测序结果在EzTaxon专业数据库中进行在线比对分析，用Cluxtalx1.83软件进行多序列匹配排列，分析结果采用Mega6.0软件中的邻位相连法(Neighbor-joining method)做出系统进化树，并自举分析(Bootstrap)进行置信度检测，自举数据集1000次。
结果显示：菌株SC16与芽孢杆菌Bacillus subtitles PWA的相似度最高，比对序列长度占16S rDNA基因序列全长的94.2％。采用邻接法构建系统发育树(图3)，SC16菌株与Bacillus subtitles PWA(MH142143)聚为一支。综合菌株SC16的形态学结果，由此初步推测SC16为芽孢杆菌属，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的保藏信息：保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC No：60942，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期：2020年1月2日。
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示(1441bp)。
实施例3：所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的好氧反硝化性能实验
用接种环挑取实施例2中保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的种子液于LB固体平板上划线，28℃恒温培养24h。从LB平板上挑取一环SC16菌落至LB液体培养基中，28℃摇床200rpm培养24h，用PBS缓冲液将菌液(6500rpm，4℃)离心洗涤，按照10％(体积比)比例接种至DM-1，DM-2和DM-3液体培养基(其中DM-1中的氮源为KNO3 0.5g/L，DM-2中的氮源为NH4Cl 0.5g/L，DM-3中的氮源为NaNO2 0.3g/L)，在28℃、200rpm条件下摇床培养。每隔12h取样测定硝态氮
Figure BDA0002376796240000063
亚硝态氮
Figure BDA0002376796240000062
氨态氮
Figure BDA0002376796240000064
以及菌密度(OD600)，通过分析三种氮源的去除率来判断菌株的好氧反硝化性能。由图4，图5和图6可看出，菌株SC16具备很好的脱氮性能，72h时水体中硝态氮去除率可以达到97％；24h时水体中的亚硝态氮的去除率可以达到99.9％。
实施例4：所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16对亚硝酸盐的耐受性实验
配制一系列含不同
Figure BDA0002376796240000065
浓度(0.1，2，50，100，200，250，300，500和1000mg/L)的液体DM培养基。用接种环挑取实施例2中保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的种子液于LB固体平板上划线，28℃恒温培养24h。从LB平板上挑取一环SC16菌落至LB液体培养基中，28℃摇床200rpm培养24h，用PBS缓冲液将菌液(6500rpm，4℃)离心洗涤，按照10％(体积比)比例接种至不同浓度
Figure BDA0002376796240000068
浓度的DM培养基中。在28℃、200rpm条件下摇床培养。每隔12h取样测定亚硝态氮
Figure BDA0002376796240000067
和菌密度(OD600)。
由图7和图8可知，菌株SC16对亚硝酸盐有很强的耐受性，在24h内能去除200mg/L的亚硝态氮，并且在250mg/L亚硝态氮浓度下也能生长。
实施例5：所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16对硫化物的去除实验
用接种环挑取实施例2中保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC16的种子液于LB固体平板上划线，28℃恒温培养24h。从LB平板上挑取一环SC16菌落至LB液体培养基中，28℃摇床200rpm培养24h，用PBS缓冲液将菌液(6500rpm，4℃)离心洗涤，按照10％(体积比)比例接种含硫化物的液体培养基中。在28℃、200rpm条件下摇床培养。每隔12h取样测定硫化物(S2-)和菌密度(OD600)。
含硫化物的液体培养基配方：Na2S·9H2O 1.0g/L，CH3COONa 2.0g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.07g/L，KH2PO4 0.4g/L，微量元素溶液1mL，Tris缓冲液12mL，pH7.0。微量元素溶液的配方见实施例1。
由图9和图10可知，菌株SC16对硫化物由很强的降解效果，48h时水体中硫化物的去除率可以达到99.8％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一株芽孢杆菌及其在养殖水体中脱氮除硫的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）SC16的16S rDNA基因序列
<400> 1
aaggttgcag ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgcctcg 1440
a 1441
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌，其特征在于：名称为芽孢杆菌（Bacillus sp.）SC16，于2020年1月2日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60942。
2.一种基于权利要求1所述的芽孢杆菌制备得到的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：通过权利要求1所述的芽孢杆菌经液体培养制备得到。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于：包含以下步骤：
将芽孢杆菌接种至LB液体培养基中培养，即获得菌剂。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：
所述的培养指在28～30 ℃，摇床震荡速率为180～200 rpm下培养24 h。
6.权利要求2～5任一项所述的菌剂在水体中脱氮除硫的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述的菌剂在养殖水体中脱氮除硫的应用。
8.权利要求1所述的芽孢杆菌在水体中脱氮除硫的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述的芽孢杆菌在养殖水体中脱氮除硫的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：
所述的芽孢杆菌的投加量为105～107cfu/mL。
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