CN101234823A

CN101234823A - 一种修复水体石油污染的方法

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Publication number: CN101234823A
Application number: CNA2008100265488A
Authority: CN
Inventors: 尹华; 叶锦韶; 何宝燕; 张娜; 彭辉; 秦华明
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2008-08-06

Abstract

本发明公开了一种修复水体石油污染的方法，包括以下步骤：(1)表面活性剂产生菌的筛选及活性剂的提纯分析：采集含油废水，稀释，涂布于原油平板培养基上培养出菌落后经划线分离、纯化、保种，获得可能产生表面活性剂的菌株；将所筛选的菌株接种在合适的液体培养基中振荡培养，获取含有表面活性物质的发酵液；从发酵液中提纯表面活性物质；(2)原油降解菌的筛选；(3)表面活性剂－原油降解菌联合处理含油废水。本发明的生物表面活性剂比一般的化学表面活性剂在性能方面更优越，而且利用生物表面活性剂－原油降解菌联合处理水体的石油污染，处理效率高，无二次污染。

Description

一种修复水体石油污染的方法

技术领域

本发明涉及石油污染生物修复，特别是一种利用生物表面活性剂-原油降解菌联合修复水体石油污染的方法，该方法处理水体的石油污染效率高，无二次污染。

背景技术

众多研究表明，在被石油污染的土壤和水体中，微生物的数量会先减少，随后再逐渐增加，或在被石油污染的地区，一些微生物能够更好的生长，这说明自然界的微生物普遍存在利用石油烃类生长的能力，而有些微生物在石油烃环境中会更好的生长。在石油环境的长期选择下，这些微生物对石油烃类的降解效果会逐渐加强和稳定下来，甚至出现能以石油烃为唯一碳源生长的微生物。

一般来说，石油烃进入微生物细胞可分为两个阶段，第一阶段是烃类从油相转移到微生物细胞表面，第二阶段是烃类通过细胞壁与膜进入细胞内。在第一阶段即烃类的转移阶段中，由于石油烃几乎不溶于水，所以微生物降解烃类时有水相、烃相、空气相和微生物相同时存在，是一个很复杂的体系。在利用微生物降解修复石油污染时，生物表面活性剂的存在可以降低油-水的界面张力，有利于油在水体中的分散，在水体中形成微小油滴，这样微生物能更好的与石油物质接触，达到好的降解效果。尤其对于石油中较难降解的烃类物质，其憎水性是微生物进行代谢、降解的主要障碍，因为烃基质必须通过外层亲水细胞壁(膜)才能进入细胞内而被位于细胞质膜中的烃降解酶所代谢。而某些细菌可以通过产生生物表面活性剂促使烃类乳化，使其被动扩散进入细胞内，从而被降解。

生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌的具有一定表面和界面活性，同时含有亲水基和疏水基的两性化合物。许多微生物，如细菌、酵母等在各种碳源，特别是在疏水性基质如烃类中能产生生物表面活性剂。生物表面活性剂按照结构分为：糖脂、脂肪酸、磷脂和含氨基酸类脂等，大多数生物表面活性剂为糖脂类物质。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种处理效率高的利用生物表面活性剂-原油降解菌联合修复水体石油污染的方法。

本发明的上述技术目的通过以下技术方案予以实现：

一种修复水体石油污染的方法，包括以下步骤：

(1)表面活性剂产生菌的筛选及活性剂的提纯分析：采集含油废水，稀释，涂布于原油平板培养基上培养出菌落后经划线分离、纯化、保种，获得能产生表面活性剂的菌株；将所筛选的菌株接种在液体培养基中振荡培养，获取含有表面活性物质的发酵液；从发酵液中提纯表面活性物质，分析其中的化合物组成；

(2)原油降解菌的筛选：采集含油废水，稀释，涂布于原油平板培养基上培养出菌落后划线分离、纯化、保种，纯化后的菌种在原油培养基平板上反复驯化，获得原油降解菌种；

(3)表面活性剂-原油降解菌联合处理含油废水：同时接种上述表面活性剂产生菌和原油降解菌于含油废水中，利用所产生的表面活性剂乳化原油，使其分散溶解在水中，以便降解菌对其进行生物降解及作为碳源利用。

上述步骤(1)和步骤(2)中的原油培养基的pH为7.5，包含原油10g、NH₄NO₃3g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、微量元素液2mL、和水1000mL；步骤(1)中的液体培养基的pH为7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氢钾1g、微量元素液2mL和水1000mL；微量元素液：按质量百分比，包含MgSO₄ 0.4％、CuSO₄ 0.1％、MnSO₄ 0.1％、FeSO₄·7H₂O 0.1％和CaCl₂ 0.1％。

上述步骤(1)和步骤(2)中的培养时间为3～5天。

上述步骤(2)中的驯化次数为3～4次。

上述步骤(1)中得到的产生物表面活性剂菌株为铜绿假单胞菌。

上述步骤(2)中的原油降解菌种为节杆菌属、邻单胞菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属和黄单胞菌属。

上述节杆菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶1；邻单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.8；假单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.6；芽孢杆菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.4；黄单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.6。

本发明公开的一种修复水体石油污染的方法，其关键点是：步骤(1)中筛选表面活性剂产生菌时，观察原油平板上是否出现乳化圈或噬油斑的菌落，此类菌落可能对原油具有较强的乳化能力；步骤(2)中筛选原油降解菌时，在原油培养基中生长旺盛的菌具有更强的原油降解潜力，值得进一步分离纯化；步骤(3)中的原油降解过程，在于表面活性剂的投加方式，采用同时接种表面活性剂产生菌和原油降解菌，使得处理体系中表面活性剂不断乳化原油，促进生物降解，这种方式处理效果好，操作简便。

与现有技术相比较，本发明具有以下优点：

1、本发明的生物表面活性剂比一般的化学表面活性剂在性能方面更优越。

2、本发明利用生物表面活性剂-原油降解菌联合处理水体的石油污染的处理效率高，且无二次污染。

3、本发明采用生物表面活性剂-原油降解菌联合处理水体的石油污染的方法，其操作简便，经济实用，适合大面积的原位修复。

附图说明

图1是本发明表面活性剂临界质量胶束浓度的测试图；

图2是本发明的铜绿假单胞菌所产鼠李糖同系物HPLC-ESI-MS分析总离子流图；

图3是本发明生物表面活性剂的量对体系降解率影响的示意图。

具体实施方式

实施例1生物表面活性剂产生菌的筛选及活性剂的提纯分析

原油培养基的pH为7.5，包含原油10g、NH₄NO₃ 3g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、微量元素液2mL和水1000mL；微量元素液：按质量百分比，包含MgSO₄ 0.4％、CuSO₄ 0.1％、MnSO₄ 0.1％、FeSO₄·7H₂O 0.1％和CaCl₂ 0.1％。

自广州石化厂采集含油污水，稀释10⁶、10⁷、10⁸倍，涂布于原油培养基平板上。培养3～5d后，观察平板上是否出现乳化圈或噬油斑的菌落，将这些菌落在营养培养基平板上划线分离、纯化、保种，获得产生物表面活性剂菌株S6，经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。以碳源、氮源、磷酸盐、微量元素液和pH这五个因素对产表面活性剂培养基进行正交实验，获得产表面活性剂的最佳优化培养基，该培养基的pH为7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氢钾1g、微量元素液2mL和水1000mL。

接种铜绿假单胞菌于上述优化的培养基中(接种量2％)，30℃，165rpm，摇床振荡培养48h，4000rpm离心获得发酵液。

将发酵液与原油各8mL混合，用力振荡1min后，油水形成均匀的乳化液，三角瓶瓶壁不挂油，此时原油的粘度由原来的1123mPa·s降低至195mPa·s，降低了82.67％，室温静置2d，油水相略有分离，16d后，油水相完全分离，此时，油相体积降低为6mL，说明部分原油已溶于发酵液，形成了长时间稳定的微乳状液。

粗提：将铜绿假单胞菌培养液12500r/min离心30min去除菌体，上清液用6mol/L的盐酸调pH为2.0，加入等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，40℃旋转蒸发浓缩得到绿色浆状物，为表面活性剂粗产品。

精提：将粗品溶于0.05mol/L的NaHCO₃溶液，过滤后，用盐酸调pH为2.0，4℃放置24h，12500r/min离心15min，去掉上清液，干燥得表面活性剂纯品。铜绿假单胞菌产表面活性剂的量为0.283g/L。

将提取到的表面活性剂纯品分别稀释至20mg/L、25mg/L、33mg/L、40mg/L、50mg/L、67mg/L、100mg/L、200mg/L后，测不同质量浓度的表面活性剂溶液的表面张力，实验结果见图1。随着表面活性剂质量浓度的增大，溶液的表面张力逐渐降低，到34mN/m后基本保持不变，说明该生物表面活性剂的CMC值(临界胶束浓度)为67mg/L，比一般化学表面活性剂的CMC值低1～2个数量级，性能优越。

采用HPLC-ESI-MS分析铜绿假单胞菌产生的生物表面活性剂组分。在分析之前，将表面活性剂纯品溶于乙腈-水(1∶1)溶液。

分析方法：仪器为美国Agilent公司高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪。质谱仪为AB公司生产，4000QTARP，配以Eclipse Plus C18反相键合色谱柱(150mm×2.1mm×5mm)。

液相色谱条件：进样量5μL，分流进样(1∶4)；流动相为乙腈-水，采用线性梯度洗脱，流速：250μL/min。

梯度洗脱程序如表1：

表1梯度洗脱程序

质谱条件：采用负离子电离，雾化气和干燥气都为N₂；碰撞电压：-70V；喷雾电压：-4.5kV；温度：400℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200～1000m/z。各组分质量分数的确定采用面积归一化法。图2是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)所产鼠李糖脂的HPLC-ESI-MS分析的总离子流图。各组分的保留时间、分子离子峰、相对丰度、主要的离子碎片如表2所示。

表2铜绿假单胞菌所产鼠李糖脂同系物中各组分的结构及相对丰度

鼠李糖脂结构	保留时间(分钟)	分子离子峰(质荷比)	相对丰度/％
鼠李糖脂结构	保留时间(分钟)	分子离子峰(质荷比)	相对丰度/％	Rha-Rha-C₈-C₁₀Rha-Rha-C₁₀-C₈Rha-C₈-C₁₀Rha-Rha-C₁₀-C₁₀Rha-Rha-C₁₀-C_12:1Rha-Rha-C_12:1-C₁₀Rha-C₁₀-C₁₀Rha-Rha-C₁₀-C₁₂Rha-Rha-C₁₂-C₁₀Rha-C₁₀-C_12:1Rha-C_12:1-C₁₀Rha-C₁₀-C₁₂Rha-C₁₂-C₁₀	31.6932.7636.9339.5643.1244.1745.9947.7148.9751.6352.8755.8257.45	621.7621.7475.4649.5675.8675.8503.3677.8677.8529.6529.6531.7531.7	3.29640.633910.57938.505314.67530.806810.85194.66481.61015.188613.43123.16180.6005

Rha表示一个鼠李糖分子；C_n表示一个碳链长度为n的烷基脂肪酸分子；C_n:1表示一个碳链长度为n的含一个不饱和键的烷基脂肪酸分子。

实施例2原油降解菌株的筛选、分离

将含油污水稀释10⁶、10⁷、10⁸倍涂布于原油培养基平板上，培养3～5d后，挑取生长较好，菌落较大的菌株在营养培养基平板上划线分离、纯化、保种，纯化后的菌种在原油培养基平板上驯化3～4次，获得石油降解菌种P1、P2、P3、P4、P5。菌种鉴定结果为：P1-节杆菌属(Arthrobacter sp.)，P2-邻单胞菌属(Plesiomonassp.)，P3-假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，P4-芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，P5-黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)。

在原油培养基中接种石油降解菌种，经摇床振荡培养5d后，加入20mL石油醚(30～60℃)，转至分液漏斗萃取，振荡1min，静置，待分层后分离，收集上层液，用石油醚洗涤2～3次，合并上层液用干燥的无水硫酸钠脱水，66℃蒸干，置干燥器中冷却恒重，称重。以同步不加菌液摇床振荡的原油水样为对照。测得P1、P2、P3、P4、P5对原油的降解率分别为69.3％、74.0％、83.1％、75.7％和72.9％。

降解率的计算：

降解率＝(m₁-m₂)/m₁×100％

m₁——对照组的残油质量(g)；m₂——样品的残油质量(g)

实施例3表面活性剂产生菌—原油降解菌联合处理含油废水

将2mL P1、P2、P3、P4、P5菌液分别与2mL铜绿假单胞菌菌液混合投加到初始拉分别为5、6、7、8、9、10的水样(原油质量浓度为1g/L)中培养，同时设空白对照(只加P1、P2、P3、P4、P5菌液，pH＝7.5)，5d后测降解率。结果表明，在不同pH条件下原油降解菌与表面活性剂产生菌联合投加时的降解率均高于单独投加原油降解菌，最高降解率分别为70.2％、76.9％、84.8％、77.9％和74.5％(空白对照依次为62.5％、70.2％、66.7％、73.9％和55.2％)，证明生物表面活性剂可在一定程度上加快石油的降解速率。

将2mL P1、P2、P3、P4、P5菌液分别与铜绿假单胞菌菌液0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL混合投加到水样(原油质量浓度为1g/L)中培养，5d后测降解率，结果如图3，联合投加的降解效果均好于单独投加石油降解菌，随着生物表面活性剂产生菌接种量的增加，降解率有一个上升的趋势，随后降解率保持稳定，由此可知生物表面活性剂与石油降解菌存在一个最佳的匹配量。各单株原油降解菌及混合菌群与铜绿假单胞菌菌液的最佳匹配依次为1∶1、1∶0.8、1∶0.6、1∶0.4、1∶0.6。

实施例4产表面活性剂菌株与原油降解菌的菌种鉴定

1、实施例1筛选的产表面活性剂菌株与实施例2筛选的原油降解菌株的形态观察结果，如表3所示：

表3菌株(菌落)的形态观察结果

菌株名	菌形态	菌苔颜色	菌形状
菌株名	菌形态	菌苔颜色	菌形状	P1P2P3P4P5S6	边缘假根状，根状扩散，表面干燥边缘整齐，表面湿润突起边缘整齐，表面湿润，突起，菌落圆形边缘不规则，表面湿润，皮革状有皱褶边缘整齐，表面湿润，表面光滑边缘整齐，表面湿润，菌落光滑呈圆形	白色，不透明白色，不透明红棕色，半透明白色，不透明黄色，不透明绿色，透明	杆状，无鞭毛短杆状，有鞭毛杆状，有鞭毛长杆状，有鞭毛短杆状，有鞭毛短杆状，有鞭毛

2、实施例1筛选的产表面活性剂菌株与实施例2筛选的原油降解菌株的生理生化特征鉴定结果，如表4所示。

表4菌株的生理生化特征鉴定结果

M.RV.P柠檬酸盐利用硝酸盐还原

+-++

+--+

3、实施例1筛选的产表面活性剂菌株与实施例2筛选的原油降解菌株的菌株鉴定结果

根据表3和表4的实验结果及16S rDNA测序结果，参照《一般细菌常用鉴定手册》鉴定，可以确定：实施例1筛选的产表面活性剂菌株S6为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；实施例2筛选的五株原油降解菌株中：P1为节杆菌属(Arthrobacter sp.)，P2为邻单胞菌属(Plesiomonas sp.)，P3为假单胞菌(Pseudomonassp.)，P4为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，P5为黄单胞菌(Xanthomonas sp.)。

Claims

1、一种修复水体石油污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

2、根据权利要求1所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于步骤(1)所述产生物表面活性剂菌株为铜绿假单胞菌；步骤(2)所述原油降解菌种为节杆菌属、邻单胞菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属和黄单胞菌属。

3、根据权利要求2所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于，节杆菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶1；邻单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.8；假单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.6；芽孢杆菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.4；黄单胞菌属原油降解菌与铜绿假单胞菌的配比是1∶0.6。

4、根据权利要求1所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述原油培养基的pH为7.5，包含原油10g、NH₄NO₃ 3g、KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、微量元素液2mL和水1000mL。

5、根据权利要求1所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于步骤(1)中所述液体培养基的pH为7.5，包含葡萄糖10g、尿素5g、磷酸二氢钾1g、微量元素液2mL和水1000mL。

6、根据权利要求4或5所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于所述微量元素液，按质量百分比，包含MgSO₄ 0.4％、CuSO₄ 0.1％、MnSO₄ 0.1％、FeSO₄·7H₂O0.1％和CaCl₂ 0.1％。

7、根据权利要求1所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述培养时间为3～5天。

8、根据权利要求1所述的修复水体石油污染的方法，其特征在于：步骤(2)中所述驯化次数为3～4次。