CN102757906A - 一种降解六六六的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降解六六六的菌株及其应用。本发明提供的鞘脂单胞杆菌(Sphingobium japonicum)LZ-2，其保藏号为CGMCC No.3540。所述鞘脂单胞杆菌(Sphingobium japonicum)LZ-2CGMCC No.3540在降解农药中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明的Sphingobium japonicum LZ-2 CGMCC No.3540是从长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的土壤中分离筛选的，该菌能在10小时内完全降解20mg/l的林丹。

Description

一种降解六六六的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种降解六六六的菌株及其应用。

背景技术

六六六作为一种应用广泛的光谱有机氯农药，为持久性有机污染物，能够通过大气输送的方式进行全球输送，并通过食物链富集的方式对生态环境产生影响.目前有机氯农药污染已经成为一个倍受关注的全球性环境问题。它在环境中存在非常稳定，而它在环境中主要的α、β、γ和δ(甲体、乙体、丙体、丁体)等4种异构体，其不同异构体在环境中的稳定性也不一样，这主要取决于氯原子在环己烷结构上的不同排列结构，他们在环境中的持久性顺序为β-HCH＞δ-HCH＞γ-HCH＞α-HCH。在斯德哥尔摩公约中，六六六已经被列为12种持久性有机污染物之一。在这4种异构体中，只有丙体六六六(γ-HCH，又称为林丹)具有杀虫活性，主要用来防治农作物害虫。我国也于1983年开始禁止生产六六六(HCHs)等有机氯农药，虽然有机氯农药已禁止使用20多年，但环境中仍然能检出有机氯农药残留。

六六六在环境中有脂溶性大毒性大等特点，主要蓄积在人体脂肪体或是神经系统内，存留最久的是β-六六六，可在口服后持续排泄6个月，并且随着食物链发生富集作用，同时刺激大脑运动及小脑，使脏器营养失调，发生变性坏死。中国曾经是生产和使用六六六的大国，自20世纪60年代初开始使用有机氯农药，到1983年停止生产，产量呈逐年持续增长趋势。由于进入水环境中的六六六，可被水中的悬浮物(包括泥土、有机颗粒及浮游生物等)吸附；进入水体和土壤表面的农药也可通过挥发而进入到地面表层的大气中，而空气中的颗粒物或呈气态的农药又可随气流中的尘埃飘流携带到一定距离，沉降于底质环境中；土壤中的农药也可通过渗透的形式从土壤上层渗透到土壤下层，进而污染地下水。所以禁止使用后，并不意味着六六六的危害不存在了，据对水体中的农药检测，黄河部分河段、白洋淀地区端村水域生态系统、珠江三角洲地区都检测到了一定浓度的六六六。

农药在环境中的分解，是通过生物学和化学两种途径进行的，农药的生物学分解是农药消失的重要原因。环境中的六六六在微生物的作用下会发生降解，一般认为六六六生物降解在厌氧条件下比有氧条件下进行更快。不少微生物可分解六六六，如梭状芽胞杆菌，假单孢菌等。有机氯农药的化学性分解是在各种理化因素作用下进行的，这些理化因素包括阳光、碱性环境、空气、湿度等、其中阳光对有机氯农药的分解有重要作用。一般情况下有机氯农药中的六六六在土壤中消失时间需6年半。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解六六六的菌株及其应用。

本发明提供的鞘脂单胞杆菌(Sphingobium japonicum)LZ-2，其保藏号为CGMCCNo.3540。

上述菌为鞘脂杆菌目、鞘脂杆菌科、鞘脂杆菌属、鞘氨醇单胞菌。

所述鞘脂单胞杆菌(Sphingobium japonicum)LZ-2CGMCC No.3540在降解农药中的应用也是本发明保护的范围。

所述农药为六六六。

所述六六六为丙体六六六。

所述降解的温度为15℃-45℃，具体为25℃-35℃，尤其优选为25℃。

所述降解的pH为5.5-8.5，具体为5.5-7.5，尤其优选为5.5。

所述的菌在制备降解农药的产品中的应用也是本发明保护的范围。

所述农药为六六六，所述农药具体为丙体六六六。

所述的菌在对六六六污染土壤的生物修复中的应用也是本发明保护的范围。

LZ-2已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为：CGMCC No.3540，分类命名为Sphingobium japonicum。

丙体六六六的化学名称为γ-异构体-1，2，3，4，5，6-六氯环己烷。

本发明的实验证明，本发明的Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No.3540是从长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的土壤中分离筛选的，该菌能以林丹(丙体六六六)为唯一碳源和能源生长，并可以在10小时内完全降解20mg/l的林丹，使用pH值为5.5的无机盐培养液按10％接种量接种本发明的六六六降解菌，在25℃对10～100mg/l的林丹有良好的降解效果。实验室内的土壤修复实验表明该菌在20天内可以降解土壤中20mg/kg的林丹，对污染的土壤中有良好的降解效果，可以特别应用于修复点源或面源六六六污染的土壤和水体。

附图说明

图1为菌株LZ-2降解γ-六六六的产物的色谱图

图2为菌株LZ-2对20mg/lγ-六六六的降解曲线图

图3为pH值对菌株LZ-2降解γ-六六六的影响

图4为温度对菌株LZ-2降解γ-六六六的影响

图5为底物浓度对菌株LZ-2降解γ-六六六的影响

图6为LZ-2在土壤中降解γ-六六六的曲线图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Sphingobium japonicum LZ-2的分离、纯化及鉴定

1、分离

将从天津农药厂附近采集的长期受六六六和滴滴涕等有机氯农药污染的活性土样接种到以γ-HCH(丙体六六六，50mg/l)作为唯一碳源的无机盐溶液中振荡培养。转接培养6次后，菌悬液以10倍梯度稀释接种到含γ-HCH的无机盐固体培养基上，30℃恒温箱培养。选取生长快，菌落规则，传代稳定的菌落，纯化2-3次后得到纯菌株；将分离出的5株菌作为复筛菌株在LB培养基中扩大培养至相同的OD₆₀₀nm值1.0，以10％(10⁵cfu/g)的接种量接入含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基中，于30℃，180rpm摇床培养48h，得到培养液。

在10ml的培养液中加入等量正己烷，剧烈振荡，混合物在4℃下，10000rpm离心10min，小心收集下层有机相。此有机溶剂萃取过程重复3次。抽提液中加入无水硫酸钠干燥后，用正己烷适当稀释，然后抽提液用气相色谱分析。用气相色谱(GC-ECD)定量测定降解率，以不接菌的培养基作为对照，所用的气相色谱的检测条件为：Agilent J&W GC Columns，Agilent Agilent 7890A，色谱柱为HP-55％PhenylMethyl Siloxan：1281.58306，HP-55％Phenyl Methyl Siloxan，长度30m，直径320μm，厚度0.25μm。升温程序；80℃保持1.5min，以20℃/min升至190℃，保持0min，以5℃/min升至230℃，保持0min，以25℃/min升至290℃，保持0min；加热器为270℃，压力10.875psi，载气流速2.0mL/min，进样量1μL，平均速率37.143cm/sec，滞留时间1.3461分钟。前检测器μ-ECD加热器300℃，尾吹流量：30ml/min。在这些检测条件下，γ-HCH的保留时间分别为11.28min。将测得的每个样品对应的峰面积代入预先建立的峰面积-浓度标准曲线，就可以计算出γ-HCH的浓度。

降解率(％)＝(对照组γ-HCH的浓度-样品组γ-HCH的浓度)/对照组γ-HCH的浓度×100。

最终筛选到降解效率最高(76％)的一株菌，将该菌株命名为LZ-2，转入牛肉膏蛋白胨斜面保存。

上述无机盐培养液是按下述比例配制的：在1000ml水中，K₂HPO₄，1.5g/l；KH₂PO₄，0.5g/l；(NH₄)₂SO₄，0.5g/l；NaCl，0.5g/l；MgSO₄，0.2g/l；CaCl₂，0.05g/l；FeSO₄，0.02g/l；酵母粉，0.002g/l，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

无机盐固体培养基是将上述无机盐培养液加入占无机盐培养液总重量的1.5％(g/l)的琼脂。

上述LB培养基与文献(微生物学实验[M]，北京，高等教育出版社，1988，75-78)中相同。

将LZ-2采用美国BIOLOG微生物分类鉴定系统对降解菌进行分类鉴定。将纯化的LZ-2菌株在Biolog培养基上培养16h；采用干管法以GN/GP-IF制备菌悬液，调整浊度52％T；菌悬液以每孔150μl接种于GN-Microplate鉴定板，测定每个孔的吸光度值，原理：微生物利用碳源进行呼吸时，会将四唑类氧化还原染色剂，从无色还原成紫色，从而在微生物的鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式或“指纹”，通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化，由于对光密度的吸收值的差异，计算机通过概率最大模拟法，并将该反应模式或“指纹”与数据库相比较，将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行比对，对分析的微生物进行最大限度的匹配，可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的微生物的属名或种。

测定的结果与数据库比对，由软件自动给出鉴定结果。经BIOLOG技术鉴定LZ-2为鞘脂单胞杆菌(Sphingobium japonicum)。

LZ-2已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为：CGMCC No.3540，分类命名Sphingobium japonicum。

2、鉴定

将Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No.3540接种到LB平板上30℃培养4天后，观察，该菌形成黄色扁平的，具有清晰边缘、不透明的菌落；

1)显微镜观察，该菌有极生鞭毛，G-，直或弯杆状；

2)革兰氏染色试验

a.将培养18-24h的培养物涂片，要涂得薄些。

b.将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后水洗。

c.滴加助染剂，1min后水洗。

d.滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止(约20-30s)水洗。

e.滴加复染剂，1min后水洗，晾干，镜检。

结果为呈紫色者为革兰氏阳性菌，红色者为阴性菌，结果其为革兰氏阴性菌。

3)细胞色素氧化酶试验

取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。

结果该菌株细胞色素氧化酶反应呈阳性，具有假单胞菌的特征。

4)过氧化氢酶试验

部分细菌具有分解双氧水的酶，能分解双氧水产生氧气和水。过氧化氢酶阳性细菌滴加3％双氧水后，可立即产生大量气泡，呈阳性反应。

结果该菌株具有接触酶和氧化酶活性。

5)细胞色素氧化酶试验

取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。同时镜检观察菌体颜色

结果该菌株产黄色色素。

6)镜检

观察该菌体周围产荚膜。

7)将葡萄糖，乳糖或麦芽糖等分别加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75～1％。并加入一定量酚红指示剂及小倒管，制成单糖发酵管，接种Sphingobiumjaponicum LZ-2CGMCC No.3540经30℃培养18～24小时，若能分解糖产酸则酚红指示剂由红变黄，若能分解甲酸有CO₂和H₂等气体形成，小倒管内则聚集有气泡；不分解，则指示剂不变色。

结果该菌株能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化产酸。

实施例2、Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No.3540的降解性能的测定

一、六六六的降解和菌株生长实验

Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No.3540的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD_600nm值为1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，并用无机盐培养液配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入含有20mg/lγ-HCH(丙体六六六，γ-HCH(分析纯)购自Sigma-Aldrich(USA)233390，即为林丹)的无机盐培养液中，于25℃，180rpm摇床培养12h，得到培养液，每隔2h取样一次，用气相色谱(GC-ECD)定量测定降解率(检测条件同实施例1)，以未接种菌株LZ-2的培养基(含20mg/l γ-HCH)作为对照。

具体为：将10ml培养液中加入等量正己烷，剧烈振荡，混合物在4℃、3000rpm离心10min分层，小心收集上层有机相。此有机溶剂萃取过程重复3次。抽提液中加入无水硫酸钠干燥后，用正己烷适当稀释，然后抽提液用气相色谱分析。

标准品为20mg/lγ-HCH，保留时间为12.88min；

不同时间的抽提液在保留时间为12.88min的峰对应的为γ-HCH(见图1)。

降解率(％)＝(对照组γ-HCH的浓度-样品组γ-HCH的浓度)/对照组γ-HCH的浓度×100。

LZ-2菌株在25℃，180rpm摇床培养2h、4h、6h、8h、10h、12hγ-HCH的降解率分别为71.21％、39.98％、19.52％、7.12％、0.15％、0％；

对照在25℃，180rpm摇床培养2h、4h、6h、8h、10h、12hγ-HCH的降解率分别为98.62％、97.97％、97.32％、96.7％、96.43％、96.5％；

LZ-2菌株在25℃，180rpm摇床培养2h、4h、6h、8h、10h、12hγ-HCH的浓度分别为14.242mg/l、7.996mg/l、3.904mg/l、1.424mg/l、0.03mg/l、0mg/l；

对照在25℃，180rpm摇床培养2h、4h、6h、8h、10h、12hγ-HCH的降解率分别为19.724mg/l、19.594mg/l、19.464mg/l、19.34mg/l、19.286mg/l、19.3mg/l；

用DU 800分光光度计测定LZ-2菌株在25℃，180rpm摇床培养2h、4h、6h、8h、10h、12h在600nm的光密度，分别为0.13、0.19、0.28、0.36、0.39、0.43；

相比之下，在未接种菌株的培养基中没有检测到六六六的降解和细胞的生长。

将上述结果作图如图2所示，其中，◆-为LZ-2菌株对20mg/L丙体六六六的降解曲线，▲-为未接入LZ-2菌株的降解对照组，■-为LZ-2菌株生长曲线，从图中可以看出，在无机盐培养基中LZ-2在10小时之内，可以完全降解一定量的丙体六六六。

二、不同因素对菌株LZ-2降解特性影响的研究

1、pH值对菌株LZ-2降解γ-六六六的影响

LZ-2的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD₆₀₀nm值1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基中，分别将初始培养液的pH值分别调为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，并以不接菌作为对照，每个样品两个平行。在30℃下、200rpm培养30h。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)，萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图3所示，该菌株在pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下，六六六的降解率分别为52.71％，98.85％，96.89％，95.99％，89.15％，82.45％，78.77％，46.55％；

而对照在pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下，六六六的降解率分别为98.8％、99.1％、99.4％、98.9％、99.3％、99.5％、99.5％、99.6％；

表明，该菌株在pH5.5-7.5的范围内生长和降解效果均较好，其中在pH5.5时的降解能力最强。

2、温度对菌株LZ-2降解γ-六六六的影响

LZ-2的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD₆₀₀nm值1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接入7份含有20mg/lγ-HCH的无机盐培养基中(pH5.5)，分别将培养温度分别调为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，200rpm培养30h，并以不接菌的培养基在与上述相同条件下放置作为对照，每个样品两个平行。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)，萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图4所示，该菌株在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45C条件下，六六六的降解率为76.83％，87.97％，93.27％，91.15％，85.76％，61.07％，42％；

而对照在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，六六六的降解率分别为99.4％、99.3％、98.4％、98.1％、98.6％、99.3％、99.6％；

表明，菌株在25-35℃时的降解效率都比较高，其中在25℃时降解速度最快。

3、菌株LZ-2对不同浓度的γ-六六六的降解

LZ-2的单菌落先在LB培养基中30℃扩大培养16h，培养至OD₆₀₀nm值1.5，培养物4℃、6000rpm离心5min，用无菌的无机盐培养液(成分如实施例1中所述)洗涤菌体沉淀，配置成菌悬浮液，以10％的接种量(1.5×10⁵cfu/g)分别接种于10ml含不同浓度(10，30，50，80，120，150mg/l)γ-六六六的无机盐培养基(PH值为5.5)中，在25℃下、200rpm培养7天。并以不接菌作为对照，每个样品两个平行。用GC测定培养基中六六六的浓度，计算降解率(方法同实施例1)萃取方法和GC检测条件如步骤一所述。

结果如图5所示，该菌株在γ-六六六浓度为10mg/l，30mg/l，50mg/l，80mg/l，120mg/l，150mg/l条件下，六六六的降解率分别为91.74％，96.14％，98.30％，87.99％，67.87％，60％；

而对照在γ-六六六浓度为10mg/l，30mg/l，50mg/l，80mg/l，120mg/l，150mg/l条件下，六六六的降解率分别为98.43％、97.52％、97.31％、98.45％、99.54％、99.74％；

表明，当外加γ-六六六的浓度在10-50mg/l时，菌株可以在一周内将其完全降解。然而，当外加γ-六六六的浓度超过50mg/l时，则表现出明显的底物抑制效应，γ-六六六的降解速度明显减慢。

三、LZ-2对六六六污染土壤的生物修复

在北京中国科学院动物研究所校园中采集土壤样品，样品用直径2mm的滤网过滤，除去土壤中的颗粒物质。土壤样品存放于4℃冰箱。取一部分土壤样品，用氯仿熏蒸法对土壤进行消毒处理：先将氯仿加入盛有土壤的容器中，密闭容器，使其散发为气态，渗入土壤样本以杀死所有微生物，再开启容器使土样中残余气态氯仿全部散发。将γ-六六六加入到100g土壤中，使其终浓度为20mg/kg，搅拌混合均匀。将LZ-2的细胞悬液以每g土壤10⁶个细胞接种量加入到100g熏蒸和未熏蒸的土壤中，搅拌混合均匀。未接种LZ-2的熏蒸的土壤和未接种LZ-2的未熏蒸的土壤作为对照。土壤置于30℃培养箱中培养15d。在整个培养期间，不断喷洒添加无菌的去离子水，以保持土壤的含水量在50％附近。测定LZ-2在土壤中是否对γ-HCH具有降解作用，同时研究HZ-1在有额外的碳源存在下与土壤中其他微生物的相互关系，本研究中分别将HZ-1接种到熏蒸土壤和未熏蒸土壤两种处理中，未接种的熏蒸土壤和未接种的未熏蒸土壤作为对照，每个对照和处理都重复三次。

熏蒸的土壤，接种：在0天、2.5天、5天、7.5天、10天、12.5天、15天、17.5天、20天剩余丙体六六六浓度为：20mg/kg、18.872mg/kg、17.18mg/kg、15.21mg/kg、13.21mg/kg、8.523mg/kg、4.92mg/kg、0mg/kg、0mg/kg；

未熏蒸的土壤，接种：在2天、2.5天、5天、7.5天、10天、12.5天、15天、17.5天、20天剩余丙体六六六浓度为：20mg/kg、18.92mg/kg、17.92mg/kg、16.92mg/kg、14.93mg/kg、12.123mg/kg、6.754mg/kg、2.64mg/kg、0mg/kg；

未熏蒸的土壤，未接种：在2天、2.5天、5天、7.5天、10天、12.5天、15天、17.5天、20天剩余丙体六六六浓度为：20mg/kg、19.89mg/kg、19.78mg/kg、19.87mg/kg、18.98mg/kg、18.99mg/kg、17.98mg/kg、17.98mg/kg、17.68mg/kg

熏蒸的土壤，未接种：在2天、2.5天、5天、7.5天、10天、12.5天、15天、17.5天、20天剩余丙体六六六浓度为：20mg/kg、19.99mg/kg、19.97mg/kg、19.98mg/kg、19.89mg/kg、19.87mg/kg、19.87mg/kg、19.88mg/kg、19.84mg/kg；

作图如图6所示，◆-熏蒸的土壤，接种；■-未熏蒸的土壤，接种；●-熏蒸的土壤，未接种；▲-未熏蒸的土壤，未接种，可以看出，在20天内，两种对照中的γ-HCH的浓度几乎都没有变化，γ-HCH在经熏蒸的土壤中的降解速率明显比在未熏蒸土壤快，在熏蒸的土壤中17天基本可以完全降解，而在未熏蒸土壤中需要20天。20天后LZ-2能从未经熏蒸的土壤中分离出来，这说明在该土壤中的降解作用主要由LZ-2完成。

以上结果说明，LZ-2菌株在施入土壤中后，没有出现不产生降解或降解率急剧下降的现象，它的降解性能仍然稳定和优良，这就为该菌株作为受六六六污染的土壤修复剂提供了科学的试验依据。本实验表明该菌对六六六污染的土壤有良好的修复能力，为该菌的大规模应用奠定了基础。

Claims (9)

1.Sphingobium japonicumLZ-2，其保藏号为CGMCC No.3540。

2.权利要求1所述Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No.3540在降解农药中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述农药为六六六。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述六六六为丙体六六六。

5.根据权利要求2-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述降解的温度为15℃-45℃，所述降解的温度具体为25℃-35℃，所述降解的温度尤其优选为25℃。

6.根据权利要求2-5中任一所述的应用，其特征在于：

所述降解的pH为5.5-8.5，所述降解的pH具体为5.5-7.5，所述降解的pH尤其优选为5.5。

7.权利要求1所述的菌在制备降解农药的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述农药为六六六，所述农药具体为丙体六六六。

9.权利要求1所述的菌在对六六六污染土壤的生物修复中的应用。

Images