CN106479914B

CN106479914B - 一株抗锑假单胞菌xks1及其应用

Info

Publication number: CN106479914B
Application number: CN201610848881.1A
Authority: CN
Inventors: 彭霞薇; 郭东矗; 杨沁雪; 曾滢帆
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing encyclopedia Technology Co., Ltd
Priority date: 2016-09-23
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2019-09-17
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: CN106479914A

Abstract

本发明公开了一种抗锑细菌假单胞菌（Pseudomonas sp.），保藏号为CGMCC No.12894。本发明所述菌高度抗锑，同时具有抗As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²等多种重金属，以及促进植物生长的特性，对促进植株生长、缓解植物对重金属的毒害具有重要意义，在重金属污染的矿区土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。

Description

一株抗锑假单胞菌XKS1及其应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株抗锑细菌XKS1及其应用。

背景技术

近年来，随着锑矿采集规模的不断扩大，以及锑工业中废弃物的排放，导致矿区周边的土壤受到严重的污染。作为环境污染物，锑及锑化物已被证实是一类具有基因毒性的物质，并对人体具有致癌作用（Huang et al., 1998; Takahashi et al., 2002;Beyersmann et al., 2008）。此外，锑还能导致肺损伤、血尿、纤维母细胞死亡、姐妹染色单体互换、循环系统疾病等（Huang et al., 1998）。锑已被美国环境保护署和欧共体理事会列为优先治理污染物，也是日本环境厅密切监测的污染物。近年来，我国锑的污染状况越来越严重，逐渐受到社会各界的广泛关注。同时，锑矿的采冶活动同时会导致与锑伴生的重金属元素如砷、汞等进入矿区表生环境，污染了矿区农田，不仅影响农作物生长，降低农作物质量。对矿区的土壤也造成了很大的破坏。研究如何修复矿区土壤已成为亟待解决的难题。

虽然锑对于人类来说具有很高的毒性，但一些微生物却能够在浓度极高的环境下生长，甚至可以利用这种元素作为能源物质，或者是将毒性较高的 Sb(Ⅲ) 氧化为毒性较弱的Sb(Ⅴ)，由此，污染土壤的微生物修复理论及修复技术便应运而生（腾应等，2007）。微生物可以通过菌体对锑的外排、高毒性的Sb（Ⅲ）的氧化成低毒性的Sb（Ⅴ）、微生物对锑的甲基化、菌体吸附等方式降低锑对菌体及环境的毒性。抗锑1971年，Lyalthova，首次报道了1株锑氧化细菌，该菌株能够把三价的锑氧化成五价的锑为自身提供能量（Lyalthova,1971)。之后陆续有少量关于抗锑微生物的报道，总之，到目前为止己经报道的抗锑微生物的种类相对还较少，因此，筛选具有锑抗性的微生物是实现锑污染修复的重要环节。

目前关于抗锑微生物的筛选及应用方面的相关研究报道不多，刘成佐（2012）筛选到一株耐锑微生物，经鉴定为青霉菌，其耐锑浓度为600mg/L。本发明专利中的菌种为假单胞菌（Pseudomonas sp.）中的一株细菌，其抗锑效果明显高于已经报道的青霉菌。且该假单胞菌具有植物促生功能，能够产生IAA、铁载体和ACC脱氨酶，对植物具有一定的促生效果；同时对As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺等多种重金属具有很强的抗性，具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一株具有高度抗锑的细菌，经16S rDNA测序分析，结果形态学观察，初步鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.），菌株编号为XKS1，该菌同时具有抗As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²等多种重金属，以及促进植物生长的特性。

本发明的假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1，是从湖南省冷水江市锡矿山锑矿区冶炼厂附近的植物根际土壤中分离筛选的菌种，最高能够耐受锑浓度为3200mg/L的重金属胁迫。菌株于2016年8月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC （单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为CGMCC No.12894，经检测存活。

在LB固体培养基上培养18h后，其菌落特征是：淡黄色，圆形，直径约0.95mm，表面光滑，中央稍突起，不透明，边缘完整。其菌体细胞特征为：杆菌，革兰氏染色呈阴性，无芽孢。

将该菌株的16S rDNA序列通过PCR扩增，获得1400bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，该菌株与假单胞菌（Pseudomonas sp.）中乙酸钙不动杆菌和嗜油不动杆菌同源性最高，相似度在98%以上。结合形态特征、培养特征及16S rDNA序列分析，该菌株确定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。

该菌株在含有不同浓度Sb（酒石酸锑钾）的CDM固体培养基中培养一定时间，观察其生长情况，结果表明，该菌抗Sb能力极强，对三价锑耐受性达3200mg/L。

本发明具有以下有益效果：

本发明的菌种是从湖南省冷水江锡矿山锑矿区冶炼厂附近的植物根际土壤中分离筛选出的一株高抗锑（Sb）细菌，经鉴定该为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。本发明菌株除了具有很强的抗重金属锑的特性，而且该菌株对As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺等重金属具有很强的抗性，特别是对As³⁺的耐受浓度达到3000mg/L以上。同时该菌还具有植物促生功能，能够产生IAA、铁载体和ACC脱氨酶这三种植物促生因子，并对Sb污染土壤中的植物生长有促进作用，例如对油菜生长具有一定的促进效果。目前关于抗锑细菌的多种抗重金属能力及促生效果方面的研究在国内外还未见相关报道。因此，从矿区污染地筛选耐受重金属的高抗促生微生物，对促进当地植被生长、缓解植物对重金属的毒害具有重要意义。该菌在重金属污染的矿区土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。

附图说明

图1本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.）的培养物。

图2本发明假单胞菌（Pseudomonas sp.）的16S rDNA 基因序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1 抗锑细菌的分离筛选及抗Sb能力

采集湖南省冷水江市锡矿山锑矿区冶炼厂附近的植物根际土壤样品，称取上述新鲜土壤样品100g，加入适量的酒石酸锑钾（[C₈H₄K₂O₁₂Sb₂·3(H₂O)]），使土样中锑的最终浓度为1000mg/kg，放于28℃恒温培养箱富集培养一周。取上述土样10g放于装有 10 粒玻璃珠、并盛有90mL 0.85% NaCl无菌溶液中，30℃，180 r min-1摇床中摇30 min，使样品充分散开。取0.1mL涂布到CDM培养基上（CDM培养基配方：MgSO₄·7H₂O 2.0 g，NH₄Cl 1.0 g，Na₂SO₄ 1.0 g，K₂HPO₄ 0.013 g，CaCl₂·2H₂O 0.067 g，Na-lactate 5.0 g，琼脂 15.0 g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.2），其中CDM培养基中以酒石酸锑钾为胁迫因子，使最终培养基中锑的浓度为50μM，于30℃恒温培养箱中培养一周，每天观察其生长状况。将上述初步分离出的菌株进行进一步的分离纯化获得纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4℃保存进行后续实验。

将筛选所得的菌株接种于LB培养基中（LB培养基配方：蛋白胨 10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂 15 g，加蒸馏水至1000 mL，pH 7.2），活化24 h，取2 mL 转入装有100mL LB液体培养基的250 mL 三角中，30 ℃、150 r/min 振荡培养，以未接种的LB液体培养基为对照，选择600nm 的波长，用酶标仪测定不同培养时间细菌悬浮液的光密度值(OD600)。以培养时间为横坐标，OD600 为纵坐标，绘制细菌的生长曲线，以了解菌株的生长周期，为后期进一步研究菌株对Sb、As等重金属的耐受性、抗性及促生效果的研究适宜生长周期的菌体。向 CDM 培养基中添加Sb储备液，使培养基中的Sb的终浓度分别为1、2、4、6、8和10 mmol/L及以上浓度，根据实验结果依次提高重金属浓度，将斜面保存的抗Sb菌株在LB培养液中活化24 h，在固体培养基上分离纯化出单菌落，再转接到含相应浓度Sb的固体培养基上，观察菌株生长情况，能够抑制菌株生长的最低浓度为该菌株的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。

通过上述分离筛选，获得若干抗Sb细菌，大多数株菌在48h进入稳定期，菌株对数期为6h-36h。其中，本发明菌株（编号为XKS1）生长较快，在36h后就进入稳定期，因此后续实验取培养24h的菌体进行研究。通过测定Sb对分离菌株最低抑菌浓度，发现菌株XKS1对Sb的抗性非常高，最低抑菌浓度达27mM，折合成质量浓度大致为3200mg/L。

实施例2 NXH1菌株的鉴定

将该菌株进行形态学、培养特征以及16S rDNA的序列测序分析。16S rDNA分子鉴定按照以下步骤进行：挑取筛选菌株的单菌落接种于液体 LB 培养基中，30℃、150r/min摇床振荡培养，在24h 取出培养液，5000r/min 离心 1min取上清液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司提供），提取菌落DNA；通用引物 27F 和 1492R 对提取的细菌 DNA 进行 PCR 扩增；27F序列为5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；1492R序列为5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成；将 PCR产物进行序列测序，测序结果在 NCBI 数据库中 BLAST 进行序列分析，并进行同源性比较。

NXH1菌株的菌落形态特征如下：杆菌，革兰氏染色呈阴性，无芽孢，菌落特征如下：在LB固体培养基上培养18h后，其菌落特征是：淡黄色，圆形，直径约0.95mm，表面光滑，中央稍突起，不透明，边缘完整，见图1。该菌16S rDNA 基因序列长度为1411 bp，将基因序列提交到 Genbank上，进行同源性比较，然后采用 MEGA 6.0软件绘制系统发育树，从而确定菌株的种属。结果表明该序列与假单胞菌（Pseudomonas sp.）中各菌的 16S rDNA 基因序列相似度最高，达 98%以上，同时结合菌落形态特征、菌体显微特征确定XKS1菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.），其16S rDNA基因序列如图2所示。该菌于2016年8月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为 CGMCC （单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为CGMCC No.12894。

实施例3：假单胞菌XKS1对多种重金属的耐受性

分别配制含有不同浓度As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²重金属的CDM固体培养基，Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²重金属浓度从100mg/L起，依次为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L，As³⁺浓度从100mg/L起，依次为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1200mg/L、1600mg/L、2000mg/L、3000 mg/L、4000 mg/L，以不加重金属的处理作为对照。将假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1菌株接种到不含重金属的CDM培养基中活化培养24h，取0.1mL分别接种于含有不同种类、不同浓度重金属的培养基中，置于30℃培养24h，观察菌体在含有各种类、不同浓度重金属的培养基中生长情况，结果见表1。从表中可以看出，XKS1菌株对上述几种重金属均具有较强的耐受性，对As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²的耐受浓度分别为3000mg/L，1200mg/L，1600ml/L和800mg/L。

表1假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1在不同重金属浓度下的生长情况

注：“+”表示生长良好；“-”表示不生长；“+/-”表示能长，但生长不良

实施例4 假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1的植物促生特性

具有植物促生作用的微生物往往通过向环境中分泌吲哚乙酸（Indole-3-aceticacid,IAA）、产生铁载体和ACC脱氨酶，起到促进植物生长的效果。通过以下实验操作，可以验证不动杆菌NXH1具有植物促生特性。产生IAA的功能鉴定方法如下：在培养微生物的特定液体培养基加入0. 5 g /L L-色氨酸（约2. 5 mmol /L）后高温灭菌，用牙签将株菌株挑入液体培养基，放在恒温培养摇床内30℃培养24小时，吸取2mL菌液，2mL菌液中加入2mLSalkowski试剂（12g FeCl₃，430mL 98% H₂SO₄，570mL H₂O）显色。呈粉红色的菌液则为阳性，说明此菌株产IAA。产生铁载体的功能鉴定方法如下：配制CAS检测培养基，在超净台中将分离纯化的菌株点在CAS检测培养基上，在30 ℃的培养箱中培养；通过观察细菌分泌铁载体形成的橙色晕圈的大小做定性筛选，橙色晕圈越大，说明菌株产铁载体能力越强。ACC脱氨酶鉴定方法如下：配制DF培养基（DF培养基配方：KH₂PO₄ 4 g，Na₂HPO₄6 g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.2 g，葡萄糖 2g，葡萄糖酸 2 mL，柠檬酸 2 g，(NH₄)₂SO₄ 2 g，蒸馏水定容至 1 L，pH 7.2），用干净牙签将待测菌株挑入固体培养基中划线培养，放在恒温培养箱内，培养24h，再将菌株用干净牙签将待测菌株挑入转接到无氮且含ACC的ADF培养基(以 3mmol/LACC 代替 DF 培养基中的(NH₄)₂SO₄为唯一氮源)中，放在30℃ 恒温培养箱内培养24h后观察结果，在ADF培养基上能够长出菌落的菌株，可以初步确定具有ACC脱氨酶活性。

CAS 检测培养基配制方法如下：

溶液a：将0.012gCAS（铬天青 S）溶于10ml蒸馏水中，再加入含有10mmol/LHCl 2ml的1mmol/L FeCl₃溶液；

溶液b：取0.015gHDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）溶于8mL蒸馏水中；

染料溶液c：将溶液a缓慢加入溶液b中，轻轻晃动，使得两溶液互相混合均匀，得到染液c；

将10×MM9盐溶液：(Na₂HPO₄ 30g，KH₂HPO₄ 1.5g，NaCl 2.5 g，NH₄Cl 5g，双蒸水500ml) 20mL和哌嗪二乙醇磺酸6.04g加入有150ml的双蒸水的洁净三角瓶中，混匀后用50%的NaOH调节pH到6.8，并加入琼脂粉3.2g，并得到培养基d。

将染料溶液c、培养基d和1mmol·L^-1CaCl₂、1mmol·L^-1 MgSO₄·7H₂O, 20%的葡萄糖分别灭菌（115℃，20min）,10%的酸水解酪蛋白过滤除菌后，都置于50℃水浴锅保温待用。

分别量取上述0.2ml 1mmol/L CaCl₂ 4ml，1mmol/L MgSO₄·7H₂O 6ml，10%的酪蛋白氨基酸及2ml 20%的葡萄糖，加入培养基d中再沿瓶壁加入染液c，充分混匀，即得蓝色定性检测培养基，然后按每皿30ml倾注于培养皿中，置于无菌操作台待用。

通过上述实验，结果表明：假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1能够产生IAA、铁载体和ACC脱氨酶，具有潜在的植物促生功能。

实施例5 假单胞菌（Pseudomonas sp.）XKS1对油菜生长的影响

以北京某地区的农田土为盆栽基质。土壤风干后过20目筛，测定含水量，以烘干土重20Kg称取对应风干土重，把应加入的锑的量配置成250mL溶液，与上述土壤充分混匀，使土壤中含锑浓度为20 mg/Kg、50 mg/Kg、100 mg/Kg、250 mg/Kg、500 mg/Kg，以田间持水量70%加入相应的去离子水，置于避光条件下平衡2个月，不加锑的为锑浓度为0mg/kg的处理为对照，平衡后的土壤装盆，备用。实验前先选取一定数量颗粒饱满，大小均匀的油菜种子放于 10%双氧水溶液中浸泡 15min ，然后用ddH₂O冲洗干净，消毒后的种子均匀的洒在铺有三层纱布的培养皿中，于培养箱中培养2d，待种子露白时选取发芽势接近的种子播种于上述不同锑污染土壤中，每盆播种30粒，播种后每盆用喷壶接入约 10⁸ CFU/g 培养的菌液10mL，以不接菌的处理为对照，每个处理设3个重复。定期浇水，保持每天8 h的光照，植株在温室下生长 14 d后测量植物株高、根长。由表2可以看出：在不同锑浓度的土壤中，添加假单胞菌XKS1的各处理油菜株高及根长均高于未加菌的处理，说明假单胞菌XKS1在减轻锑对植物毒害、促进植物生长方面具有潜在应用价值。

表2 假单胞菌XKS1对油菜株高及根长的影响

Sb(mg/kg)	不加菌株高	加菌株高	不加菌根长	加菌根长
					0	12.43	14.07	3.43	5.97
20	13.23	14.90	4.38	5.87
					50	13.77	15.73	4.15	5.85
100	13.17	14.08	3.68	4.93
					250	12.76	13.71	3.77	5.48
500	11.68	12.82	3.38	5.38

Claims

1.一株抗锑细菌假单胞菌（Pseudomonas sp.），保藏号为CGMCC No.12894。

2.如权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）在重金属污染的矿区土壤生物修复中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重金属为Sb³⁺、As³⁺、Cd²⁺、Cr⁶⁺、Hg²⁺。

4.如权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.）在植物促生中的应用。