CN109880757A - 一株具有自身固氮能力的氢氧化细菌及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株氢氧化细菌荧光假单胞菌SDW‑16（Pseudornonas fluorescens SDW‑16），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018640。该氢氧化细菌对苹果腐烂病菌Cytospora sp.和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea具有拮抗作用以及对小麦具有促生作用，可促进植物生长，提高产量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。

Description

一株具有自身固氮能力的氢氧化细菌及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及一株氢氧化细菌SDW-16及其分离培养和应用，具体涉及一株从不含吸氢酶的豆科植物沙打旺根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌荧光假单胞菌（Pseudornonasfluorescens）SDW-16。该氢氧化细菌SDW-16菌株已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018640。

背景技术

我国是一个人口大国和农业大国，随着人口数量的不断增长，面临的粮食压力不断增加，现在进口粮食占国内粮食产量的比重逐年增加，因此在可用耕地面积一定的情况下，提高单位面积的粮食产量无疑是一种很好的解决办法。长期以来运用化肥和农药被人们视为提高粮食产量的行之有效的办法，但是长期的大量的滥用并不能无限提高粮食的产量，反而带来了一系列环境问题，如土壤板结、肥力下降、土壤生态平衡遭到破坏等，农药的使用也会因其药物残留、渗入地下水等威胁人类健康，以上问题显然不利于农业的可持续发展。因而，找到替代传统化肥的新肥料的工作势在必行。

植物根际促生菌不但能促进植物生长还能起到一定的生物防治作用，目前国际上和国内关于根际促生菌方面的研究工作已经很多，所有研究者有一个共同目标，那就是早日弄清楚根际促生菌的促生机制和相关生理生化特性等一些与其生长繁殖相关的特征，并尽量多的发现有较高促生潜力的优质菌种资源，毕竟高促生潜力的菌株才有可能被用于生产商业化的微生物肥料。Dong Z.等人提出了“氢肥”的概念并得到了广大研究者的认可和重视，“氢肥”的主角氢氧化细菌被归类为植物根际促生菌，其具有植物根际促生菌的一些重要促生特征，同时又有自身独特代谢特点即利用H₂为能源同化CO₂进行化能自养生长，这使得其相比其他植物根际促生菌有一些优势，尤其在其被应用于豆科植物根际时。而正是由于氢氧化细菌独特的代谢特点使得其分离工作比较困难，因而目前优质的高潜力促生菌种资源相对较少，研究工作也不太充分。所以分离优质的具高促生潜力的菌种，并进一步研究其促生机制，为用于商业化生产的微生物肥料提供优质菌种资源和前期理论依据的工作任重道远。

发明内容

本发明的目的是提供一株氢氧化细菌荧光假单胞菌SDW-16（Pseudornonas fluorescens SDW-16）及其分离培养方法。

本发明的另一目的是提供该氢氧化细菌在生物防治和促生作用中的应用。

本发明的实现过程如下：

一种氢氧化细菌SDW-16，其分类命名为氢氧化细菌荧光假单胞菌SDW-16（Pseudornonas fluorescens SDW-16），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018640。

其形态特征为：短杆状，G^-，在固体培养基上菌落呈淡黄色圆形，边缘整齐；其最适的生长温度30℃，最适的pH值为7.0~7.2。

上述氢氧化细菌SDW-16的分离纯化步骤如下：

（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

（2）富集培养：将采集的土壤样品置于持续通H₂的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；

（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；

（4）菌种筛选：吸氢酶鉴定。

上述氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法中，步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英或沙打旺，根际土壤范围为距离根瘤5 mm以内。

上述氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法中，步骤(3)所述的将土壤样品稀释为10^-1～10^-12系列梯度，然后涂布于无机盐基础培养基平板上，置于浓度为1:4 mmol/L的气体循环培养系统中培养3～4周，以平板上产生肉眼可见菌落为准；从各平板上挑取形态特征不同的菌落于无机盐基础培养基平板上继续划线纯化，直至平板上的菌落形态和镜检的菌体形态一致，每株菌要连续纯化三代以上，最后将纯化的菌株用牛肉膏蛋白呈斜面于4℃条件下保存，以备后用。

所述的无机盐基础培养基组分为：2.9 g Na₂HPO₄·2H₂O; 1.5 g KH₂PO₄; 0.5 gNaHC0₃; 1.0 g NH₄Cl;0.2 g MgSO₄·7H₂O; 0.01 g CaCl_2·2H₂O; 0.01 g FeSO₄·7H20;水1000 mL; pH 7.2;每1L无机盐培养基加入3 mL微量元素溶液，微量元素溶液((1 L)含:0.6g H₃BO₃; 0.4g CoC1₂·6H₂O;0.2 g ZnSO₄·7H₂O;0.06 g MnCl₂·4H₂O; 0.06 g NaMoO₄·2H₂O;0.04 gNiC1₂·6H₂O;0.02 g CuSO₄·5H₂O。

上述氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法中，步骤(4)所述的具体步骤为：将已灭菌的直径0.2～0.45µm滤膜放在无机盐基础培养基平板上，然后将待测菌株点接于滤膜上于气体循环系统中培养，待滤膜上有明显菌落出现时，把滤膜放在用0.1% W/V现配的TTC溶液浸透的滤纸上，空气中室温黑暗条件下放置10～15 min，注意菌落可能出现的颜色变化和强度，然后再置于100% H₂条件下培养10～15 min，并注意菌落出现的颜色变化，空气中培养时不着色而在H₂条件下培养变为红棕色的菌株说明有吸氢酶活性。

本发明氢氧化细菌SDW-16在生物防治中的应用。

本发明氢氧化细菌SDW-16在促进小麦生长中的应用。

本发明选用沙打旺根际土壤为研究对象，采用气体循环培养体系模拟根际氢氧化细菌的生长条件，在富氢的条件下用矿物质无机盐固体培养基对氢氧化细菌进行分离，并做形态特征和生理生化初步鉴定及吸氢酶的定性鉴定。从ACC脱氨酶、IAA、铁载体等促生特征探索其促生机制。根据促生特征结果选出高促生潜力的菌株，做16SrDNA序列测定并结合生理生化特征判定菌株种属，而后进一步做真菌拮抗试验和小麦促生试验，为用于实践的微生物肥料提供优质菌种资源和初步理论依据。本发明氢氧化细菌对苹果腐烂病菌Cytospora sp.和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea具有拮抗作用以及对小麦具有促生作用。本发明以最优菌株在实验室发酵，制备氢细菌制剂，用于农业生产可以促进植物生长，提高产量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。

附图说明：

图1是IAA标准曲线；

图2α—丁酮酸标准曲线；

图3菌株铁载体试验结果；

图4SDW-16对病原菌的拮抗作用。

具体实施方式

实施例1 土壤微生物SDW-16的分离纯化和吸氢酶的鉴定

本发明菌株从陕西省西北大学果园内的沙打旺根际土壤中分离获得。

该菌株鉴定特征如下：

1.生理生化特征

菌株SDW-16的生理生化特征显示在表1

2.序列分析

菌株的16S rDNA序列测定及系统发育树构建按如下步骤进行，模板DNA的提取按照UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒上的标准步骤执行，具体步骤如下：

(1)收集并裂解细胞

G-细菌

A.向离心管中加入1 mL活化24 h (30℃, 180 r/min)的待测菌悬液，于离心机中10000 r/min离心30秒，收集菌体沉淀，弃上清液；

B.取180 µL Digestion Buffer加入离心管中，于漩涡振荡器上轻轻振荡使菌体重悬，然后向菌体悬浮液中加入20 µL Proteinase K溶液，并充分混匀。水浴锅中56℃水浴30min，期间将离心管轻轻颠倒混匀，直至菌体细胞完全裂解。

(2)向上述离心管中加入200 µL BD Buffer, 70℃水浴10 min使溶液澄清，期间将离心管反复颠倒棍匀。

(3)取200 µL无水乙醇加入上述离心管中，充分颠倒混匀。

(4)将吸附柱放入收集管中，将离心管中溶液和悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min,离心后(12000 r/min, 3 min)弃上清。

(5)取500 µL PW Solution加入吸附柱中，离心后(10000 r/min, 1 min)再次弃上清。

(6)取500 µL Wash Solution再次加入吸附柱中，离心后(10000 r/min, 1 min)弃上清。

(7)吸附柱放回收集管中后继续离心(12000 r/min, 2 min)，去除残留的乙醇。

(8)取干净的1.5 mL离心管放入吸附柱，于吸附膜中央处加入100 µL的 ElutionBuffer(2.5 mM Tris-HCI, pH 8.5，事先预热至60℃)，静置3 min后离心(10000 r/min,1min)收集DNA，得到的DNA溶液-20℃保存或用于后续试验。

基因组DNA得到后，以27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACGGCTACCTTGTTACGACTT)为通用引物对菌株的16S rDNA片断进行扩增。PCR反应体系为:模板DNA 0.5 µL, 5 ×Buffer 2.5 µL, Dntp(各2.5 mM)1 µL，上下游引物各0.5 µL，加ddH20至25 µL。PCR循环条件为：98℃预变性3 min, 98℃ 25 s, 55℃ 25s, 72℃ 1 min，第2∽4步30个循环，72℃ 10 min终止延伸，4℃终止反应。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖浓度为1%，电泳条件为150V，20min）后，观察电泳结果，见图1。

PCR产物由生工生物(上海)有限公司进行纯化和测序，序列在NCBI数据库中经BLAST比对后，确定SDW-16(KF835389)为荧光假单胞(Pseudornonas. Fluorescens)。

本发明的氢氧化细菌为本发明的氢氧化细菌的分离培养方法是将土壤样品稀释为10^-1～10^-12系列梯度，然后涂布于无机盐基础培养基平板上，置于气体循环培养系统（H₂浓度约为1.4mmol/L）中培养3～4周，以平板上产生肉眼可见菌落为准。从各平板上挑取形态特征不同的菌落于无机盐基础培养基平板上继续划线纯化。对于纯化的菌株还要进一步做吸氢酶活性的定性试验，以确定各菌株是否含有吸氢酶，并分析氢氧化细菌对生物防治和小麦促生的影响。

本发明在具体使用时，是将其制成微生物菌剂。

氢氧化细菌制剂的制备方法：

(1)菌株：上述分离纯化出的较强氧化能力H₂的氢氧化细菌荧光假单胞(Pseudornonas. Fluorescens)SDW-16；

(2)发酵培养：接种新鲜的氢氧化细菌到三角瓶，放入摇床，转速180r/min,280C摇瓶培养36h；

(3)菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂；

(4)田间试验：在西北大学试验田进行。设SDW-16、营养液、空白对照3个处理，每个处理用土埂隔开。每隔5天调查促生效果。

实施例2 菌株分泌IAA能力的测定

用接种环挑取活化24 h的单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，28℃于摇床中180 r/min培养24 h，取1 mL菌液加入灭菌的干净1.5 mL离心管中，10000 r/rnin离心10 min，弃上清液，将细菌沉淀用无菌水洗涤2次，然后用无菌水稀释10倍得菌悬液。从上述菌悬液中取100 µL接种到50 mL KingB-Trp培养基(L-Trp终浓度为100 mg/L)中，摇床中180 r/min，28℃培养72 h后将培养液转移到干净的大离心管中，离心机中5000 r/min离心20 min，将上清液转移到新的干净的离心管中。取1 mL上清液与1 mL Salkowski reagent混合均匀，室温中黑暗处静置15 min，观察各样品出现的颜色变化，混合液显粉红色则证明有IAA产生，将显色的样品于530 nm处测吸光值，对照为不接菌的溶液与Salkowski reagent试剂的混合液，根据标准曲线计算各菌株产生IAA的量。每个处理三次重复。

结果显示：IAA分泌能力为21.62 0.30 µg/mL，颜色反应为粉红色。

实施例3 菌株ACC脱氨酶活性的测定

首先用Tris-HCl溶液((0.1M, pH 8.5)配制100 mM的α—丁酮酸母液，然后用相同的Tris-HCl溶液将上述母液稀释至10 mM，并以此为基础配置0∽1.0 µM的标准溶液，从每个梯度中取200 µL标准液加入干净的5 mL冻存管中，然后依次加入HCl (0.56 M)溶液1.6 mL和0.2%的2,4一二硝基苯肼溶液((0.2 g 2,4一二硝基苯肼溶于100 mL 2M的HCl中)300 }L，于漩涡振荡器上充分混匀后置于30℃水浴锅中30 min，最后向上述混合液中加入2 mLNaOH溶液((2 M)终止反应，NaOH, α一丁酮酸和2,4一二硝基苯肼三者会发生颜色反应，依此在540 nm处测各梯度吸光值并建立标准曲线。

标准曲线建立后，按如下步骤测各菌株ACC脱氨酶活力：

取一环活化24 h的待测菌株于1 mL无菌水的离心管中制成菌悬液，吸取5 µL菌悬液加入到7.5 mL LB培养液中，摇床上培养24 h (30℃, 200 r/min)。

将上述菌悬液转入10 mL无菌离心管，离心(5000 r/min, 20 min)弃上清，然后用5 mL DF无氮培养液洗涤菌体(5000 r/min, 20 min)两次，用7.5 mL DF无氮培养液再次悬浮菌体，并向每管中加入45 µL ACC溶液(0.5 M)，于摇床中继续培养24 h (30℃, 200 r/min)。

再次将7.5 mL菌悬液转入10 mL无菌离心管，离心(5000 r/min, 20 min)弃上清，然后用5 mL Tris-HC1溶液(0.1 M , pH 7.6)洗涤菌体(5000 r/min)两次，弃上清。

将菌沉淀用1 mL Tris-HCl溶液(0.1 M, pH 7.6)重新悬浮，5000 r/min离心20min，弃上清。用600 µL Tris-HCl溶液(0.1 M , pH 8.5)再次悬浮菌体，向每管中加入30 µL甲苯，用漩涡振荡器以最高速震荡30 s后从每管中取100 µL菌体裂解液于4℃冰箱中保存用于蛋白含量的测定，剩余的裂解液立即用于ACC脱氨酶活性的测定。

从每管中分别取200 µL菌体裂解液至两根1.5 mL离心管中，其中一根离心管标记为A并加入20 µL ACC溶液((0.5 M)混合均匀，另一只离心管标记为B不加任何物质，水浴锅中30℃反应15 min，向上述离心管中加入1 ml HC1溶液(0.56 M)混匀，10000 r/min离心10min，取1 mL上清液至5 mL冻存管中，立即加入800 µL HCl溶液((0.56 M)混匀，向所有离心管中加入0.2%的2,4一二硝基苯肼溶液300 µL, 30℃水浴锅中反应30 min，最后向所有离心管中加入2 mL NaOH溶液(2 M)充分混匀。

用分光光度计在540 nm处检测A，B两管溶液吸光值，依据A，B两管溶液吸光值之差和α一丁酮酸标准曲线可计算α一丁酮酸产量，再根据菌体蛋白含量(Bradford法)可知ACC脱氨酶活力(nmol·mg^-1·h^-1)。以Tris-HCl溶液(0.1 M, pH 8.5)为空白对照，每个处理三次重复。

结果显示：氢氧化细菌SDW 16的ACC脱氨酶的活力为8694.55 nmol·mg^-1h^-1。

实施例4 铁载体的检测

从斜面上取一环待测菌株接种至5 mL LB培养基中于摇床上30℃ 200 r/min活化24h，取5 µL活化菌液接种至10 mL MKB液体培养基中30℃ 200 r/min培养72 h，将上述经铁饥饿处理的菌株以点接或划线的方式接种至MKB无铁培养基平板上，生化培养箱中30℃培养，待平板上出现明显菌落后将预先灭菌的冷却至60℃左右的CAS半固体检测培养基倒在长有菌落的MKB无铁培养基平板之上，每皿10 mL，静置观察平板上出现的颜色变化。若待测菌株能分泌铁载体，则菌落周围会出现桔黄色的铁载体晕圈，铁载体晕圈出现时间、大小和颜色深浅与菌株分泌铁载体的能力相关。菌株在铁胁迫环境中分泌对Fe³⁺有更强亲和力的铁载体，HDTMA. CAS和Fe³⁺三者形成的蓝色复合物中的Fe³⁺会与铁载体结合，而使培养基由蓝色变为桔黄色。

结果显示：菌株SDW-16为铁载体阳性菌株。

实施例5 真菌拮抗和小麦促生作用

细菌对真菌的抑制试验采用平板对峙法，取一环待测菌株接种至5mL LB液体培养基中，摇床中30℃，200r/min培养24h，取5µL活化的菌液分3点在PDA平板上接种，同时挑取试验病原菌点接在平板中央，病原菌与待测菌株间距3cm。待接种菌液渗入PDA培养基中后将平板倒置于生化培养箱中30℃培养3-7d，观察试验菌株对病原菌有无抑制作用并记录相关数据，每个处理三次重复。对SDW-16，AaP-6，AaP-20三株氢氧化细菌进行种属鉴定后，又初步考察了三株菌的生物防治潜能，选用苹果腐烂病菌(Cytospora sp.），腐皮镰刀菌(Fusarim Solani)，葡萄座腔菌((Botryosphaeria dothidea)，番茄灰霉病菌((Botrytiscinerea)以平板对峙法对三株氢氧化细菌进行了拮抗试验。将三株菌和病原菌分别点接到PDA平板上30℃培养5～7d后，发现AaP-6，AaP-20对上述四株病原菌均无拮抗作用，如图4显示仅有SDW-16对苹果腐烂病菌(Cytospora sp.）和番茄灰霉病菌((Botrytis cinerea)有拮抗作用。故选用SDW-16进行小麦促生试验。具体步骤如下：挑取大小基本一致和完好的小麦种子用蒸馏水浸泡6h，蒸馏水冲洗干净后用70%的乙醇处理1min，无菌水冲洗5min去除乙醇，再次用1%的次氯酸钠溶液浸泡5min，然后用无菌水冲洗5min，将消毒的小麦种子置于洁净的培养皿中，上面覆盖湿润纱布以保持种子湿润，25℃暗处催芽3d。

挑一环待测菌株于10mL LB液体培养基中活化24h，从上述菌液中取1mL转入50mLDF-ACC液体培养基上继续培养24h，选取生长一致的发芽的小麦种子在15mL待测菌液中浸泡1h后，转入装有50mL Hoagland半固体培养基的大试管(3cm × 18cm)中培养，光照培养箱温度设为25℃，光暗时间比为12:12h。培养10d后测量小麦的苗高、茎长、根长、总鲜重、根鲜重、总干重、根干重等参数。对照组发芽小麦用等量不接菌的培养液浸泡1h。结果显示在表2。

注:表中数值为三个重复的平均值;“士”为标准差;"CK”为对照组;“*”和“**”分别表示相同测试项下较对照差异显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)。

从表2中数据可知经SDW-16处理的小麦培养10d后与对照组相比，苗高、根长、茎长、总鲜重、根鲜重、总干重、根干重分别增加了50.26%，191.67%，2.42%，76.57%，107.71%，35.11%，25.66%，其中根长和根鲜重两项参数达到了极显著差异，苗高、总鲜重、总千重和根干重为显著差异。从结果来看氢氧化细菌SDW-16对小麦产生了明显的促生作用，尤其对根长和根鲜重的作用最为明显，但对茎长的促生长作用似乎不太明显。氢氧化细菌SDW-16促生作用的初步研究证明了上述观点，SDW-I6不但具有铁载体、IAA、以及ACC脱氨酶三项促生特征，而且更表现出了对小麦显著的促生长能力，其可作为日后开发微生物肥料的优质菌种资源。

Claims (9)

1.一种氢氧化细菌SDW-16，其分类命名为氢氧化细菌荧光假单胞菌SDW-16（Pseudornonas fluorescens SDW-16），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018640。

2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌SDW-16，其特征在于：短杆状，G^-，在固体培养基上菌落呈淡黄色圆形，边缘整齐；其最适的生长温度30℃，最适的pH值为7.0~7.2。

3.权利要求1所述的氢氧化细菌SDW-16的分离纯化步骤如下：

（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

（2）富集培养：将采集的土壤样品置于持续通H₂的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；

（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；

（4）菌种筛选：吸氢酶鉴定。

4.根据权利要求3所述的氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法，其特征在于：其中步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英或沙打旺，根际土壤范围为距离根瘤5 mm以内。

5.根据权利要求3所述的氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法，其特征在于：其中步骤(3)所述的将土壤样品稀释为10^-1～10^-12系列梯度，然后涂布于无机盐基础培养基平板上，置于浓度为1:4 mmol/L的气体循环培养系统中培养3～4周，以平板上产生肉眼可见菌落为准；从各平板上挑取形态特征不同的菌落于无机盐基础培养基平板上继续划线纯化，直至平板上的菌落形态和镜检的菌体形态一致，每株菌要连续纯化三代以上，最后将纯化的菌株用牛肉膏蛋白呈斜面于4℃条件下保存，以备后用。

6.根据权利要求3所述的氢氧化细菌SDW-16的分离纯化方法，其特征在于步骤(4)所述的具体步骤为：将已灭菌的直径0.2～0.45µm滤膜放在无机盐基础培养基平板上，然后将待测菌株点接于滤膜上于气体循环系统中培养，待滤膜上有明显菌落出现时，把滤膜放在用0.1% W/V现配的TTC溶液浸透的滤纸上，空气中室温黑暗条件下放置10～15 min，注意菌落可能出现的颜色变化和强度，然后再置于100% H₂条件下培养10～15 min，并注意菌落出现的颜色变化，空气中培养时不着色而在H₂条件下培养变为红棕色的菌株说明有吸氢酶活性。

7.含有权利要求1所述氢氧化细菌SDW-16的固体菌剂。

8.权利要求1所述的氢氧化细菌SDW-16在生物防治中的应用。

9.权利要求1所述的氢氧化细菌SDW-16在促进小麦生长中的应用。