CN102268391A - 氢氧化细菌wmq-7及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氢氧化细菌恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）WMQ-7，已于2011年3月8号在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏登记号为CCTCC M 2011060；还涉及从不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出该氢氧化细菌的方法，首先是利用持续通H₂的培养装置、矿质盐培养基实现对氢细菌的富集、分离和培养，并通过气相色谱法筛选具有较强氧化H₂的菌株。以最优菌株在实验室发酵，制备氢细菌制剂。该生物制剂用于农业生产可以提高植物生长，提高产量，提高肥效和提高植物的抗逆能力。

Description

氢氧化细菌WMQ-7及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及氢氧化细菌WMQ-7及其分离方法和应用，具体涉及一种不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）WMQ-7及其微生物制剂，该氢氧化细菌WMQ-7菌株于2011年3月8号保藏于武汉大学中国典型培养物中心，保藏编号为CCTCC M 2011060。

背景技术

豆科作物的轮作、间作效益多被认为是来自豆科作物根部的残留氮的作用，而新近的研究表明氮肥并不能完全取代豆科作物的轮作效果，大约75%的增产效应还不能用已有的理论来解释。研究发现，不含吸氢酶（Without Uptake Hydrogenase，HUP^－）的根瘤菌在固氮过程中释放的H₂能够促进根际氢氧化细菌的生长，并进一步促进植物生长，即“氢肥理论”。即Hup^-豆科根瘤在固氮过程中释放的H₂可以通过改变豆科根瘤周围的特定土壤微生物种群——氢氧化细菌来促进植物的生长。最新研究表明，某些氢氧化细菌通过促进植物对矿质元素的吸收和利用、产生某种促进植物生长的代谢物、抑制有害病原菌等，直接或间接增进土壤肥力、增强植物抗病和抗干旱能力调控作物生长。

氢氧化细菌是能够利用H₂作为能源并同化CO₂作为碳源的一类细菌，在自然界中氢氧化细菌的营养要求比较简单，而分离培养氢氧化细菌的培养基，需要特定的营养和条件，如以铵盐形式存在的氮元素、钠或钾的磷酸盐、硫酸镁、铁盐和钙盐。多年来人们一直致力于如何有效分离、纯化出氢氧化细菌，以便进行进一步的研究，但由于氢氧化细菌的生长需要消耗H₂，导致菌株的分离工作极其困难，这是因为H₂混合气体存在一定的安全隐患（H₂浓度≥5%易于爆炸）。培养设备、混合气体浓度、培养基的营养成分、温度、pH及盐浓度等都可能影响氢氧化细菌的生长。

氢氧化细菌属于植物根际促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR），对农作物的增产具有重要作用，其研究价值已引起广泛重视。由于技术限制，至今未得到大面积推广应用。选择正确的氢氧化细菌的分离培养方法，构建完善的培养体系，是实现大规模菌种选育工作的基础，进一步制备出促进植物生长的氢氧化细菌制剂，是当前所面临的主要问题。

因此，本发明的发明者在研究土壤微生物的同时，采用气体循环培养体系，模拟自然土壤环境，从豆科作物根际土壤中筛选出自然条件下的优良氢氧化细菌。分离鉴定了可定植于小麦植物根系内外的氢氧化细菌WMQ-7，并发现该菌株可替代豆科作物固氮过程中释放的氢气的作用，促进农作物生长，大幅度地减少土壤的退化和水系的污染，改善土壤肥力，促进农业的可持续发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种氢氧化细菌WMQ-7及含有氢氧化细菌WMQ-7或由其产生的次级代谢物的环境亲和性氢氧化细菌制剂。

本发明的另一目的是提供上述氢氧化细菌的分离方法。

本发明的氢氧化细菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）WMQ-7，已于2011年3月8号在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏登记号为CCTCC M 2011060。

在自然条件下，氢氧化细菌WMQ-7定植于植物根系内外，分泌植物生长促进物质，并通过对植物病原菌的拮抗作用来抑制多种病原体的生长。

本发明的氢氧化细菌WMQ-7为在28℃的MSA培养基中培养的革兰式阴性杆状细菌。

本发明的氢氧化细菌的分离培养方法首先是利用持续通H₂的培养装置实现对土壤样品的富集，然后将其稀释涂布于MSA培养基平板，筛选能够以H₂为能源并同化CO₂为唯一碳源的菌株，进而纯化并转接MSA培养基斜面，气相色谱检测菌株的H₂消耗量，从而进一步筛选出H₂消耗能力比较强的氢氧化细菌。而后经过实验室发酵，制备氢氧化细菌制剂不同剂型，最后分析氢氧化细菌制剂不同剂型对冬小麦促生效果。

其鉴定特征如下：

1、生理生化特征

WMQ-7菌株的生理生化特征显示在表1中。

所述WMQ-7菌株呈短杆状，大小约0.52μm～0.76μm ×0.84μm～1.80μm，革兰氏染色阴性。在MSA半固体培养基上28 ℃培养7 d 可形成1.5 mm 菌落,呈圆形、边缘不整齐，白色,表面光滑。

附注：1：氧化酶；2：过氧化氢酶；3：葡萄糖氧化发酵；4：V.P试验；5：甲基红试验；6：淀粉水解；7：纤维素分解；8：明胶液化；9：硝酸盐还原；10：色氨酸脱氨酶；11：吲哚产生；12：脲酶；13：硫化氢的产生；14：苯丙氨酸脱氨酶；15：利用柠檬酸盐

2、序列分析

对WMQ-7菌株进行16S rDNA序列分析，从分子生物学角度对菌株进行鉴定。包括基因组DNA的提取、细菌16S rDNA基因PCR扩增及产物纯化、载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、重组质粒的提取及双酶切鉴定。

（1）基因组DNA的提取

主要采用两种方法，一种是热裂解，将配制的新鲜菌悬液置于99℃，10min，方法简单，但是DNA总量少且有杂质；另一种方法是利用DNA提取试剂盒，本实验中用到的细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-02，购自天根生化科技北京有限公司。

（2）细菌16S rDNA基因PCR扩增及产物纯化

PCR反应的模板为提纯的基因组DNA，引物用16S rDNA全长扩增通用引物，正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物5′-ACGGTTACCTTGTTACGA CTT-3′（引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。PCR反应每10μL体系中含有模板DNA 1μL，正反向引物各1μL，Premix Taq 5μL（TaKaRa），ddH₂O 2μL。以无模板DNA的反应体系作为空白对照。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，30cycle；72℃ 5min，1cycle；4℃ pause。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳（电压100v，电流120mA，30min）和凝胶图像分析仪进行检测，观察目的片段是否得到有效的扩增。在紫外灯下，将扩增出的明亮的条带切成细小的碎块，尽量减少凝胶在紫外灯下暴露的时间，避免对DNA造成的损伤。按照DNA凝胶回收试剂盒（Axygen）的操作程序回收PCR产物并进行纯化。

（3）载体的连接和大肠杆菌感受态细胞的转化

回收的PCR产物用T-载体PCR产物克隆试剂盒（TaKaRa）连接到pMD18-T Vector上，16℃循环水浴连接过夜。连接体系（10μL）：PCR产物 1μL，pMD18-T Vector（50ng/μL） 1μL，ddH₂O 4μL，Solution I 5μL。

大肠杆菌Top10感受态细胞的制备：挑取大肠杆菌单菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃培养过夜。将过夜培养物接种于50mL LB培养基中，37℃振荡培养3h，使A₆₀₀≤0.6。将培养物装在50mL离心管中，4℃、3000r/min离心15min。加15mL缓冲液A重悬，冰浴1h。4℃、3000r/min离心15min，弃上清。2mL缓冲液B重新悬浮，冰浴15min。按每管100μL分装，-70℃保存。（缓冲液A：100mmol/L KCl，60mmol/L CaCl₂，30mmol/L KAc，15%甘油。混合后用冰醋酸调pH至5.8，0.22μm滤器过滤除菌。缓冲液B：10mmol/L KCl，75mmol/L CaCl₂，10mmol/L MOPS，15%甘油。混合后用NaOH调pH至6.8，0.22 μm滤器过滤除菌。）

吸取10μL连接产物，加入大肠杆菌Top10感受态细胞，轻轻混匀，在冰上放置30min。42℃热休克90s，置于冰上1-2min。每管加无抗生素的LB培养基800μL，37℃摇床振摇1h。取200μL菌液涂布含100 mg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB培养基平板，37℃平放30min，然后倒置培养10-14h。

（4）阳性克隆的筛选

质粒的提取：从含Amp的LB培养基平板上挑取单菌落，接种于5mL含Amp（100 mg/mL）的LB液体培养基中。置于37℃下200r/min振荡培养过夜。将培养物转移至1.5mL离心管中，12000r/min离心30s，去上清。加入100μL溶液I，重悬细胞。加入200μL新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，不要振荡，应确保离心管的整个表面均与溶液II接触，将离心管置于冰上。加入150μL预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，使溶液III将粘稠的细菌裂解物分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。12000r/min离心5min，将上清转移到另一离心管中。加等量氯仿：异丙醇（24:1），振荡混匀，4℃、12,000 rpm离心5min将上清转移到另一离心管中。用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA，振荡混和，于室温放置1h。4℃、12000 r/min离心10min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸上，使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。1mL70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀2次，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥30min。用30μL去离子水重新溶解DNA，保存于-20℃。（溶液I：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0）；溶液II：0.2mol/L NaOH，1%SDS；溶液III：60mL 5mol/L 乙酸钾，11.5 mL冰乙酸，28.5mL蒸馏水。）

双酶切反应采用20μL反应体系，按以下顺序在冰浴中加入：10×M Buffer 2μL，质粒DNA 10μL，限制性内切酶Hind III、EcoR I各1μL，ddH₂O 6μL。瞬间离心后，于37℃保温3-4h，取20μL用于1%琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像仪上进行检测并照相。挑取携带外源载体的阳性克隆送样，16S rDNA序列的测定由上海生工生物工程技术服务有限公司和大连TaKaRa公司完成。

（5）16S rDNA序列分析

将菌株的16S rDNA序列通过NCBI网站录入，与已知的序列对比并分析同源性。利用DNASTAR（MegAlign）将序列进行对位排列，并手工适当校正。MEGA3.1分子进化遗传分析软件分析碱基组成、GC含量，并以Kimura-2参数计算遗传距离，采用Nj邻近法构建系统进化树。

以下序列代表WMQ-7 菌株的16S rDNA序列，其片段长度为1451 bp，GC 含量53.8 % , GenBank 登录号为EU807744。WMQ-7 菌株与假单胞菌属在系统发育树上位于相同的发育分支，且与恶臭假单胞菌的同源性在99 %，同时结合菌体形态和生理生化特征，鉴定菌株WMQ-7 为恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida)。

氢氧化细菌最优菌株的筛选具体包括以下步骤：

（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤。

（2）土壤富集：采集的根际土壤用16目的筛子过筛后，与灭过菌的石英砂混合（土壤：石英砂=2：1）防止板结。将60 mL混合土壤装入两端密闭的玻璃管（2.5 ×60 cm）中，然后将3个玻璃管串联。电解水的方式产生H₂，形成流速为280 mL/min，H₂含量为4.16×10^-4-2.42×10^-3 mol/L的混合气体，富集土壤中的氢氧化细菌。

（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养。待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，将菌株转接斜面培养基，放入密闭干燥器中，按上述通H₂的量培养，备用。

（4）菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。按照：氧化H₂值（mol/L） = 密闭试管中初始H₂浓度（mol/L）- 培养3 d后密闭试管中剩余H₂浓度（mol/L），检测菌株是否具有氧化H₂能力以及氧化H₂能力的大小，筛选出具有较强氧化能力H₂的氢氧化细菌—恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida) WMQ-7。

氢氧化细菌制剂的制备

（1）菌株：上述分离纯化出的较强氧化能力H₂的氢氧化细菌恶臭假单胞菌( Pseudomonas putida) WMQ-7。

（2）发酵培养：接种新鲜的氢氧化细菌到三角瓶，放入摇床，转速180r/min，28℃摇瓶培养36h。

（3）菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂。

（4）田间试验：在西北大学试验田进行。设WMQ-7、营养液、空白对照3个处理，每个处理用土埂隔开。每隔5天调查促生效果。

    使用本发明的氢氧化细菌WMQ-7具有如下优点：

（1）当使用含有该菌株的微生物制剂作为农作物的接种物时，由于本发明的氢氧化细菌WMQ-7可提供生物活性物质如某些酶供给并促进植物生长，因此尽管使用少量的化肥，也能促进农作物产量。

（2）本发明的氢氧化细菌WMQ-7是化肥的替代品，对农作物有广泛的使用范围，如可用于小麦、冬小麦、玉米、番茄和黄瓜。

（3）当本发明的氢氧化细菌WMQ-7接种到农作物中时，该菌株可以通过抑制土壤中的植物病原微生物来帮助农作物生长免受病原体的危害。

（4）本发明的氢氧化细菌WMQ-7通过定植于农作物根系内部可在被接种的农作物大量表达。

（5）由于本发明的氢氧化细菌WMQ-7不可能污染环境，所以可以保护水质和土壤环境，并改善土壤生态系统的健康。

本发明还提供了含有氢氧化细菌WMQ-7或其产生的次级代谢产物的微生物制剂。

可以使用本领域熟知的方法将本发明的氢氧化细菌制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但本发明并不局限于此。为替代化肥，本发明的氢氧化细菌制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。

根据本发明的环境亲和性微生物制剂通过含有氢氧化细菌WMQ-7而能够减少化肥的用量、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态系统的健康。

氢氧化细菌WMQ-7可产生成合适的微生物制剂，该制剂可接种到农作物如小麦、玉米、番茄和黄瓜中。

在农作物的种植过程中，该菌株通过定植于植物根系内外，通过氧化土壤中的H₂并同化CO₂而生长，或由其产生的次级代谢物而能够减少化肥的使用量、抑制植物病原菌生长、保护土壤环境并改善植物根际微生态来促进植物生长。

本发明的植物根际促生菌特殊功能体现在以下几个方面：

（1）产生ACC脱氨酶：乙烯是一种重要的植物激素，但在逆境条件下植物会产生过量的乙烯，导致植物生长发育严重受阻或死亡。而ACC脱氨酶可将乙烯的前体ACC分解成α-丁酮酸和氨，降低乙烯的浓度，从而缓解对植物的不良影响，促进植物生长。

Honizeas，Jacobson等证明恶臭假单胞菌含有ACC脱氨酶，进而促进植物生长。自Honma等发现ACC脱氨酶以来，先后在多种土壤微生物中发现该酶的存在，如细菌、真菌和酵母，包括许多革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、根瘤菌及真菌等。吉云秀、BelimovA.A.等研究发现含ACC脱氨酶的植物根际促生细菌在高盐、重污染等逆境条件下能够有效地促进植物生长。

（2）铁载体：由于生物体生存的环境多是氧化性环境，Fe²⁺很容易被氧化成Fe³⁺，并以氧化铁或氢氧化铁等不溶性多聚体的形式存在，很难被微生物利用。植物根际促生细菌通过分泌对Fe³⁺具有较高亲和力的铁载体，即一种低分子量、水溶性的分子，可与Fe³⁺特异结合，因此可大量结合根周围可利用的的Fe³⁺，有效阻止病原微生物在植物根际的繁殖， 促进植物的生长。1980年Kloepper等首次证明了铁载体在植物根际促生细菌对土传病害的生防中起着重要作用。

（3）植物激素：研究表明植物生长发育过程中共生微生物产生的植物激素可促进植物根系有效吸收土壤中的水分和养分，促进植物生长发育，同时调控植物体其他生命活动。植物激素类物质主要有生长素(auxin，主要是IAA，吲哚-3-乙酸)、赤霉素(主要是GA3，GA1)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)和酚类化合物及其衍生物等。不同类型的植物根际促生细菌产生的植物激素的种类与数量都是有差异的，通常以一种激素为主，结合其他几种以低浓度从生理与形态上调节植物的生长。80%的根际细菌能产生IAA，其中主要有固氮螺菌、假单胞菌、黄单胞菌、粪产碱杆菌以及根瘤菌等。根际微生物主要通过3种方式产生IAA提供给植物：一是IAA基因直接整合到植物细胞染色体上，在植物细胞的调控下合成IAA，如土壤杆菌；二是细菌侵入植物细胞，在宿主细胞内分泌IAA供植物生长；三是细菌在宿主植物的根际生活，合成外源IAA供给植物利用。

（4）诱导体系抗性：诱导系统抗性（ISR）是利用各种生物或非生物的因子处理植物，使之形成物理或化学屏障而产生抗性。某些植物的抗病性能需要一定条件的诱导，这种诱导可以由微生物及其代谢产物引发。植物根际促生细菌与其他诱导因子诱发的抗病性反应类似，因此可通过植物根际促生细菌的处理获得植物的系统抗病性能。目前，运用植物根际促生细菌诱导植物ISR，如黄瓜、康乃馨、大豆、胡萝卜、拟南芥、烟草、水稻等的抗病性，取得很大成功。

（5）解磷作用：磷是植物必需的营养元素之一，土壤中95%以上的磷以无效形式存在，植物难以直接吸收利用。很多因素都影响土壤中磷的利用效率，其中微生物对土壤中磷的转化和有效性影响很大。土壤中存在大量能将植物难以直接吸收利用的磷转化为可吸收利用的形式的微生物，称为解磷菌或溶磷菌(Phosphate-solubilizing microorgani- sms,PSM)。这类解磷菌可分泌甲酸、乙酸、丙酸、延胡索酸、乙醇酸等有机酸，降低植物根际土壤的pH值，使不溶性磷转变成可溶性磷，供植物吸收和利用。

（6）产生抗生素：一些植物根际促生细菌可分泌抗生素类物质，在很大程度上可抑制土壤病原微生物的生长，从而减少植物病原微生物对植物的侵染，增强植物的抗逆性。因此植物根际促生细菌在病害生物防治中起着非常重要的作用。Weller于上世纪80年代首次发现荧光假单胞杆菌可产生抗生素吩嗪（Phenazines）及其衍生物；Pierson等发现通过转座子插入突变Pseudomonas aureofacience获得的突变体，因其不产抗生素羧化吩嗪而对病原菌的抑制能力有所减弱。随后发现了由不同属PGPR产生的抗生素，包括吩嗪、脓青素（Pyocy- unim）、2，4-二乙酰藤黄酚（2,4-diacetylphloroglulinol）、藤黄绿脓菌素（Pyolnteorin）、托酚酮（Tropolone）、硝基吡咯菌素（Dlrelintrin）、苯二酚（Phyloroglucinol）等。

总之，植物根际促生细菌能够分泌生长调节物质、抗生素类物质等促进植物的生长，而且某些微生物体产生的聚合物还具有降低水分胁迫、抗干旱、改善土壤结构和质量、调节离子活性以及为植物提供有机营养的能力。还有研究表明某些菌类可诱发根系伸长，间接促进吸收养分和水分。因此，深入研究植物根际促生细菌与植物之间相互作用的机制，促进微生物肥料产业化成为当前的研究热点，对资源合理综合的利用和环境保护具有重大意义。

本发明的植物根际促生菌可以产生ACC脱氨酶、铁载体和其他植物难以吸收的微量元素，提高农作物营养。

本发明的氢氧化细菌制剂的具体指标如下：

铁载体测定方法：Schwyn和Neilands在1987年就建立了通用的CAS铁载体检测方法，当高铁螯合能力的铁载体从由铬天青、铁离子和十六烷基三甲基溴化铵组成的CAS蓝色检测液中夺取铁离子时，检测培养基会发生有蓝色到橙色或粉红色的改变。1994年王平采用的CAS检测方法检测到了小麦根圈的铁载体分泌。因此，从CAS检测平板颜色的变化，可以初步判断菌株是否能够产生螯合铁离子的铁载体。铁载体含量用邻菲啰啉法测定，样品溶液中的Fe³⁺在酸性条件下还原为Fe²⁺，然后与邻菲啰啉作用生成红色络合离子，其颜色强度与铁的含量成正比。微生物的生长过程中，铁载体能够转运环境中的Fe³⁺以供生存需要，因此可以用邻菲啰啉的方法间接检测出Fe³⁺浓度的减少量，从而判断出铁载体的含量。

ACC脱氨酶测定方法：茚三酮比色法检测该菌株ACC脱氨酶活力。首先，取10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的ACC溶液各5mL于25mL 的比色管中,各加入1mL的0.5%茚三酮试剂,加上塞充分摇匀。将其置于90℃下水浴20-25 min, 冷却至室温, 用721型分光光度计在570nm下测得其光密度值。以标准液的光密度值和浓度做一标准曲线。然后，将筛选的菌株接种到含0.5g/L ACC的ACC检测（ADF）培养基，180r/min，28℃培养24h。培养液10000r/min，4℃离心30s，取上清液。以同样的反应量与反应条件进行反应，并在570nm下测定其吸光值。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为ACC待测液的浓度，以ACC浓度的变化来检测ACC脱氨酶活力的大小。本实验ACC脱氨酶的单位酶活定义为28℃，pH7.5时，每分钟消耗1μg ACC的活力。

附图说明

图1是富集的土壤样品中氢氧化细菌的吸H₂的变化曲线图。

图2表示氢氧化细菌WMQ-7电镜照片。

具体实施方式

本发明可通过下列与氢氧化细菌WMQ-7的分离、鉴定和植物生长促进活性相关的实例体现出来，氢氧化细菌WMQ-7是从中国陕西地区不含吸氢酶的结瘤豆科植物紫花苜蓿（Medicago sativa）根际土壤中分离出来的。然而，提供这些实例只是用来解释说明，并不能被认为是对本发明范围的限制，所附的权利要求对本发明的范围做了恰当的描述。

实施例 1 

    土壤微生物WMQ-7的分离

    1、样品采集：按常规方法采集生长旺盛的HUP^－结瘤紫花苜蓿根际（≤5 mm）土壤。

2、土壤富集：采集的根际土壤用16目的筛子过筛后，与灭过菌的石英砂混合（土壤：石英砂=2：1）防止板结。将60 mL混合土壤装入两端密闭的玻璃管（2.5 ×60 cm）中，然后将3个玻璃管串联。电解水的方式产生H₂，形成流速为280 mL/min，H₂含量为4.16×10^-4-2.42×10^-3 mol/L的混合气体，富集土壤中的氢氧化细菌。同样作3个串联玻璃管中各装有60 mL混合土壤，对该组土样持续通空气作为对照。每隔2 d，气相色谱检测培养装置出气口V₂和V₄的H₂含量，制作土壤的吸氢曲线，检测氢氧化细菌的富集程度。

3、菌种分离与纯化：取富集1个月的混合土壤10 g，溶于90 mL无菌水（含有玻璃珠）三角瓶中，振摇20 min，使土样与水充分混合，将细胞打散，梯度稀释10^-3-10^-6涂布MSA平板。将平板放入密闭容器中，通入流速280 mL/min，含H₂量为2.42×10^-3 mol/L的混合气体，室温倒置培养。待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，直至固体培养基上的菌落形态一致，且光学显微镜下观察的细胞形态一致。将菌落转接斜面，试管放入密闭干燥器中，按上述通H₂的量培养，备用。

4、菌种筛选：H₂含量分析利用气相色谱仪进行检测，内装5A分子筛的1 m×2 mm的色谱柱，载气为高纯度N₂，流速20 mL/min；进样口温度：150 ℃；检测器温度：160 ℃；检测温度：40 ℃。配制含H₂量为2.42×10^-3 mol/L的标准样品，校正并调整气相色谱仪达到稳定状态。将长有明显菌苔的试管斜面改用无菌橡皮塞密闭（每株菌做两个重复），用100 μL进样器注入H₂，使混合气体中H₂浓度为2.42×10^-3 mol/L左右，混合均匀，气相色谱检测密闭试管中的初始H₂含量，一支无菌的培养基斜面试管作为空白对照。将密闭试管在室温下水平放置于摇床上80 r/min培养3 d，在同样的气相色谱条件下检测H₂的终浓度。按照：氧化H₂值（mol/L） = 密闭试管中初始H₂浓度（mol/L）- 培养3d后密闭试管中剩余H₂浓度（mol/L），检测菌株是否具有氧化H₂能力以及氧化H₂能力的大小。

按上述实施方法共分离筛选出6株氢氧化细菌，表1是6株氢氧化细菌的氧化H₂能力测定结果，其吸氢值均大于2.44×10^-4 mol/L，有较强的氧化氢能力。

附注：0: < 2.44×10^-4 mol/L; Ⅰ: 2.44×10^-4 mol/L~5.96×10^-4 mol/L;Ⅱ: 6.06×10^-4 mol/L~8.93×10^-4 mol/L; Ⅲ: 12.28×10^-4 mol/L~13.83×10^-4 mol/L; Ⅳ: ≥18.59×10^-4 mol/L.

实施例 2 氢氧化细菌WMQ-7的植物生长促进效果

为了检测氢氧化细菌WMQ-7的植物生长促进效果，对冬小麦进行了实验。

室温下将小麦种子在蒸馏水中浸泡7-10h，待小麦种子萌芽，挑取无虫害完整的萌芽小麦种子，进行表面消毒。75%酒精浸泡1min，无菌蒸馏水清洗5次。0.1%酸性升汞浸泡5-10min，无菌蒸馏水清洗后备用。将筛选的氢氧化细菌分别接种于含8g/L葡萄糖的MSA液体培养基中，30℃、120r/min培养24h，在无菌平板中加入15mL菌悬液和10粒小麦种子。另15mL含8g/L葡萄糖的MSA无菌液体培养基平板，加10粒小麦种子作为空白对照。放入恒温光照培养箱中，温度25℃培养5-7天，观察平板小麦生长情况，记录根、叶发育情况。然后去根、去胚，取根以上部分于100℃烘干32h称干重。结果显示在表3中。

如表3所示，菌株WMQ-7在小麦生长过程中，在根、苗、干重三方面具有比较明显的促进作用。菌株WMQ-7处理过的小麦生根情况与空白对照相比，根的长度比无菌的空白对照增加了73.92%；苗的长度均比无菌的空白对照增加34.64%以上；小麦干重与空白对照相比增加95.24%。

附图1 是富集的土壤样品中氢氧化细菌的吸H₂的变化曲线图，H₂初始含量为2.42×10^-3 mol/L，检测培养装置出口端的H₂残留量发现，培养的7 d内H₂含量基本未发生变化，说明此时氢氧化细菌还未大量生长。富集培养的第9-19 d，H₂含量下降了52.31 %，氢氧化细菌开始快速繁殖生长。21-29 d，H₂含量基本维持在0.887 mmol/L比较低的水平，说明此时氢氧化细菌已经达到最大生长量，富集培养结束。 

附图2 是菌株WMQ-7扫描电子显微镜检测，发现菌株WMQ-7呈短杆状 ,大小约0.52μm～0.76μm ×0.84μm～1.80μm ,革兰氏染色阴性。

根据本发明的微生物制剂通过使用氢氧化细菌WMQ-7，能减少化肥的使用、稳定农作物产量、保护水质和土壤环境并改善土壤生态系统的健康。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  西北大学

 

<120>  氢氧化细菌WMQ-7及其分离方法和应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1451

<212>  DNA

<213>  恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

 

<400>  1

acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggatg agaagagctt gctcttcgat        60

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tcatgactgg g                                                                           1451

Claims (10)

1.一种氢氧化细菌WMQ-7，其特征在于该细菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）WMQ-7，保藏登记号为CCTCC M 2011060。

2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌WMQ-7，其特征在于：氢氧化细菌WMQ-7的生态特征如下：

WMQ-7菌落特征：在MSA半固体培养基上28 ℃培养7 d 可形成1.5 mm 菌落，呈圆形、边缘不整齐,白色，表面光滑；

WMQ-7个体形态：短杆状，大小约0.52μm～0.76μm ×0.84μm～1.80μm ,一端丛生鞭毛，革兰氏染色阴性。

3.含有权利要求1所述的氢氧化细菌的固体菌剂。

4.权利要求3所述的氢氧化细菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：将新鲜的氢氧化细菌发酵液以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑或蒙脱土为吸附剂制成固体菌剂。

5.权利要求1所述的氢氧化细菌的制备方法，包括以下步骤：

（1）样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

（2）土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H₂的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；

（3）菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；

（4）菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。

6.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于：其中步骤（1）所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5 mm以内。

7.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤（2）所述采集的根际土壤用16目的筛子过筛后与石英砂以体积比2:1混合，将混合土壤装入两端密闭的玻璃管中，H₂流速为280 mL/min，H₂含量为4.16×10^-4-2.42×10^-3 mol/L的混合气体，富集土壤中的氢氧化细菌。

8.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤（3）所述的矿质盐培养基：NaNO₃ 2.0 g，KH₂PO₄ 0.14 g，K₂HPO₄ 1.2 g，酵母膏 0.02 g，MgSO₄ 0.5 g，Fe₂(SO₄)₃ ·3H₂O 0.01 g，KCl 0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水 1 L，pH 7-7.2；取富集1个月的混合土壤与水混匀，以10^-3-10^-6梯度稀释涂布MSA培养基平板。

9.根据权利要求5所述的氢氧化细菌的制备方法，其特征在于，其中步骤（4）所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1 m×2 mm的色谱柱，载气为高纯度N₂，流速20 mL/min，进样口温度：150 ℃，检测器温度：160 ℃，检测温度：40 ℃。

10.权利要求1所述的氢氧化细菌在促进植物生长中应用。

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