CN109022324B - 一种荧光假单胞菌及其应用 - Google Patents

一种荧光假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens RQ3‑01，保藏编号为CGMCC No.14471。另外，本发明还公开了该荧光假单胞菌在降解难溶性无机磷中的应用。本发明的荧光假单胞菌是以难溶性无机磷为磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中使难溶性无机磷转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐；除此之外，本发明的荧光假单胞菌还具有降解有机磷和降解钾的功能，可有效的增加土壤中有效磷和有效钾的含量，具有促进植物生长和提高产量的作用。

Description

一种荧光假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种荧光假单胞菌及其应用。
背景技术
磷是植物体内化合物的主要成分，为生物固氮所必需，植物的生长发育和光合作用都离不开磷的参与，是植物生长必需营养元素之一。施用磷肥是农业生产中保障产量的主要途径，但磷肥在土壤中易被固化，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+结合形成难溶性无机磷，因此土壤中95％以上的磷以植物无法直接利用的无效形式存在，磷肥当季利用率仅为5％至25％。目前农业生产过程中为增加产量而过量施用化肥，导致土壤营养失调，土壤品质退化，严重影响我国农业可持续发展。
近年来，利用植物根际与磷循环相关的生物学系统来调节植物根际磷的有效性，特别是利用解磷微生物活化土壤中难溶性无机磷来提高土壤中磷的有效性已成为研究热点。据报道，土壤中存在大量具有解磷能力的微生物，能够将难溶性无机磷如磷矿粉转化为可溶性磷酸盐，提高土壤中的可溶性磷含量，从而改善植物磷素营养，提高作物产量。因此，寻找一种高效的解磷菌对发展持续高效农业具有深远的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种荧光假单胞菌。该菌株源于土壤，生态安全，该菌株是以难溶性无机磷为磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可使难溶性无机磷转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐，从而促进植物生长和提高产量。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种荧光假单胞菌，其特征在于，所述荧光假单胞菌为Pseudomonas fluorescens RQ3-01，保藏编号为CGMCC No.14471，保藏日为2017年7月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
1、该菌株具有如下的性质：
形态特征：在无机磷固体平板培养基上呈白色粘稠的细菌，菌落周围有透明圈，形状不规则，边缘平滑，是无核细菌，不形成芽孢，呈杆状。
生理生化特征：革兰氏阴性细菌。
2、该菌株的筛选方法包括：
步骤一、初筛和纯化：
从西安市雁塔区紫薇花园、白沙路路边、博文路广场和甘家寨旁地表以下10cm处采集土壤样品各100g左右，将采集的土壤样品放入烘箱中烘干，将烘干土壤过100目筛，以无菌方式准确称取10g过100目筛的土壤于90mL无菌水中，静置30min后在室温条件下摇床振荡30min，得到稀释度为10-1的土壤悬液；从上述土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-2的土壤悬液：以此类推，分别制备得到稀释度为10-3、10-4和10-5的土壤悬液；取上述稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的土壤悬液各0.1mL涂布于无机磷固体平板培养基中，置于30℃恒温培养箱内培养3-7d，将菌落周围出现溶磷圈(透明圈)的菌株视为有解磷能力的菌株，并将视为有解磷能力的菌株在无机磷固体平板培养基上进行多次划线分离纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株(共九株)，将纯化菌株转接到营养琼脂培养基斜面上，于30℃培养箱中培养2d，置于4℃冰箱中保存待用；并将保存的菌株分别标记为RQ3-01、RQ1-01、RQ1-02、RQ2-02、RQ2-03、RQ3-02、RQ3-03、RQ4-01、RQ4-02；所述无机磷固体平板培养基的组成为：葡萄糖10g，琼脂20g，氯化钠0.3g，七水硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，四水硫酸锰0.03g，磷酸三钙12g，硫酸亚铁0.03g，硫酸铵0.5g，蒸馏水1000mL，培养基pH值7.2；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，培养基pH值7.2-7.4；
步骤二、复筛：
将步骤一中保存的菌株活化得到菌悬液，将菌悬液滴加到无机磷固体平板培养基中，30℃恒温培养箱内培养5d，以1μL无菌水为对照，测量菌株产生的溶磷圈直径D和菌落直径d，并根据是否产生溶磷圈以及D/d值的大小确定菌株的解磷能力，结果见表1。
表1透明圈法测定九株菌株的解磷能力
溶磷圈直径D/mm 菌落直径d/mm 比值D/d
RQ3-01菌株 55 31 1.78
RQ1-01菌株 46 32 1.44
RQ1-02菌株 44 28 1.57
RQ2-02菌株 47 30 1.57
RQ2-03菌株 52 34 1.53
RQ3-02菌株 55 33 1.67
RQ3-03菌株 53 31 1.71
RQ4-01菌株 47 29 1.62
RQ4-02菌株 49 30 1.63
无菌水 0 0 0
结果表明初筛得到对难溶性无机磷具有降解能力的九株菌株中RQ3-01菌株溶磷圈最大，D/d值达到1.78，故RQ3-01菌株降解无机磷的能力最强。
3、菌株的鉴定方法为：
(1)形态学鉴定：将筛选出来的RQ3-01菌株在无机磷固体平板培养基上培养，观察细菌菌落生长特征；
结果：RQ3-01菌株呈杆状，不产芽孢，菌株在无机磷固体平板培养基上呈白色黏稠的细菌，菌落周围有透明圈，形状不规则，边缘平滑。
(2)生理生化鉴定：用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色和吖啶橙染色，镜检，记录结果；对RQ3-01进行氧化酶实验，观察现象；
结果：RQ3-01菌株为革兰氏阴性菌，氧化酶实验结果呈阳性；如图1所示，RQ3-01菌株能分泌黄绿色荧光色素发出荧光。
(3)16SrDNA的扩增与测序：
将RQ3-01菌株送往上海生工生物工程股份有限公司进行基因组的提取，PCR的扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物的转化，蓝白斑筛选等一系列实验并进行测序分析；如图2所示，RQ3-01菌株的碱基对在1000bp-3000bp之间；对PCR扩增的产物进行测序，得到的16SrDNA部分基因序列见SEQ ID NO.1，RQ3-01菌株的碱基对为1391bp，该基因序列与GenBank中已发表的荧光假单胞菌相关片段序列有100％同源性；
综合生理生化鉴定结果和16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株RQ3-01为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
本发明还提供了上述荧光假单胞菌在降解难溶性无机磷中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的荧光假单胞菌RQ3-01菌株源于土壤，该菌株生态安全。
2、本发明的荧光假单胞菌RQ3-01菌株是以难溶性无机磷为磷源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中使难溶性无机磷转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐，从而起到促进植物生长和提高产量的作用。
3、本发明的荧光假单胞菌RQ3-01菌株除具有降解难溶性无机磷的作用，还具有降解有机磷和降解钾的作用，可为后续研制生物有机肥提供高效、稳定的菌种及基础资料。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明RQ3-01菌株的吖啶橙染色荧光显微镜照片。
图2为本发明RQ3-01菌株PCR的电泳图。
具体实施方式
该菌株的筛选方法包括：
步骤一、初筛和纯化：
从西安市雁塔区紫薇花园、白沙路路边、博文路广场和甘家寨旁地表以下10cm处采集土壤样品各100g左右，将采集的土壤样品放入烘箱中烘干，将烘干土壤过100目筛，以无菌方式准确称取10g过100目筛的土壤于90mL无菌水中，静置30min后在室温条件下摇床振荡30min，得到稀释度为10-1的土壤悬液；从上述土壤悬液中吸出1mL，加入9mL无菌水中，充分混匀，制得稀释度为10-2的土壤悬液：以此类推，分别制备得到稀释度为10-3、10-4和10-5的土壤悬液；取上述稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的土壤悬液各0.1mL涂布于无机磷固体平板培养基中，置于30℃恒温培养箱内培养3-7d，将菌落周围出现溶磷圈(透明圈)的菌株视为有解磷能力的菌株，并将视为有解磷能力的菌株在无机磷固体平板培养基上进行多次划线分离纯化，以纯化得到形态一致的纯化菌株(共九株)，将纯化菌株转接到营养琼脂培养基斜面上，于30℃恒温培养箱内培养2d，置于4℃冰箱中保存待用；并将保存的菌株分别标记为RQ3-01、RQ1-01、RQ1-02、RQ2-02、RQ2-03、RQ3-02、RQ3-03、RQ4-01、RQ4-02；所述无机磷固体平板培养基的组成为：葡萄糖10g，琼脂20g，氯化钠0.3g，七水硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，四水硫酸锰0.03g，磷酸三钙12g，硫酸亚铁0.03g，硫酸铵0.5g，蒸馏水1000mL，培养基pH值7.2；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，培养基pH值7.2-7.4；
步骤二、复筛：
将步骤一中保存的菌株活化得到菌悬液，将菌悬液滴加到无机磷固体平板培养基中，30℃恒温培养箱内培养5d，以1μL无菌水为对照，测量菌株产生的溶磷圈直径D和菌落直径d，并根据是否产生溶磷圈以及D/d值的大小确定菌株的解磷能力，结果见表1。
结果表明初筛得到对难溶性无机磷具有降解能力的九株菌株中RQ3-01菌株溶磷圈最大，D/d值达到1.78，故RQ3-01菌株降解无机磷的能力最强。
菌株的鉴定方法为：
(1)形态学鉴定：将筛选出来的RQ3-01菌株在无机磷固体平板培养基上培养，观察细菌菌落生长特征；
结果：RQ3-01菌株呈杆状，不产芽孢，菌株在无机磷固体平板培养基上呈白色黏稠的细菌，菌落周围有透明圈，形状不规则，边缘平滑。
(2)生理生化鉴定：用接种环挑取单菌落进行革兰氏染色和吖啶橙染色，镜检，记录结果；对RQ3-01进行氧化酶实验，观察现象；
结果：RQ3-01菌株为革兰氏阴性菌，氧化酶实验结果呈阳性；如图1所示，RQ3-01菌株能分泌黄绿色荧光色素发出荧光。
(3)16SrDNA的扩增与测序：
将RQ3-01菌株送往上海生工生物工程股份有限公司进行基因组的提取，PCR的扩增，凝胶电泳，纯化回收，连接，感受态细胞的制备，连接产物的转化，蓝白斑筛选等一系列实验并进行测序分析；如图2所示，RQ3-01菌株的碱基对在1000bp-3000bp之间；对PCR扩增的产物进行测序，得到的16SrDNA部分基因序列见SEQ ID NO.1，RQ3-01菌株的碱基对为1391bp；该基因序列与GenBank中已发表的荧光假单胞菌相关片段序列有100％同源性；
综合生理生化鉴定结果和16SrDNA序列分析鉴定结果，鉴定本发明的菌株RQ3-01为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
本发明的荧光假单胞菌的应用效果试验：
1、RQ3-01菌株对难溶性无机磷降解能力试验：
采用液体摇瓶培养法，在250mL三角瓶中加入150mL无机磷液体培养基，高温高压灭菌，将RQ3-01菌株按照3-6％的比例接种到所述灭菌的无机磷液体培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5-7d后，8000r/min离心15min，取上清液5mL，进行超声波破碎细菌细胞(200W，20min)，使之释放出细菌细胞内的有效磷，用钼锑抗比色法测定PO4 3-含量，以加入等体积无菌水的对照组为调零组，结果见表2；所述无机磷液体培养基的组成为：葡萄糖10g，琼脂20g，氯化钠0.3g，七水硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，四水硫酸锰0.03g，磷酸三钙12g，硫酸亚铁0.03g，硫酸铵0.5g，蒸馏水1000mL，培养基pH值7.2；
表2 RQ3-01菌株降解无机磷时发酵液中可溶性磷含量
菌株名称 可溶性磷含量(mg/L)
RQ3-01菌株 22.313
从表2中可以看出，本发明的荧光假单胞菌RQ3-01菌株在生长繁殖过程中可改变难溶性无机磷酸盐的性质，将难溶性无机磷酸盐转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐，起到解磷作用。
2、RQ3-01菌株对有机磷降解能力试验：
采用液体摇瓶培养法，在250mL三角瓶中加入150mL蒙金娜有机磷液体培养基，高温高压灭菌，将RQ3-01菌株按照3％～6％的比例接种到所述灭菌的有机磷液体培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5～7d后，8000r/min离心15min，取上清液5mL，进行超声波破碎细菌细胞(200W，20min)，使之释放出细菌细胞内的有效磷，用钼锑抗比色法测定PO4 3-含量，结果见表3；所述的蒙金娜有机磷液体培养基的制备方法为：向1000mL灭菌后的蒙金娜培养基中加入0.2g用无水乙醇溶解的经过滤和灭菌的卵磷脂，其中蒙金娜培养基的组成为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸亚铁0.03g，一水硫酸锰0.03g，蒸馏水1000mL。
表3 RQ3-01菌株降解有机磷时发酵液中可溶性磷含量
菌株名称 可溶性磷含量(mg/L)
RQ3-01菌株 20.266
3、RQ3-01菌株解钾能力试验：
采用液体摇瓶培养法，在250mL三角瓶中加入150mL钾液体发酵培养基，高温高压灭菌，将RQ3-01菌株按照3％～6％的比例接种到所述灭菌的钾液体发酵培养基中，以接种等体积的无菌水为对照，每组三个重复试验，在30℃、180r/min的条件下摇床培养5～7d后，2000r/min离心20min，弃去菌体和残渣，采用四苯硼钠法对供试菌株培养液中水溶性钾含量进行测定，以加入等体积无菌水的对照组为调零组，结果见表4；所述钾液体发酵培养基的组成为：蔗糖0.75g，钾长石10g，硫酸铵0.15g，磷酸氢二钠0.3g，加蒸馏水至1000mL，在121℃条件下高压灭菌15min。
表4 RQ3-01菌株降解钾时发酵液中可溶性钾含量
菌株名称 可溶性钾含量(mg/L)
RQ3-01菌株 12.738
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西安文理学院
<120> 一种荧光假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1391
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcaagtcga gcggtagaga ggtgcttgca cctcttgaga gcggcggacg ggtgagtaat 60
gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata acgctcggaa acggacgcta ataccgcata 120
cgtcctacgg gagaaagcag gggaccttcg ggccttgcgc tatcagatga gcctaggtcg 180
gattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag 240
gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt 360
cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtta cctaatacgt aattgttttg 420
acgttaccga cagaataagc accggctaac tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg 480
gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc gttaagttgg 540
atgtgaaagc cccgggctca acctgggaac tgcattcaaa actgtcgagc tagagtatgg 600
tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca 660
gtggcgaagg cgaccacctg gactgatact gacactgagg tgcgaaagcg tggggagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcaactagcc gttgggagcc 780
ttgagctctt agtggcgcag ctaacgcatt aagttgaccg cctggggagt acggccgcaa 840
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atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag cacgtaatgg 1080
tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140
atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca gagggttgcc 1200
aagccgcgag gtggagctaa tcccacaaaa ccgatcgtag tccggatcgc agtctgcaac 1260
tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca gaatgtcgcg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcacc agaagtagct 1380
agtctaacct t 1391

Claims (2)

1.一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其特征在于，所述荧光假单胞菌为Pseudomonas fluorescens RQ3-01，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14471。
2.一种如权利要求1所述的荧光假单胞菌在降解难溶性无机磷中的应用。
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