CN110272848B - 一株具有解钾作用的根瘤菌j16及其应用 - Google Patents

一株具有解钾作用的根瘤菌j16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物根际促生菌技术领域，具体公开了一株具有解钾作用的根瘤菌J16及其应用。所述根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。本发明从小麦根际土壤中分离得到一株解钾菌J16，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，鉴定其为根瘤菌(Rhizobium radiobacter)。该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶钾，可大幅度的增加土壤中速效钾的含量，提高植物对土壤中钾的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。

Description

一株具有解钾作用的根瘤菌J16及其应用
技术领域
本发明涉及植物根际促生菌技术领域，具体地，涉及一株具有解钾作用的根瘤菌J16及其应用。
背景技术
钾是作物所需的三大基本营养元素之一，可促进作物生长发育，能够提高粮食品质，增强作物的抗病性、抗逆性等。但是，土壤中的钾大多与钠、钙等碱金属以铝硅酸盐的形式存在，降低了钾的溶解性，植物很难吸收利用。在农业生产中往往通过施加钾肥来改善这一状况，但由于我国可直接利用的钾资源匮乏，且分布不均，严重制约钾肥的生产和使用，近年来我国钾肥的进口比例也在不断攀升，生产成本大大提高。生物钾肥是一种微生物肥料，可以溶解土壤中的硅酸盐矿物，释放出可溶性的钾供植物吸收利用，相比化学肥料，生物钾肥技术新、成本低、污染小，是当今研究的热点，具有较好的应用前景。
微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不仅数量巨大，而且种类极多，许多微生物对土壤氮、磷、钾等养分的转化和供给起非常重要的作用。研发生物钾肥的关键是要筛选出能够高效溶解硅酸盐矿物的菌株。解钾菌是自然界中天然存在的一种可以溶解硅酸盐矿物的细菌，可以将矿物中难溶性的钾、硅等养分元素转化成可溶性养分，提高钾利用率，减少钾肥的使用。此外，解钾菌不仅能通过活化土壤中的营养元素，增强植物对钾的吸收，并且部分解钾菌还能合成和分泌对植物生长有促进作用的物质，如吲哚-3-乙酸(IAA)、铁载体及1-氨基环丙烷-羧酸(ACC)脱氨酶等，从而促进植物的生长和发育。因此，筛选相关的功能微生物并研究其对植物的促生作用，对减少钾肥使用、提高作物产量方面有重要意义。
目前发现的能够使土壤中矿物态钾转化为有效形态的细菌主要有胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulansJordan)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。例如韩晓阳等(2018)从茶园采集土壤，分离得到了一株枯草芽孢杆菌，该菌株对土壤钾素的转化和释放能力较强。将分离到的该解钾菌接种到土壤后发现茶园土壤中的速效钾含量增加了约28％。通过对茶树的芽重进行测定发现，使用解钾菌后百芽重显著增加；同时，茶叶的茶多酚含量降低，而氨基酸的浓度明显提高，说明解钾菌不仅能提高茶叶产量，还能改善茶叶的品质。
虽然现有技术中已有多种解钾菌，但分离筛选新的植物根际解钾菌并研究其对植物的促生作用仍然具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株具有解钾作用的根瘤菌J16，本发明从小麦根际土壤中分离得到一株新的解钾菌J16，对小麦的适应性较好，能在小麦根际定殖并促进小麦生长。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在溶解植物根际土壤难溶钾中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在提高植物根际土壤速效钾含量中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在制备促进植物生长的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在制备提高植物株高的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在制备提高植物干重的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在制备提高植物钾含量的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述根瘤菌J16在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明从小麦根际土壤中分离得到一株解钾菌J16，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，16S rDNA鉴定结果验证其为根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)。通过对钾含量进行测定，结果表明该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶钾，可大幅度的增加土壤中速效钾的含量，提高植物对土壤中钾的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量。
因此，本发明请求保护一株具有解钾作用的根瘤菌J16，所述根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16具有如下形态和生理生化特性：
所述根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，菌落乳白色；在显微镜下，革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢。该菌株能够以葡萄糖、枸橼酸为碳源生长，不能利用乳糖和丙二酸盐，VP反应、吲哚实验、甲基红实验和淀粉水解实验呈阴性，能产生脲酶。
所述根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在溶解植物根际土壤难溶钾中的应用。
优选地，所述难溶钾为含钾硅酸盐矿物。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在提高植物根际土壤速效钾含量中的应用。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在制备促进植物生长的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在制备提高植物株高的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在制备提高植物干重的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在制备提高植物钾含量的制剂中的应用。
本发明还请求保护上述根瘤菌J16在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
更优选地，所述植物为小麦。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从小麦根际土壤中分离得到一株解钾菌J16，并对其进行了形态学、生理生化特性和遗传学方面的鉴定，鉴定其为根瘤菌(Rhizobium radiobacter)。该菌株能有效溶解植物根际土壤中的难溶钾，可大幅度的增加土壤中速效钾的含量，提高植物对土壤中钾的利用率，进而促进植物生长，减少化肥的使用量，提高作物产量，在农业生产上具有重要意义。
附图说明
图1为菌株J16形成的解钾圈。
图2为菌株J16产IAA比色检测结果。
图3为菌株J16的系统发育树。
图4为小麦接种菌株J16后株高、干重、钾含量和磷含量的变化情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
解钾培养基：蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，钾长石粉1g(过100目筛后无菌水浸泡3d，除去水溶性钾)，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5。
LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，水1000mL。
LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，水1000mL。
Salkowski显色液：0.5M FeCl3 1mL，H2SO4 30mL，蒸馏水50mL。
实施例1解钾菌的筛选
1、解钾菌初筛
2017年9月从陕西省杨凌区的农田中采集生长7个月左右的小麦植株，用力抖落小麦根部松散结合的土壤。将植株根剪下放入10mL灭菌的离心管中，注入5mL无菌水后进行超声波处理，使与植株根部紧密结合的根际土溶于水中。所采集的土样为黄壤土，样品速效磷24.03mg/kg、速效钾126.17mg/kg、碱解氮56.28mg/kg、有机质21.06g/kg、pH＝8.27。
将水溶液作一系列10倍稀释，分别取5μL稀释度为10-5、10-6和10-7的土壤悬液涂布于解钾培养基上，于28℃培养5天。将能产生透明解钾圈的菌株转接到LB固体培养基上保存备用。
2、解钾能力测定
将上述有解钾圈的菌株纯化后重新接种于解钾培养基上，测定解钾圈直径D和菌落直径d。挑取D/d大于2的菌落于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL上述菌悬液到50mL钾长石液体培养基中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养3天后，利用火焰光度计法测定解钾细菌培养液上清中的有效钾的含量。
试验结果表明编号为J16(即CCNWSX1901)的菌株解钾圈和培养液中可溶性有效钾的含量较大，分别为3.85和224.7mg/L。菌株J16形成的解钾圈如图1所示。
3、溶解无机磷能力
将上述有解钾圈的J16菌株按1％接种于LB液体培养基中，于28℃下培养24h。吸取1mL上述菌悬液到50mL解磷液体培养基中，以1mL LB培养基代替菌悬液作为对照，各处理设3个重复。在28℃、200rpm条件下培养5天后，将5mL的培养液于10000rpm条件下离心，取1mL的上述上清液并加入5mL钼锑抗试剂，用超纯水定容到50mL后反应20min，测定OD650并计算磷含量。
试验结果表明菌株J16兼具溶磷能力，发酵液中可溶性磷的含量达到156.89mg/L。
4、J16产IAA能力测定
将具有解钾能力的J16菌株接种到装有20mL的TY液体培养基锥形瓶中，在28℃条件下，150r/min振荡培养48h。用移液器吸取50μL培养液到白色陶瓷板上，再加入50μL的Salkowski显色液，以50μL 50mg/L的IAA标准溶液作阳性对照，室温下避光反应30min后观察颜色。
结果如图2所示，表明菌株J16菌悬液与显色液反应变红，说明该菌株能产生IAA。
实施例2菌株J16的鉴定
1、形态特征
将J16菌株制备成菌悬液并稀释后涂布于LB固体培养基上，于28℃培养24h后观察菌落和菌体形态。
结果显示该菌革兰氏染色呈阴性，细胞呈短杆状，不产生芽孢；在LB培养基上培养24h后，菌落呈圆形，边缘整齐，菌落乳白色。
2、生理生化特征
参照细菌鉴定手册对菌株J16的VP反应、碳源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定，其结果显示该菌株能够以葡萄糖、枸橼酸为碳源生长，不能利用乳糖和丙二酸盐，VP反应、吲哚实验、甲基红实验和淀粉水解实验呈阴性，能产生脲酶。
3、16S rDNA测序
采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株J16的基因组DNA，用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA，经电泳检测后送公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。菌株J16的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
鉴定结果：菌株J16在分类上归属于根瘤菌，与Rhizobium radiobacter相似度为99.68％，菌株J16的系统发育树如图3所示。
将根瘤菌(Rhizobium radiobacter)J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019279。保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例3小麦促生试验
挑选颗粒饱满的小麦种子，用70％的乙醇进行表面消毒，以无菌水冲洗至少6次，最后一次冲洗的无菌水涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，检查小麦表面消毒是否彻底。将消毒的小麦种子播种于花盆土壤中，每盆种6颗，表面覆盖约1cm土壤。试验设2个处理，处理1每个植株接1mL无菌培养基，处理2每个植株接种J16菌液(约108个/mL)1mL，每个处理3个重复。花盆放置于温室，设置培养条件为光照16h/8h、温度25℃/18℃。待小麦出苗后，每隔5天浇一次水，60天后测定植物株高、鲜重、干重、氮磷钾含量。
结果如表1和图4所示，由表1可以看出，接种解钾菌的小麦对磷、钾的吸收要明显高于未接菌对照组，植物的长势更好。接菌植物株高、干重、钾含量和磷含量分别比空白对照组提高了30.2％、51.1％、24.8％和42.9％。
表1小麦接种J16菌液前后植物株高、干重、钾含量和磷含量的变化
株高(cm) 植物钾含量(g/kg) 植物干重(g) 植物磷含量(g/kg)
对照 21.03 24.82 0.95 2.42
接菌处理 27.38 30.98 1.435 3.46
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一株具有解钾作用的根瘤菌J16及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1250
<212> DNA
<213> 根瘤菌(Rhizobium radiobacter)
<400> 1
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcat gctgatctgc 60
gattactagc gattccaact tcatgcactc gagttgcaga gtgcaatccg aactgagatg 120
gcttttggag attagctcga catcgctgtc tcgctgccca ctgtcaccac cattgtagca 180
cgtgtgtagc ccagcccgta agggccatga ggacttgacg tcatccccac cttcctctcg 240
gcttatcacc ggcagtcccc ttagagtgcc caactaaatg ctggcaacta agggcgaggg 300
ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca 360
gcacctgttc tggggccagc ctaactgaag gacatcgtct ccaatgccca taccccgaat 420
gtcaagagct ggtaaggttc tgcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 480
tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc caggcggaat 540
gtttaatgcg ttagctgcgc caccgaacag tatactgccc gacggctaac attcatcgtt 600
tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagc 660
gtcagtaatg gaccagtaag ccgccttcgc cactggtgtt cctccgaata tctacgaatt 720
tcacctctac actcggaatt ccacttacct cttccatact caagataccc agtatcaaag 780
gcagttccag agttgagctc tgggatttca cccctgactt aaatatccgc ctacgtgcgc 840
tttacgccca gtaattccga acaacgctag cccccttcgt attaccgcgg ctgctggcac 900
gaagttagcc ggggcttctt ctccggatac cgtcattatc ttctccggtg aaagagcttt 960
acaaccctaa ggccttcatc actcacgcgg catggctgga tcaggcttgc gcccattgtc 1020
caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc 1080
tgatcatcct ctcagaccag ctatggatcg tcgccttggt aggcctttac cccaccaact 1140
agctaatcca acgcgggcca atccttcccc gataaatctt tcccccgtag ggcgtatgcg 1200
gtattaattc cagtttcccg gagctattcc gcaggaaagg gtatgttccc 1250

Claims (9)

1.一株具有解钾作用的根瘤菌J16在溶解植物根际土壤难溶钾中的应用，其特征在于，所述根瘤菌J16于2019年4月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019279。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述难溶钾为含钾硅酸盐矿物。
3.权利要求1中所述根瘤菌J16在提高植物根际土壤速效钾含量中的应用。
4.权利要求1中所述根瘤菌J16在制备促进植物生长的制剂中的应用。
5.权利要求1中所述根瘤菌J16在制备提高植物株高的制剂中的应用。
6.权利要求1中所述根瘤菌J16在制备提高植物干重的制剂中的应用。
7.权利要求1中所述根瘤菌J16在制备提高植物钾含量的制剂中的应用。
8.权利要求1中所述根瘤菌J16在制备提高植物磷含量的制剂中的应用。
9.根据权利要求1至8任一项所述应用，其特征在于，所述植物为小麦。
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