CN104911127B - 一种根瘤菌及其菌剂和制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种根瘤菌及其制剂和制备方法与应用，所述的根瘤菌为放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）A32，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10031；所述根瘤菌属于细菌界，变形菌门，α‑变形菌纲，根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌属。所述根瘤菌为活性成分的菌剂，是以所述放射根瘤菌经平板培养、种子培养、发酵后制成的菌剂；所述芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括平板培养、种子培养、发酵、菌剂制备步骤；所述菌剂在土壤解磷、解钾、提高土壤速效氮中的应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种根瘤菌及其菌剂和制备方法与应用。
背景技术
现代农业生产中随着化肥的大量施用，农作物的产值、产量都有了很大的提高，同时也导致了土壤有机质降低、土壤板结、土地生产力下降等一系列问题。土壤微生物具有促进土壤养分转化、活化土壤养分、增加养分供应的作用。土壤微生物参与土壤养分转化的各种生物化学反应，与土壤养分的供应和损失密切相关。在土壤中，有机质矿化与腐殖化、氮素的硝化和反硝化、含磷钾矿物的有效化等过程均有土壤微生物的参与，土壤微生物制约着土壤氮、磷、钾营养元素的供应和生物有效性，影响烟株的产、质量。而土壤养分大部分以无效态存在，氮大部分为有机氮，含磷和含钾矿物占土壤全磷钾的95%以上。有机氮在微生物的作用下矿化为无机氮，供给植物营养；土壤中的溶磷解钾微生物能分泌甲酸、乙酸、草酸、柠檬酸、丁二酸等，溶解含磷和含钾矿物，释放磷钾，提高它们的生物有效性，改善作物营养。在土壤中，存在共生固氮菌、自生固氮菌和联合固氮菌等多种固氮微生物，通过不同方式固定空气中的氮，增加土壤的氮素养分，供给植物营养之需要。而一种微生物具有多种作用的菌剂未见相关报道。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种根瘤菌，第二目的在于提供一种以所述根瘤菌作为活性成分的菌剂，第三目的在于提供所述以根瘤菌作为活性成分的菌剂制备方法，第四目的在于提供所述菌剂的应用。
本发明第一目的是这样实现的，所述的根瘤菌为放射根瘤菌（R. radiobacter）A32，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No. 10031；所述根瘤菌属于细菌界，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌属。
——放射根瘤菌（R. radiobacter）A32的获得与鉴定
（1）放射根瘤菌（R. radiobacter）A32的获得与鉴定
本发明所述的放射根瘤菌，是采用硅酸盐细菌培养基从楚雄市东华镇烟田的紫色土壤中分离出来，在硅酸盐细菌培养基上选择菌落透明、发亮、粘性较大的菌落再转接到无机磷细菌培养基上，出现溶磷圈后，记录菌落直径和溶磷圈大小，取溶磷圈较大的菌重新纯化培养，再挑到40%的灭菌干油管中4℃保存备用。
所用培养基配方：
1、硅酸盐细菌培养基：
蔗糖5g、土壤矿物 1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO3 0.1g、Na2HPO4 2.0g、FeCl3（1%）0.2ml、琼脂 20g、蒸馏水1000ml、pH 7.0~7.5。
2、无机磷细菌培养基：
葡萄糖 10 g、(NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03 g、CaCO3 5 g、Ca3(PO4)2 10g、琼脂 18-20g、蒸馏水1000ml、pH 7.0~7.5。
对上述分离的菌株A32，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取用TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction Kit Ver.2.0，方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
该菌呈杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性，葡萄糖发酵阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阴性，VP试验阴性，硝酸盐还原阳性.。
16S rDNA序列分析：通过序列比对和生理生化特性将A32菌株鉴定为放射根瘤菌（R. radiobacter）。
（2）放射根瘤菌（R. radiobacter）A32的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株A32为放射根瘤菌（R. radiobacter）的一个株系，命名为A32，于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为CGMCC No.10031。
本发明第二目的是这样实现的，是以所述放射根瘤菌（R. radiobacter）A32经平板培养、种子培养、发酵后制成的菌剂。
本发明的第三目的是这样实现的，包括平板培养、种子培养、发酵、菌剂制备步骤，具体包括：
A、平板培养：将放射根瘤菌（R. radiobacter）A32接种到平板培养基上，在温度为26~30℃下培养48~54h，得平板菌种；
B、种子培养：将平板菌种接种到液体培养基中，在温度为26~30℃下摇床上培养48~54h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积8~12%的量接种入发酵罐，在28~32℃下培养36~54h，搅拌速度为170~190 r/min，通气量60~100%，得到放射根瘤菌A32发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中加入吸附剂吸附经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
本发明第四目的是这样实现的，所述菌剂直接施用于土壤，起到解磷、解钾、提高速效氮的作用。
除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
本发明所述放射根瘤菌和以所述放射根瘤菌为活性成分的制剂的优点：
本发明所用的放射根瘤菌具有将土壤中难溶的无机磷、钾分解成植物易于吸收的磷、钾的功能，同时提高土壤中全氮的含量。施用放射根瘤菌菌剂后可以促进土壤直接释放不被植物吸收的氮、磷、钾养分，可以适当降低无机氮、磷、钾肥料的施入；同时该菌是从烟田土壤中分离得到的，通过增殖培养后再以有机肥的形式施入田间，对植烟土壤环境改良具有较好的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的根瘤菌为放射根瘤菌（R. radiobacter）A32，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCCNo. 10031；所述根瘤菌属于细菌界，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌属。
本发明所述的根瘤菌为活性成分的菌剂，是以放射根瘤菌（R. radiobacter）A32经平板培养、种子培养、发酵后制成的菌剂。
本发明所述的根瘤菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括平板培养、种子培养、发酵、菌剂制备步骤，具体包括：
A、平板培养：将放射根瘤菌（R. radiobacter）A32接种到平板培养基上，在温度为26~30℃下培养48~54h，得平板菌种；
B、种子培养：将平板菌种接种到液体培养基中，在温度为26~30℃下摇床上培养48~60h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积8~12%的量接种入发酵罐，在28~32℃下培养36~54h，搅拌速度为170~190 r/min，通气量60~100%，得到放射根瘤菌A32发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中加入吸附剂吸附经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
所述的平板培养基、液体培养基和发酵培养基均为营养肉汤培养基，其成分为：蛋白胨8~12g、牛肉粉4~6g、氯化钠4~6g，其余为水，pH值为7.0~7.5；平板培养基成分还包括琼脂粉16~20g。
所述的B步骤中所述摇床的转速为100~110r/min。
所述的C步骤中发酵培养时，投料量为发酵罐的70~80%。
C步骤中发酵罐培养时，发酵温度为28~32℃，压强为0.05MPa，搅拌速度为170~190r/min，培养时间为48h。
所述的D步骤中吸附剂为硅藻土、草炭、发酵后的油枯或活性炭的一种或几种，吸附剂的粒径为1~5mm。
本发明的应用为所述菌剂直接施入土壤，起到解磷、解钾、提高土壤速效氮的作用。
下面通过实施例加以说明：
实施例1
——以放射根瘤菌（R. radiobacter）A32为活性成分的制剂的制备
取在营养肉汤平板上培养好的放射根瘤菌R. radiobacter A32接种到装有营养肉汤液体培养液的250ml三角瓶中，在转速为100-110转/分的摇床上培养60小时后，按10%的接种量再转接到装有液体培养液的组培兰花瓶中，在转速为100-110转/分的摇床上培养72小时后，用2倍体积粒径为1-5mm的草炭进行吸附，形成固体菌剂型。
以上所述的营养肉汤平板培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000m，pH7.0-7.5。营养肉汤培养液成分为：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000m，pH7.0-7.5。
以上培养温度为室温20-25℃，摇床转速为100-110转/分，培养时间为72小时。
实施例2
——以放射根瘤菌（R. radiobacter）A32为活性成分的制剂的制备
取在营养肉汤平板上培养好的放射根瘤菌（R. radiobacter）接种到装有营养肉汤液体培养液的组培兰花瓶中，在转速为100-110转/分的摇床上培养60小时后，按10%的接种量再转接到装有液体发酵培养液的CT5-2全自动发酵灌中，投料量为3.5L，发酵培养时间为48小时，用粒径为1-5mm的草炭80L进行吸附，形成固体菌剂型。
以上所述的营养肉汤平板培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000m，pH7.0-7.5。营养肉汤培养液成分为：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000m，pH7.0-7.5。
CT5-2全自动发酵灌的无菌空气的通气量为： 70％；搅拌速度为180转/分，培养温度为：30 ℃，培养时间48小时。
实施例3
——以放射根瘤菌（R. radiobacter）A32菌解磷、解钾，提高土壤氮能力的测试实验
1．液体培养法测定菌株的解钾能力
在100ml三解瓶中加入20ml营养肉汤培养液，在加入土壤矿物0.2g，灭菌后每瓶加R. radiobacter A32液体菌液1ml，同时设不接种的菌液作对照，每个处理三次重复，在28℃条件下恒温振荡培养6天，取离心菌液（上清液）10ml，加入2ml 6%的H2O2，在沸水浴中消化1h ，蒸馏水定容至50ml，用火焰光度计测定钾离子浓度。
2．平板法测定菌株的解磷能力
将解磷菌在有机磷的固体培养基上培养，测定菌落周围产生溶磷圈的大小。
3．土壤培养法测定菌株的解钾、解磷和提高土壤全氮的能力
称取20g 土壤（细土）装入500mL组培兰花瓶中并加灭菌蒸馏水200 m L ，每株菌接种3瓶，每瓶接种10mL菌培养液，另取3瓶加等量的灭菌水作为对照1，另取3瓶加等量的灭菌NB培养液作对照2，置室内恒温摇床培养15d，摇床转速为110转/分，培养结束后，测定土壤过滤液中速效钾、速效磷和全氮含量。
4．盆栽法测定菌株的解钾、解磷和提高土壤全氮的能力
在直径为30cm的花盆中装入红壤，用150ml的烧杯取一杯草炭吸附的R.radiobacter A32菌固体菌剂施入花盆中，每盆施用一杯，固体菌剂与花盆中15cm的土混匀，然后每盆栽烟一株，同时设不加菌液的草炭为对照，每个处理栽烟10盆，共20盆，正常浇水，不再施用任何肥料，栽烟40天后测定烟株的生物学性状，同时每个处理取5盆土混合后测定土壤有机质，全N、P、K和速效N、P、K。
5．结果与分析
5．1液体培养法测定R. radiobacter A32菌株的解钾能力
R. radiobacter A32菌株对难溶的土壤矿物具有较好的解钾效果（表1），与对照相比其解钾能力提高了1.65倍。
表1 R. radiobacter A32菌株对土壤矿物的解钾效果
| 处理 | K浓度(mg/l) | 5%显著水平 | 1%极显著水平 |
| A32 | 2.60 | a | A |
| CK | 0.98 | b | B |
5．2平板法测定R. radiobacter A32菌株的解磷能力
R. radiobacter A32菌株对难溶的磷酸钙具有较好的解磷效果（表2），五个重复的平均D/d为2.06。
表2 R. radiobacter A32菌株对磷酸钙的解磷效果
5．3土壤培养法测定R. radiobacter A32菌株的解钾、解磷和提高土壤全氮的能力
R. radiobacter A32菌株对红壤有较好的解磷、解钾和提高土壤全氮和硝态氮的效果（表3）。与CK2相比解磷效果提高0.77倍，解钾效果提高0.35倍，土壤中的总氮提高0.47倍，硝态氮提高1.2倍。
表3 R. radiobacter A32菌株对土壤的解磷、解钾和提高土壤氮的效果
| 处理 | 速效磷（mg/L） | 速效钾（mg/L） | 总氮 （mg/L） | 硝态氮（mg/L） |
| R. radiobacter ATCC 19358(T)菌 | 0.039 | 25.37 | 46.20 | 33.8 |
| CK2（接NB无菌培养液） | 0.022 | 18.73 | 31.47 | 15.3 |
| CK1（接灭菌蒸馏水） | 0.020 | 6.11 | 1.34 | 0.9 |
5．4盆栽法法测定R. radiobacter A32菌株的解钾、解磷和提高土壤全氮的能力
施用R. radiobacter A32菌剂对烟株生长有一定的影响(表4、表5)， 烟株移栽40天后，施用R. radiobacter A32菌剂的烟株株高比对照高1.3cm，叶面积系数比对照多0.0261。
施用R. radiobacter A32菌剂土壤中养分有一定的提高。烟株移栽40天后，施用R. radiobacter A32菌剂土壤的水解氮比对照提高28.8 mg/kg，有效磷比对照提高4.4mg/kg，速效钾比对照提高8mg/kg，全氮比对照提高8.6%。
表4 R. radiobacter A32菌剂对烟株株高的影响
表5 R. radiobacter A32菌剂对烟株叶面积系数的影响(m2)
| 处理 | 株1 | 株2 | 株3 | 平均 |
| R. radiobacter A32 | 0.2086 | 0.2277 | 0.2166 | 0.2176 |
| CK | 0.1704 | 0.1800 | 0.2240 | 0.1915 |
表6 R. radiobacter A32菌剂对土壤养分的影响
| 处理 | 有机质 (g/kg) | 水解氮 (mg/kg) | 有效磷 (mg/kg) | 速效钾(mg/kg) | 全氮 (%) |
| R. radiobacter A32 | 15.9 | 71.7 | 65.2 | 213 | 0.063 |
| CK | 16.2 | 42.9 | 60.8 | 205 | 0.058 |
Claims (9)
1.一种根瘤菌，其特征在于所述根瘤菌为放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）A32，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No. 10031；所述根瘤菌属于细菌界，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌属。
2.一种以权利要求1所述根瘤菌为活性成分的菌剂，其特征在于是以所述放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）A32经平板培养、种子培养、发酵后制成的菌剂。
3.一种权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于包括平板培养、种子培养、发酵、菌剂制备步骤，具体包括：
A、平板培养：将放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）A32接种到平板培养基上，在温度为26~30℃下培养48~54h，得平板菌种；
B、种子培养：将平板菌种接种到液体培养基中，在温度为26~30℃下摇床上培养48~60h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积8~12%的量接种入发酵罐，在28~32℃下培养36~54h，搅拌速度为170~190r/min，通气量60~100%，得到放射根瘤菌A32发酵液；
D、菌剂制备：在发酵液中加入吸附剂吸附经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述平板培养基、液体培养基和发酵培养基均为NA培养基，其成分为：蛋白胨8~12g、牛肉粉4~6g、氯化钠4~6g，其余为水，pH值为7.0~7.5；平板培养基成分还包括琼脂粉16~20g。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于B步骤所述摇床的转速为100~110r/min。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于C步骤发酵培养时，投料量为发酵罐的70~80%。
7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于C步骤发酵培养时，发酵温度为28~32℃，压强为0.05MPa，搅拌速度为170~190r/min，培养时间为48h。
8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于D步骤所述吸附剂为硅藻土、草炭、发酵后的油枯或活性炭的一种或几种，吸附剂的粒径为1~5mm。
9.一种权利要求2所述菌剂在土壤解磷、解钾、提高土壤速效氮中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |