CN110115212A - 一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，先采用特定方法制得根瘤菌菌液，再将根瘤菌菌液接种于非豆科植物幼苗的根部，施用根瘤菌菌液后，可以促进土壤直接释放不被植物吸收的氮、磷、钾养分，适当降低无机氮、磷、钾的施入，最终可以显著促进非豆科植物的生长，提高非豆科植物的产量。

Description

一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法
技术领域
本发明属于农作物种植的技术领域，具体涉及一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法。
背景技术
根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类革兰氏染色阴性需氧杆菌。正常细胞以鞭毛运动，无芽孢。可利用多种碳水化合物，并产生相当量的胞外粘液。如根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞—类菌体。类菌体在根瘤内不生长繁殖，却能与豆科植物共生固氮，对豆科植物生长有良好作用。类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰脲类化合物，输出到根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。
中国人民很早就把瓜类和豆类轮作种植以提高产量，其内在的机理就是利用微生物的固氮作用来提供土壤肥效。而在欧美国家是在18世纪33年代之后采用轮作种植技术。近年来，人们把固氮的微生物进行人工培养获得大量的活菌体，然后用它们拌种或施播，发展成为细菌肥料。细菌肥料不仅能提高农作物产量，而且因为活的菌体能在土壤中继续生长繁殖，一年施加多年有效。目前，在农业生产上应用的固氮微生物肥料主要有共生根瘤菌肥、自生固氮菌肥和固氮蓝藻菌肥三类，而根瘤菌剂是种植豆科作物的主要菌性肥料，应用于非豆科作物的菌肥还非常少。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法。通过采用特定方法培养得到根瘤菌菌液，接种于非豆科植物幼苗的根部，可以有效促进非豆科植物的生长，提高非豆科植物的产量。
本发明所采用的技术方案为：
一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，包括如下步骤：
(1)根瘤菌培养：将根瘤菌接种到平板培养基上，在25-33℃条件下培养24-36h得到根瘤菌菌落，超净台内用无菌水冲洗菌落，得到平板菌体液；将平板菌体液接种到液体培养基中，在温度为25-33℃条件下摇床上培养24-36h，得到液体发酵种子；将液体发酵种子接种入发酵培养基进行发酵培养，得到根瘤菌发酵液；将所述根瘤菌发酵液进行离心，得到菌体分散于PBS溶液中，制得根瘤菌菌液；
(2)非豆科植物幼苗培育：将非豆科植物的种子置于无菌培养皿中，培养催芽后移植于植物培养液中，于光照条件下培养至长出幼苗，移植至培养土中；
(3)将步骤(1)所述根瘤菌菌液接种于步骤(2)所得幼苗的根部。
步骤(1)中，所述平板培养基、液体培养基和发酵培养基均为NA培养基，所述NA培养基的成分为蛋白胨8-12重量份、牛肉粉4-6重量份、氯化钠1-5重量份、去离子水76-88重量份。
所述平板培养基的成分还包括琼脂粉16-23重量份。
所述NA培养基的pH值为7.3-7.2。
步骤(1)中，所述液体发酵种子的接种量为占培养基体积4-6％。
步骤(1)中，进行所述发酵培养的条件为：在28-32℃条件下培养24-28h，搅拌速度为143-183r/min，通气量为43-53％。
步骤(2)中，所述光照条件为每天光照6-8h；所述植物营养液的pH为6.2-6.5。
步骤(2)中，所述植物营养液的组成为去离子水63-83重量份、硝酸铵13-23重量份、磷酸二氢钾13-23重量份、硝酸钾1-5重量份、硝酸钙1-5重量份、过磷酸钙1-5重量份、硫酸镁1-5份、助剂2-4重量份、滑石粉13-23重量份、萘乙酸3.5-1.5重量份。
所述助剂包括等质量量的硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵、硫酸亚铁。
步骤(3)中，所述根瘤菌菌液处理幼苗时，每隔6-8天接种一次。
本发明的有益效果为：
本发明所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，先采用特定方法制得根瘤菌菌液，再将根瘤菌菌液接种于非豆科植物幼苗的根部，施用根瘤菌菌液后，可以促进土壤直接释放不被植物吸收的氮、磷、钾养分，适当降低无机氮、磷、钾的施入，最终可以显著促进非豆科植物的生长，提高非豆科植物的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
以下实施例以1重量份代表1g。
实施例1
本实施例提供了一种应用根瘤菌促进水稻生长的方法，包括如下步骤：
(1)根瘤菌培养：将根瘤菌接种到平板NA培养基上，在25℃条件下培养36h得到根瘤菌菌落，超净台内用无菌水冲洗菌落，得到平板菌体液；将平板菌体液接种到液体NA培养基中，在温度为25℃条件下摇床上培养36h，得到液体发酵种子；将液体发酵种子按照占培养基体积4％的量接种入发酵NA培养基进行发酵培养，得到根瘤菌发酵液；进行所述发酵培养的条件为：在28℃条件下培养28h，搅拌速度为143r/min，通气量为43％；将所述根瘤菌发酵液进行离心，得到菌体分散于PBS溶液中(分光光度计检测OD633＝3.6)，制得巨大芽孢杆菌根瘤菌菌液；
所述平板NA培养基、液体NA培养基、发酵NA培养基的pH值均为7.3；其中，所述液体NA培养基和发酵NA培养基的成分为蛋白胨8重量份、牛肉粉6重量份、氯化钠1重量份、去离子水88重量份；所述平板培养基的成分为蛋白胨8重量份、牛肉粉6重量份、氯化钠1重量份、琼脂粉23重量份、去离子水88重量份；
(2)水稻幼苗培育：将水稻的种子置于无菌培养皿中，培养催芽后移植于pH为6.2的植物培养液中，于每天光照6h的光照条件下培养至长出幼苗，移植至培养土中；
所述植物营养液的组成为：去离子水63重量份、硝酸铵23重量份、磷酸二氢钾13重量份、硝酸钾5重量份、硝酸钙1重量份、过磷酸钙5重量份、硫酸镁1份、助剂4重量份、滑石粉13重量份、萘乙酸1.5重量份。
所述助剂包括等质量量的硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵、硫酸亚铁；
(3)将步骤(1)所述根瘤菌菌液接种于步骤(2)所得幼苗的根部，每隔6天接种一次。
实施例2
本实施例提供了一种应用根瘤菌促进水稻生长的方法，包括如下步骤：
(1)根瘤菌培养：将根瘤菌接种到平板NA培养基上，在33℃条件下培养24h得到根瘤菌菌落，超净台内用无菌水冲洗菌落，得到平板菌体液；将平板菌体液接种到液体NA培养基中，在温度为33℃条件下摇床上培养24h，得到液体发酵种子；将液体发酵种子按照占培养基体积6％的量接种入发酵NA培养基进行发酵培养，得到根瘤菌发酵液；进行所述发酵培养的条件为：在32℃条件下培养24h，搅拌速度为183r/min，通气量为53％；将所述根瘤菌发酵液进行离心，得到菌体分散于PBS溶液中(分光光度计检测OD633＝3.4)，制得胶质芽孢杆菌根瘤菌菌液；
所述平板NA培养基、液体NA培养基、发酵NA培养基的pH值均为7.2；其中，所述液体NA培养基和发酵NA培养基的成分为蛋白胨12重量份、牛肉粉4重量份、氯化钠5重量份、去离子水76重量份；所述平板培养基的成分为蛋白胨12重量份、牛肉粉4重量份、氯化钠5重量份、琼脂粉16重量份、去离子水76重量份；
(2)水稻幼苗培育：将水稻的种子置于无菌培养皿中，培养催芽后移植于pH为6.5的植物培养液中，于每天光照8h的光照条件下培养至长出幼苗，移植至培养土中；
所述植物营养液的组成为：去离子水83重量份、硝酸铵13重量份、磷酸二氢钾23重量份、硝酸钾1重量份、硝酸钙5重量份、过磷酸钙1重量份、硫酸镁5份、助剂2重量份、滑石粉23重量份、萘乙酸3.5重量份。
所述助剂包括等质量量的硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵、硫酸亚铁；
(3)将步骤(1)所述根瘤菌菌液接种于步骤(2)所得幼苗的根部，每隔8天接种一次。
实施例3
本实施例提供了一种应用根瘤菌促进水稻生长的方法，包括如下步骤：
(1)根瘤菌培养：将根瘤菌接种到平板NA培养基上，在28℃条件下培养33h得到根瘤菌菌落，超净台内用无菌水冲洗菌落，得到平板菌体液；将平板菌体液接种到液体NA培养基中，在温度为28℃条件下摇床上培养33h，得到液体发酵种子；将液体发酵种子按照占培养基体积5％的量接种入发酵NA培养基进行发酵培养，得到根瘤菌发酵液；进行所述发酵培养的条件为：在33℃条件下培养26h，搅拌速度为163r/min，通气量为45％；将所述根瘤菌发酵液进行离心，得到菌体分散于PBS溶液中(分光光度计检测OD633＝3.5)，制得圆褐固氮菌根瘤菌菌液；
所述平板NA培养基、液体NA培养基、发酵NA培养基的pH值均为7.1；其中，所述液体NA培养基和发酵NA培养基的成分为蛋白胨13重量份、牛肉粉5重量份、氯化钠3重量份、去离子水82重量份；所述平板培养基的成分为蛋白胨13重量份、牛肉粉5重量份、氯化钠3重量份、琼脂粉18重量份、去离子水82重量份；
(2)水稻幼苗培育：将水稻的种子置于无菌培养皿中，培养催芽后移植于pH为6.4的植物培养液中，于每天光照7h的光照条件下培养至长出幼苗，移植至培养土中；
所述植物营养液的组成为：去离子水73重量份、硝酸铵15重量份、磷酸二氢钾15重量份、硝酸钾3重量份、硝酸钙3重量份、过磷酸钙3重量份、硫酸镁3份、助剂3重量份、滑石粉15重量份、萘乙酸1重量份。
所述助剂包括等质量量的硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵、硫酸亚铁；
(3)将步骤(1)所述根瘤菌菌液接种于步骤(2)所得幼苗的根部，每隔7天接种一次。
实验例
在同一试验田的不同水稻植株上，选取93棵分成两组，分别为实验组、对照组和空白对照组，每组33棵。每组做三个重复实验，实验组用实施例3方法进行接种固氮菌，对照组使用普通的氮磷钾化肥，空白对照组不接种固氮菌也不使用氮磷钾化肥，其他田间管理均相同。通过对水稻一个周期的跟踪实验，水稻产量如表1所示。
表1-固氮菌对水稻产量的影响
项目 增产
实验组 39.6％
对照组 18％
空白对照组 --
从表1可以看出，使用固氮菌的水稻产量有显著提高，比空白对照组增产达39.6％。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根瘤菌培养：将根瘤菌接种到平板培养基上，在25-30℃条件下培养24-36h得到根瘤菌菌落，超净台内用无菌水冲洗菌落，得到平板菌体液；将平板菌体液接种到液体培养基中，在温度为25-30℃条件下摇床上培养24-36h，得到液体发酵种子；将液体发酵种子接种入发酵培养基进行发酵培养，得到根瘤菌发酵液；将所述根瘤菌发酵液进行离心，得到菌体分散于PBS溶液中，制得根瘤菌菌液；
(2)非豆科植物幼苗培育：将非豆科植物的种子置于无菌培养皿中，培养催芽后移植于植物培养液中，于光照条件下培养至长出幼苗，移植至培养土中；
(3)将步骤(1)所述根瘤菌菌液接种于步骤(2)所得幼苗的根部。
2.根据权利要求1所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(1)中，所述平板培养基、液体培养基和发酵培养基均为NA培养基，所述NA培养基的成分为蛋白胨8-12重量份、牛肉粉4-6重量份、氯化钠1-5重量份、水76-88重量份。
3.根据权利要求2所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，所述平板培养基的成分还包括琼脂粉16-20重量份。
4.根据权利要求2所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，所述NA培养基的pH值为7.0-7.2。
5.根据权利要求2所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(1)中，所述液体发酵种子的接种量为占培养基体积4-6％。
6.根据权利要求2所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(1)中，进行所述发酵培养的条件为：在28-32℃条件下培养24-28h，搅拌速度为140-180r/min，通气量为40-50％。
7.根据权利要求1所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(2)中，所述光照条件为每天光照6-8h；所述植物营养液的pH为6.2-6.5。
8.根据权利要求1所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(2)中，所述植物营养液的组成为去离子水60-80重量份、硝酸铵10-20重量份、磷酸二氢钾10-20重量份、硝酸钾1-5重量份、硝酸钙1-5重量份、过磷酸钙1-5重量份、硫酸镁1-5份、助剂2-4重量份、滑石粉10-20重量份、萘乙酸0.5-1.5重量份。
9.根据权利要求5所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，所述助剂包括等质量量的硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸铵、硫酸亚铁。
10.根据权利要求1所述的在非豆科作物中使用根瘤菌的种植方法，其特征在于，步骤(3)中，所述根瘤菌菌液处理幼苗时，每隔6-8天接种一次。
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