CN108841751A - 一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用 - Google Patents

一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用，属于微生物技术领域。本发明耐盐碱溶磷细菌菌株，命名为溶磷细菌菌株RPB03，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:15928，保藏时间2018年6月11日。该菌株对高盐、高碱环境适应性强，可将磷酸钙发酵液中有效磷含量能提高至430mg/L；在盐碱土壤环境中生长良好，土著微生物对其溶磷效果影响不大；能有效提高盐碱地农田、林地等盐碱土壤中磷素的有效利用率，提高植物生物量。该菌剂的应用，可缓解因化学肥料的使用造成的土壤板结，提高土壤磷的利用率，减少环境污染。

Description

一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用。
背景技术
中国盐渍土壤资源丰富且分布广泛，据全国第二次土壤普查数据，中国盐渍土总面积约3600hm2，占全国可利用土地面积的4.88%。而分布在我国西北、东北及滨海地区盐碱荒地和盐碱障碍耕地总面积超过3333万hm2 (5亿亩）。盐碱地农业高效利用对我国农业生产能力提升具有重要意义，其中磷素的不足与匮乏是制约盐碱地农业产值不高的重要因素之一。
磷是不可再生资源，同时也是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，磷素的有效性也是保证农田、林地可持续利用的重要保证。然而，土壤中绝大多数磷与Ca2+、Fe3+或Al3 +结合，以难溶性的磷酸盐矿物态存在，致使植物不能直接吸收，从而造成土壤有效磷匮乏。外施磷肥会导致土壤的板结及周围水域的富营养化现象，引起更为严重的环境污染。大量研究表明，利用微生物溶磷作用，提高土壤有效磷含量，可以解决外施磷肥所引起的一系列环境污染问题。
盐碱土壤中固定化磷的有效利用主要依赖微生物作用。外施具有溶磷效果的微生物菌制剂，可提高盐碱地溶磷微生物的数量，有效促进土壤中固定化磷素有效转换，形成易于植物吸收的有效磷，促进植物的生长，提高盐碱地植被生物量。但是，盐碱地土壤由于其盐度、碱度等特性，其土著微生物不管是种类还是数量皆远远低于非盐渍土壤类型，所以外施具有解磷效果的微生物菌制剂，在一定程度上可提高土壤中的微生物数量，从而提高土壤中有效磷的含量。
目前，具有溶磷效果的微生物主要包含细菌和真菌两大类群。真菌生存环境偏酸性，虽然其溶磷效果显著，但施入盐碱地土壤后不易定殖，从而制约了溶磷真菌制剂在盐碱地土壤中的应用。具有耐盐碱特性的溶磷细菌非常少，而且现有溶磷细菌在盐碱地环境中的定殖与溶磷效果不佳。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用。
本发明的技术方案为：
一种耐盐碱溶磷细菌菌株，命名为溶磷细菌菌株RPB03，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:15928，保藏时间为2018年6月11日。
作为优选方案，所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其16sRNA序列为：
cacaagtcgg acggtagcac agagagcttg ctctcgggtg acgagtggcg gacgggtgag 60
taatgtctgg ggatctgccc gatagagggg gataaccact ggaaacggtg gctaataccg 120
cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc tcactatcgg atgaacccag 180
atgggattag ctagtaggcg gggtaatggc ccacctaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaaggcgg tgcggttaat aaccgcgccg 420
attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgttaag 540
tcagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt tgaaactggc aggcttgagt 600
cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat 660
accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt 780
tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccacggaatt cggcagagat 960
gccttagtgc cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020
tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc 1080
ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa 1200
gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcaca aagtgcgtcg tagtccggat cggagtctgc 1260
aactcgactc cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgg 1397。
作为优选方案，所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其获取过程包括以下步骤：
1）收集盐碱地根际土壤，于碱性的PKO液体培养基中进行富集培养，直至培养基中的Ca3(PO4)2全部降解；
2）将步骤1）所得培养液用生理盐水稀释，然后涂布于碱性的PKO琼脂平板；
3）挑取步骤2）PKO琼脂平板上透明圈周围的菌落，纯化后在碱性PKO培养基上连续20代以上；获得依然具有溶磷效果的初筛菌株；
4）将所得初筛菌株在筛选培养基中培养，获得一株溶磷能力最强的溶磷菌株，命名为溶磷细菌菌株RPB03。
进一步地，步骤1）中所述碱性的PKO液体培养基以及步骤2）中所述碱性的PKO琼脂平板的pH均为8-9。
作为优选方案，所述筛选培养基为：碳源10.0g/L、Ca3(PO4)2 5.0g/L、氮源0.50g/L、NaCl 0.20g/L、KCl 0.20g/L、MgSO4 0.03g/L、MnSO4 0.03g/L、FeSO4 0.03g/L、水1000ml，pH采用NaOH溶液调整。
利用所述耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，所述菌株依次经活化培养、三角瓶培养后，接种至种子罐中培养，发酵完成后，沉淀干燥获得菌粉，所述菌粉直接用于盐碱地或者配制成菌液后喷洒至盐碱地。
作为优选方案，活化培养、三角瓶培养以及种子罐培养所用培养基均为牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15-25g、水1000ml，pH7.4-8.0。
作为优选方案，所述菌液通过自来水悬浮所述菌粉制备而成。
进一步地，所述菌液的浓度为4.1×108cfu/ml。
作为优选方案，盐碱地中菌粉施用量为6-20斤/亩。
本发明的有益效果为：
本发明的溶磷细菌菌株RPB03对高盐、高碱的适应能力强，液体发酵条件下，有效磷含量可提高至430mg/L。在盐碱环境中生长良好，溶磷能力强，能显著提高农田、林地等盐碱土壤的有效磷含量及植物生物量，对提高盐碱地土壤肥力，尤其是磷素的有效利用方面具有优势，可缓解土壤板结，减少环境污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为溶磷菌株定性筛选时PKO琼脂平板的菌落图；
图2 为酸碱度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图；
图3为温度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图；
图4为盐度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图；
图5为碳源对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图；
图6为氮源对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图；
图7为溶磷细菌菌株RPB03系统进化树；
图8为土著微生物对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响曲线图。
具体实施方式
一种耐盐碱溶磷细菌菌株，命名为溶磷细菌菌株RPB03，属于泛菌属（Pantoea vagans），该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No:15928，保藏时间为2018年6月11日。
实施例1 溶磷细菌菌株RPB03的获取
溶磷细菌菌株RPB03的获取过程为：
1）富集培养：收集黄河三角洲盐碱地的根际土壤，于pH值为8.2的碱性PKO培养基中进行富集培养，直至培养基中的Ca3(PO4)2全部降解；
2）溶磷菌株的定性筛选：将步骤1）所得培养液用8%生理盐水稀释，用10倍浓度梯度稀释法进行稀释，选择稀释浓度108-1012进行涂布，用200µl无菌移液枪吸取上述稀释液100µl，涂布于pH值为8.2的碱性PKO琼脂平板；挑取PKO琼脂平板上透明圈周围的菌落，纯化后在pH为8.2的碱性PKO培养基上连续20代；获得依然具有溶磷效果的初筛菌株17株，将初选菌株置于-20℃的冰箱进行保存，保藏方法采用甘油保藏法。如图1所示，菌落周围出现透明圈者即为溶磷细菌。
3）溶磷细菌菌株RPB03的筛选：将所得17株初筛菌株分别在筛选培养基中培养，在一定温度下，恒温振荡培养48h后，测定培养液中的有效磷含量。
其中，筛选培养基为：碳源10.0g/L、Ca3(PO4)2 5.0g/L、氮源0.50g/L、NaCl 0.20g/L、KCl 0.20g/L、MgSO4 0.03g/L、MnSO4 0.03g/L、FeSO4 0.03g/L、水1000ml，pH采用NaOH溶液调整。
各初筛菌株均在以上筛选培养基中30℃下恒温振荡培养48h后，测定培养液中有效磷含量。溶磷能力的强弱通过测定有效磷含量确定。有效磷含量的测定采用钼锑比色法（国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].第四版，北京：中国环境科学出版社，2009.）。
经过上述振荡培养后测试17株初筛菌株的溶磷能力，经测试最大溶磷量基本保持在400mg/L的微生物菌株，为溶磷能力最强的溶磷菌株，命名为溶磷细菌RPB03。
实施例2溶磷细菌菌株RPB03的进一步研究
1、酸碱度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响
将保存的菌种RPB03进行活化，在液体培养基中培养24h后作液体菌种。将1ml(108cfu/ml)的种子液转接入PKO培养基中，PKO培养基初始pH值分别为6、7、8、9 和 10，每个处理三个重复。初始pH值用盐酸或NaOH溶液调节。置摇床培养48h后，10000rpm/min离心15min，取无菌滤液测定有效磷含量，结果如图2所示。
由图2可知，随溶液初始pH值的升高，RPB03菌株解磷能力不断下降，当pH>8条件下解磷效果存在显著差异。pH6-8范围内其解磷能力无差异，皆超过430mg/L，初始pH6时RPB03解磷效果最好，达到450.57mg/L。当pH提高到9时，其解磷能力虽有所降低，为385.19mg/L，但有效磷含量依然处于比较高的水平。可见，该菌株从微酸性至碱性的范围内皆有解磷能力，并且在较强的碱性环境条件下，仍然可以通过调节环境酸碱度进行磷的转化。
2、温度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响
将菌种RPB03进行活化，在液体培养基中培养24h后作液体菌种。将1ml(108cfu/ml)的种子液转接入100ml PKO培养基中，置于10℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃摇床培养48h后，离心取上清液测定磷含量；结果如图3所示。
由图3可知，不同温度下RPB03的解磷效果存在显著差异，最适解磷温度为35℃，其次是30 ℃。
3、盐度对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响
将菌种RPB03进行活化，在液体培养基中培养24h后作液体菌种。用NaCl调节PKO培养基的盐浓度分别为0%、1%、2.5%、5%、7.5%和 10%，每个处理三个重复。将1ml(108cfu/ml)的种子液转接入100ml上述培养基中，在温度35℃，转速170r/min，摇床培养48h后，用钼酸铵比色法测有效磷含量，用酸度计测定培养液pH值；结果如图4所示。
由图4可知，RPB03显示了在高盐范围内，仍然保持有较高的解磷能力。比如在5%盐度下，有效磷含量达到347.6mg/L，仍然处于一个较高的范围。
4、碳源对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响
碳源对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响的实验过程为：
将保存的菌种RPB03进行活化，在液体培养基中培养24h后作液体菌种。以PKO为基础培养基，分别用麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖和葡萄糖作碳源。每个处理三个重复。将1ml(108cfu/ml)的种子液转接入上述100ml培养基中，培养温度35℃，转速170r/min，摇床培养48h；结果如图5所示。
由图5可知，RPB03菌株在利用不同碳源时其解磷效果存在显著差异。葡萄糖作唯一碳源时解磷效果最好，达到500.87mg/L，其次是蔗糖，乳糖不适合做该菌株碳源。
5、氮源对溶磷细菌菌株RPB03磷素转化的影响
将保存的菌种RPB03进行活化，在液体培养基中培养24h后作为液体菌种。以PKO为基础培养基，分别以硝酸钾（KNO3）、硝酸铵（NH4NO3）、硫酸铵(NH4)2SO4、尿素（urea）、氯化铵（NH4CI）作为PKO培养基中氮源，将1ml(108cfu/ml)的种子液转接入100ml上述培养基中，每个处理三个重复。培养温度35℃，转速170r/min，摇床培养48h；结果如图6所示。
由图6可知，利用不同氮源时RPB03菌株解磷效果亦存在显著差异。其解磷效果为KNO3>NH4NO3>(NH4)2SO4>NH4CI>urea。从N源形态来看，硝态氮优于铵态氮，尿素效果最差。
6、溶磷细菌菌株RPB03系统进化树
溶磷细菌菌株RPB03系统进化树如图7所示。经 PCR 扩增后菌株RPB03的16SrRNA序列全长为1397bp，GenBank 登录号为MH247129，BLAST分析结果显示该序列与泛菌属（Pantoea）16SrRNA序列同源性最高，与Pantoea vagans strain FDAARGOS(CP014129)有较高的同源性，相似度均为100%，其他菌株的相似性达到99%。综合生理生化指标特征，菌株PRB03被鉴定为泛菌（Pantoea vagans）。
溶磷细菌菌株RPB03的16sRNA序列为：
S0052RPB03 1397bp
cacaagtcgg acggtagcac agagagcttg ctctcgggtg acgagtggcg gacgggtgag 60
taatgtctgg ggatctgccc gatagagggg gataaccact ggaaacggtg gctaataccg 120
cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc tcactatcgg atgaacccag 180
atgggattag ctagtaggcg gggtaatggc ccacctaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
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cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgg 1397。
实施例3
土著微生物对溶磷细菌菌株RPB03的影响
将RPB03菌株在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15-25g、水1000ml，pH7.4-8.0）上进行活化，28-30℃培养36-48h，然后接入1000mL 三角瓶，在30℃，170rpm/min 下，培养36h。按体积比5%接种量接入到50L种子罐中，培养条件为170rpm/min，pH8.0，通气量 0.6vvm，培养2天。发酵完成后，离心，沉淀干燥获得菌粉。用自来水悬浮制成浓度为4.1×108cfu/ml的菌液。
取两份等量的黄河三角洲盐碱土，设置实验组和对照组。对照组采用干热灭菌法进行灭菌，灭菌条件为温度170℃，时间2小时，实验组土样不做处理，研究土壤微生物对解磷菌RPB03是否有影响。将处理土样装入直径20cm花盆内，每盆放土壤1000g，每个处理4盆，实验时间为2017年4月-2017年6月，共计90天，实验地点在黄河三角洲生态研究中心温室培养。施加菌液后第0d、第30d和第60d取土样测定土壤中有效磷含量。每盆施加量菌剂为20ml，相当于菌粉0.6g/m2，解磷菌数量2.6×1011cfu/m2；结果如图8所示。
实验组和对照组在投加RPB03菌剂前后，土壤中有效磷含量皆有提高，且比处理前土壤有效磷含量多，差异显著。实验组效果比对照组效果要好。可以预测，该菌株施加黄河三角洲盐碱土壤后，土壤中的微生物不会影响RPB03菌株对磷素的转化效果。
实施例4 溶磷细菌菌株RPB03盆栽应用试验
将RPB03菌株在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15-25g、水1000ml，pH7.4-8.0）上进行活化，28-30℃培养36-48h，然后接入1000mL 三角瓶，在30℃，170rpm/min 下，培养36h。按体积比5%接种量接入到50L种子罐中，培养条件为170rpm/min，pH8.0，通气量 0.6vvm，培养2天。发酵完成后，离心，沉淀干燥获得菌粉。用自来水悬浮制成浓度为4.1×108cfu/ml的菌液。
实验设置对照组和实验组。对照组用自来水，实验组用菌剂处理。每组8盆，每盆种植120株中华结缕草。实验土壤采集黄河三角洲盐渍土壤，土壤盐度0.67%，pH值8.2-8.5，速效磷0.029g/kg，全磷0.530g/kg。实验时间为2017年4月-2017年7月，共计120天，在黄河三角洲生态研究中心温室培养，实验组在培养0d、20d、40d喷施菌液，对照组采用等量自来水等量处理。其他时间每隔25d左右用自来水喷施所有处理组，防止实验对象因干旱死亡。实验结束后测试对照组和实验组，结果如表1所示。
表1 溶磷细菌菌株RPB03对土壤有效磷含量及植物生物量的影响
RPB03菌株能够明显促进中华结缕草的生长及干物质的积累。株高平均可达29.47cm，明显高于对照组，植株干重也呈现显著差异，土壤中的有效磷含量达到极显著水平。
结果表明，施加RPB03菌剂后，对中华结缕草生物量的增加效果明显，表现在株高干重增长达到极显著水平，根部增长与对照相比达到显著水平。盆栽实验表明，施加PPB03菌剂后能显著增加土壤有效磷含量，说明该菌对土壤肥力的提升效果明显。
实施例5 溶磷细菌菌株RPB03大田应用试验
将RPB03菌株在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15-25g、水1000ml，pH7.4-7.6）上进行活化，28-30℃培养36-48h，然后接入1000mL 三角瓶，在30℃，170rpm/min 下，培养36h。按体积比5%接种量接入到50L种子罐中，培养条件为170rpm/min，pH8.0，通气量 0.6vvm，培养2天。发酵完成后，离心，沉淀干燥获得菌粉。施用量10斤/亩，相当于7.5mg菌粉/m2，使用方式用水等比例混合后，菌剂贴地喷施。
实验地点在黄河三角洲滨州市靳家村三级农田进行小麦大田实验，该实验田土壤基本化学性质pH8.02，盐度0.61%，有效磷含量19.21mg/kg，全磷439mg/kg。试验时间2017年10月——2018年5月。设置6个样地，每个样地面积为6m×6m，实验组施加RPB03菌剂，时间为播种前1天，播种后20天及40天。开春3月5日追施一次菌剂。其余三个样地为对照组，以等量水代替菌剂喷施。实验开展前，玉米秸秆返田，深耕，旋耕深度30-35cm，田间常规管理。小麦收获后，计算产量。
实验结果为：实验组土壤中有效磷含量提升至38.86mg/kg，全磷含量高达462.7mg/kg；对照组小麦产量为748斤/亩，施加菌肥的实验组小麦产量高达925斤/亩，施加解磷菌后，实验组产量接近一级地小麦产量。可见本发明所得解磷菌RPB03能有效提升盐碱地农田肥力及小麦作物的产量。
SEQUENCE LISTING
<110> 滨州学院
<120> 一种耐盐碱溶磷细菌菌株及其应用
<130> 2018
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 泛菌属（Pantoea vagans）
<400> 1
cacaagtcgg acggtagcac agagagcttg ctctcgggtg acgagtggcg gacgggtgag 60
taatgtctgg ggatctgccc gatagagggg gataaccact ggaaacggtg gctaataccg 120
cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc tcactatcgg atgaacccag 180
atgggattag ctagtaggcg gggtaatggc ccacctaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaaggcgg tgcggttaat aaccgcgccg 420
attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgttaag 540
tcagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt tgaaactggc aggcttgagt 600
cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat 660
accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt 780
tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccacggaatt cggcagagat 960
gccttagtgc cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020
tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc 1080
ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa 1200
gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcaca aagtgcgtcg tagtccggat cggagtctgc 1260
aactcgactc cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgg 1397

Claims (10)

1.一种耐盐碱溶磷细菌菌株，其特征在于：命名为溶磷细菌菌株RPB03，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:15928，保藏时间为2018年6月11日。
2.如权利要求1所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其特征在于，其16sRNA序列为：
cacaagtcgg acggtagcac agagagcttg ctctcgggtg acgagtggcg gacgggtgag 60
taatgtctgg ggatctgccc gatagagggg gataaccact ggaaacggtg gctaataccg 120
cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc tcactatcgg atgaacccag 180
atgggattag ctagtaggcg gggtaatggc ccacctaggc gacgatccct agctggtctg 240
agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360
ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaaggcgg tgcggttaat aaccgcgccg 420
attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgttaag 540
tcagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt tgaaactggc aggcttgagt 600
cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat 660
accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt 780
tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc 840
gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccacggaatt cggcagagat 960
gccttagtgc cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020
tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcgattc 1080
ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa 1200
gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcaca aagtgcgtcg tagtccggat cggagtctgc 1260
aactcgactc cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380
ggtagcttaa ccttcgg 1397。
3.如权利要求1或2所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其特征在于，其获取过程包括以下步骤：
1）收集盐碱地根际土壤，于碱性的PKO液体培养基中进行富集培养，直至培养基中的Ca3(PO4)2全部降解；
2）将步骤1）所得培养液用生理盐水稀释，然后涂布于碱性的PKO琼脂平板；
3）挑取步骤2）PKO琼脂平板上透明圈周围的菌落，纯化后在碱性PKO培养基上连续20代以上；获得依然具有溶磷效果的初筛菌株；
4）将所得初筛菌株在筛选培养基中培养，获得一株溶磷能力最强的溶磷菌株，命名为溶磷细菌菌株RPB03。
4.如权利要求3所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其特征在于：步骤1）中所述碱性的PKO液体培养基以及步骤2）中所述碱性的PKO琼脂平板的pH均为8-9。
5.如权利要求3所述耐盐碱溶磷细菌菌株，其特征在于，所述筛选培养基为：碳源10.0g/L、Ca3(PO4)2 5.0g/L、氮源0.50g/L、NaCl 0.20g/L、KCl 0.20g/L、MgSO4 0.03g/L、MnSO4 0.03g/L、FeSO4 0.03g/L、水1000ml，pH采用NaOH溶液调整。
6.利用权利要求1所述耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，其特征在于：所述菌株依次经活化培养、三角瓶培养后，接种至种子罐中培养，发酵完成后，沉淀干燥获得菌粉，所述菌粉直接用于盐碱地或者配制成菌液后喷洒至盐碱地。
7.如权利要求6所述利用耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，其特征在于：活化培养、三角瓶培养以及种子罐培养所用培养基均为牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15-25g、水1000ml，pH7.4-8.0。
8.如权利要求6所述利用耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，其特征在于：所述菌液通过自来水悬浮所述菌粉制备而成。
9.如权利要求8所述利用耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，其特征在于：所述菌液的浓度为4.1×108cfu/ml。
10.如权利要求6或9所述利用耐盐碱溶磷细菌菌株对盐碱地溶磷的方法，其特征在于：盐碱地中菌粉施用量为6-20斤/亩。
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