CN106754515B - 一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高作物耐盐能力的促生菌株的筛选方法，属于微生物分离与应用技术领域。本发明方法包括筛选优势菌株和组合优势菌株两部分。筛选优势菌株是通过一系列耐盐促生功能筛选，最终获得具有多种功能或优势功能的菌株；组合优势菌株则遵循菌株间即互利共生又功能互补的原则，以提高菌株组合在作物根际的定殖和功能表达能力，实现一加一大于二的效果。通过本发明方法筛选获得的复合菌系，在田间应用效果突出，克服了同类研究因菌株单一或采用简单组合方法，田间应用效果不稳定和效果差的问题，极大地促进了盐碱地作物的生产。

Description

一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物分离与应用技术领域，具体地，涉及一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法。
背景技术
目前，随着社会的发展和人口的增加，对耕地资源的需求越来越多。我国有盐碱地9913万公顷，其中环渤海70万公顷，是重要的潜在耕地资源。盐碱地的改良是国际性难题，世界各国都在努力寻找盐碱地改良的科学方法，目前可应有的方法有物理的改良技术，如以水压盐法，渗管排盐以及一些耕作措施；化学的改良技术，如使用土壤改良剂；生物改良技术，利用微生物的促生作用，以提高植物耐盐性和生物产量。其中物理方法并不适宜淡水资源匮乏的地区，使用土壤改良剂，材料用量大，受地方资源的限制，微生物由于成本低，繁殖快，可利用它们的促生、防病、抗衰老等作用，大幅度提高作物的耐盐、抗旱性和生物产量，从而达到改善盐碱地的目的。利用根际促生微生物提高盐碱地作物耐盐促生的方法具有投资少，见效快，效益高的特点，已经成为国际上的研究热点。但是根据发明人的经验和相关报道，大部分菌株功能一般，效果不佳且或效果不稳定，优良菌株/菌系的高效率选方法显得十分重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法。
为了实现上述技术目的，本发明提供了具有提高作物耐盐能力促生菌株的筛选方法，包括以下步骤:
(1)筛选优势菌株；
(2)组合优势菌株。
步骤(1)是将重度盐碱地上生长的植物进行原位采集后，将其根际土壤、非根际土壤和根系三个样品进行稀释，培养基上培养并分离获得的细菌菌株。
上述方法中，对分离获得的细菌进行耐盐度，耐碱度，溶磷，固氮，和产IAA、ACCD、嗜铁素耐盐促生功能的检测，筛选具有上述一个或多个优势功能的菌株。
上述方法中，功能检测所使用的基础培养基为1/3KMB培养基或LB培养基，所述1/3KMB培养基的配方为胰蛋白胨6g/L，蛋白胨1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L pH7.0。所述的LB培养基的配方为胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0。
其中，耐盐度检测是检测并获得在含氯化钠0.1％-5％的培养基中能生长的菌株。
其中，酸碱度检测是检测并获得在pH值为7.0-9.0的培养基中能够生长的菌株。
步骤(2)组合优势菌株是将步骤(1)筛选得到的具有一个或多个优势功能的菌株按照功能互补，协同共生的原则进行组合。
本发明提供了一种促进盐碱地作物生长的生物肥的制备方法，将上述筛选方法获得的菌株与腐熟的有机肥混合，使混合后肥料的活菌数＞2×107CFU/g。
本发明提供了上述筛选方法在盐碱地作物促生中的应用。
本发明提供了上述筛选方法在筛选促生菌株或菌系中的应用。
本发明方法通过一系列耐盐促生功能筛选，最终获得具有多种功能或优势功能的菌株，利用互利共生又功能互补的原则将菌株进行合理组合，以提高菌株组合在作物根际的定殖和功能表达能力，实现一加一大于二的效果。通过该方法筛选获得的复合菌系，在田间应用效果突出，克服了同类研究因菌株单一或采用简单组合方法，田间应用效果不稳定和效果差的问题。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1重度盐碱地植物根系细菌的分离及其促生功能检测
将重度盐碱地上生长的植物进行原位采集，装入无菌样品袋中，记录釆样的经纬度、温湿度以及采样生境。轻柔摇荡植株样品，去除根上附着的松散土土壤即根围土壤。称取根围土1g，加入5mL生理盐水，涡旋震荡器振荡1min后获得的土壤悬液，即为根围土样1。剪下根系，附带一点茎干以使根系都在一起。将根系放在PA瓶中，加入5mL生理盐水，在涡旋仪上最大频率振荡1min。该土壤悬液即为根际土样2。随后将根系转移到新PA瓶中，进行表面灭菌(95％乙醇浸泡5min，5％次氯酸钠浸泡5min，无菌水洗涤12次)，然后用烧过的无菌镊子将根转移到研钵中，加入1ml生理盐水和适量灭菌石英砂进行研磨，用研钵碾碎后加入4mL生理盐水溶解，该悬液即为根系样3。上述获得的3中样品悬液振荡均匀后，静置1min后依次制成样品1：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀释液。样品2：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的土壤稀释液。样品3：10-1、10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀释液。将上述样品1：10-3、10-4、10-5；样品2：10-4、10-5、10-6；样品3：10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀释液分别涂布到含氯化钠浓度为5％以及pH8.0的基础培养基1/3KMB平板上，每个平板涂布菌液100μL，重复2次。30℃倒置培养2d。最终将获得的单菌落进行保存待用。
实施例2提高盐碱地作物生产性能优良菌株/系和菌株组合筛选方法
将稀释分离获得的细菌菌株进行活化后，离心收集菌体，用生理盐水洗涤2次后，重悬于1mL生理盐水中待用。①准备好含氯化钠0％，5％，pH＝9.0的1/3KMB平板，CAS，有机磷，无机磷，阿须贝，ADF 8种平板，依次将每种菌悬液点到8种平板上，30℃倒置培养7d。②将重悬液按百分之一的接种量，接种到含有色氨酸终浓度为100mg/L的1/3KMB液体培养基中，30℃，48-72h培养。然后进行IAA检测(500μg/ml色氨酸)。记录每株菌的促生结果，并整理成excel统计表。
依据生物功能互补，营养吸收互补，协同共生的原则，将多株功能菌进行组配，通过盆栽试验，检验提高植物耐盐、促生、防病等应用效果，筛选优良复合菌系。
实施例3全功能菌系组合及玉米盆栽筛选试验
以功能互补为原则，以尽量多地涵盖生物功能谱为目标，分别挑选具有不同功能的优势菌株，如具有较强产IAA、解磷、固氮功能的解淀粉芽孢杆菌ZCM18【该菌株于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12959，分类名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)】，具有较强产嗜铁素、拮抗病原真菌和产乙烯脱氨酶的优势菌株特基拉芽孢杆菌ZCM5【该菌株于2016年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12960，分类名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)】功能互补的耐盐碱菌株，进行组合。各菌株单独培养，按发酵液中活菌数量1：1配成复合菌液，复合菌液的活菌数为1×1010cfu/mL，将菌液接种到含盐0.3％土壤玉米种子周围，每颗玉米种子500μL。阳性对照为单一优势菌株处理，空白对照组接种无菌水，每颗玉米种子500μL。重复10次。光照室培养25d，统计玉米的株高、地上干重、根干重等生物量指标。经比较，优良菌株组合处理的植株生物量都优于单一菌株处理，分别比对照组增加34.7％、46.8％和15.0％。
表1全功能菌系玉米盆栽试验数据
Figure BDA0001190041370000051
实施例4全功能单一菌株玉米盆栽筛选试验
挑选具有较强耐盐碱、促生等功能齐全的单一菌株进行玉米盆栽试验。将菌株进行培养，最终将培养物调节为1×1010cfu/mL。试验组将菌液接种到玉米种子周围，每颗玉米种子500μL。对照组接种无菌水到玉米种子周围，每颗玉米种子500μL。重复10次。光照室培养25d后统计玉米的株高、地上干重、根干重等生物量指标。结果表明，试验组的上述生物量分别比对照组增加23.3％，11.0％，15.0％。
表2全功能菌株玉米盆栽试验数据
Figure BDA0001190041370000052
Figure BDA0001190041370000061
实施例5全功能菌系生物肥制备和盐碱地玉米田间应用试验
如实施例3的方法，将优良菌系分别培养并制备复合菌培养液，活菌数量达到1×1010cfu/mL。将菌液按照5％的量喷洒在有机肥颗粒上制备成菌数为1×108cfu/g的生物肥。田间试验的地点设在河北省沧州市海兴县盐碱地低产田，含盐范围0.1-0.3％。采用常用的精量播种、施肥一体播种机，将生物肥(养分含量5％)与复混肥料(养分含量39％)混合后一并施入，肥种相距3-5cm。采用等养分比较法，处理组使用15公斤/亩生物肥加18公斤/亩39％复混肥料，对照使用39％复混肥20公斤/亩。最终统计玉米的根干重和产量。最终处理组的根干重和产量分别比对照组增加26.2％，19.3％。
表3全功能菌系进行玉米田间试验数据
Figure BDA0001190041370000062
Figure BDA0001190041370000071
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种促进盐碱地作物生长的生物肥的制备方法，其特征在于，将菌株与腐熟的有机肥混合，使混合后肥料的活菌数＞2×107CFU/g；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZCM18和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)ZCM5，其保藏编号分别为CGMCC No.12959和CGMCC No.12960。
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耐盐解磷菌的筛选、鉴定及其在盐胁迫下对甘草的促生作用;韩杨;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20160515(第5期);第1章第1.1.2、1.2.5节、第2章第2.1.3、2.2.1-2.2.2、2.2.4节 *

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