CN116179640B - 一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法。所述方法包括以下步骤：(1)收集尖孢镰刀菌细胞壁，以尖孢镰刀菌细胞壁为唯一营养物质来源配置拮抗菌筛选固体培养基；(2)从香蕉发病田中生长健康的香蕉周围土壤采集土壤样品，制备土壤悬浮液，涂布在步骤(1)拮抗菌筛选固体培养基上；(3)在步骤(2)长有菌种的筛选固体培养基上喷雾接种镰刀菌孢子液；(4)通过观察抑菌圈的大小初步判断拮抗能力的大小，得到初筛拮抗菌；(5)将纯化好的初筛拮抗菌菌落接种于LB或PDA固体培养基平板上，再用镰刀菌孢子液喷雾后倒置培养，培养后根据抑菌能力复筛，得到香蕉枯萎病拮抗菌。采用本发明方法能够高效、简便筛选得到香蕉枯萎病拮抗菌。
Description
技术领域
本发明涉及生防菌株领域，特别涉及一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法。
背景技术
尖孢镰刀菌属半知菌类(Fungiim perfecti)镰刀菌属(Fusarium)真菌。能侵染多种作物的维管束系统。香蕉枯萎病(Banana vascular wilt)是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder)引起的一种毁灭性病害。病原菌经由香蕉根部伤口侵入，在维管束、球茎和假茎处繁殖和蔓延，导致植株枯萎死亡。该菌的厚垣孢子可在植株病残体和土壤中潜伏存活8年之久，遇到合适的条件即可侵染传播，造成病害的流行。
化学药剂对此病害的防治效果不佳，并且容易产生环境污染和农药残留问题。选育抗病品种是一个有效的方法，但是目前抗病育种存在抗源材料短缺，抗病品种品质较差等缺点。生物防治以其环境友好、防效持久高效和微生物资源丰富等优点成为土传病害防治的重要手段和研究热点。
在用生防菌株进行生物防治的过程中，高效的生防菌株的筛选是一个重要的环节。传统的拮抗菌筛选首先将采集的样品进行梯度稀释后培养，待菌长出后分离所有菌株进行纯化。然后采用平板对峙法等对菌株进行逐一拮抗试验，筛选出病原菌的拮抗菌。其中有拮抗效果的菌株比例很小。拮抗菌的分离、纯化和筛选没有针对性，导致许多重复和繁杂的工作，工作量大，效率低。另外，由于病原菌对原有生防菌耐药性的产生，急需筛选新的高效生防菌株。
因此，研究高效、简便的香蕉枯萎病生防菌株筛选方法非常重要。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法
本发明的技术方案是这样实现的：
一种高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法，包括以下步骤：
(1)收集尖孢镰刀菌细胞壁，以尖孢镰刀菌细胞壁为唯一营养物质来源配置拮抗菌筛选固体培养基；
(2)从香蕉发病田中生长健康的香蕉周围土壤采集土壤样品，制备土壤悬浮液，涂布在步骤(1)拮抗菌筛选固体培养基上；
(3)在步骤(2)长有菌种的筛选固体培养基上喷雾接种镰刀菌孢子液；
(4)通过观察抑菌圈的大小初步判断拮抗能力的大小，得到初筛拮抗菌；
(5)将纯化好的初筛拮抗菌菌落接种于LB或PDA固体培养基平板上，再用镰刀菌孢子液喷雾后倒置培养，培养后根据抑菌能力确定为香蕉枯萎病拮抗菌。
进一步的，步骤(1)，尖孢镰刀菌细胞壁制备的具体步骤：在PDA液体培养基中接种尖孢镰刀菌，27.5-28.5℃震荡培养70-75h后收集菌体；用液氮充分研磨破碎菌体，用无菌水反复洗涤去除细胞内容物后收集细胞壁，得到湿细胞壁；烘干湿细胞壁，按照固液重量比为1：15-20的比例加入质量分数为40-50％的氢氧化钠溶液，搅拌处理11.5-12.5h，用蒸馏水充分漂洗后，真空干燥，得到降解细胞壁。
进一步的，步骤(1)，所述拮抗菌筛选固体培养基的配方为：降解细胞壁25-35g，琼脂粉10-15g，加无菌蒸馏水至1L，pH值为7.0-7.2；高压灭菌。
进一步的，步骤(2)，所述土壤悬浮液的配制浓度为10-1～10-5g/ml。
进一步的，步骤(2)，所述土壤悬浮液的制备方法：土壤样品风干后过筛，取土样加入无菌水中震荡均匀，配置10-1g/ml土壤悬浮液；再分别稀释至10-2g/ml，10-3g/ml，10-4g/ml，10-5g/ml；取土壤悬浮液100-200uL均匀涂布在拮抗菌筛选固体培养基上；每个梯度悬浮液重复3次，28℃倒置培养48小时。
进一步的，步骤(3)，所述镰刀菌孢子液浓度为10-5CFU/mL。
进一步的，步骤(3)，将尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中，27.5-28.5℃震荡培养90-100h；用无菌纱布过滤，滤液即为孢子液；稀释镰刀菌孢子液浓度为10-5CFU/mL；将镰刀菌孢子液加入灭菌喷雾器中，在长有菌种的筛选固体培养基上喷雾接种0.9-1.1mL镰刀菌孢子液，晾干后于27.5-28.5℃倒置培养2-3d。
进一步的，步骤(4)，观察培养后的平板，挑选出现明显抑菌圈内的菌落，在PDA或LB培养基上分离纯化，得到初筛拮抗菌；
进一步的，步骤(5)，将纯化好的初筛拮抗菌落接种于LB或PDA固体培养基平板上，再次用镰刀菌孢子液喷雾后27.5-28.5℃倒置培养45-50h；选择有稳定抑菌能力和抑制能力强的菌落确定为拮抗菌。
本发明高效筛选香蕉枯萎病拮抗菌的方法具体包括以下步骤：
(1)尖孢镰刀菌细胞壁的制备：在PDA液体培养基中接种尖孢镰刀菌，28℃震荡培养72h后收集菌体；用液氮充分研磨破碎菌体，用无菌水反复洗涤去除细胞内容物后收集细胞壁，得到湿细胞壁；烘干湿细胞壁，按照固液重量比为1：15-20的比例加入质量分数为45％的氢氧化钠溶液，搅拌处理12h，用蒸馏水充分漂洗后，真空干燥，得到降解细胞壁；
(2)拮抗菌筛选固体培养基的制备：以降解细胞壁为唯一营养物质来源配置培养基；配方为：降解细胞壁25-35g，琼脂粉10-15g，加无菌蒸馏水至1L，pH值为7.0-7.2；高压灭菌；
(3)拮抗菌的筛选：在香蕉发病田中健康香蕉周围采集土壤样品，土壤样品风干后过筛，取土样加入无菌水中震荡均匀，配置10-1g/ml土壤悬浮液；再分别稀释至10-2g/ml，10-3g/ml，10-4g/ml，10-5g/ml；取土壤悬浮液100-200uL均匀涂布在拮抗菌筛选固体培养基上；每个梯度悬浮液重复3次，28℃倒置培养48小时；
(4)病原菌孢子制备和接种：将尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中，28℃震荡培养4d；用无菌纱布过滤，滤液即为孢子液；稀释镰刀菌孢子液浓度为10-5CFU/mL；将镰刀菌孢子液加入灭菌喷雾器中，在长有菌种的筛选固体培养基上喷雾接种1mL镰刀菌孢子液，晾干后于28℃倒置培养2-3d；
(5)拮抗菌初筛：观察培养后的平板，挑选出现明显抑菌圈内的菌落，在PDA或LB培养基上分离纯化，得到初筛拮抗菌；
(6)拮抗菌复筛：将纯化好的初筛拮抗菌菌落接种于LB或PDA固体培养基平板上，再次用镰刀菌孢子液喷雾后28℃倒置培养48h；选择有稳定抑菌能力和抑制能力强的菌落确定为拮抗菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)现有的拮抗菌筛选需要先从样品中分离纯化出种类和数量繁多的菌株，然后再进行拮抗能力的筛选，这种筛选方法工作量大，效率低下，筛选工作存在一定的盲目性。本发明分离培养基中以尖孢镰刀菌细胞壁为唯一营养物质来源，能在培养基上生长的菌株一般都具有分解尖孢镰刀菌细胞壁的能力，成为拮抗菌的几率很高。本发明筛选方法针对性强，极大地减少了工作量，提高了筛选效率。
(2)初筛时，在长有菌株的培养基上喷雾镰刀菌孢子液，通过观察抑菌圈的大小判断拮抗能力的大小，进一步提高了筛选效率。
(3)香蕉发病田中生长健康的香蕉周围土壤中存在拮抗菌的可能性较大。在这些土壤中采集土样，进一步提高了筛选效率和防效的准确性。
附图说明
图1.拮抗菌株Streptomyces abikoensis HN-06与香蕉枯萎病菌FOC 4的对峙实验。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1.尖孢镰刀菌细胞壁收集：在PDA液体培养基中接种尖孢镰刀菌，28℃震荡培养3天后收集菌体。用液氮充分研磨破碎菌体，用无菌水反复洗涤去除细胞内容物后收集细胞壁，得到湿细胞壁。
2.降解细胞壁的制备：取上述湿细胞壁，按照固液重量比为1：15的比例加入质量分数为45％的氢氧化钠溶液，搅拌处理12h，用蒸馏水充分漂洗后，真空干燥，得到降解细胞壁。
3.拮抗菌筛选固体培养基的制备：以降解细胞壁为唯一营养物质来源配置培养基。配方为：降解细胞壁30g，琼脂粉12g，加无菌蒸馏水至1L，pH值为7.0-7.2。高压灭菌。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl5 g/L，加蒸馏水至1L，121℃灭菌20min。
PDA液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，加蒸馏水至1L，121℃灭菌20min保存备用。PDA固体培养基：在PDA液体培养基中加入琼脂20g/L，灭菌后即可。
4.拮抗菌筛选：1).在香蕉发病田中选取健康香蕉田块采集土壤样品。将采集的土样在阴凉处风干，过筛。混匀后称取土样10g加入100mL无菌水中，充分震荡混匀，即得土壤悬液。静置1min后取上清液依次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5g/ml的土壤悬浮液。
2).分别吸取10-4g/ml、10-5g/ml梯度稀释液100μL，均匀涂布于筛选固体培养基上。每个梯度重复涂布3个平板，置于28℃培养48小时。
3).将尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中，28℃震荡培养4d。用无菌纱布过滤，滤液即为孢子液。用雪球计数板对孢子进行计数，将孢子浓度稀释为105CFU/mL-1。4℃保存备用。将孢子液加入灭菌喷雾器中，在长菌的筛选固体培养基上喷雾接种1mL孢子液，晾干后于28℃倒置培养2-3d。
4).拮抗菌初筛：观察培养后的平板，如在菌落周围出现抑菌圈，则初步判断为拮抗菌。根据共培养后的抑菌圈大小判断该菌的拮抗能力。挑取拮抗菌，在LB或PDA固体培养基平板上划线纯化，观察菌落的形态，颜色和生长情况，直至平板上的菌落性状一致。
5).复筛：将纯化好的菌落接种于LB或PDA固体培养基平板上，再次用孢子液喷雾后28℃倒置培养48h。选择有稳定抑菌能力的菌落为拮抗菌(抑菌圈>2.0cm)。
5.拮抗菌的鉴定：将菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
采用PCR扩增拮抗菌16S rRNA基因保守区基因序列，将所测基因序列与GenBank数据库序列进行BLAST比对，鉴定结果表明菌株为阿比科恩链霉菌(Streptomycesabikoensis)。命名为StreptomycesabikoensisHN-06。保藏编号为CGMCCNO:25999，保藏日：2022年10月31日，保藏中心：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
试验例
一、拮抗菌抑菌能力实验
1.香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubenserace4)由中国热带农业科学院热带生物技术研究所种质与基因资源研究室提供。
2.将病原菌接种于PDA固体培养基上，于28℃培养5天。用直径5mm的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼，接种于PDA固体培养基平板中央，在距圆心3mm的点上等距的2处接种拮抗菌菌株，与病原菌对峙培养。以只接种病原菌的PDA固体培养基平板为对照，重复3次。待对照病原菌菌落半径长至约4.0cm时，测量对照与处理病原菌菌落半径，计算抑制率。
抑菌带：对峙实验中镰刀菌生长边缘与拮抗菌生长边缘的最近距离。
抑制率(％)＝(对照病原菌半径(mm)－处理病原菌半径(mm))/对照病原菌半径(mm)×100％。
表1.香蕉枯萎病拮抗菌筛选结果
由表1可知，对峙实验中，Streptomyces abikoensis HN-06对香蕉枯萎病菌的抑制率为54.76％，具有良好的抑制作用，如图1。
二、Streptomyces abikoensis HN-06防治香蕉枯萎病的盆栽试验
1.种子培养基：可溶性淀粉20g，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，NaCl 4g/L，K2HPO30.5g/L，MgSO4.H2O 0.5g/L，CaCO3 2g/L。
2.固体发酵培养基：大米100g，黄豆粉10g，麸皮15g，NaCl 0.5g，K2HPO3 0.5g，CaCO3 1g。料水比10:6。3.拮抗菌剂的准备：1).挑取拮抗菌Streptomyces albulus HN-06单菌落，接种于液体种子培养基中，30℃，250r/min培养72h即得种子液。
3.固体发酵：按照体积质量比为10％的接种量将步骤1种子液接种至固体发酵培养基中无菌培养，30℃、65％湿度培养96h。期间每隔24h翻耙一次。培养结束后于35℃烘干后粉粹，过120目筛即得链霉菌孢子粉拮抗菌剂。有效活菌数大于6.5×107g-1。
4.枯萎病菌分生孢子悬浮液制备：将尖孢镰刀菌接种在PDA液体培养基中，28℃震荡培养4d。用无菌纱布过滤，滤液即为孢子液。用雪球计数板对孢子进行计数，将孢子浓度稀释为106CFU/mL-1。即得孢子悬浮液。4℃保存备用。
5.供试香蕉材料为巴西蕉((Musa sp.,Cavendish group cv.Baxi)。选取6叶期生长一致的健康苗进行试验。设置对照(不接种拮抗菌剂)和接种拮抗菌剂2个处理。每处理25个重复。每重复1株盆栽苗。
将巴西蕉幼苗移栽于盆钵中。将4g孢子粉拮抗菌剂施于定植穴。对照不施拮抗菌剂。移栽1个月后利用伤根法接种枯萎病菌。用干净玻璃棒插入香蕉根际土壤中，共插入4处。每处接种15mL浓度为106CFU/mL-1的枯萎病菌孢子悬浮液。香蕉生长期间每10天随水施肥1次，苗期管理参考香蕉大田管理措施。45天后统计香蕉枯萎病发病情况。
6.香蕉苗期病情指数分级如下：0级：植株生长正常，无症状。1级：植株有20％以下的叶片萎蔫或变黄。2级：植株有20％-40％的叶片萎蔫或变黄。3级：植株有40％-80％的叶片萎蔫或变黄。4级：植株80％的叶片萎蔫或变黄，仅有顶部1-2片健康叶。5级：整株枯死。
发病率＝(发病株数/调查总株数)×100％
病情指数＝[∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)]×100
相对防效＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100
表2拮抗菌剂对香蕉枯萎病的防效分析
由表2可以看出，接种45d后，对照病情指数高达81.33％。而拮抗菌处理病情指数显著低于对照，为51.67％。防治效果为36.47％。
另外，在不同地区(海口、三亚和儋州)香蕉发病田中生长健康的香蕉周围土壤进行取样，采用本发明的筛选方法，均能得到香蕉枯萎病菌的拮抗菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1. 一种阿比科恩链霉菌，其特征在于，所述阿比科恩链霉菌为Streptomyces abikoensisHN-06，保藏编号为CGMCC NO: 25999，保藏中心为中国普通微生物菌种保藏管理中心。
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