CN110669686B - 一株伯克霍尔德氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株伯克霍尔德氏菌及其应用。一株伯克霍尔德氏菌，分类命名为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16428，保藏日期为2018年9月6日。上述的伯克霍尔德氏菌在促进作物生长中的应用,具体是将上述的伯克霍尔德氏菌制成微生物种衣剂。本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌及其应用具有以下有益效果：1、能促进作物生长，能合成植物生长所需的生长激素；2、能在一定范围的酸碱环境下保持作物的稳定生长；3、能将土壤中的磷转化为植物可利用的有效磷，降低种植成本，同时保护了环境；4、能够抑制病原菌的生长。

Description

一株伯克霍尔德氏菌及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株伯克霍尔德氏菌及其应用。

背景技术

我国目前有70％以上的耕地土壤缺磷，尽管在这些耕地上使用了氮、磷、钾等各类化肥，但是由于大部分磷元素与土壤中的铁离子、铝离子、钙离子结合形成难溶性磷酸盐，被利用的磷元素只有10％～20％，利用率非常低。

解磷菌(Phosphate-solubilizing microorganism,PSM)是土壤中一种特殊的微生物类群，其是能够将植物难以吸收利用的无效磷转化为可吸收利用的有效磷形态的一类特殊微生物功能的菌群，其在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用。解磷菌可通过分泌各种酶类或有机酸来活化土壤中的难溶态磷，影响植物根系分泌物，促进植物根系对K、N、Ca、Mg、Fe、Zn等营养元素的吸收，促进植物的生长发育，影响根际微生物的群落结构。

立枯丝核菌通常以菌丝和菌核的形态习居于土壤，在土壤中存活时间长，连作、轮作都能使病原菌数量大量积累，在育苗中后期发病严重，造成大量死苗甚至毁床，被认为是最具破坏力的土传植物病原物之一。长期以来，农业上多采用恶霉灵、多菌灵等化学农药对立枯丝核菌进行防治，但是连续长期用药不仅导致病原菌产生抗药性，防效逐年降低，农药残留也给环境和社会带来众多负面影响。

现有的农业微生物在作物上的应用往往比较单一，解磷菌的主要功能就是解磷，但是在环境适应性上的要求较高，由于我国幅员辽阔，土壤的构成随地域分布差异很大，这就使得同样的产品面对不同的土壤环境，作用效果差别较大。此外，常见的植物病原菌，如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，在自然界中分布广泛，寄主广、腐生性强，可引起多种蔬菜瓜果和农作物病害。能引起植物的根腐、烂种、苗期猝倒和立枯病，也会引起禾谷类作物的纹枯病，还可侵染玉米、大豆、花生、甘蔗、棉花等作物。因此，作物的正常生长，一方面需要功能稳定的促生型微生物的辅助，另一方面，也需要其具有能够抑制有害微生物生长的能力，这是现在传统微生物产品所欠缺的。

发明内容

发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一株伯克霍尔德氏菌及其应用。

技术方案：一株伯克霍尔德氏菌，分类命名为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16428，保藏日期为2018年9月6日。

上述的伯克霍尔德氏菌在促进作物生长中的应用。

进一步地，将上述的伯克霍尔德氏菌制成微生物种衣剂。

更进一步地，微生物种衣剂的制备包括以下步骤：

(1)制备接种液

将上述的伯克霍尔德氏菌接种到装有100mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养24h作为种子液，然后再将种子液稀释到有效活菌数5×10⁷cfu/mL～1.5×10⁸cfu/mL即得到接种液，其中：

LB液体培养基包括胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、水1L，其pH值为7；

(2)在噻虫嗪种衣剂中加入步骤(1)得到的接种液，振荡混匀即得到微生物种衣剂，其中：

噻虫嗪种衣剂与接种液的质量比为10:3。

有益效果：本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌及其应用具有以下有益效果：

1、本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌促进作物生长，能合成植物生长所需的生长激素；

2、本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌对环境的适应力高，能在一定范围的酸碱环境下保持作物的稳定生长；

3、本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌有解磷效果，能将土壤中的磷转化为植物可利用的有效磷，节省磷肥的使用，从而降低种植成本，同时保护环境；

4、本发明公开的一株伯克霍尔德氏菌能够抑制病原菌的生长，对常见的植物病原菌如禾谷镰刀菌、番茄灰霉病菌、立枯丝核菌、黄瓜灰霉的生长有抑制作用。

附图说明

图1为对病原菌LC11387的抑制效果对比图。

图2为对病原菌黄瓜灰霉的抑制效果对比图。

图3为对植株茎叶生长促进效果对比图。

图4为对植株根系生产促进效果对比图。

具体实施方式：

下面对本发明的具体实施方式详细说明。

1、分离及鉴定

伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)MN218107分离于2018年4月9日采集的广东惠州市龙门县永汉镇(N23°36′42.40″，E113°56′10.45″)的兰科植物根际土壤，采用稀释平板法和平板涂布法将样品涂板于有机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，酵母浸粉0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 1g，MgSO₄0.3g，卵磷脂0.2g，琼脂15～20g，水1L，pH 7)上进行分离筛选获得。

分离方法为：先将样本根系采用抖土法抖掉与根系松散结合的土,然后将根系置盛有30mL无菌水的50mL三角瓶中,振荡15min左右,使土壤充分脱离根系,以洗下的土制成根际土悬液。用无菌镊子取出根系,将上述根系菌悬液以10倍稀释法(取根系菌悬液1mL至盛有9mL无菌水的试管中充分混合,稀释10倍,再取该稀释液1mL至下一个盛有9mL无菌水的试管中稀释,依次类推分别稀释成10^-2～10^-5倍，取其10^-3，10^-4，10^-5进行平板涂布，每个梯度涂布三个平行，28℃，2～4d，观察平板是否有出现解磷圈，挑选出有解磷圈的菌株保存，进行下一步复筛工作。

菌株MN218107已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.16428。具有如下微生物学特性：在有机磷固体培养基平板上生长24h后，乳白色，菌落圆形，表面平整湿润，革兰氏阴性。利用引物27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，以及1492RTACGGYTACCTTGTTACGACTT，对菌株MN218107进行扩增和测序，得到序列长度为1393bp，菌株MN218107的16S rDNA序列如序列表所示。通过BLAST将序列与GenBank数据库中序列进行对比，其与Burkholderia sp.的相似性为99％，鉴定其为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.。

2、菌株MN218107在培养基上的解磷效果

菌株MN218107接种于解有机磷的固体平板上，各三个重复，28℃，5d后观察解磷圈，并记录好解磷圈(D)与菌落直径(d)，计算D/d值，检测菌株在固体培养基中的菌落直径及对固体平板难溶性磷的溶解能力。菌株MN218107的菌落直径为4.3mm，解磷圈直径为18.3mm，D/d的比值为4.25。

在无机磷液体培养基的解磷：将解磷菌MN218107以10⁸cfu/mL浓度接种装有100mL的NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，酵母浸提物0.4g，磷酸三钙2.5g，磷酸亚铁1.5g，磷酸铝1g，pH值7.0-7.5，水1L。)的250mL三角瓶中，设置三个重复，于28℃的恒温振荡器中180r/min，振荡5d，得到其发酵液。

用钼磷比色法测定其发酵液中的有效磷含量，以不接菌的NBRIP液体培养基作为对照。MN218107的解磷量可达301.56mg/L。

用pH计测定其发酵后液中的pH值，以不接菌的NBRIP液体培养基作为对照。测定结果显示：MN218107能降低培养基的pH值，液体培养基pH值下降至3.76。

由此可知，菌株MN218107能通过溶解土壤中的难溶性磷，将无效磷转化为植物能吸收的有效磷，提高土壤有效磷含量，提高土壤肥力。

3、耐酸碱性测定和IAA

耐酸碱性：

pH值梯度培养基配置：以LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1L，pH7)为基础培养基，向其中加NaOH或HCl溶液调节其pH值，pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的一系列LB培养基，在121℃灭菌25min后冷却备用。

将MN218107接种于100mL不同pH值梯度的LB培养基中，接种菌液浓度为10⁸cfu/mL，接种量为100uL，每个梯度设置3个重复，接种后，于28℃的恒温振荡器中180r/min，振荡48h，查看菌株的生长情况。结果显示：菌株MN218107有一定的耐酸碱能力，能在pH值为4-9之间生长。

LB培养基的pH值	pH4	pH5	pH6	pH7	pH8	pH9
							OD<sub>600</sub>	3.465	3.409	3.401	3.301	3.275	3.127

IAA测定：

待测发酵液：将菌株MN218107接种于加有0.1％L-色氨酸(1g/10mL)的AGPS液体培养基(K₂HPO₄ 0.34g，KH₂PO₄ 0.7g，水合硫酸镁1g，NH₄Cl 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，多价蛋白胨10g，甘油10g，pH7，水1L)中180r/min，28℃培养2天，取出，10000r/min离心10min，作为发酵液。

采用Salkowski比色法对MN218107分泌IAA能力的定性测定。

取发酵液100μL滴于白色陶瓷板上，加100μL的Salkowski比色液，以100μL 50mg/LIAA为阳性对照，于室温避光30min后观察颜色变化，若变红则为阳性，表示能分泌IAA，颜色越深表明分泌量越多，若不变色则为阴性，表示不分泌IAA。

用标准曲线法对MN218107分泌IAA能力进行定量测试。

取发酵液与Salkowski比色液混匀(1:1)，在室温避光静置30min后，然后快速利用分光光度计在530nm波长下测定吸光度，根据标准曲线得到IAA的分泌量。

在IAA定性测试中，反应呈阳性；在IAA的定量测试中，MN218107产IAA的量达57.69μg/mL。

4、菌株MN218107对病原菌的拮抗作用

将禾谷镰刀菌Fusarumgraminearum(F.g)、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea(LC11387)、立枯丝核菌Rhizoctonia solani(R.s)、黄瓜灰霉Botrytis caroliniana用PDA培养，28℃下培养3～5d，新鲜菌丝用打孔器制成直径为5mm的菌丝块，备用。

菌株MN218107接种于LB培养基，180r/min，28℃培养5天，取出，10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm细菌过滤器得到无菌发酵液。

将MN218107的无菌发酵液和PDA培养基以体积比1:4(2mL:8mL)混匀倒平板，以无菌LB培养基处理为对照组，于平板中央接病原菌的菌饼，每处理重复3次，28℃培养3～8天，根据病原菌菌落发展速度、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的MN218107对病原菌有无拮抗作用，测量菌落大小，计算抑制率。

抑制率(％)＝(对照菌落纯生长量-实验组菌落纯生长量)/对照菌落纯生长量×100；

纯生长量(mm)＝菌落平均直径-菌饼直径。

数据如下：

如上表及图1和2的结果所示：MN218107对病原菌F.g、LC11387、R.s、黄瓜灰霉均有不同程度的抑制作用，因此MN218107有一定的生防效果。

5、MN218107的应用部分

微生物种衣剂的制备包括以下步骤：

(1)制备接种液

将上述的伯克霍尔德氏菌接种到装有100mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养24h作为种子液，然后再将种子液稀释到有效活菌数1×10⁸cfu/mL即得到接种液，当然，有效活菌数也可以为5×10⁷cfu/mL～1.5×10⁸cfu/mL之间的其他值，其中：

LB液体培养基包括胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、水1L，其pH值为7；

(2)在噻虫嗪种衣剂中加入步骤(1)得到的接种液，振荡混匀即得到微生物种衣剂，其中：

噻虫嗪种衣剂与接种液的质量比为10:3。

进一步地，在进行步骤(1)之前，还要对伯克霍尔德氏菌进行活化，具体步骤为：

将-80℃的伯克霍尔德氏菌保存甘油管恢复至室温状态，在标准固体LB培养基上划线，32℃培养2d,挑取单克隆。

菌株MN218107对植株的促生鉴定

种子处理：将大小、质地相似的玉米种子以80:1(微生物种衣剂与种子重量比)的量加入到微生物种衣剂中，振荡使菌株能够均匀吸附于种子上，种子上有1×10³cfu/mL～1×10⁶cfu/mL的菌数。

将相同质量的灭菌土(土壤过10目筛，121℃，灭菌1h，加0.5％的磷酸三钙)装在育苗盘里。以经过微生物种衣剂菌株MN218107处理过的玉米种子为实验组(MN218107)，以无菌种衣剂的玉米种子为负对照组(Blank)，以不种衣剂的玉米种子为空白对照组(CK)，每组3个重复，每个重复播种18颗，即每个组共处理54颗进行盆栽实验，常规管理。生长18d后收获，测定单个植株株高、茎长、根重及干重。

盆栽实验结果：从数据及图3和图4可知，实验组的玉米生物量均明显的高于对照组玉米，实验组MN218107较对照组CK的鲜重增加36.57％，干重增加33.68％；较对照组Blank的鲜重增加17.54％，干重增加16.89％。

根系的增加最显著，MN218107的根系较CK鲜重上增加了30％，干重增加41.63％；较Blank鲜重增加21.76％，干重增加23.21％。

由此可知，菌株MN218107能很好的促进植物根系的发育，提高植物的营养吸收，促进植物生长；菌株MN218107对玉米苗期生长的生物量影响见下表。

菌株MN218107和玉米拌种对玉米苗期生长的生物量影响

上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (4)

1.一株伯克霍尔德氏菌，其特征在于，分类命名为伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16428，保藏日期为2018年9月6日。

2.如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌在促进作物生长中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌制成微生物种衣剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，微生物种衣剂的制备包括以下步骤：

(1)制备接种液

将上述的伯克霍尔德氏菌接种到装有100mL LB液体培养基的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养24h作为种子液，然后再将种子液稀释到有效活菌数5×10⁷cfu/mL～1.5×10⁸cfu/mL即得到接种液，其中：

LB液体培养基包括胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、水1L，其pH值为7；

(2)在噻虫嗪种衣剂中加入步骤(1)得到的接种液，振荡混匀即得到微生物种衣剂，其中：

噻虫嗪种衣剂与接种液的质量比为10:3。

Images