CN112625970A - 一株洋葱伯克霍尔德氏菌jt79及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株洋葱伯克霍尔德氏菌JT79及其应用。本发明提供了一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79，于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。本发明提供的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79具有较强溶解难溶性磷、钾、固氮以及分泌嗜铁素的能力，对烟草、黄瓜、玉米、大豆苗具有良好促生长效果；该菌株对多种植物病原菌如棉花黄萎病菌、菜心炭疽病菌等13种病菌具有良好的抑菌效果，且在不同培养条件下抑菌效果稳定。由洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液进行过滤灭菌后获得的无菌滤液对大豆和玉米具有促生长作用。

Description

一株洋葱伯克霍尔德氏菌JT79及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体地，涉及一株洋葱伯克霍尔德氏菌 JT79及其应用。

背景技术

据FAO数据统计，每年全球因病虫害造成的粮食损失可达总量的10％。 化学农药是防治植物病虫害的主要措施，但是化学药剂的过量使用，导致了病虫 抗性增强，农产品中农药残留严重，土壤环境遭受破坏，有益天敌数量减少等诸 多问题。就农业商品贸易而言，农产品中的农药残留直接限制着产品的销售和对 外贸易。为了减少化学农药的过量使用，开发和推广生物制剂是目前一个重要措 施。其中，生物制剂的开发关键点在于筛选有益的微生物，能够用于防治植物病 虫害的发生，诱导植物产生抗性从而抵御病害，从而达到防治病害的目的。从目 前的研究和使用情况看，微生物制剂具有安全、可持续、广谱和绿色的特点。微 生物制剂发挥作用的机理包括抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生 系统抗性等。利用微生物制剂除了可以达到防治病害的目的以外，其分泌的代谢 物，还可以促进物生长，对农产品也有增产作用。目前国内外的研究者分离得到 多种有益的拮抗微生物，其分离的来源主要为土壤和植物根际。研究者获得的拮 抗微生物除了用于实验室的研究以外，有很多研发的拮抗微生物已经进行生产和 试验示范。不少菌剂也被登记为生物农药。据估计，全球生物农药市场预计将以 17.4％的年复合增长率增长，这说明微生物制剂的研发和应用不仅具有理论意义， 也可以很好的应用到生产实践中。在微生物制剂的研究中，关于伯克霍尔德氏菌 属(Burkholderia)的研究颇多，例如公开号为CN103642742A的中国专利公开 了一株伯克霍尔德氏菌，该菌可以稳定定殖在土壤中，利用其制备的微生物肥料 能够改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍，并对尖孢镰刀菌具有明显抑制作 用，而且可促进香草兰的生长；公开号为CN111849842A的中国专利公开了一种解钾菌伯克霍尔德氏菌K4-1及其应用，该菌易于生长，能够大量繁殖，对植物 具有促生作用；公开号为CN102533593A的中国专利公开了一株洋葱伯克霍尔德 氏菌SD7及其培养方法和应用，公开了该菌株对水稻纹枯病菌、香蕉炭疽病菌、 稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄 叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌等均具有强烈的抑制作用，然 而洋葱伯克霍尔德氏菌SD7并不能溶磷解钾、分泌嗜铁素等，不具备促进植物 生长功能。由此可知，生防微生物具有特异性，无论是对于抗菌谱、抗菌效果， 还是促植物生长性能而言，即使是同一物种不同菌株之间的效果也具有较大差异。因此，分离筛选出既能够防治多种植物病害，又具有促植物生长性能且稳定 性良好的多功能高效生防菌并不容易，这对生物农药开发具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株洋葱伯克霍尔德氏菌JT79。

本发明的第二个目的在于提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在作为或制备 植物促生剂中的应用。

本发明的第三个目的在于提供上述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在作为或制备 防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79，于2019年9月30 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地 址为广州市先烈中路100号。本发明提供的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提供了上述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79或其菌株发酵液或其发酵无 菌滤液在作为或制备植物促生剂中的应用。

所述的发酵无菌滤液为将洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液进行过滤灭菌后 获得的无菌滤液，该滤液中含有伯克霍尔德氏菌JT79发酵产生的次生代谢产物， 而不含有活体伯克霍尔德氏菌JT79。

优选地，为在作为或制备具有溶磷、解钾、固氮或分泌嗜铁素功能的植物促 生剂中的应用。

本发明还提供了上述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79或其菌株发酵液在作为或制 备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。

优选地，所述植物病原菌为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，辣椒根腐病 菌(Fusarium vasinfectum)，花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)，菜心炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)，水稻稻瘟病菌(PyricuLaria oryzae)，棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)，香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cubense)，兰花根腐病菌(F.solani)，兰花炭疽病菌(C.orchidearum)，大豆炭疽菌(C.truncatum)，兰花枯萎 病菌(F.oxysporum)，茶树炭疽病菌(Gloeosporium theae-sinesis Miyake),菜心立 枯病菌(R.solani)中的任意一种或多种。

本发明还提供了一种微生物制剂，包含洋葱伯克霍尔德氏菌JT79或洋葱伯 克霍尔德氏菌JT79发酵液或其发酵无菌滤液。

优选地，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备方法为：菌株活化后 取单菌落接种在LB培养基中，在30～35℃培养45～50h，获得种子液，然后将 种子液和液体培养基混合，培养45～60h，，即得。

优选地，所述发酵液中的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79浓度为1×10⁸～ 3×10⁸cfu/mL。

进一优选地，所述液体培养基为LB培养基或NB培养基。

更优选地，所述种子液和液体培养基的体积比为1：9～12。

作为一种可实现的优选方案，所述发酵液的制备方法具体如下：

菌株活化后取单菌落接种在50mL LB液体培养基中，在30℃培养48h，获 得种子液，然后按照种子液和LB培养基体积比为1：10混合，在30℃180r/min 下培养48h，即得。上述LB培养基的配方均为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g， NaCl 5g，无菌水定容至1L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79具有较强溶解难溶性磷、钾、固氮 以及分泌嗜铁素的能力，对烟草、黄瓜、大豆苗具有良好促生长效果；该菌株对 多种植物病原菌如棉花根腐病病菌、菜心炭疽病菌等13种病原菌引起的植物病 害具有良好的抑菌效果，且其在不同培养条件下培养后抑菌效果稳定。经四点对 峙法实验表明，洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对棉花黄萎病菌的抑制率高达99.0％， 对菜心炭疽病菌的抑制率达到76.6％，且对菜心立枯病菌具有显著的防治效果。 该菌是一种既能够防治多种植物病害，又具有促植物生长性能且稳定性良好的多 功能高效生防菌。由洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液进行过滤灭菌后获得的无 菌滤液对大豆和玉米具有促生长作用。

附图说明

图1为JT79菌株的培养形状和生理特征图，图1A为伯克霍尔德氏菌JT79 菌落图，图1B为伯克霍尔德氏菌JT79革兰氏染色图，图1C为伯克霍尔德氏菌 JT79扫描电镜图。

图2为伯克霍尔德氏菌JT79的遗传进化树。

图3为伯克霍尔德氏菌JT79在有机磷筛培养基上的生长图。

图4为伯克霍尔德氏菌JT79在阿须贝氏固氮培养基上生长图。

图5为伯克霍尔德氏菌JT79在CAS平板上的生长图。

图6为伯克霍尔德氏菌JT79促生作用生长情况图，其中，图6A为接种JT79 菌液的烟草生长情况，图6B为接种无菌水的烟草生长情况。图6C左为接种JT79 菌液的大豆生长情况，图6C右为接种无菌水的大豆生长情况。

图7为洋葱伯克霍尔德氏菌JT79不同处理对黄瓜幼苗的促生效果图，其中 图7A为接种无菌水的黄瓜生长情况，图7B为接种JT79发酵液的黄瓜生长情况， 图7C为接种菌体悬浮液的黄瓜生长情况。

图8为洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对不同植物病菌的抑菌效果图。

图9为伯克霍尔德氏菌JT79对香蕉枯萎病菌的抑制效果图；左图为香蕉枯 萎病菌对照；右图为JT79菌株和香蕉枯萎病菌对峙培养。

图10为伯克霍尔德氏菌JT79对水稻纹枯病菌的抑制效果图；左图为水稻纹 枯病菌对照；右图为JT79菌株和水稻纹枯病菌对峙培养。

图11为伯克霍尔德氏菌JT79对辣椒根腐病菌的抑制效果图；左图为辣椒根 腐病菌对照；右图为JT79菌株和辣椒根腐病菌对峙培养。

图12为伯克霍尔德氏菌JT79对花生白绢病菌的抑制效果图；左图为花生白 绢病菌对照；右图为JT79菌株和花生白绢病菌对峙培养。

图13为伯克霍尔德氏菌JT79对菜心炭疽病菌的抑制效果图；左图为菜心炭 疽病菌对照；右图为JT79菌株和菜心炭疽病菌对峙培养。

图14为伯克霍尔德氏菌JT79对水稻稻瘟病菌的抑制效果图；左图为水稻稻 瘟病菌对照；右图为JT79菌株和稻瘟病菌对峙培养。

图15为伯克霍尔德氏菌JT79对棉花黄萎病菌的抑制效果图；左图为棉花黄 萎病菌对照；右图为JT79菌株和棉花黄萎病菌对峙培养。

图16为伯克霍尔德氏菌JT79对兰花枯萎病菌的抑制效果图；左图为兰花枯 萎病菌对照；右图为JT79菌株和兰花枯萎病菌对峙培养。

图17为伯克霍尔德氏菌JT79对兰花根腐病菌的抑制效果图；左图为兰花根 腐病菌对照；右图为JT79菌株和兰花根腐病菌对峙培养。

图18为伯克霍尔德氏菌JT79对兰花炭疽菌的抑制效果图；左图为兰花炭疽 菌对照；右图为JT79菌株和兰花炭疽菌对峙培养。

图19为伯克霍尔德氏菌JT79对大豆炭疽病菌的抑制效果图；左图为大豆炭 疽病菌对照；右图为JT79菌株和大豆炭疽病菌对峙培养。

图20为伯克霍尔德氏菌JT79不同发酵条件对香蕉枯萎病菌的抑菌率。

图21为伯克霍尔德氏菌JT79对菜心立枯病的防治效果图；图21A接种为 接种丝核菌菌液的菜心生长情况，图21B为接种JT79菌液与丝核菌菌液的菜心 生长情况，图21C为空白对照。

图22为伯克霍尔德氏菌JT79对丝核菌的菌核数量的影响。

图23为伯克霍尔德氏菌JT79无菌滤液稀释不同倍数后对大豆幼苗的促生 效果对比图。

图24为伯克霍尔德氏菌JT79发酵过滤获得无菌滤液对玉米的促生效果图， 从左到右依次为：对照组，接种稀释20、40、80倍无菌滤液。

图25为伯克霍尔德氏菌JT79无菌滤液稀释不同倍数后对玉米幼苗的促生效 果对比图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1洋葱伯克霍尔德菌JT79的分离和鉴定

从广州华南农业大学农场水稻土中分离得到的菌株JT79，在LB培养基上培 养，观察形态特征：单菌落为规则圆形，黄色，乳状，菌落较大，表面光滑(见 图1)。

生理生化鉴定发现，JT79菌株能利用葡萄糖，接触酶反应、氧化酶反应、 运动性测定、V-P试验、等生理生化试验呈阳性，需氧，不能利用果糖、乳糖、 甘露醇、蔗糖和麦芽糖，淀粉水解、甲基红试验、V-P试验、明胶液化、硝酸盐 还原和硫化氢试验等呈阴性。结合JT79菌株的形态特征和生理生化特征，初步 鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia)。菌株JT79的16S rDNA基因长度为1445bp， 与洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的同源性达到99.86％。16S rDNA 基因的遗传进化树分析表明，菌株JT79与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)在同一分支，置信度高(见图2)。结合形态和分子鉴定，菌株JT79鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，将JT79菌株于2019年9 月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798， 分类命名号为Burkholderiacepacia JT79，保藏地址为广州市先烈中路100号， NCBI登录号：MK928421。

实施例2洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备

(1)将-80℃下保存的菌株活化，挑取活化后的菌落在LB液体培养基(酵 母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.2)，在121℃下灭 菌15min，30℃培养48h，获得种子液。

(2)按照含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液和液体培养基体积比为1： 10将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液加入LB液体培养基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加无菌水定容至1L)中，在30℃、180r/min 下培养48h，得到洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液。其中，洋葱伯克霍尔德氏 菌JT79的浓度为1×10⁸cfu/mL。

实施例3洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备

仅将实施例2中步骤(2)的LB液体培养基培养基替换为等体积的NB培 养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加无菌水定容至1L)来制备洋葱 伯克霍尔德氏菌JT79发酵液。其中，洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的浓度为 1×10⁸cfu/mL。

实施例4伯克霍尔德氏菌JT79菌株解磷能力测定

取伯克霍尔德氏菌JT79菌株的单菌落到液体LB培养基中，摇菌48h。吸 取10μL菌悬液点植在有机磷筛选培养基(Glucose 10.0g,(NH₄)₂SO₄ 0.5g,NaCl 0.3g,MgSO₄ 0.3g,MnSO₄ 0.03g,K₂SO₄,0.3g,FeSO₄,0.03g，Ca₃(PO4)₂5.0g， Agar 15.0g，卵磷脂0.2g，加无菌水定容至1L)上，在30℃下细菌培养箱培养， 观察有无透明圈生成，并在培养2d，3d，4d时分别记录下透明圈直径D和菌 落直径d。

结果分析：伯克霍尔德氏菌在平板上可出现明显且较大的透明圈(见图3)， 在培养第7天，菌落直径d为7.0mm，透明圈直径D为25.0mm，D/d值为3.57， 具有较强溶解难溶性磷的能力。

实施例5伯克霍尔德氏菌JT79菌株解钾能力测定

在250mL的三角瓶内加入100mL的解钾细菌筛选培养基(钾长石2.5g, Na₂HPO₄，0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5g，Glucose 10g，CaSO₄·7H₂O 0.1g)，实验组加入10mL实施例2制备得到的发酵液，对照组加入10mL LB液体培养基，在28℃、180r/min恒温摇床培养7d，发酵液在5000r/s的转 速下离心10min后用四硼酸钠法测定上清液中速效钾含量。细菌溶解钾的量＝实 验组发酵液可溶性钾含量-对照组培养液可溶性钾含量。

经测定发现，伯克霍尔德氏菌JT79具备解钾活性，菌液中平均速效钾含量7.54mg/L(见表1)。

表1伯克霍尔德氏菌JT79菌液速效钾含量

实施例6伯克霍尔德氏菌JT79菌株固氮能力测定

取伯克霍尔德氏菌JT79菌株的单菌落到液体LB培养基中，摇菌48h。吸 取10μL菌悬液点植在固氮菌筛选培养基(阿须贝固体培养基，KH₂PO₄ 0.2g， MgSO₄，0.2g，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g,CaSO₄ 0.1g，Agar 15.0g， H₂O 1L)上，28℃培养48h，观察菌株能否在培养基上的生长，能生长细菌即 为固氮细菌。

结果分析：伯克霍尔德菌JT79培养在阿须贝氏固氮培养基上能够生长，则 伯克霍尔德氏菌JT79具备固氮能力(见图4)。

实施例7伯克霍尔德氏菌JT79菌株产嗜铁素能力测定

(1)相关培养基和试剂制备：

MKB液体培养基：酪蛋白氨基酸15g，甘油15mL，K₂HPO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水1000mL。

CAS检测液：将0.079g的CAS溶于50ml去离子水中，再加入10mL，1 mmol/L FeCl₃溶液，得到溶液A；将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶 于40mL的去离子水中，得溶液B；将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅 拌混匀即得100mL CAS蓝色检测液。

0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)：每100ml含Na₂HPO₄·12H₂O 2.427g， NaH₂PO₄·2H₂O 0.075g，NH₄Cl 0.250g，NaCl 0.125g，使用时稀释10倍。

CAS培养基：每100g含20％蔗糖溶液1mL，1mmol/L的10％Casein acidHydrolysate 3mL，1mmol/L Ca₂Cl₂ 100μL，高压灭菌后，60℃时缓慢加入磷酸 缓冲溶液和CAS染液各5mL，即得CAS蓝色培养基。

(2)定性检测：

按照实施例2中方法取得伯克霍尔德菌JT79发酵液。吸取10μL菌悬液点 植在CAS培养基上，28℃培养48h，观察菌落周围的橙黄色晕圈，记录培养48 h，72h和96h后晕圈的直径D和菌落直径d，计算可溶性指数即D/d。

(3)定量检测：

将按照试验实例2中方法取得洋葱伯克霍尔德菌JT79发酵液以1×10⁸ cfu/mL浓度接种1mL到100mL MKB液体培养基中发酵培养，28℃，180r/min 振荡培养48h，每24h取样一次。将菌悬液8000r/min离心15min后得到细菌 发酵上清液，分别取发酵上清液与CAS检测液各3mL充分混匀，静置1h，用 分光光度计测溶液在630mm波长处的吸光值As，用无菌水作对照调零。取3mL CAS检测液与3mL未接种的MKB液体培养基上清液充分混匀，同上测定吸光 值Ar作为对照。计算铁载体活性单位的公式如式(1)所示：

su＝[(Ar-As)/Ar]×100 (1)

洋葱伯克霍尔德菌JT79培养在CAS检测平板上，分泌铁载体使菌落周围出 现明显的黄色晕圈(见图5)。培养7d后，菌落半径d为6mm，淡黄色晕圈半 径D为3.4mm，可溶性指数(D/d值)为5.67，分泌嗜铁素能力较强。

伯克霍尔德氏菌JT79在MKB液体培养基中，在28℃、180r/min下培养48 h，菌悬液离心15min后获得细菌发酵上清液，将发酵上清液、MKB培养基与 CAS检测液等体积混合，静置1h后在630nm波长处，测定发酵上清液吸光值 As为1.386，测定未接种MKB液体培养基吸光值参比值Ar为1.714，根据式(1) 计算铁载体活性单位为19.13，伯克霍尔德氏菌JT79具有分泌铁载体能力。

实施例8伯克霍尔德氏菌JT79菌株促生效果的盆栽实验

1.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液对烟草的促生效果

将10株长势相同的烟草幼苗培养生长至4～5片叶片后，实验组用50mL OD₆₀₀＝1.0的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液浇灌在烟草根部，空白对照组用 等量的无菌水浇灌在烟草根部。每7天处理一次，完成第三次灌根处理一周后， 采收烟草并测定烟草生物量(干重和鲜重)。

结果分析：空白对照组(图6B)地上部分平均鲜重3.3578g，而用洋葱伯 克霍尔德氏菌JT79菌株发酵液灌根的烟草(图6A)地上部分平均鲜重4.4171g， 与空白对照组相比增产了31.55％。可见洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液对烟草 具有明显促生效果。

2.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液对大豆的促生效果

将8株长势相同的大豆幼苗培养生长至4片叶片后，实验组用50mL OD₆₀₀＝1.0的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液浇灌到大豆根部，空白对照组用等量的 无菌水施浇大豆根部。每隔10天处理1次，完成处理30天后，观察大豆的生长 情况。

结果分析：根据图6与表2可知，施加洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的 大豆(图6C左)相比正常培养的大豆长势良好，株高显著高于空白对照组(图 6C右)，可见洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液对大豆具有明显促生效果。

表2洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对大豆的促生效果

3.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液对黄瓜的促生效果

将48株长势相同的黄瓜幼苗培养至2片叶子后，用JT79发酵液或JT79菌 悬液对黄瓜幼苗进行灌根处理，以无菌水为空白对照，采用两种处理方法：

实验组一：将JT79的发酵液10000r/s离心后获得菌体，用无菌水稀释获得 OD₆₀₀＝1.0的菌悬液；

实验组二：OD₆₀₀＝1.0的JT79发酵液；

对黄瓜幼苗进行灌根处理，每株10mL，观察黄瓜幼苗的长势。采收黄瓜幼 苗并测定黄瓜地上部生物量(鲜重)。

结果分析：空白对照组地上部分平均鲜重1.059g(图7A)；实验组一的黄 瓜地上部分平均鲜重1.685g(图7C)，与无菌水组相比增产了59.11％；实验组 二的黄瓜地上部分平均鲜重3.131g(图7B)，与无菌水组相比增产了195.66％， 可见洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对黄瓜具有明显促生效果(表3)。

表3洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对黄瓜的促生效果

*同列具相同字母者差异不显著(p<0.05)

实施例9伯克霍尔德氏菌JT79菌株广谱的抑菌效果测定

采用四点对峙法，按照实施例2的方法制备洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵 液，将指示菌打取菌饼在PDA平板上接种于平板中央，将发酵液滴到四周的滤 纸片上，每片约10μL，在对照组的滤纸片上滴等量的ddH₂O，设置三个重复。 在28℃培养一定时间至对照刚长满平板时，观察抑菌状况及抑菌圈大小。记录 菌落直径，并计算抑菌率。所用的病原菌有：水稻纹枯病菌，辣椒根腐病菌，花 生白绢病菌，菜心炭疽病菌，水稻稻瘟病菌，棉花黄萎病菌，香蕉枯萎病菌，兰 花枯萎病菌，兰花根腐病菌，兰花炭疽病菌，大豆炭疽病菌，茶树炭疽病菌。计 算抑菌率的公式如式(2)所示：

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％(2)

结果表明：伯克霍尔德氏菌JT79菌株对12种植物病原真菌(水稻纹枯病菌， 辣椒根腐病菌，花生白绢病菌，菜心炭疽病菌，水稻稻瘟病菌，棉花黄萎病菌， 香蕉枯萎病菌，兰花枯萎病菌，兰花根腐病菌，兰花炭疽病菌，茶树炭疽病菌， 大豆炭疽病菌)具有广谱抑菌效果，抑菌率50％～99％(图8～19)。其中，该 菌对棉花黄萎病菌的抑制率高达99.0％，对菜心炭疽病菌的抑制率达到76.6％。

实施例10洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株抑菌效果稳定性试验

在抑菌实验中，通过改变培养基的种类、碳氮比、pH以及培养的时间来探 究洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的抑菌效果稳定性，具体实施措施如下：

1.洋葱伯克霍尔德菌JT79不同培养基菌液抑菌效果的影响

各种培养基的配方如下：

TSB培养基：胰酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 5g，加水定容至1L， pH 7.1～7.5。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水定容至1L，pH 7.1～7.5。

NB培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加水定容至1L，pH 7.2。

伯克菌选择培养基：葡萄糖2g，L-天冬氨酸1g，NaHCO₃ 1g，KH₂PO₄0.5 g， MgSO₄·7H₂O 0.1g，加水定容至1L。

采用平板四点对峙法测试，将实施例2的种子液分别接种于TSB培养基、 LB培养基、NB培养基以及伯克菌选择培养基中，得到不同的洋葱伯克霍尔德 菌JT79发酵液，以尖胞镰刀菌为指示菌，将尖胞镰刀菌打饼在PDA平板上接种 于平板中央，将上述不同的发酵液(菌浓度为1×10⁸cfu/mL)滴到四周的滤纸片 上，每片约10μL，在对照组的滤纸片上滴等量ddH₂O。每一种发酵液和对照组 均设置三个平行组。28℃下再培养一定时间至对照刚长满平板时，观察抑菌状 况及抑菌圈大小。记录菌落直径，并计算抑菌率。

2.洋葱伯克霍尔德菌JT79培养基不同碳和氮含量对菌液抑菌效果的影响

选择上述NB培养基，调节培养基的配方，改变碳源与氮源的供应量，分别 取牛肉膏设为1g/L，4g/L 2个水平，蛋白胨设为5g/L，15/L 2个水平， 通过不同组合得四个处理的培养基为：

处理1：牛肉膏4g/L，蛋白胨设为15g/L(C:N-1)；

处理2：牛肉膏4g/L，蛋白胨设为5g/L(C:N-2)；

处理3：牛肉膏1g/L，蛋白胨设为15g/L(C:N-3)；

处理4：牛肉膏1g/L，蛋白胨设为5g/L(C:N-4)；

按照实施例2的方法，将JT79种子液按照1：10的比例接种于各处理培养 基中，在37℃下以180rpm的条件下培养48h。同样采用本实例中的四点对峙 法检测各组菌液对镰刀菌的抑菌效果，实验重复3次。

3.洋葱伯克霍尔德菌JT79培养基不同pH对菌液抑菌效果的影响

选择上述NB培养基，调节培养基pH值分别为5.8，6.8，7.8，8.8。将JT79 接种于各培养基中获得发酵液，在37℃下以180rpm的条件下培养48h。采用四 点对峙法检测各组发酵液对镰刀菌的抑菌效果。

4.洋葱伯克霍尔德菌JT79不同发酵时间对生防菌JT79抑菌效果影响

按照实施例2制得发酵液，分别培养1、2、4、6和8d。采用平板四点对峙 法测试，以尖胞镰刀菌为指示菌，将镰刀菌接种于PDA平板中央，将JT79菌株 发酵液滴到四周的滤纸片上，每片约10μL，在对照组的滤纸片上滴等量ddH₂O。 重复三次。28℃下培养一定时间至对照组刚长满平板时，观察抑菌状况及抑菌圈 大小。记录菌落直径，并计算抑菌率。

结果分析：如图20所示，改变JT79菌株发酵液的培养时间，不同培养基的 发酵液，培养基的不同碳氮比及pH值对香蕉根腐病菌抑菌率从55％到65％左右 波动。数据波动经F检验结果不显著。抑菌效果也没有差异。说明以上条件对伯 克霍尔德氏菌JT79的抑菌效果几乎没有影响。从上述结果可以看出，本发明中 使用的JT79菌株培养条件不严格，培养方便，无需特殊的培养基，且抑菌效果 稳定，不会产生衰减，在生产实际中稳定性高。

实施例11洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株对菜心立枯病的生防效果

将30mL(OD₆₀₀＝0.8)丝核菌菌丝悬浊液和60mL(OD₆₀₀＝1.0)伯克霍尔 德氏菌JT79菌悬液与500g灭菌基质(基质土：蛭石＝2：1)混合，对照组以60 mL无菌水和30mL(OD₆₀₀＝0.8)的丝核菌菌丝悬浊液与500g基质混合，以等 量无菌水与500g基质混合为空白对照，每盆撒上100粒菜心种籽后保湿培养， 观察菜心幼苗的生长情况和基质表面菌核数量。

结果表明，菜心幼苗保湿培养7天后，对照组(图21A)菜心幼苗有明显倒 伏、腐烂和被菌丝包围的现象，出芽率为36％；用丝核菌菌丝悬浊液和洋葱伯克 霍尔德氏菌JT79菌悬液处理的菜心幼苗(图21B)出芽率为72％；用无菌水处 理的空白对照组出芽率为88％，说明JT79对丝核菌菌丝的防治效果十分明显， 相对防治效果为56.25％(表4)。通过对菌核个数的统计，对照组基质表面菌 核数量为55，而经过JT79菌悬液处理的基质表面菌核数量为9，进一步证明洋 葱伯克霍尔德氏菌JT79对丝核菌的菌核产生具有明显的抑制效果(见图22)。

表4洋葱伯克霍尔德氏菌JT79对菜心立枯病的防治效果

实施例12伯克霍尔德氏菌JT79无菌滤液促生效果实验

1.伯克霍尔德氏菌JT79菌株无菌滤液对大豆的促生效果

按照实施例2制备的伯克霍尔德氏菌JT79发酵液，对发酵液进行过滤灭菌 获得无菌滤液，将无菌滤液分别稀释成20、40和80倍。大豆种子催芽后，分别 放在装有5mL MS培养基的试管上，加入无菌滤液1mL，对照组加入等体积无 菌水。在无菌条件下，28℃，16光：8暗，培养2周，第一周时各补1mL无菌 水。两周后将大豆幼苗取出并测量大豆苗株高。

结果分析：用JT79发酵液的无菌滤液分别稀释20倍、40倍、80倍无菌滤 液处理大豆幼苗，平均株高分别是18.1，19.7，17.7cm，对照组的大豆平均株高 为14.3cm，表明该无菌滤液对大豆苗的生长具有显著的效果(见图23)。

2.伯克霍尔德氏菌JT79菌株无菌滤液对玉米的促生效果

按照实施例2制备的伯克霍尔德氏菌JT79发酵液，对菌液进行过滤灭菌获 得无菌滤液，将无菌滤液分别稀释成20，40，80倍。玉米种子催芽后，分别放 在装有5mL MS培养基的试管上，加入无菌滤液1mL，对照组加入等体积无菌 水。在无菌条件下，28℃，16光：8暗，培养2周，第一周时各补1mL无菌水。 两周后将玉米幼苗取出并测量大豆苗株高。

结果分析：用JT79发酵液的无菌滤液分别稀释20倍、40倍、80倍无菌滤 液处理玉米幼苗，平均株高分别是14.30，18.33，15.07cm，对照组的玉米平均 株高为11.1cm，表明该无菌滤液对玉米苗的生长具有显著的效果(见图24～25)。

Claims (10)

1.一株洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79，其特征在于，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。

2.权利要求1所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79或其菌株发酵液或其发酵无菌滤液在作为或制备植物促生剂中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，为在作为或制备具有溶磷、解钾、固氮或分泌嗜铁素功能的植物促生剂中的应用。

4.权利要求1所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT799或其菌株发酵液在作为或制备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述植物病原菌为水稻纹枯病菌，辣椒根腐病菌，花生白绢病菌，菜心炭疽病菌，水稻稻瘟病菌，棉花黄萎病菌，香蕉枯萎病菌，兰花枯萎病菌，兰花根腐病菌，兰花炭疽病菌，大豆炭疽病菌，茶树炭疽病菌，菜心立枯病菌中的任意一种或多种。

6.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79或洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液或其发酵无菌滤液。

7.根据权利要求6所述微生物制剂，其特征在于，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备方法为：菌株活化后取单菌落接种在LB培养基中，在30～35℃培养45～50h，获得种子液，然后将种子液和液体培养基混合，培养45～60h，即得。

8.根据权利要求7所述微生物制剂，其特征在于，所述液体培养基为LB培养基或NB培养基。

9.根据权利要求7所述微生物制剂，其特征在于，所述发酵液中的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79浓度为1×10⁸～3×10⁸cfu/mL。

10.根据权利要求7～9任一所述微生物制剂，其特征在于，所述种子液和液体培养基的体积比为1：9～12。

Images