CN109913393A - 一株洋葱伯克霍尔德氏菌p10及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10及其应用，所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10命名为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019172。本发明的洋葱伯克霍尔德氏菌P10具有溶解无机磷、产ACC脱氨酶及分泌铁载体的功能，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大，尤其对花生促生有明显的有益效果。

Description

一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10及其应用。

背景技术

植物根际促生菌是一类生长在植物根际土壤中的有益细菌，对植物有多种促生机制，如生物固氮、溶磷解钾、产生植物激素如IAA、拮抗病原菌、诱导系统抗性等。尤其是，这些细菌在代谢过程中产生的有机酸可以溶解土壤中难溶性磷、难溶性钾而促进植物的生长发育，也可通过分泌铁载体、ACC脱氨酶增强植物对病害、重金属及盐碱等逆境的抗性。从环境中分离筛选有促生作用的微生物菌株并研制微生物肥料加以应用，对减轻环境污染、发展种植产业有重要意义。

花生为豆科一年生草本植物，是我国主要的油料经济作物，种植面积和产量都居世界首位。但是，花生种植生产存在的主要问题是单产增长较慢，花生生长需要充足的氮磷钾等大量元素，但大量化肥的施用会导致土壤、水源污染及生态环境恶化。

目前对花生有促生作用的专利菌株报道为芽孢杆菌属和贪噬菌属。另外，关于伯克霍尔德氏菌属菌株专利的报道较少,且并未有伯克霍尔德氏菌属菌株对于花生促生作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10及其应用。本发明的洋葱伯克霍尔德氏菌P10具有溶解无机磷、产ACC脱氨酶及分泌铁载体的功能，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大，尤其对花生促生作用明显的特点。

本发明的技术方案：一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10，其特征在于：所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10命名为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019172。

前述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10在作为植物生长促生菌中的应用。

前述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，所述促生菌是具有溶解并利用培养基中磷酸钙功能的促生菌。

前述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，所述促生菌具有产ACC脱氨酶和分泌铁载体功能的根际促生菌。

一种植物生长促生菌制品，所述制品的活性成分包括权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

一种植物生长促生菌制品，所述制品的活性成分是权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

一种植物生长促生菌制品的制备方法，采用权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一

一种花生促生菌制品，所述制品的活性成分包括权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

一种花生促生菌制品，所述制品的活性成分是权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

前所述的花生促生菌制品，还包括用于促生菌制品的常规成分。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明公开了一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10及其应用，从贵州省宽阔水自然保护区茶树根际分离筛选到促生菌菌株P10，对其形态、生理生化特性及16S rDNA序列进行测定，鉴定该菌株为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。促生特性测定结果表明，该洋葱伯克霍尔德氏菌P10菌株具有较高的溶解无机磷能力，在30℃条件下、150rpm摇床振荡培养7d，培养液中的可溶性磷含量可达358.54mg/L；其分泌的ACC脱氨酶活性为16.61μmolα-酮丁酸/mg·h，产生的铁载体相对含量为37.98％，具有多种促生特性，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大，且洋葱伯克霍尔德氏菌P10菌株接种的花生鲜重、株高显著增高，明显促进了花生的生长。

综上所述，本发明的洋葱伯克霍尔德氏菌P10具有溶解无机磷、产ACC脱氨酶及分泌铁载体的功能，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大，尤其对花生促生有明显的有益效果。

附图说明

图1洋葱伯克霍尔德氏菌P10在LB固体培养基上的菌落形态图；

图2洋葱伯克霍尔德氏菌P10在光学显微镜(1000倍)下的镜检图；

图3洋葱伯克霍尔德氏菌P10在NBRIP固体培养基上培养7d的溶磷圈；

图4接种洋葱伯克霍尔德氏菌P10对花生的促生效果图，图中左侧3株花生为P10菌液接种组，右侧3株花生为对照组(未接种菌液)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1：洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)P10的分离和鉴定

1.1洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)P10的分离

从贵州省宽阔水自然保护区的茶园中采集茶树根际土壤10g，加入到90mL NBRIP液体培养基中进行富集培养；富集培养的条件为30℃、150rpm摇床振荡培养7d，将5％培养液转接到相同成分的新鲜培养基中，相同条件下进行培养，此过程重复4次；吸取1mL最后一次培养液倍比稀释后涂布在NBRIP固体培养基上30℃恒温培养7天，挑取溶磷水解圈较大的菌落于NBRIP平板上进行反复划线纯化，直至获得纯培养菌株，将其标记为P10。

上述NBRIP的培养基配方为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，MgCl₂·6H₂O5g，MgSO₄·7H₂O0.25g，KCl 0.2g，(NH₄)₂SO₄0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0，115℃灭菌30min。固体培养基则加入2％琼脂。

1.2洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)P10的鉴定

对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列形态及生理生化鉴定，并提取细菌基因组DNA，扩增16S rDNA测序。

该菌株在LB固体培养基上形成圆形、表面湿润光滑、边缘整齐，微隆起的淡黄色菌落，如附图1所示；镜检为短杆菌，革兰氏染色阴性，无芽孢，如附图2所示。

上述LB培养基的配方为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7.0，121℃灭菌20min。

该菌株的生理生化鉴定结果显示：接触酶试验阳性，氧化酶试验阴性；硝酸盐还原试验阳性，亚硝酸还原盐试验阴性；可水解脲和酪蛋白，明胶液化能力弱，不可水解淀粉；能够利用麦芽糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、甘油及苯甲酸钠；可发酵麦芽糖、葡萄糖、木糖及乳糖产酸；能在30℃，但不可42℃生长，也不能耐受低温和6％(w/V)NaCl。

对该菌株进行分子鉴定：对菌株P10提取细菌DNA，以该DNA为模板，采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如序列1所示，P10菌株的16SrDNA序列的扩增长度为1340bp。经同源性比对，该菌株16S rDNA序列与GenBank数据库中Burkholderia cepacia ATCC 2180916S rDNA序列(NCBI登录号：AY741338)同源性最高，达99.85％。

以上所述扩增16S rDNA通用引物序列为：

27f:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，

1492r：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

所述PCR体系为：1×premix rTaq，0.4μM引物27f，0.4μM引物1492r，50ng DNA。

所述PCR程序为：95℃预变性10min，95℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸90sec，35个循环；之后72℃延伸7min。

结合菌株形态特征、生理生化特性和分子鉴定结果，鉴定P10菌株为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，其保藏号为CCTCC NO:M 2019172。

实施例2：洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)P10促生特性的测定

2.1洋葱伯克霍尔德氏菌P10溶磷能力测定

溶磷定性测定：将活化的P10菌株点种于NBRIP固体培养基上，30℃条件下倒置培养7d，见附图3，测定菌落直径及溶磷水解圈直径，计算溶磷水解圈直径/菌落直径之比为3.29。

溶磷定量测定：将活化的P10菌液转接于100mL NBRIP液体培养基中，30℃条件下摇床振荡培养7d，取培养液于4℃、10000rpm离心10min后测定pH值，钼蓝比色法测定上清液中的可溶性磷含量。每个处理重复3次，结果见表1。

表1菌株P10溶磷结果

注：数值采用“平均值±标准差”的方式，同一列中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

2.2洋葱伯克霍尔德氏菌P10产ACC脱氨酶酶活测定

将P10菌株经60mL TSB液体培养基活化培养24h，培养液8000rpm离心10min、以DF培养液洗涤2次后，重悬于24mL ADF培养基中24h培养；离心收集菌体用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)洗涤后，重悬于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中；再加入30μL甲苯振荡30sec以破碎细胞获得粗酶液；以Bradford法测定菌体蛋白浓度，以2,4-二硝基苯肼法测定粗酶液中α-酮丁酸含量，ACC脱氨酶具有将ACC分解成为氨和α-酮丁酸的能力，结果显示P10菌株的ACC脱氨酶酶活为16.61μmolα-酮丁酸/mg·h。

上述培养基配方为：

TSB培养基：大豆蛋白胨3g，胰蛋白胨17g，NaCl 5g，葡萄糖2.5g，K₂HPO₄2.5g，蒸馏水1000mL，pH7.1-7.5，115℃灭菌30min。

DF培养基：KH₂PO₄4g，Na₂HPO₄6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸钠2g，柠檬酸2g，(NH₄)₂SO₄2g，组分一、组分二溶液各0.1mL，蒸馏水1000mL，pH7.2，115℃灭菌30min。其中组分为H₃BO₃10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg，CuSO₄·5H₂O78.22mg，MoO₃10mg，溶于100mL灭菌蒸馏水中；组分二为FeSO₄·7H₂O100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中。

ADF培养基：将ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含(NH₄)₂SO₄的灭菌DF培养基中，终浓度为3.0mmol/L。

2.3洋葱伯克霍尔德氏菌P10分泌铁载体能力测定

将菌株P10接种于MKB培养基中摇床振荡培养2d，3500rpm离心15min取上清液，采用CAS法测定铁载体含量，结果显示P10菌株的铁载体活性为37.98％。

上述MKB的培养基配方为：酪蛋白氨基酸5g，甘油15mL，K₂HPO₄2.5g,MgSO₄·7H₂O2.5g,双蒸水1000mL，pH 7.2，115℃灭菌20min。

促生特性测定结果表明，该洋葱伯克霍尔德氏菌P10菌株具有较高的溶解无机磷能力，在30℃条件下、150rpm摇床振荡培养7d，培养液中的可溶性磷含量可达358.54mg/L；其分泌的ACC脱氨酶活性为16.61μmolα-酮丁酸/mg·h，产生的铁载体相对含量为37.98％，具有多种促生特性，在植物生长促生，开发成微生物菌剂的潜力大。

实施例3：洋葱伯克霍尔德氏菌P10对花生的促生测定

P10接种菌液的制备：将P10菌株接入NA液体培养基中30℃、摇床150rpm振荡培养24h，离心收集菌体用适量无菌水重悬，调节OD600值为0.5(菌体数量约10⁸cfu/mL)备用。

上述NA培养基的配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，121℃20min灭菌。

将花生种子经20％过氧化氢溶液浸泡20min表面消毒、无菌水多次冲洗后，置于蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，30℃恒温培养箱中催芽约3-4d，选取生长一致的花生苗移栽到育苗盆中。实验设2个处理，接种P10菌株组和对照组，每个处理做6个重复。每隔2d进行浇菌处理，每盆浇菌量5mL，对照浇灌等量无菌水。30d后测定花生的鲜重、株高以及叶绿素含量。结果见附图4和表2

表2接种菌株对花生生理生长特性的影响

注：数值采用“平均值±标准差”的方式，同一列中不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。

盆栽实验结果表明，利用洋葱伯克霍尔德氏菌P10接种的花生株高及鲜重显著高于未接种处理组(P<0.05)，且接种组花生的叶绿素含量也有所增高，所以对花生促生有着明显的作用。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一株洋葱伯克霍尔德氏菌及其应用

<141> 2019-04-03

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1340

<212> DNA

<213> 洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)

<400> 1

cgggtgcttg cacctggtgg cgagtggcga acgggtgagt aatacatcgg aacatgtcct 60

gtagtggggg atagcccggc gaaagccgga ttaataccgc atacgatcta cggatgaaag 120

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ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc 1320

cgtcacacca tgggagtggg 1340

Claims (10)

1.一株洋葱伯克霍尔德氏菌P10，其特征在于：所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10命名为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2019172。

2.根据权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，其特征在于：所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10在作为植物生长促生菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，其特征在于：所述促生菌是具有溶解并利用培养基中磷酸钙功能的促生菌。

4.根据权利要求2所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10，其特征在于：所述促生菌具有产ACC脱氨酶和分泌铁载体功能的根际促生菌。

5.一种植物生长促生菌制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

6.一种植物生长促生菌制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

7.一种植物生长促生菌制品的制备方法，其特征在于：采用权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

8.一种花生促生菌制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

9.一种花生促生菌制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的洋葱伯克霍尔德氏菌P10。

10.如权利要求8或9所述的花生促生菌制品，其特征在于：还包括用于促生菌制品的常规成分。