CN104711209B - 用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌b011及其应用 - Google Patents

用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌b011及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌B011及其应用，涉及植物病害生物防治技术领域，其保藏号为CCTCC NO：M2014576；其分离步骤如下：㈠、取样；㈡、研磨；㈢、离心；㈣、纯化；㈤、筛选。具有对烟草青枯病有较好拮抗作用、且对环境安全性好、易于工业化生产等特点，既可用于防治烟草青枯病、也可用于防治烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌，还可用于防治辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、柑橘炭疽病菌、稻瘟病菌和西瓜灰霉病菌等病原真菌。

Description

用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌B011及其应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一种用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌B011及其应用。
背景技术
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌[Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)]引起的一种主要从根部侵入的土传病害，烟草青枯病病菌主要在土壤中及遗落土中的病株残体上越冬，通过根茎的伤口或次生根的根冠进入木质部，然后在整个维管束蔓延，引起严重的萎蔫最终导致烟草枯萎死亡。该病在我国南方烟区普遍发生，连作地烟草青枯病发生较严重，对烟草生产具有很大威胁。
由于烟草青枯病为土传性细菌病害,化学农药在大田施用的过程中表层土壤对其进行吸附影响了其防治效果，目前尚无防治烟草青枯病的特效药剂。由于青枯病主要通过土壤传播，其传播途径隐蔽，长期大量施用化学农药易使病菌产生抗药性和造成环境污染。随着人类环保意识增强，绿色防控烟草病虫害日益引起人们的重视，挖掘有效的生防菌资源并基于其开发和利用生物防治技术已成为目前防治烟草青枯病的重点和热点。
近些年来，人们开始利用拮抗细菌对植物病虫害进行生物防治，“以菌治菌”的防治模式也逐渐被大家所接受。其中内生菌以其独特的内生性而作为生防菌优势更为显著。内生细菌广泛分布于植物体内，是集生物农药与生物肥料等多方面优势于一体的天然资源菌株，具有广阔的理论研究价值与开发应用前景。挖掘能有效防治烟草青枯病的内生细菌菌株，对于防治烟草青枯病均有重要的意义。如中国专利(专利申请号为201010595753.3)公开的“一种防治烟草青枯病的方法”，包括：青枯菌的培养与纯化：取青枯病烟草叶脉，用无菌水浸泡，在培养基上筛选，选取流动性好的单菌落继续培养，保存纯化的青枯菌；噬菌体的筛选：取发生烟草青枯病的植烟土壤，过筛，去杂；取小颗粒用无菌水浸泡，离心后取上清液过滤，取滤液与青枯菌液共同培养，保存筛选的噬菌体；噬菌体富集培养、收集：在三角瓶中加入培养基和含青枯菌的无菌水，震荡培养后，再加入含噬菌体的无菌水，继续培养；离心培养液，取上清液，过滤，滤液备用；牙签用无菌水浸泡，冲洗、灭菌后烘干，冷却至室温，置于滤液中浸泡，取出后分装保存备用；烟草移栽后,用该牙签插于旺长时期烟草植株茎基部，防治烟草青枯病。又如中国专利(专利申请号为201310046171.3)公开的“防治烟草青枯病拮抗菌及其应用”，该拮抗菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)QJ-1和黑曲霉(Aspergillus niger)Ty-3；其中，QJ-1保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2012年7月5日，保藏号：CCTCC NO:M2012271；Ty-3保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2011年7月8日，保藏号：CCTCCNO:M2011241。本发明的拮抗菌蜡状芽孢杆菌QJ-1和黑曲霉Ty-3组合可制成菌剂，将菌剂与有机物料发酵制成的微生物有机肥能提供有A效营养和功能菌，有效的防治烟草青枯病。还有中国专利(专利申请号为201210338294.X)公开的“防治烟草青枯病拮抗菌及其应用”，所用的生防微生物为烟草赖氨酸芽孢杆菌LysinibacillustobaccocumKpa菌株，该菌株2012年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.6161；该微生物通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，且在烟草根际有很好的定殖能力，是一种具有工业化生产前景的菌株。菌剂为Kpa菌株可湿性粉剂，它对烟草青枯病菌有很好的防治效果，能用于漂浮育苗基质处理，移栽期和成熟期；利用Kpa菌株制备的Kpa菌株可湿性粉剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是烟草农业种植中防治青枯病菌的高效生物农药；该发明为烟草农业生产中青枯病的防治提供了一种具有较好防治效果的生防微生物。
发明内容
本发明的目的是提供一种对烟草青枯病有较好拮抗作用的内生细菌，该内生细菌对环境安全性好，且易于工业化生产。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是提供一种用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B011，该解淀粉芽孢杆菌B011的活体纯培养已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)(地址：武汉市武昌珞珈山，邮政编码430072，电话：027-68752319)，保藏号：CCTCC NO：M2014576。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的分离方法，其分离步骤如下：
㈠、取样：在已有烟草青枯病发生的烟田中，选取仍然生长健康的烟株样品，洗净，剪下主根和侧根进行表面消毒，得消毒样品，备用；
㈡、研磨：将备用的消毒样品0.05-0.15g置于灭过菌的研钵中，加入5-15ml无菌水进行研磨，得研磨液，备用；
㈢、离心：取备用的研磨液0.5-1.5ml静置20-40min，在2-6℃下离心处理，得离心后的上清液，备用；
㈣、纯化：将备用的上清液用无菌水10-1～10-7梯度稀释后，在NA培养基上采用涂布平板法，待分离平皿上菌落长出后，挑取形态不同的单菌落在相应的空白NA培养基平板上进行划线纯化，并在26-30℃恒温培养箱中黑暗倒置培养30-50h，得纯化菌株，备用；
㈤、筛选：将备用的纯化菌株接种在预先混有标准烟草青枯菌株(R.solanacearumGMI1000)(由湖南农业大学植物病理学实验室提供，下同)的NA培养基平板上，采用菌落对峙法，根据抑菌圈的大小逐一筛选(即：优先选取抑菌圈最大的菌落)，即得解淀粉芽孢杆菌B011。
上述筛选方法为本领域常规方法。
所述NA培养基的配方为：
牛肉膏2-5g 葡萄糖5-15g 蛋白胨3-7g
氯化钠3-5g 琼脂15-20g；
其配制方法为：
将上述原料加水，定容至1L，用HCl或NaOH调节pH值至6.0～8.0，加热后分装三角瓶(250mL瓶，装100mL液)，在115-130℃灭菌15-30min，即得NA培养基(由于添加有琼脂，故冷却后的NA培养基呈固态状)。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对青枯雷尔氏菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对烟草黑胫病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对烟草赤星病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对辣椒炭疽病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对辣椒疫霉病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对西瓜灰霉病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对柑橘炭疽病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011的应用，对稻瘟病菌有拮抗作用。
所述解淀粉芽孢杆菌B011菌株的形态特征鉴定：该解淀粉芽孢杆菌B011菌株在NA培养基上呈灰白色，不透明，表面干燥皱缩，边缘不规则，具有较强的粘附性，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，有芽孢，呈杆状；该菌株既能在培养基表面生长又能沿穿刺线生长，为兼性厌氧型细菌；能产生过氧化氢酶和淀粉水解酶，分解明胶和蛋白胨中的色氨酸，但不能分解含硫的有机硫化物，通过对葡萄糖的代谢产生大量酸，使培养液pH降到4.2以下；可还原培养基中的硝酸盐离子。根据对该解淀粉芽孢杆菌B011菌株的形态观察并结合生理生化的结果，初步认定该解淀粉芽孢杆菌B011菌株为芽孢杆菌(Bacillus)。
所述解淀粉芽孢杆菌B011菌株分子鉴定：提取解淀粉芽孢杆菌B011的总DNA，将所提取的样品基因组DNA容易稀释作为模板进行PCR扩增，PCR扩增采用细菌通用引物对，由上海生物工程有限公司合成：正向引物序列27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物序列1492R5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。以解淀粉芽孢杆菌B011的基因组DNA为模板，经PCR反应扩增后，通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到一条约1.5kb特异性片段。将回收后的PCR产物送到上海生物工程有限公司进行测序后，将测出序列提交到NCBI进行系列比对。通过比对发现，解淀粉芽孢杆菌B011的16S rDNA序列与数据库中已有的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16S rDNA序列同源性均高达100％。采用MEGA5.0软件，通过N-J法构建系统发育树，结合形态特征，将解淀粉芽孢杆菌B011确定为淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
本解淀粉芽孢杆菌B011对烟草青枯病菌(即：青枯雷尔氏菌)的抑制作用：本解淀粉芽孢杆菌B011对烟草青枯病菌在平板对峙培养过程中有很强的抑制作用，本解淀粉芽孢杆菌B011在NA液体培养基(配方即为前面所述的NA培养基，NA液体培养基与NA培养基的区别在于：NA液体培养基中不加琼脂，下同)的发酵液对烟草青枯病菌的抑菌圈(其中孔径为11mm)直径达到了31.5mm，是内生拮抗菌中的优势菌种。
本解淀粉芽孢杆菌B011对烟草青枯病的防治效果：烟草青枯病是一种典型的土传性根茎类病害，病原菌主要从根部侵入寄主。本发明针对病原菌的侵入途径，利用本解淀粉芽孢杆菌B011在NA液体培养基的发酵液进行灌根处理，获得了好的防治效果。本解淀粉芽孢杆菌B011在NA液体培养基的发酵液的田间小区防治效果分别为40.49％，较目前使用的化学药剂72％农用硫酸链霉素SP在防治烟草青枯病上更具优势。
本解淀粉芽孢杆菌B011的最佳发酵条件：菌株发酵条件单因素测定表明，本解淀粉芽孢杆菌B011的生长和抑制烟草青枯病菌的拮抗物质产生的最适单因素条件分别是：牛肉膏3.0g/L、葡萄糖8.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化钠4.0g/L、发酵温度为29℃、培养液初始pH值为6.5、发酵时间为52h、转速180r/min，抑菌圈直径达37.6mm。进行正交试验优化的最佳发酵条件组合为牛肉膏3.0g/L、葡萄糖8.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化钠4.0g/L、发酵温度30℃、培养基初始pH7.0、发酵时间56h、转速为170r/min培养56h，抑菌活性明显增强，抑菌圈直径达到42.8mm。比上述最适单因素条件下的发酵液抑菌圈直径37.6mm增加了13.83％。
本解淀粉芽孢杆菌B011的抗菌谱分析：该菌株能抑制烟草病原真菌，对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜灰霉病菌、柑橘炭疽病菌、稻瘟病菌均表现出明显的抑制作用。
本发明的优点是：
①本发明的解淀粉芽孢杆菌B011是从健康烟株根部分离获得的内生菌株，是首次发现并鉴定的一个新菌株，其本身在平板上对烟草青枯病菌等多种烟草病原菌有很强的抑制作用，其发酵液对烟草青枯病有很好的防治效果，较目前使用的化学药剂72％农用硫酸链霉素SP在防治烟草青枯病上更具优势。
②、因为本发明的解淀粉芽孢杆菌B011是从烟株内部分离获得，表明该菌株可以在烟株内部定殖，与化学农药相比对烟株和土壤生态无毒副作用、无残留，对环境安全性好，具有良好的开发前景和应用潜力，尤其是对烟草青枯病的防治具有重要的意义。
③、本发明所述的分离方法中，其菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011的菌落形态图；
图2是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011的芽孢染色图；
图3是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011对标准烟草青枯菌株(R.solanacearumGMI1000)的平板抑制效果图；
图4是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011模板扩增后的电泳图；
图5是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011的16S rDNA扩增序列图；
图6是本发明的解淀粉芽孢杆菌B011的系统发育进化树图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明作进一步的说明。下面的说明是采用例举的方式，但本发明的保护范围不应局限于此。
实施例一：
本实施例的解淀粉芽孢杆菌B011的分离方法，其分离步骤如下：
㈠、取样：在已有烟草青枯病发生的烟田中，选取仍然生长健康的烟株样品，洗净，剪下主根和侧根进行表面消毒，得消毒样品，备用；
㈡、研磨：将备用的消毒样品0.1g置于灭过菌的研钵中，加入10ml无菌水进行研磨，得研磨液，备用；
㈢、离心：取备用的研磨液1ml静置30min，在4℃下采用7000r/min的离心机离心处理，得离心后的上清液，备用；
㈣、纯化：将备用的上清液用无菌水10-5梯度稀释后，在NA培养基上采用涂布平板法，待分离平皿上菌落长出后，挑取形态不同的单菌落在相应的空白NA培养基平板上进行划线纯化，并在28℃恒温培养箱中黑暗倒置培养40h，得纯化菌株，备用；
㈤、筛选：将备用的纯化菌株接种在预先混有标准烟草青枯菌株(R.solanacearumGMI1000)的NA培养基平板上，采用菌落对峙法，按照优选抑菌圈最大的原则，逐一筛选，即得解淀粉芽孢杆菌B011。
实施例二：
应用实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011对标准烟草青枯菌株(R.solanacearumGMI1000)的平板抑制作用试验：
将NA培养基加热熔化，待冷却至45℃时加入标准烟草青枯菌株(R.solanacearumGMI1000)NA液体培养基的发酵培养液至终浓度为1×107cfu/mL。随后倒入直径为9cm的培养皿，待NA培养基完全凝固后用灭菌后的直径为11mm的打孔器在NA培养基上打4个对称的孔。其中两个对称的孔内每孔注入应用实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011在NA液体培养基的发酵液20μL，另两个对称孔注入未经使用的NA液体培养基作为对照。实验设3次重复，29℃培养24h后测定抑菌圈直径，由附图3可见本实施例的解淀粉芽孢杆菌B011显著抑制标准烟草青枯菌株(R.solanacearum GMI1000)的生长。经测定实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011在NA液体培养基发酵液的抑菌圈直径达到了31.5mm。
实施例三：
应用实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011制备解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂：
首先，配制NA培养基斜面，接种实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011，放入30℃培养箱培养48小时，得斜面菌体，备用；
其次，配置NA液体培养基，灭菌前分装三角瓶(250mL，装100mL液)，121℃灭菌20min，冷却后在超净工作台上，用无菌水直接洗下上述斜面菌体，接入装有上述装有灭菌后的NA液体培养基的三角瓶中，摇瓶培养，pH 7.0，29℃，170r/min，培养48h，得摇瓶培养菌，备用；
接着，按照正交试验优化的最佳发酵条件组合配方(牛肉膏3.0g/L、葡萄糖8.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化钠4.0g/L)配置NA液体培养基，121℃灭菌20min，冷却后接种摇瓶培养菌，然后转入发酵罐中发酵，pH7.0，温度30℃、转速为170r/min，培养56h后中止发酵，所得的发酵液即为解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂。
本实施例的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂可用于烟田防治烟草青枯病，使用方法为：上述抑菌剂稀释600倍，分别于移栽时、移栽后25-30天施用，施药方式为根部浇灌，施药量250mL/株。
实施例四：
应用实施例三所得的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂对烟草青枯病的田间防治测试：
选择烟草青枯病常年发病的地块，分别于移栽时、移栽后25-30天施用实施例三所得的抑菌剂600倍稀释液，施药方式为根部浇灌，施药量250mL/株。以72％农用硫酸链霉素14g/667m2为药剂对照，于发病初期、发病初期施药后10天各灌根一次，施药量每株50ml/次。设清水灌根为空白对照。每小区面积25m2以上，植烟不低于40株，小区随机排列，3次重复，大田常规烟草栽培管理。于烟草青枯病发病盛期调查一次所有烟株的发病情况，统计发病率和病情指数，以此计算应用实施例三所得的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂对烟草青枯病的田间相对防治效果。结果表明：解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂与72％农用硫酸链霉素的相对防效分别为40.49％、30.46％，解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂较72％农用硫酸链霉素防效高10.03％。其试验统计数据见下表：
实施例五：
应用实施例三所得的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂对多种植物病原菌的抑制作用试验：
采用平板对峙法，测试应用实施例三所得的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂对烟草黑胫病菌(P.parasitica)、烟草赤星病菌(A.alternata Keissler)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)、辣椒疫霉病菌(P.capsici)、柑橘炭疽病菌(C.gloeosprioides)、稻瘟病菌(P.oryzae)和西瓜灰霉病菌(C.cuc-umerinum)等7种病原真菌的拮抗效果，在PDA平板中央接入5mm2的靶标菌丝块，随后在距离靶标菌丝块相同的距离按“实施例二”所述的方法打孔。对称的两孔加入按“实施例三”制备的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂各20μL，另两个对称孔注入无菌的NA液体培养基做为对照。28℃培养4-5d后，测量并记录抑菌圈直径。结果表明，应用实施例三制备的解淀粉芽孢杆菌B011抑菌剂的抑菌谱广，对上述7种病原真菌均有很明显的抑制作用，其抑制效果下面的见表1。
表1 应用实施例一所得的解淀粉芽孢杆菌B011对几种病原真菌的抑制效果
病原真菌 抑制半径
烟草黑胫病菌(P.parasitica) +++
烟草赤星病菌(A.alternataKeissler) +++
辣椒炭疽病菌(C.capsici) +++
辣椒疫霉病菌(P.capsici) ++
柑橘炭疽病菌(C.gloeosprioides) ++
稻瘟病菌(P.oryzae) +++
西瓜灰霉病菌(C.cuc-umerinum) ++
-：无抑制作用；
+：抑菌圈直径1-4mm；
++：抑菌圈直径4-8mm；
+++：抑菌圈直径＞8mm。
本发明所得的解淀粉芽孢杆菌B011，既可用于防治烟草青枯病、也可用于防治烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌，还可用于防治辣椒炭疽病菌(C.capsici)、辣椒疫霉病菌(P.capsici)、柑橘炭疽病菌(C.gloeosprioides)、稻瘟病菌(P.oryzae)和西瓜灰霉病菌(C.cuc-umerinum)等病原真菌。

Claims (1)

1.一种用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B011，其保藏号为CCTCC NO：M2014576；其特征在于：对青枯雷尔氏菌有拮抗作用，对烟草赤星病菌均有拮抗作用，对辣椒炭疽病菌和辣椒疫霉病菌均有拮抗作用，对西瓜灰霉病菌有拮抗作用，对柑橘炭疽病菌有拮抗作用。
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